CN111748640A - 肠道菌群在肌少症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肠道菌群在肌少症中的应用，具体的涉及肠道菌群Erysipelotrichaceae_UCG‑003，本发明首次发现了Erysipelotrichaceae_UCG‑003在肌少症患者中丰度降低，通过检测Erysipelotrichaceae_UCG‑003的丰度，可以诊断受试者是否患肌少症和/或患肌少症的风险，从而实现受试者的无创诊断。

Description

肠道菌群在肌少症中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及肠道菌群在肌少症中的应用。

背景技术

肌肉衰减综合症(Sarcopenia)，简称肌少症，是一种进行性的、广泛性的骨骼肌质量及力量的下降，以及由此导致的身体残疾、生活质量下降和死亡等不良后果的综合征。国际肌少症工作组(International Working Group on Sarcopenia,IWGS)在2009年将肌少症定义为肌肉质量减少和肌肉功能减退(Fielding RA,Vellas B,Evans WJ etal.Sarcopenia:an undiagnosed condition in older adults.Current consensusdefinition:prevalence,etiology,and consequences.International working groupon sarcopenia.J Am Med Dir Assoc 2011；12(4):249-256.)。在西方国家65岁以上的老年人群中，肌少症发病率在20％左右(Money JE Sarcopenia:diagnosis and treatment.JNutr Health Aging 2008；12(7):452-456.)。在肿瘤患者中，若综合肌肉质量和肌肉功能进行诊断，肌少症的发病率为12％～51％，若仅根据肌肉质量进行诊断，肌少症的发病率为11％～74％(Peterson SJ,Mozer M Differentiating Sarcopenia and Cachexia AmongPatients With Cancer.Nutr Clin Pract 2017；32(1):30-39.)。

肌少症根据发病原因可以分为原发性肌少症和继发性肌少症(Cruz-Jentoft AJ,Bahat G,Bauer J et al Sarcopenia:revised European consensus on definition anddiagnosis.Age Ageing 2018.)。原发性肌少症主要指与年龄增加相关的肌肉减少。继发性肌少症主要由系统性疾病(例如器官衰竭、恶性肿瘤等)、活动减少(例如久坐不动、疾病所致活动障碍或残疾等)、营养失调(例如缺乏不良、吸收障碍、厌食症、营养过剩、肥胖等)所引发的肌肉减少。此外，肌少症还可以分为急性肌少症和慢性肌少症，持续时间<6个月为急性肌少症，持续时间>6个月为慢性肌少症。急性肌少症通常与急性疾病或损伤相关，慢性肌少症通常与慢性进行性疾病相关。

肌少症的发病机制十分复杂，肠道菌群在其中起着重要作用。目前缺少关于肌少症患者的肠道菌群与肌少症的相关性报道，本申请的目的在于探讨肌少症患者中，肠道菌群与肌少症的关系，明确肠道菌群可以作为肌少症的生物标志物。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于发现与肌少症发生发展相关的肠道菌群，通过检测肠道菌群的丰度或者相对丰度，可以判断受试者是否患肌少症和/或患肌少症的风险。

本发明提供了微生物标志物在制备诊断肌少症的产品中的应用，所述微生物为Erysipelotrichaceae_UCG-003。

进一步，所述产品通过测定样本中的Erysipelotrichaceae_UCG-003的丰度来确定受试者是否患有肌少症。

进一步，所述试剂包括检测Erysipelotrichaceae_UCG-003的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。

进一步，所述的特异性引物是检测Erysipelotrichaceae_UCG-003 16S rRNA的引物。

本发明提供了一种利用微生物标志物Erysipelotrichaceae_UCG-003预测肌少症的系统，包括：

核酸样本分离单元，用于从检测对象中分离肠道菌群核酸样本；

测序单元，用于对分离的肠道菌群核酸样本进行测序，以获得测序结果；

数据处理单元，用于根据测序结果，对肠道菌群中的所述微生物标志物的相对丰度进行检测，将所得到的相对丰度值进行分析，得出上述微生物标志物的临界值；

结果判定单元，用于将数据处理单元得到的微生物标志物的临界值与设定诊断值进行比较。

本发明提供了一种诊断肌少症的产品，所述产品包括检测Erysipelotrichaceae_UCG-003丰度的试剂。

进一步，所述试剂包括检测所述Erysipelotrichaceae_UCG-003的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。

进一步，所述特异性的引物是能够检测所述Erysipelotrichaceae_UCG-00316SrRNA的引物。

本发明提供了Erysipelotrichaceae_UCG-003在构建预测肌少症的计算模型中的应用。

本发明提供了Erysipelotrichaceae_UCG-003在制备治疗肌少症的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括增加Erysipelotrichaceae_UCG-003丰度的试剂。

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了Erysipelotrichaceae_UCG-003与肌少症相关，其丰度在肌少症患者和健康人群中呈现显著性差异，ROC曲线分析其作为检测变量具有较高的特异性和敏感性，因此，可以将Erysipelotrichaceae_UCG-003作为检测靶标应用于肌少症患者的诊断。

附图说明

图1是Rank-Abundance曲线图；

图2是以Erysipelotrichaceae_UCG-003作为检测变量的ROC曲线图；

图3是Erysipelotrichaceae_UCG-003的差异情况图。

具体实施方式

为了评估肠道共生菌群组成能否作为肌少症的预测因子，本发明通过收集肌少症患者和健康人的样本，进行16S rRNA测序以及使用生物信息学进行测序数据的统计，发现与疾病相关的肠道菌群，将肠道菌群与疾病信息整合，最大程度预测肌少症患者。本发明通过16S rRNA测序，首次发现了Erysipelotrichaceae_UCG-003在肌少症患者和健康人中呈现显著性差异，说明Erysipelotrichaceae_UCG-003可作为肌少症的预测因子。

术语“生物标志物”应做广义理解，其包括任何能够反映异常状态的任何可检测生物指标，可以包含基因标志物、物种标志物(种标志物/属标志物)以及功能标志物。其中，基因标志物的含义并不局限于现有可以表达为且有生物活性的蛋白质的基因，还包括任何核酸片段，可以为DNA，也可以为RNA，可以是经修饰的DNA或者RNA，也可以为未经修饰的DNA或者RNA。特别地，本发明的生物标志物为微生物标志物。

根据本发明的实施例，分析肌少症的不同样本。基于高通量测序数据，对不同菌群在肌少症中的存在情况进行统计，从而确定与肌少症相关的肠道菌群和/或特异性序列。

作为一种优选的实施方案，包括以下步骤：

(1)样品的收集与处理：收集相关样本，使用试剂盒进行DNA提取，得到核酸样本；

(2)文库构建和测序：利用高通量测序进行DNA文库构建和测序，以便得到样本中所包含肠道微生物的核酸序列；

(3)通过生物信息学的分析方法确定肌少症相关的特异性肠道微生物核酸序列。

首先，获得所述个体的样本中的核酸序列的测序数据，所述测序数据包括多个读段；组装所述读段，获得基因集，所述基因集包括多个组装片段，所述基因集中的组装片段为非冗余序列；确定所述标志物中的各种微生物包含的组装片段；依据所述测序数据，分别确定所述基因集中的各个组装片段的丰度，其中包括，分别确定所述标志物中的各种微生物包含的组装片段的丰度；分别依据所述确定的组装片段的丰度，确定各种微生物的丰度。

在本发明中，测序依据所选的测序平台的不同，可选择但不限于半导体测序技术平台比如PGM，合成测序的技术平台比如Illumina公司的HISeq、Miseq序列平台以及单分子实时测序平台比如PaCBio序列平台。测序方式可以选择单端测序，也可以选择双末端测序，获得的下机数据是测读出来的片段，称为读段。

在本发明中，所称的组装可以利用已知序列组装方法或软件进行，例如利用SOAPdenovo、velvet等。

根据本发明的一个实施例，通过将基因集中的组装片段与微生物参考序列运用软件MetaGeneMark比对，依据与某种微生物参考序列的相似程度来判断组装片段是否来自该种微生物。所称参考序列指预先确定的序列，可以是预先获得的待测样本所属或者所包含的生物类别的任意参考模板，例如，若目标是待测样本中的微生物，参考序列可选择NCBI数据库中的各种微生物的参考基因组和或MetaHIT项目公开的DAcc肠道基因组，进一步地，也可以预先配置包含更多参考序列的资源库，例如依据待测样本来源的个体的状态、地域等因素选择或是测定组装出更接近的序列作为参考序列。根据本发明的一个实施例，确定肌少症标志物中的各种微生物包含的组装片段包括：将所述基因集中的组装片段分别与所述各种微生物的参考序列进行比对，确定与一种微生物的参考序列的相似性大于或者等于90％的组装片段来自该种微生物。

根据本发明的一个实施例，所称的分别依据所述确定的组装片段的丰度，确定所述肌少症标志物中的各种微生物的丰度的步骤中，微生物的丰度为该种微生物包含的所有组装片段的丰度的中位数或者平均数。

在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

探针通常被直接标记，例如用同位素、发色团、发光团、色原体，或被间接标记，例如用生物素，链霉亲和素复合物随后可以与生物素结合。因此，本发明测定中所用的可检测的标记可以是一级标记(其中该标记包含可直接检测的元件或能产生直接可检测的元件的元件)或二级标记(其中可检测的标记与一级标记结合，例如，免疫标记中常用的)。通常，标记的信号核酸用于检测杂交。可以通过常用于检测杂交多核苷酸存在的数种方法中的任一种标记互补的核酸或信号核酸。最常用的检测方法是利用用³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P标记的探针等的放射自显影法。其它标记包括，例如，能结合标记抗体的配体、荧光团、化学发光剂、酶以及能作为标记配体的特异结合对成员的抗体。

在作为探针使用的多核苷酸的大小优选为18个或更多个核苷酸、更优选为20个或更多个核苷酸，以及转录区域的全长或更少。作为引物使用时，该多核苷酸大小优选为18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。

在本发明中，术语“引物”表示寡核苷酸，不管是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下，即在存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶并在合适温度和pH下时它能作为合成起点。引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素，其中包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。

在本发明中，术语“抗体”以最广义使用，而且具体涵盖例如单克隆抗体，多克隆抗体，具有多表位特异性的抗体，单链抗体，多特异性抗体和抗体片段。此类抗体可以是嵌合的，人源化的，人的和合成的。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1筛选与肌少症相关的肠道菌群

1、研究对象和样本收集

收集11例肌少症以及60例健康人的粪便样本，患者资料统计如表1所示。

表1患者资料

2、16S rRNA测序

2.1 DNA的提取

使用基因组DNA提取试剂盒自样本中提取基因组DNA，操作步骤按说明书进行。

2.2 DNA样本纯度及浓度测定

利用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。

2.3 PCR扩增及产物纯化

按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物，或合成带有错位碱基的融合引物。

PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。

2.4 Miseq文库构建

连接“Y”字形接头，使用磁珠筛选去除接头自连片段，利用PCR扩增进行文库模板的富集，氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

2.5 Miseq测序

将DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上，另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”，PCR扩增，产生DNA簇，将DNA扩增子线性化成为单链，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸；统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

3、数据分析

3.1数据预处理

Miseq测序得到的是Pair-End(PE)双端序列数据，对测得的Fastq数据进行质控处理，最终得到优质的Fasta数据。

使用FLASH、Trimmomatic等软件对Miseq测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤；使用Vearch软件进行聚类操作，将序列按照彼此的相似性归为许多OUT，采用RDP classifier贝叶斯算法在97％的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析，并使用Silva数据库进行比对。

3.2肠道菌群物种差异分析

使用mothur软件的Metastats分析组间显著性差异，找出两组中具有显著差异的微生物类型，使用R及其qvalue包的Kruskal-Wallis秩和检验计算多组独立数据均值之间的差异，使用R及其stats包的Wilcoxon检验比较两个配对组之间的差异并分析这些差异，同时使用R的pROC分析绘制ROC曲线并计算其AUC面积。

4、结果

测序数据及OUT信息如表2所示，Case代表肌少症患者，CON代表健康对照。

物种多样性分析结果如图1所示，在水平方向，物种的丰度由曲线的宽度来反映，物种的丰度越高，曲线在横轴上的范围越大；曲线的形状(平滑程度)反映了样本中物种的均度，曲线越平缓，物种分布越均匀。

物种差异性分析结果显示Erysipelotrichaceae_UCG-003丰度水平显著降低(P＝0.002997)，以Erysipelotrichaceae_UCG-003作为检测变量，绘制ROC曲线以及计算其AUC值，结果如图2所示，显示AUC值为0.746，最佳临界值点的特异性为0.818，敏感性为0.633，提示以Erysipelotrichaceae_UCG-003作为检测变量具有较高的特异性和敏感性。

表2测序数据以及OUT数目统计

实施例2验证Erysipelotrichaceae_UCG-003与肌少症之间的相关性

1、研究对象和样本收集

按照实施例1的方式收集肌少症的样本11例以及健康人的样本72例，患者信息如表3所示。

表3患者信息

2、16S rRNA测序及数据分析同实施例1。

3、结果

结果如图3所示，Erysipelotrichaceae_UCG-003丰度水平显著降低(P＝0.004995)，ROC曲线显示，AUC值为0.703，最佳临界值的敏感度为0.909，提示Erysipelotrichaceae_UCG-003应用于肌少症的诊断具有较高的敏感性。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.微生物标志物在制备诊断肌少症的产品中的应用，其特征在于，所述微生物为Erysipelotrichaceae_UCG-003。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过测定样本中的Erysipelotrichaceae_UCG-003的丰度来确定受试者是否患有肌少症。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测Erysipelotrichaceae_UCG-003的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的特异性引物是检测Erysipelotrichaceae_UCG-003 16S rRNA的引物。

5.一种利用微生物标志物Erysipelotrichaceae_UCG-003预测肌少症的系统，其特征在于，包括：

核酸样本分离单元，用于从检测对象中分离肠道菌群核酸样本；

测序单元，用于对分离的肠道菌群核酸样本进行测序，以获得测序结果；

数据处理单元，用于根据测序结果，对肠道菌群中的所述微生物标志物的相对丰度进行检测，将所得到的相对丰度值进行分析，得出上述微生物标志物的临界值；

结果判定单元，用于将数据处理单元得到的微生物标志物的临界值与设定诊断值进行比较。

6.一种诊断肌少症的产品，其特征在于，所述产品包括检测Erysipelotrichaceae_UCG-003丰度的试剂。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂包括检测所述Erysipelotrichaceae_UCG-003的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述特异性的引物是能够检测所述Erysipelotrichaceae_UCG-003 16SrRNA的引物。

9.Erysipelotrichaceae_UCG-003在构建预测肌少症的计算模型中的应用。

10.Erysipelotrichaceae_UCG-003在制备治疗肌少症的药物组合物中的应用。

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