CN111727040A - 用于改善认知能力或认知功能的尿石素a和b的协同组合 - Google Patents

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CN111727040A CN201880089033.4A CN201880089033A CN111727040A CN 111727040 A CN111727040 A CN 111727040A CN 201880089033 A CN201880089033 A CN 201880089033A CN 111727040 A CN111727040 A CN 111727040A
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Abstract

任选地在营养组合物或药物组合物中，提供了一种以特别有效的比率的尿石素A(3,8‑二羟基‑二苯并‑α‑吡喃酮)和尿石素B(3‑羟基‑二苯并‑α‑吡喃酮)的协同组合。所述组合物用于在治疗认知缺陷中使用，包括增强认知功能或认知能力(益智活性)。所述组合物用于在治疗或预防人受试者的痴呆相关的障碍例如焦虑或阿尔茨海默病中使用，并用于抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)。

Description

用于改善认知能力或认知功能的尿石素A和B的协同组合
本申请要求于2018年2月19日提交的印度临时申请201841006173的优先权，将其通过引用结合于此。
技术领域
以特别有效的比率提供了尿石素A(3,8-二羟基-二苯并-α-吡喃酮)和尿石素B(3-羟基-二苯并-α-吡喃酮)的协同组合。本发明涉及组合使用尿石素A和尿石素B改善阿尔茨海默病的症状。本发明还涉及使用所述组合改善认知能力或认知功能的方法。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)被认为是与记忆力和认知衰退有关的最常见的痴呆形式。AD是一种进行性神经退行性障碍，其中痴呆症状经许多年逐渐恶化。
AD的生物化学标志包括淀粉样蛋白β(Aβ)肽寡聚物和可溶性过度磷酸化tau蛋白的积累。AD还伴随有易损神经元中胆碱能标记的丧失和晚期AD患者中基底前脑皮质胆碱能神经元的变性。记忆力减退和认知障碍与乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的变化密切相关。此外，AChE可以通过结合作为有效的淀粉样蛋白促进因子的淀粉样蛋白β相关蛋白来提高原纤化的速率。因此，胆碱能假说导致对于AD的临床有效治疗的发展。线粒体功能障碍也是认知衰退的一个因素。
有几种已批准的用于治疗这种疾病的药物，但仍然对有效的药物存在迫切需求。
3,8-二羟基-二苯并-α-吡喃酮(也称为尿石素A)和3-羟基-二苯并-α-吡喃酮(也称为尿石素B)是存在于喜来芝中的生物活性化合物，喜来芝来源于来自沉积岩的腐殖质。新研究表明，这些分子也是鞣花单宁的代谢物，所述鞣花单宁是由动物胃肠道中的微生物组产生的。如果发现一种方法可以有利地使用一种或多种尿石素来改善认知功能，或改善认知能力，甚至治疗认知缺陷，那么它将对营养或制药领域做出有价值的贡献。
发明内容
本文描述了对这些化合物的认知增强作用进行的数项研究，并且令人惊讶地发现，3,8-二羟基-二苯并-α-吡喃酮和3-羟基-二苯并-α-吡喃酮以特别的比率的组合对于抗乙酰胆碱酯酶活性具有协同效应，其进而转化为改善的认知能力(益智活性)和/或认知功能。
在一个实施例中，本发明描述了一种包含尿石素A和尿石素B的组合物，其中尿石素B与尿石素A的wt./wt.比率为从约0.2:1至约0.6:1。药物组合物或营养组合物可通过包括可接受的载体或赋形剂来制备。
在一个实施例中，药物组合物在用于治疗或预防人受试者中与痴呆相关的障碍(例如应激诱导的痴呆)的方法中使用。
与痴呆症相关的障碍可以包括但不限于焦虑或抑郁障碍、阿尔茨海默病或其他因衰老引起的认知障碍。所述组合物针对乙酰胆碱酯酶活性的抑制具有约0.05微克/ml至约0.06微克/ml的抑制浓度(IC50)。
附图说明
图1描绘了用喜来芝50mg/kg、尿石素B 50mg/kg和尿石素A 50mg/kg治疗21天后的呼吸控制比率(皮质脑线粒体中的RCR)。条表示组平均值±SEM(每组中n＝5)。
图2描绘了表示在年轻和年老小鼠中用喜来芝50mg/kg、尿石素B 50mg/kg和尿石素A 50mg/kg治疗21天后在脑皮质部分线粒体中线粒体呼吸的不同状态的典型柱状图。条表示组平均值±SEM(n＝5/组)。
图3描绘了表示在试验1中东莨菪碱(Sc)诱导在好奇行为变化中的影响的柱状图。所有值为平均值±SEM。
图4描绘了表示在试验2中东莨菪碱诱导在好奇行为变化中的影响的条形图。所有值为平均值±SEM。
图5描绘了表示对新环境的应对行为的柱状图。所有值为平均值±SEM。大鼠的应对行为以试验2期间花费在设备的新臂的时间的百分比表示。
图6描绘了表示在Y-迷宫中已知臂进入(％)相对于新臂进入(％)的数目以确定改变的臂辨别力(空间识别记忆)的柱状图。所有值为平均值±SEM。
图7描绘了表示根据标准方法(Ellman,G.L.等人,“A new and rapidcolorimetric determination of acetylcholinesterase activity[新型并快速比色测定乙酰胆碱酯酶活性]”,Biochemical Pharmacology[生化药理学](1961)7:88-95)进行的乙酰胆碱酯酶(“AChE”)酶促抑制测定的柱状图，其中将喜来芝(S)、尿石素B(B)和尿石素A(A)相比于对照进行了测试，并与多奈哌齐(D)进行了比较。值为平均值±SEM。
图8描绘了表示如图7中进行的乙酰胆碱酯酶(“AChE”)酶促抑制测定的柱状图。
图9A描绘了柱状图，所述柱状图说明通过测试化合物3(OH)-DBP(尿石素B:B)、3,8(OH)2-DBP(尿石素A:A)和喜来芝(分别表示为的化合物B、A和S)的不同化学计量组合在固定浓度的淀粉样蛋白β(10μM)情况下对Aβ40聚集体的抑制(通过ThT荧光强度定量)，所述ThT荧光强度以给定时间点(48h)在485nm处的相对荧光单位表示。将多奈哌齐(D)用作参考标准。所有值为平均值±SEM。
图9B描绘了柱状图，所述柱状图说明通过测试化合物3(OH)-DBP(尿石素B:B)、3,8(OH)2-DBP(尿石素A:A)和喜来芝(分别表示为的化合物B、A和S)的不同化学计量组合在固定浓度的淀粉样蛋白β(30μM)情况下对Aβ40聚集体的抑制(通过ThT荧光强度定量)，所述ThT荧光强度以给定时间点(48h)在485nm处的相对荧光单位表示。将多奈哌齐(D)用作参考标准。所有值为平均值±SEM。
图10描绘了表示如图7中进行的人重组乙酰胆碱酯酶(“AChE”)酶促抑制测定的柱状图。
图11描绘了表示使用Amplex Red试剂盒方法进行的人重组乙酰胆碱酯酶(“AChE”)酶促抑制测定的柱状图。
图12A描绘了柱状图，所述柱状图说明使用人重组AChE通过测试化合物3(OH)-DBP(尿石素B:B)、3,8(OH)2-DBP(尿石素A:A)和喜来芝(分别表示为的化合物B、A和S)的不同化学计量组合在固定浓度的淀粉样蛋白β(10μM)情况下对Aβ40聚集体的抑制(通过ThT荧光强度定量)，所述ThT荧光强度以给定时间点(48h)在485nm处的相对荧光单位表示。将多奈哌齐(D)用作参考标准。所有值为平均值±SEM。
图12B描绘了柱状图，所述柱状图说明使用人重组AChE通过测试化合物3(OH)-DBP(尿石素B:B)、3,8(OH)2-DBP(尿石素A:A)和喜来芝(分别表示为的化合物B、A和S)的不同化学计量组合在固定浓度的淀粉样蛋白β(30μM)情况下对Aβ40聚集体的抑制(通过ThT荧光强度定量)，所述ThT荧光强度以给定时间点(48h)在485nm处的相对荧光单位表示。将多奈哌齐(D)用作参考标准。所有值为平均值±SEM。
图13描绘了东莨菪碱诱导的失忆大鼠模型测试DBP(即3(OH)-DBP(尿石素B:B)、3,8(OH)2-DBP(尿石素A:A)及其组合)经八(8)天的协同效应的实验设计。
图14A描述了DBP(即3(OH)-DBP(尿石素B:B)、3,8(OH)2-DBP(尿石素A:A)及其组合)对东莨菪碱诱导的失忆大鼠模型测试的试验1期间东莨菪碱(Sc)诱导的总的臂进入改变的影响。所有值为平均值±SEM。
图14B描绘了如图14A中进行的测试的试验2。
图14C描述了DBP(即3(OH)-DBP(尿石素B:B)、3,8(OH)2-DBP(尿石素A:A)及其组合)对东莨菪碱诱导的失忆大鼠模型测试的试验2中东莨菪碱诱导的新环境应对行为改变的影响。所有值为平均值±SEM。
图14D描绘了在东莨菪碱诱导的失忆大鼠模型测试的Y-迷宫任务中东莨菪碱诱导的已知臂进入(％)相对于新臂进入(％)(以确定改变的臂辨别力(空间识别记忆))方面的改变的影响。所有值为平均值±SEM。
图15描绘了东莨菪碱诱导的记忆受损在被动回避测试中的影响。所有值为平均值±SEM。
图16描绘了使用Amplex Red测定试剂盒方法，东莨菪碱诱导的海马(HIP)组织中乙酰胆碱酯酶(AChE)活性改变的影响。所有值为平均值±SEM。
图17描绘了使用Amplex Red测定试剂盒方法，东莨菪碱诱导的HIP组织中乙酰胆碱(ACh)水平改变的影响。所有值为平均值±SEM。
具体实施方式
一方面，本发明证明了喜来芝及其化学成分在治疗、减轻或预防认知障碍(例如痴呆相关的病症、抑郁症和/或焦虑障碍)中的有用性。
喜来芝由已被与海洋生物和微生物代谢物混合的岩石层压缩的岩石腐殖质、岩石矿物质和有机物质组成。它从喜马拉雅山自1000-5000米的更高海拔范围处以黑色物质渗出岩石，被认为是印度传统医学体系阿育吠陀中的玛哈拉莎(maharasa)(超级活力剂(super-vitalizer))，可追溯到公元前3500年。喜来芝含有富里酸(作为主要成分)以及二苯并-α-吡喃酮(“DBP”)和二苯并-α-吡喃酮色蛋白。
喜来芝的两种主要DBP组成成分是3,8-二羟基-二苯并-α-吡喃酮(又称“尿石素A”，或“3,8-(OH)2-DBP”)和3-羟基-二苯并-α-吡喃酮(又称“尿石素B”或可替代地“3-(OH)-DBP”)。尿石素A和尿石素B均可购自Natreon公司(美国新泽西州新不伦瑞克省)。
源自喜来芝的富里酸复合物是天然存在的低分子量和中等分子量化合物的集合，所述化合物包含氧化的二苯并-α-吡喃酮(DBP)(既处于还原形式又处于氧化形式)作为中心核、和酰化的DBP和脂质作为部分结构单元、以及富里酸(“FA”)。来源于冲积源的富里酸复合物材料缺乏DBP；相反，冲积的富里酸的中心核由苯甲酸组成。
因此，喜来芝的活性成分含有二苯并-α-吡喃酮和相关代谢物、小肽(构成非蛋白质氨基酸)、一些脂质和载体分子(富里酸)。参见Ghosal,S.等人,“Shilajit Part 1-Chemical constituents[喜来芝部分1-化学成分]”J.Pharm.Sci.[药物科学杂志](1976)65:772-3；Ghosal,S.等人,“Shilajit Part 7-Chemistry of Shilajit,animmunomodulatory ayurvedic rasayana[免疫调节性阿育吠陀拉萨亚那(ayurvedicRasayana)喜来芝的化学成分]”Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学](IUPAC)(1990)62:1285-8；Ghosal,S.等人,“The core structure of Shilajit humus[喜来芝腐殖质的核心结构]”Soil Biol.Biochem.[土壤生物学生物化学](1992)23:673-80；以及美国专利号6,440,436和6,869,612(以及其中引用的参考文献)；全部通过引用结合于此。
喜来芝(例如Prima
Figure BDA0002624910150000061
)在阿育吠陀中广泛用于各种临床状况。几个世纪以来，生活在喜马拉雅山和毗邻地区的偏远村庄中的人们单独使用喜来芝，或与其他植物疗法组合使用，以预防和抵抗糖尿病问题(Tiwari,V.P.等人,“An interpretation ofAyurvedica findings on Shilajit[阿育吠陀关于喜来芝的解释]”J.Res.IndigenousMed.[本土药物研究杂志](1973)8:57)。此外，作为抗氧化剂，它还可以防止细胞毒性氧自由基对胰岛细胞的损伤(Bhattacharya S.K.“Shilajit attenuates streptozotocininduced diabetes mellitus and decrease in pancreatic islet superoxidedismutase activity in rats[喜来芝在大鼠中减弱链脲佐菌素诱导的糖尿病并降低胰岛超氧化物歧化酶的活性]”Phytother.Res.[植物疗法研究](1995)9:41-4；BhattacharyaS.K.,“Effects of Shilajit on biogenic free radicals[喜来芝对生物自由基的影响]”Phytother.Res.[植物疗法研究](1995)9:56-9；以及Ghosal,S.,等人,“Interactionof Shilajit with biogenic free radicals[喜来芝与生物自由基的相互作用]”IndianJ.Chem.[印度化学学会杂志](1995)34B:596-602)。已经提出糖尿病期间葡萄糖、脂肪和蛋白质代谢的紊乱导致高脂血症的发展。在一项研究中，喜来芝对大鼠的脂质分布产生了显著的有益影响(Trivedi N.A.等人,“Effect of Shilajit on blood glucose and lipidprofile in alloxan-induced diabetic rats[喜来芝对四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠的血糖和脂质分布的影响]”Indian J.Pharmacol.[印度药理学杂志](2004)36(6):373-376)。
如所讨论的，喜来芝已经被用于治疗各种疾病。还建议将其作为行为表现增强剂。据报道，富里酸(FA)在植物、动物以及人的生物系统中引发许多重要作用，包括：(a)改善矿物质和营养素的生物利用度，(b)作为电解质，(c)包括重金属在内的有毒物质的排毒，(d)作为抗氧化剂，以及(e)改善免疫功能。此外，已经假设二苯并-α-吡喃酮参与线粒体内的电子传递，从而促进了更多ATP的产生，导致能量增加。
一方面，本发明证明了3-羟基-二苯并-α-吡喃酮(3-OH-DBP)、3,8-二羟基-二苯并-α-吡喃酮(3,8-(OH)2)或其组合在治疗患有各种认知缺陷或认知能力或功能衰退的人个体中的有用性。
为了评估3,8-二羟基-二苯并-α-吡喃酮(尿石素A)、3-羟基-二苯并-α-吡喃酮(尿石素B)和喜来芝的抗衰老作用，进行了以下研究：
研究1：实验药物对年轻及年老小鼠线粒体生物能学和功能的影响；
研究2：实验药物对大鼠中东莨菪碱诱导的痴呆的影响；
研究3：3,8-二羟基-二苯并-α-吡喃酮(尿石素A)和3-羟基-二苯并-α-吡喃酮(尿石素B)及其以不同比率的组合对体外乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响。
实例1(研究1)
1.研究1的目标：研究实验药物对年轻及年老小鼠线粒体生物能学及功能。
1.1.所述研究的实验设计示于表1中。
表1
Figure BDA0002624910150000081
2.材料与方法
2.1.化学品
喜来芝、尿石素B和尿石素A由Natreon公司(美国新泽西州新不伦瑞克省)提供。甘露醇、蔗糖、牛血清白蛋白(BSA)购自海美迪私人有限公司(HiMedia Pvt Ltd.)(印度孟买)。EGTA、HEPES钾盐、无水磷酸二氢钾(KH2PO4)、MgCl2、苹果酸盐、丙酮酸盐、ADP、琥珀酸盐、寡霉素、羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)和鱼藤酮购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯)。
3.线粒体生物能学评估
3.1.线粒体分离
按照先前描述的方法(Berman,S.B.,Hastings,T.G.,“Dopamine oxidationalters mitochondrial respiration and induces permeability transition in brainmitochondria[多巴胺氧化改变线粒体呼吸并诱导脑线粒体的通透性转换]”J.Neurochem.[神经化学杂志](1999)73:1127-1137)并进行一些细微修改(Samaiya,P.K.,Krishnamurthy,S.“Characterization of mitochondrial bioenergetics in neonatalanoxic model of rats[大鼠新生缺氧模型中线粒体生物能学的特征化]”J.Bioenerg.Biomembr.[生物能与生物膜杂志](2015)47:217-222)通过标准差速离心从小鼠脑皮质进行线粒体的分离。简而言之，将脑解剖并在分离缓冲液(由215mM甘露醇、75mM蔗糖、0.1％w/v的牛血清白蛋白、20mM HEPES缓冲液和1mM EGTA组成，在100ml蒸馏水中，并将pH用KOH调节至7.2)中均质化并首先在1300g下离心3min。将上清液作为S1储存，并如上将沉淀物再次离心以收集S2。将S1和S2混合，然后将每个上清液用含有EGTA的分离缓冲液加在上面，并在4℃下以14,000×g离心10min，以获得更紧密的线粒体沉淀物。接下来，通过将沉淀物悬浮在不含EGTA的分离缓冲液中并再次以14,000×g离心10min以从沉淀物中去除EGTA来进行洗涤步骤。使用酶标仪(伯腾公司(BioTek)，美国)(Lowry,O.H.等人,“Proteinmeasurement with the Folin phenol reagent[用Folin苯酚试剂进行蛋白质测量]”J.Biol.Chem.[生物化学杂志](1951)193:265-275)比色估算线粒体蛋白。
3.2.线粒体功能的测量
如前所述(Samaiya和Krishnamurthy，2015)，在37℃的密封恒温控制室(英国诺福克汉莎公司)中，用微型Clark型电极对线粒体呼吸进行了评估。简而言之，将线粒体添加到室中，并通过合适的底物和抑制剂评估呼吸状态。将纯化的线粒体蛋白悬浮于呼吸缓冲液中，最终体积为250μL。通过添加丙酮酸盐/苹果酸盐(P/M)以基础呼吸速率开始状态II呼吸。通过添加ADP来开始状态III呼吸；高水平的氧气利用率表明ADP已转化为ATP。通过添加寡霉素来测量状态IV。由于ATP合酶被关闭并且不允许电子返回基质，所以呼吸恢复到基础速率。由于损失的质子回到基质中，电子传递链(ETC)继续仅维持线粒体膜电位。通过添加FCCP来测量状态V。这表示最大的呼吸速率，从而导致ETC与ATP合成的解偶联，并允许质子冲回到基质中。然后添加鱼藤酮以关闭复合物I驱动的呼吸。通过添加琥珀酸盐确定状态V(琥珀酸盐)。因为系统中存在FCCP，所以这是经由复合物II的最大呼吸速率。通过将分离的线粒体对状态III呼吸的响应(存在ADP)的斜率除以对状态IV呼吸的响应(存在1lM寡霉素和不存在ADP)的斜率来计算呼吸控制率(RCR)(Samaiya和Krishnamurthy，2015年)。
4.结果与讨论
图1中示出了喜来芝、尿石素B和尿石素A对年轻和年老小鼠线粒体生物能学(RCR)的影响。双因素ANOVA的统计分析表明，组内(行因子)[F(3,32)＝13.16,P<0.05]和组间(列因子)[F(1,32)＝212.20,P<0.05]的RCR存在显著差异。邦费罗尼事后检验显示，RCR随年龄显著降低。与年轻大鼠相比，年老大鼠具有更低的RCR。这表明，年老大鼠的线粒体生物能学有显著的折损。喜来芝、尿石素B和尿石素A(50mg/kg)显著增加了年老小鼠的RCR，这表明这些化合物可以改善年老大鼠紊乱的线粒体生物能学。此外，甚至接受治疗的年轻大鼠中的RCR也有显著增加，这表明这些化合物可以分别用作食物补充剂并且也可以用作与衰老相关的障碍中的药物；然而，在21天的治疗期间，年轻和年老小鼠的线粒体功能均得到改善。
图2中示出了喜来芝、尿石素B和尿石素A(50mg/kg)对年轻和年老小鼠线粒体呼吸不同状态的影响。双因素ANOVA表明，组内(行因子)[F(4,80)＝7.5,P<0.05]和组间(列因子)[F(4,28)＝335,P<0.05]的不同状态中存在显著差异。邦费罗尼事后分析表明，与正常对照组小鼠及其各自组相比，在21天的治疗期间，喜来芝、尿石素B和尿石素A(50mg/kg)在所有状态下均显示线粒体呼吸显著增加。
衰老很可能是由于对体细胞成分未修复的的损伤的积累所致。已经提出在正常的氧化磷酸化过程中产生的自由基是造成细胞损伤的主要来源，而在50多年前首先提出衰老的自由基理论(Harman,D.“Ageing:a theory based on free radical and radiationchemistry[衰老：基于自由基和放射化学的理论]”J.Gerontol.[老年医学杂志](1956)11:298-300)。根据一项报道了细胞中的大多数ROS产生来自线粒体(Chance,B.等人,“Hydroperoxide metabolism in mammalian organs[哺乳动物器官中的过氧化氢代谢]”Physiol.Rev.[生理学评论](1979)59:527-605.)的研究提出了衰老的线粒体理论(J.Am.Geriatr.Soc.[美国老年学会杂志](1972)20:145-147.)。本文所述的实例参照以下药物在21天的治疗日程期间在50mg/kg剂量下在体重10-15gm的年轻(6至8周)小鼠和体重20-25克的年老(18至20个月)小鼠中的线粒体功能评估了抗衰老作用。随后，通过状态III除以状态IV呼吸速率来计算呼吸控制率(RCR)。(Gilmer,L.K.等人，“费舍尔344大鼠中大脑皮质线粒体呼吸和氧化损伤的与年龄相关的改变”Mech.Ageing Dev.[衰老与发育机制](2010)131:133-143)。在实验日程的21天中，发现剂量为50mg/kg的喜来芝、尿石素B和尿石素A改善了线粒体复合物酶活性、线粒体呼吸速率并延缓年轻小鼠的衰老并降低年老小鼠的衰老速率。
状态II呼吸描绘了底物丙酮酸盐/苹果酸盐为线粒体电子传递链(ETC)提供燃料的消耗，并且在以50mg/kg剂量下的喜来芝、尿石素B和尿石素A治疗的年轻小鼠(与年轻对照小鼠相比)中观察到呼吸速率显著增加。发现在50mg/kg剂量下的喜来芝、尿石素B和尿石素A治疗的年老小鼠(与老年对照小鼠相比)中的呼吸速率也增加。然而，用这三种化合物治疗的年老小鼠的呼吸速率增加比用相同化合物治疗的年轻小鼠呼吸速率的增加更显著。分离的线粒体中的状态III是具有高外部(体外线粒体)ADP、低外部ATP/ADP比和高(没有Ca2+情况下的分离的线粒体的最大值)耗氧量和ATP合成的状态(Chance B.,Williams G.R.,“Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation I.Kinetics of oxygenutilization[氧化磷酸化中的呼吸酶I.氧气利用的动力学]”Journal of BiologicalChemistry.[生物化学杂志](1955)Nov 1；217(1):383-94；和Chance B.,Williams G.R.,“The respiratory chain and oxidative phosphorylation[呼吸链和氧化磷酸化]”Adv.Enzymol.[酶学进展](1956)17:65-134)。通过添加ADP来开始状态III呼吸。在这项研究中，还发现状态III的呼吸与状态II相同。另一方面，状态IV被定义为具有非常高的ATP/ADP比、非常低的ADP、无ATP合成和仅对应于质子泄漏的耗氧量的状态(Groen,A.R.等人,“Quantification of the contribution of various steps to the control ofmitochondrial respiration[定量各种步骤的贡献以控制线粒体呼吸]”J.Biol.Chem.[生物化学杂志](1982)257:2754-2757；Hafner,R.P.等人,“Analysis of the control ofrespiration rate,phosphorylation rate,proton leak rate and proton motiveforce in isolated mitochondria using the‘top-down’approach of metaboliccontrol theory[使用代谢控制理论的‘自上而下’方法对分离的线粒体中的呼吸速率、磷酸化速率、质子泄漏速率和质子动力的控制的分析]”Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志](1990)188:313-319；Schild,L.,Gellerich F.N.,“Effect of the extramitochondrialadenine nucleotide pool size on oxidative phosphorylation in isolated ratliver mitochondria[线粒体外腺嘌呤核苷酸库大小对分离的大鼠肝脏线粒体中氧化磷酸化的影响]”Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志](1988)252:508-512；和Wanders,R.J.A.,等人,“Factors determining the relative contribution of the adenine-nucleotidetranslocator and the ADP-regenerating system to the control of oxidativephosphorylation in isolated rat-liver mitochondria[决定腺嘌呤核苷酸转运子和ADP再生系统对分离的大鼠肝脏线粒体中氧化磷酸化控制的相对贡献的因素]”Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志](1984)142:417-424)。通过使用寡霉素(ATP合酶抑制剂)在年轻和年老组小鼠中均发现了状态IV呼吸的增加；但是在年老小鼠中，这种呼吸速率增加的作用比年轻小鼠更为突出。此外，在50mg/kg剂量下的喜来芝在状态IV呼吸中也显示出显著作用。状态IV呼吸的增加可能是由于线粒体内膜的损伤(其导致更多的质子泄漏到基质中)所致。这导致失去最大的需要与ATP的产生偶联的质子梯度。由于状态IV呼吸指示出质子动力与ATP产生的偶联相对于维持基础代谢率的程度，因此氧气利用率的增加指示出ETC与ATP产生的解偶联。(参见Samaiya和Krishnamurthy，2015年)。随后添加温和的解偶联剂FCCP(状态V)使ETC从氧化磷酸化脱离。这决定了ETC在试图恢复耗散的质子梯度时的最大呼吸能力(Benz,R.,McLaughlin,S.,“The molecular mechanism of action of theproton ionophore FCCP(carbonylcyanideptrifluoromethoxyphenylhydrazone)[质子离子载体FCCP(碳酰氰对三氟甲氧基苯腙)的分子作用机理]”Biophys.J.[生物物理学杂志](1983)41:381-398)。由于线粒体不能克服此影响并无法维持呼吸(由于复合物I功能的丧失)，发现在用喜来芝、尿石素B和尿石素A治疗的年轻小鼠中处于状态V下的呼吸速率(复合物I)显著增加。然而，尿石素B在此状态下的作用较小，可能是由于它作为状态V的解偶联剂(复合物I)的作用。在年老小鼠中，所有这三种药物均显示出呼吸速率增加。添加鱼藤酮(其作为阻断复合物I驱动的呼吸的竞争性抑制剂)后，添加琥珀酸盐以确定复合物II驱动的呼吸是否受衰老影响。在年老组小鼠中观察到复合物-II状态V呼吸有显著损失，而在年轻小鼠中则没有。此结果表明复合物-II对年老小鼠的敏感性。RCR是状态III与状态IV呼吸的比率，并且它是线粒体完整性的量度(Gilmer L.K.等，2010)。发现在年轻和年老实验小鼠中，在全部三种以50gm/kg剂量的药物中，RCR均有显著增加。从以上结果可以得出结论，实验药物在年轻和年老小鼠中均证明了改善的生物能学。
5.结论
在本研究的基础上，在50mg/kg(小鼠体重)剂量下的喜来芝、尿石素B和尿石素A改善了年轻和年老小鼠中线粒体的生物能学和功能。
实例2(研究2)
1.研究2的目标：评估实验药物对大鼠东莨菪碱诱导的痴呆的影响。
2.方法
2.1.药物。实验药物：3-OH-DBP(尿石素B)、3,8-(OH)2-DBP(尿石素A)和喜来芝购自Natreon公司(美国新泽西州新不伦瑞克省)。
2.2.动物受试者。近交的Charles-Foster雄性白化病大鼠(130-180g)获得自印度北方邦瓦拉纳西的贝拿勒斯印度大学(BHU)的医学科学研究所(IMS)中央动物馆。证实这些不含病原体，并将其随机分配到不同的实验组中。将大鼠在25℃±1℃的环境温度和45％-55％RH下以12-h光照/黑暗周期(光照时间为7:00-19:00h)圈养在分间动物舍中。这些动物能够自由随意获取标准的颗粒饲料和自来水。实验在9:00和14:00之间进行。在光照阶段期间完成行为测试。将动物分组圈养，并且在将它们用于实验前使其适应环境至少一周。将动物在用深色布覆盖的笼中运输到实验室。实验程序符合国立卫生研究院关于实验动物护理和使用指南(National Institutes of Health Guide for Care and Use of LaboratoryAnimals)。
2.3.药物治疗。
通过口胃管用悬浮于0.3％羧甲基纤维素(CMC)中的实验药物(10、25和50mg/kg每天一次)对大鼠进行口服预治疗七天。治疗一直持续到实验程序结束(Singh,G.K.,Garabadu,D.,Muruganadam,A.V.,Joshi,V.K.,Krishnamurthy,S.,“Antidepressantactivity of Asparagus racemosus in animal models of depression[芦笋在抑郁症动物模型中的抗抑郁活性]”Pharmacol.Biochem.Behav.[药理学生物化学与行为学](2009)91(3):283-90)。将东莨菪碱溶解于注射用水中，并在药物治疗施用一小时后的第7天施用。将多奈哌齐(5mg/kg；i.p.)用作标准药物。在第8天进行行为实验。处死动物，并使用大鼠脑图谱的坐标对海马体进行显微解剖。所有对照组动物均用0.3ml与实验药物体积相等的媒介物(0.3％CMC悬浮液)进行治疗(Ohja，R.等人,“Asparagus recemosus enhances memoryand protects against amnesia in rodent models[芦笋在啮齿动物模型中增强记忆力并防止失忆]”Brain Cogn.[大脑和认知](2010)Oct；74(1):1-9)。
2.4.实验方法
通过Y-迷宫测试评估空间识别记忆、一般探索行为和焦虑样行为。Y-迷宫由三个类似的长50cm、宽16cm、高32cm的臂组成。在第一试验中，新臂被阻塞，并且允许动物在其他两个臂中移动15分钟。在第二试验中，打开新臂，并且在第一试验4h后允许动物在所有三个臂中移动5分钟。所有臂中的进入总数(在试验1和试验2的5分钟内)表明一般探索态度(好奇)。在试验2的5分钟内，已知臂和新臂中的进入百分比被认为是空间识别记忆的量度。通过试验2期间花费在新臂上的时间与花费在所有臂和设备中央上的时间的比率的百分比，来估计对新环境的应对策略。对新环境的应对行为降低被认为是焦虑样行为的增加(Krishnamurthy,S.等人,“Risperidone ameliorates post-traumatic stressdisorder-like symptoms in modified stress re-stress model[利培酮改善了改良的应激又应激模型中的创伤后应激障碍样症状]”Neuropharmacology[神经药理学](2013)75:62-77)。
3.结果和讨论
A.3-OH-DBP(尿石素B)和3,8-(OH)2-DBP(尿石素A)对Y-迷宫测试中好奇行为的影响。
图3和图4示出了试验1和试验2中进入的总数，即，经受Y-迷宫测试的大鼠的好奇行为。统计分析表明，分别在试验1和试验2中的组[F(9,59)＝10.63p<0.05]、[F(9,59)＝7.984,p<0.05]之间存在显著差异。单因素ANOVA之后进行施图登特-纽曼-柯尔斯(Student-Newman-Keuls)测试。施图登特-纽曼-柯尔斯检验表明，与对照组大鼠相比，施用东莨菪碱导致好奇行为的显著减少。然而，在试验1和试验-2中，在50mg剂量下的3-OH-DBP和在50mg剂量下的3,8-(OH)2-DBP减弱了东莨菪碱诱导的好奇行为的减少。
B.3-OH-DBP(尿石素B)和3,8-(OH)2-DBP(尿石素A)对Y-迷宫测试中对新环境的应对行为的影响。
图5示出了试验2期间以花费在设备的新臂的时间的百分比表示的大鼠的应对行为。统计分析表明，组[F(9,59)＝11.53,p<0.05]之间存在显著差异。单因素ANOVA之后进行施图登特-纽曼-柯尔斯(Student-Newman-Keuls)测试。施图登特-纽曼-柯尔斯检验表明，与对照组大鼠相比，东莨菪碱治疗组动物的应对行为有显著损失。在50mg剂量下的3-OH-DBP和在50mg剂量下的3,8-(OH)2-DBP减弱了东莨菪碱诱导的对新环境的应对策略的降低。
C.Y-迷宫测试中3-OH-DBP(尿石素B)和3,8-(OH)2-DBP(尿石素A)对臂辨别行为改变的影响。
Y-迷宫试验中东莨菪碱诱导7天后对空间记忆受损的影响描绘于图6中。通过双因素ANOVA进行的统计分析表明，组[F(9,100)＝0.072,p<0.05]之间已知臂和新臂进入的％存在显著差异。双因素ANOVA之后进行邦费罗尼-事后检验。事后分析表明，东莨菪碱治疗的大鼠中，已知臂和新臂进入的％分别显著增加和减少。与东莨菪碱治疗的大鼠相比，50mg剂量下的3-OH-DBP和50mg治疗剂量下的3,8-(OH)2-DBP各自剂量依赖性的逆转了Y-迷宫测试范例中已知臂和新臂进入的％。
4.总结与结论
东莨菪碱控制减少了Y-迷宫中总的臂进入，这表明动物的探索行为发生了异常改变，因此提供了认知缺陷的哺乳动物模型。探索行为被认为是啮齿动物在新环境中的生存本能。动物试图收集关于其周围环境对于潜在威胁和物质收益的信息。威胁与收益之间的平衡影响探索行为。这种动机行为可能会因内部生理变化或外部因素(例如压力)而改变。在本研究中，东莨菪碱通过下调胆碱能系统来改变这种行为。多奈哌齐(一种抗胆碱酯酶药物)可能通过增加乙酰胆碱的突触可用性来逆转这种活性。不受本公开中的理论的束缚，据信DBP(即尿石素A和B)和喜来芝通过相同的原理均减弱了东莨菪碱诱导的探索行为的改变。DBP的治疗剂量可靠地逆转了Y-迷宫测试中已知臂和新臂进入，这表明东莨菪碱诱导的空间记忆受损的减弱。此外，东莨菪碱治疗导致了以花费在新环境的时间表示的应对行为的显著损失，这表明焦虑样行为。DBP减弱了东莨菪碱诱导的对新环境的应对策略的降低。因此，DBP在Y-迷宫范例中清楚地证明了抗焦虑活性(Krishnamurthy,S.,Garabadu,D.,Joy,K.P.“Risperidone ameliorates post-traumatic stress disorder-like symptomsin modified stress re-stress model[利培酮改善了改良的应激又应激模型中的创伤后应激障碍样症状]”Neuropharmacology[神经药理学](2013)75:62-77；和Tripathi,A.,Paliwal,P.,Krishnamurthy,S.“Piracetam Attenuates LPS-InducedNeuroinflammation and Cognitive Impairment in Rats[吡拉西坦减弱了LPS诱导的大鼠神经炎症和认知障碍]”Cellular and Molecular Neurobiology[细胞与分子神经生物学],(2017)1-14)。因此，DBP改善了认知缺陷，并在东莨菪碱诱导的痴呆模型中表现出抗焦虑活性。值得注意的是，DBP的作用为在50mg/kg剂量，而喜来芝为在100mg/kg剂量。因此，在以上观察到的药理作用中，DBP的效力似乎是喜来芝的两倍。
实例3(研究3)
1.研究3的目标：评估尿石素B(B)和尿石素A(A)及其以不同比率的组合对体外乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响(Ellman,G.L.等人,“A new and rapid colorimetricdetermination of acetylcholinesterase activity[新型并快速比色测定乙酰胆碱酯酶活性]”Biochemical Pharmacology[生化药理学](1961)7:88-95。确定DBP对AChE活动的协同效应。
喜来芝、尿石素B(B)和尿石素A(A)由Natreon公司(美国新泽西州新不伦瑞克省)提供。来自电鳗(Electrophorus electricus)(electric eel(电鳗))CAS:9000-81-1的AchE购自西格玛奥德里奇公司(美国密苏里州圣路易斯)。5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB-Ellman试剂)和乙酰胆碱碘化物(AChI)购自当地供应商(印度新德里的海美迪私人有限公司)。所有其他化学药品和试剂商购自当地供应商(新德里的默克私人有限公司(Merck Pvt.Ltd.)和印度新德里的海美迪实验室私人有限公司(HiMedia LaboratoriesPvt Ltd.))购得，并且均为分析级。
经过一些修改后，使用Ellman等人描述的程序用于AChE抑制测定。乙酰硫胆碱碘化物(ATCI)、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB-Ellman试剂)购自海美迪公司。将多奈哌齐用作阳性对照。使用Tris-HCl缓冲液(pH 8)进行体外测定。在50mg/ml下确定抑制百分比以决定IC50测定的浓度范围。使用了测试化合物B(3-OH-DBP)：测试化合物A(3,8(OH)2DBP)的五个不同的组合浓度范围，并且比率为：用测试化合物B(10、20、30、40、50mg)改变测试化合物A(50mg)的浓度以确定IC50。在室温下，将50μL的AChE(0.22U mL-1)和10μL的测试化合物或标准化合物在96孔板中孵育30min(参见表3)。
此外，添加底物，即ATCI(15mM，30μL)，并再将其孵育30min。最后添加160μL(1.5mM)DTNB，并使用Epoch酶标仪(伯腾公司(BioTek))在415nm处记录吸光度。使用从测试化合物和标准化合物获得的吸光度计算IC50值。一式三份并以三个独立的运行进行测定。
抑制百分比＝(对照-测试)/对照×100 方程(1)
1.1.所述研究的实验设计示于表2中。
表2
样品编号 分组 IC<sub>50</sub>(μg/ml)
1 对照 0.0000±0.0000
2 多奈哌齐 0.0366±0.0094
3 喜来芝 0.6030±0.0441
4 尿石素B(B) 0.1430±0.0057
5 尿石素A(A) 0.1793±0.0092
6 10:50B:A 0.0459±0.0079
7 20:50B:A 0.0546±0.0080
8 30:50B:A 0.0575±0.0089
9 40:50B:A 0.1036±0.0119
10 50:50B:A 0.1260±0.0188
2.结果
如表2中所示和图7中所描绘的，组合剂量10:50、20:50和30:50示出了效果比3,8(OH)2DBP高约4倍的IC50值，比3-OH-DBP高3倍。将多奈哌齐用作参考标准，其IC50值大约类似于10:50、20:50和30:50。喜来芝具有效果比10:50低20倍的IC50值，比3-OH-DBP低8倍，比3,8(OH)2DBP低5倍。喜来芝的IC50值的效果比多奈哌齐低25倍。这些数据表明3-OH-DBP和3,8(OH)2DBP在10:50、20:50和30:50浓度下显示出协同效应。
此外，表2证明，与单独的每种组分相比，尿石素B与尿石素A的特定比率出乎意料地具有约三倍至四倍的AChE抑制活性增加。与已知的处方药多奈哌齐相比，尿石素B与尿石素A的这种协同组合具有几乎相似的活性。
表3示出了如本文所述的尿石素B与尿石素A的某些有利和有效的组合，这反映了表2的组合和比率。预期了其他有效浓度范围。
表3
尿石素B(B)(以mg/ml计) 尿石素A(A)(以mg/ml计)
10 50
20 50
30 50
40 50
50 50
在一个实施例中，尿石素B与尿石素A的组合可以制备为药物或营养配制品。示例性尿石素B与尿石素A的wt./wt.比率可以在从约0.2:1至约1:1的范围内。在一个优选的实施例中，尿石素B与尿石素A的wt./wt.比率可以在从约0.2:1至约0.6:1的范围内。
根据如本文所述的实例，在人受试者中，尿石素B和尿石素A的前述一种或多种协同组合的日剂量可以在约1.5mg/kg至约8.0mg/kg的范围内。在另一个实施例中，在人受试者中的日剂量可以在约1.5mg/kg至约10.0mg/kg的范围内。
在一个实施例中，在人受试者中，尿石素B和尿石素A的前述一种或多种协同组合的日剂量可以在约100mg至约1000mg的范围内。在一个优选的实施例中，在人受试者中，尿石素B和尿石素A的前述一种或多种协同组合的日剂量可以在约100mg至约500mg的范围内。
进一步预期，当在哺乳动物受试者中以相当的剂量范围进行时，研究3中观察到的协同将以在研究1和2中相似的方式展现。进一步期望，在治疗或预防人受试者的痴呆相关的障碍的方法中或在治疗或预防人受试者的焦虑障碍的方法中将观察到尿石素B/尿石素A协同作用。
实例4
在一个实施例中，此研究的目的是通过使用Ellman(1961)方法来评估以各种组合的喜来芝与DBP对乙酰胆碱酯酶活性的体外协同效应。化学试剂和起始原料如实例3中以及AChE抑制测定中使用。
如下制备测试化合物尿石素A、尿石素B和喜来芝的五种不同组合。如表4中所示，将测试化合物A(50mg)和喜来芝(50mg)的浓度与不同浓度的测试化合物B组合以确定IC50值。在室温下，将50μL的AChE(0.22U mL-1)和10μL的测试化合物或标准化合物在96孔板中孵育30min。
表4
Figure BDA0002624910150000201
此外，添加底物，即ATCI(15mM，30μL)，并再将其孵育30min。最后添加160μL(1.5mM)DTNB，并使用Epoch酶标仪(伯腾公司(BioTek))在415nm处记录吸光度。使用从测试化合物和标准化合物获得的吸光度计算IC50值。一式三份进行测定(参见方程1)。结果示于下表5中。
表5
Figure BDA0002624910150000211
总之，喜来芝与DBP的50:10:50的组合剂量显示出效果比喜来芝高约1.5倍的IC50值，但比3-OH-DBP低3.5倍，比3,8(OH)2DBP低3倍。将多奈哌齐用作参考标准，其IC50值的效果比50:10:50高约12倍。结果表明，喜来芝干扰DBP的抗胆碱酯酶活性。
实例5
在另一个实施例中，此研究的目的是通过使用ThT(硫黄素-T)方法来评估以各种组合的喜来芝与DBP(尿石素A和B)对大鼠乙酰胆碱酯酶诱导的β-淀粉样蛋白聚集的体外协同效应。如上使用化学试剂和起始原料。
AChE诱导的β-淀粉样蛋白肽聚集抑制测定
Aβ1-40(一种无序的肽)折叠成有序的β折叠结构，并进一步自组装形成有毒的纤维状聚集体。这些纤维状聚集体在引发AD中观察到的症状中起关键作用。抑制纤维状聚集体的形成(即纤维化)被认为是开发用于AD的有效治疗剂的最突出方法之一。
进行了3-OH-DBP(尿石素B:B)和3,8-(OH)2-DBP(尿石素A:A)对Aβ1-40的聚集倾向和(硫黄素-T)ThT测定测量值的影响。ThT是一种分子染料，当与完全形成的Aβ1-40聚集体结合时其显示出最大的荧光。因此，进行ThT测定以研究3-(OH)-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)对Aβ1-40的纤维化的影响。
将测试化合物溶解于DMSO(5％)中，并进一步用0.215M磷酸钠缓冲液(pH 7.4)稀释。将Aβ1-40(10μM和30μM)单独并分别地与表6和7中所示的比率的不同浓度的测试化合物孵育。
表6示出了Aβ1-40(10μM)与DBP的组合比率以及喜来芝与DBP的组合比率，如下。
表6
Figure BDA0002624910150000221
其中，B＝3-(OH)-DBP A＝3,8-(OH)2-DBP，S＝喜来芝
表7示出了Aβ1-40(30μM)与DBP的组合比率以及喜来芝与DBP的组合比率，如下。
表7
样品号 测试化合物 浓度比率(μM)
1 Aβ<sub>1-40</sub> 30
2 Aβ<sub>1-40</sub>:多奈哌齐 30:50
3 Aβ<sub>1-40</sub>:喜来芝 30:50
4 Aβ<sub>1-40</sub>:B 30:50
5 Aβ<sub>1-40</sub>:A 30:50
6 Aβ<sub>1-40</sub>:(B:A) 30:(10:50)
7 Aβ<sub>1-40</sub>:(B:A) 30:(30:50)
8 Aβ<sub>1-40</sub>:(B:A) 30:(50:50)
9 Aβ<sub>1-40</sub>:(S:B:A) 30:(50:10:50)
10 Aβ<sub>1-40</sub>:(S:B:A) 30:(50:50:50)
其中，B＝3-(OH)-DBP A＝3,8-(OH)2-DBP，S＝喜来芝
在不同比率的测试化合物存在下，将2μL不同浓度的Aβ40(10和30μM)与16μL AChE一起孵育，以获得最终浓度的30或10μM Aβ40，230μM AChE，10、20、50μM测试化合物和2μL分析缓冲液(体积22μL)。将混合物在室温黑暗中孵育24或48小时(时间段可以根据实验而改变)。
在抑制剂存在下、不存在抑制剂以及空白或溶剂对照的情况下，获得了Aβ40聚集的荧光强度。孵育后，添加178μL的20μM ThT。在442或450nm激发和490或483nm发射波长(总体积200μL)下读取溶液的荧光强度。
如下计算AChE诱导的Aβ1-40聚集的抑制百分比。
Figure BDA0002624910150000231
其中-IFi和IFo是分别在存在和不存在抑制剂的情况下获得的Aβ和AChE的荧光强度(Shidore,M.等人,“Benzylpiperidine-linked diarylthiazoles as potential antiAlzheimer agents:Synthesis and biological Evaluation[苄基哌啶连接的二芳基噻唑作为潜在的抗阿尔茨海默病试剂：合成与生物学评估]”J.Med.Chem.[药物化学杂志](2016)59:5823-5846)。
ThT溶液(100μM)的制备：将0.32mg ThT溶解于10ml超纯H2O中，直至获得无颗粒溶液。将溶液使用0.22-μm PES注射器过滤器进行过滤。
Aβ40储备液的制备：将Aβ40肽(0.25mg)(卡比化学公司(Calbiochem)，默克公司(Merck))溶解于六氟-2-丙醇(HFIP，0.2mL)中，并在室温下孵育1h。然后通过氮气流除去HFIP，并在真空下进一步干燥。使用1450cm-1M-1的摩尔消光系数通过UV-可见光谱(美国伯腾公司(BioTek)；酶标仪)在276nm下测定Aβ40肽的浓度。然后将经HFIP处理的Aβ40溶解于10mM PBS缓冲液中，以得到在pH 7.4时浓度为200mM。一式三份并以三个独立的运行进行测定。
多奈哌齐、喜来芝、3-OH-DBP(尿石素B:B)和3,8-(OH)2-DBP(尿石素A:A)分别抑制淀粉样蛋白β(10μM)聚集约79％、21％、50％和35％。接下来，研究了不同浓度的3-OH-DBP(B)(10、30和50μM)和固定浓度的3,8-(OH)2-DBP(A)(50μM)对Aβ40(10μM)聚集的影响。组合10:50(B:A)对Aβ40聚集具有有效作用。10:50(B:A)浓度显示出ThT荧光降低，这对应于72％的Aβ40聚集抑制，比3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)分别高出22％和38％；但比标准药物多奈哌齐低7％。另一方面，60％的Aβ40聚集被30:50(B:A)抑制，这比3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)分别高出约10％和20％；但比多奈哌齐低20％。此外，研究了将喜来芝添加至DBP的组合中。添加喜来芝降低了DBP组合对淀粉样蛋白β聚集的抑制百分比(图9A)。
此外，将以上浓度比率的测试化合物与固定浓度的Aβ40(30μM)一起孵育。多奈哌齐、喜来芝，3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)分别将淀粉样蛋白β聚集抑制约65％、10％，41％和32％。10:50(B:A)浓度在降低ThT荧光方面显示出更高效力，这对应于58％的Aβ40聚集抑制，比3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)分别高出17％和26％，但比标准多奈哌齐低7％。如上，添加喜来芝降低了DBP的抑制(图9B)。
这些数据表明，在固定比率下的测试化合物3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2DBP(A)的组合在抑制β淀粉样蛋白(10μM，30μM)聚集方面显示出协同效应。
以上研究表明，在通过ThT方法进行的淀粉样蛋白β聚集测定中，10:50μM(尿石素B:尿石素A)浓度显示出更高的协同效应。因此，将此组合用于人胆碱酯酶测定的进一步研究。
实例6
在另一个实施例中，此研究的目的是通过Ellman(1961)方法来评估DBP(尿石素A和B)和以各种组合的喜来芝与DBP对重组人乙酰胆碱酯酶的体外协同效应。
体外人重组AChE抑制测定：经过一些修改后，使用Ellman等人描述的程序用于AChE抑制测定。人重组AChE购自西格玛奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)。乙酰硫代胆碱碘化物(ATCI)、5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB-Ellman试剂)购自海美迪私人有限公司(印度新德里)。将多奈哌齐用作阳性对照组。使用Tris-HCl缓冲液(pH 8)进行体外测定。在50mg/ml下确定抑制百分比以决定IC50测定的浓度范围。制备了测试化合物B(3-OH-DBP):测试化合物A(3,8-(OH)2-DBP)的不同的组合。
使用各种浓度的测试化合物B(10、30、50mg/ml)和以50mg/ml固定浓度的测试化合物A和喜来芝(分别示于表8和9中)以确定IC50。在室温下，将50μL的人重组AChE(0.22U mL-1)和10μL的测试化合物或标准化合物在96孔板中孵育30min。
表8示出了DBP(尿石素B:尿石素A)的组合比率，如下。
表8
测试化合物B(以mg/ml计) 测试化合物A(以mg/ml计)
10 50
30 50
50 50
表9示出了喜来芝与DBP(尿石素B:尿石素A)的组合比率，如下。
表9
喜来芝(mg/ml) 测试化合物B(以mg/ml计) 测试化合物A(以mg/ml计)
50 10 50
50 30 50
50 50 50
此外，添加底物，即ATCI(15mM，30μL)，并再将其孵育30min。最后添加160μL(1.5mM)DTNB，并使用Epoch酶标仪(伯腾公司(BioTek))在415nm处记录吸光度。使用从测试化合物和标准化合物获得的吸光度计算IC50值。一式三份并以三个独立的运行进行测定(参见方程1)。
通过Ellman方法研究了不同浓度的尿石素B(10、30和50mg/ml)和固定浓度的尿石素A(50mg/ml)对体外AChE活性的影响(图10和表10)。统计分析表明，组[F(9,29)＝54.93p<0.05]之间存在显著差异。3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)的组合的IC50值；10:50(B:A)当与30:50(B:A)、50:50(B:A)、50:10:50(喜来芝:尿石素B:尿石素A)、50:50:50(喜来芝:尿石素B:尿石素A)相比时有统计学差异。组合药物10:50(B:A)具有较低的IC50值。此外，10:50(B:A)和标准多奈哌齐的IC50值之间没有显著差异。
表10示出了尿石素A、尿石素B及其组合的乙酰胆碱酯酶抑制活性(IC50)。
表10
Figure BDA0002624910150000261
Figure BDA0002624910150000271
其中，B＝3-(OH)-DBP A＝3,8-(OH)2-DBP，S＝喜来芝
总之，组合剂量10:50(B:A)示出了效果比3,8(OH)2DBP(A)高约10倍的IC50值，并且效果比3-OH-DBP(B)高7倍；而30:50(B:A)效果分别比3,8(OH)2DBP(A)和3-OH-DBP(B)高约2倍和1.5倍。50:50(B:A)和30:50(B:A)的IC50值大致相同。多奈哌齐的作用大致类似于10:50(B:A)的作用。与DBP及其组合相比，喜来芝显示出效果更低的IC50值。这些数据表明3-OH-DBP(B)和3,8(OH)2DBP(A)的组合在10:50(B:A)浓度下显示出更高的协同效应。因此，通过使用人重组AChE用Amplex Red试剂盒方法将此浓度进行进一步研究。
实例7
在另一个实施例中，此研究的目的是通过使用Amplex Red-荧光试剂盒方法来评估DBP(尿石素A和B)和以各种组合的喜来芝与DBP对重组人乙酰胆碱酯酶的体外协同效应。人重组AChE购自西格玛奥德里奇公司(美国密苏里州圣路易斯)。Amplex red试剂盒购自赛默飞世尔科技印度公司(Thermo-Fisher Scientific India)，参考编号：A12217。所有其他化学药品和试剂商购自当地供应商(新德里的默克私人有限公司(Merck Pvt.Ltd.)和印度新德里的海美迪实验室私人有限公司(HiMedia Laboratories Pvt Ltd.))购得，并且均为分析级。
通过Amplex Red试剂盒方法进行体外人重组AChE抑制测定：通过使用Amplex red分析试剂盒(美国分子探针公司(Molecular Probes,Inc.,USA))测量实验药物的抗胆碱酯酶活性。在每种实验药物存在下，从商购试剂盒(Amplex Red，英杰公司(Invitrogen)，赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)进行荧光测定用于筛选人AChE活性。通过添加一系列试剂盒酶(包括胆碱氧化酶(CO)、辣根过氧化物酶(HRP))和荧光底物Amplex Red将乙酰胆碱(AChE催化的产物)转化为称为试卤灵的荧光。由于荧光分子试卤灵取决于乙酰胆碱的产生，而乙酰胆碱的产生是AChE催化的产物，因此荧光变化速率是AChE活性的量度。与不含抑制剂的对照相比，有效的AChE抑制剂会显著降低荧光。简而言之，所有试剂均根据商购试剂盒(Amplex Red，英杰公司)来制备。设计以下程序用于与荧光多孔板扫描仪一起使用。在96孔板中进行测定，其中每孔160μL总液体体积。在实验条件下进行96孔，其中使用40μLAmplex Red溶液(400μM Amplex Red溶液含有2U/mL HRP、0.2U/mL胆碱氧化酶，这是通过添加200μL Amplex Red试剂储备溶液、100μL HRP储备溶液、100μL胆碱氧化酶(CO)储备溶液和9.6mL的1X反应缓冲液)，80μL的人重组AChE(0.22U/ml)和1.6μL的不同浓度的尿石素B(10、30、50mg/ml)与以50mg/ml固定浓度的尿石素A和任选地与以50mg/ml的喜来芝以测定IC50(分别如上表8和9中所示)。此外，将40μL的40μM底物乙酰胆碱溶液移液到每个孔中。
表示100％人重组AChE活性(0％人AChE抑制)的阳性对照孔含有乙酰胆碱和Amplex Red溶液。阴性对照孔含有乙酰胆碱和Amplex Red溶液。此外，仅将Amplex Red溶液的对照用作另外的阴性对照。在对照孔中，必要时添加1X反应缓冲液以使孔达到标准体积。在基线(将底物添加到每个孔后立即)以及在37℃下孵育60分钟后进行荧光测量。使用在530-560nm范围内的激发并在590nm处检测到的发射来测量荧光酶标仪。计算AChE、CO和HRP的抑制百分比，从实验组荧光中减去平均阴性对照荧光，并且除以平均阳性对照荧光。从100％减去活性百分比得出人AChE的抑制百分比。
表11示出了尿石素A、尿石素B及其组合的人重组乙酰胆碱酯酶抑制活性(IC50)。
表11
样品编号 浓度比率 IC<sub>50</sub>(μg/ml)
1 对照 0.00±0.00
2 多奈哌齐 82.80±25.86
3 3-OH-DBP(B) 412.00±28.28
4 3-8-(OH)<sub>2</sub>-DBP(A) 528.00±70.71
5 喜来芝 876.13±47.23
6 10:50(B:A) 74.33±21.14
7 30:50(B:A) 284.40±52.46
8 50:50(B:A) 358.00±50.74
9 50:10:50(S:B:A) 710±75.30
10 50:50:50(S:B:A) 750.00±60.17
其中，B＝3-(OH)-DBP A＝3,8-(OH)2-DBP，S＝喜来芝
如上表11中所示，组合剂量10:50(B:A)示出了效果比3,8-(OH)2-DBP(A)高约7倍的IC50值，并且效果比3-OH-DBP(B)高6倍；而30:50(B:A)的效果分别比3,8-(OH)2-DBP(A)和3-OH-DBP(B)高约2倍和1.5倍。30:50(B:A)和50:50(B:A)的IC50值大致相同。多奈哌齐的作用大致类似于10:50(B:A)的作用。与DBP及其组合相比，喜来芝显示出效果更低的IC50值。这些数据表明3-OH-DBP(B)和3,8(OH)2DBP(A)的组合在10:50(B:A)浓度下显示出更高的协同效应。因此，将此组合用于人AChE诱导的淀粉样蛋白β聚集的进一步研究。
实例8
在另一个实施例中，此研究的目的是通过使用ThT(硫黄素-T)方法来评估以各种组合的喜来芝与DBP(尿石素A和B)对重组人乙酰胆碱酯酶诱导的β-淀粉样蛋白聚集的体外协同效应。如上使用化学试剂和起始原料。
人重组乙酰胆碱酯酶酶诱导的β-淀粉样蛋白肽聚集抑制测定
重复实例5的程序(除了使用人重组AChE)，其中测试化合物的浓度分别如表6和7中所示。
多奈哌齐、喜来芝、3-OH-DBP(尿石素B:B)和3,8-(OH)2-DBP(尿石素A:A)分别抑制淀粉样蛋白β(10μM)聚集约71％、16％、46％和34％。接下来，研究了不同浓度的3-OH-DBP(B)(10、30和50μM)和固定浓度的3,8-(OH)2-DBP(A)(50μM)对Aβ40(10μM)聚集的影响。10:50(B:A)浓度显示出ThT荧光降低，这对应于67％的Aβ40聚集抑制，比3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)分别高出21％和33％；但比标准药物多奈哌齐低4％。另一方面，50％的Aβ40聚集被30:50(B:A)抑制，这比3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)分别高出约4％和16％；但比标准药物多奈哌齐低21％。此外，研究了将喜来芝添加至DBP的组合中。添加喜来芝降低了DBP组合对淀粉样蛋白β聚集的抑制百分比(图12A)。
此外，将以上浓度比率的测试化合物与固定浓度的Aβ40(30μM)一起孵育。多奈哌齐、喜来芝，3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)分别将淀粉样蛋白β聚集抑制约64％、4.2％，43％和30％。10:50(B:A)浓度在降低ThT荧光方面显示出更高效力，这对应于60％的Aβ40聚集抑制，比3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)分别高出17％和30％，但比标准药物多奈哌齐低4％。如上，添加喜来芝降低了DBP的抑制(图12B)。
这些数据表明，仅仅在固定比率下的测试化合物3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2DBP(A)的组合在抑制β淀粉样蛋白(10μM，30μM)聚集方面显示出协同效应。
以上研究表明，在通过ThT方法进行的淀粉样蛋白β聚集测定中，10:50μM(尿石素B：尿石素A)浓度显示出更高的协同效应。因此，将此组合用于体外东莨菪碱诱导的失忆模型情况下的进一步研究。
实例9
DBP及其组合对东莨菪碱诱导的失忆大鼠模型的体内协同效应。
氢溴酸东莨菪碱购自西格玛公司(美国密苏里州圣路易斯)，而盐酸多奈哌齐作为印度海得拉巴Hetero药物有限公司捐赠的礼品样品获得。
根据实验室动物护理原则进行实验。雄性Wistar大鼠(200-250g)购自印度瓦拉纳西的贝拿勒斯印度大学(BHU)的医学科学研究所中央动物馆。印度瓦拉纳西BHU的机构动物伦理委员会批准了动物实验。将动物在温度25℃±1℃和45％-55％相对湿度以及12:12h的光照/黑暗周期的受控环境条件下圈养在聚丙烯笼子中。在实验期间，实验动物能够自由随意获取商业大鼠饲料和水。在将动物用于实验之前，使其适应新环境至少一周，并且仅暴露于实验一次。
将大鼠随机分配到八个研究组中，每组含有六只(n＝6)，如下：
组1：媒介物组：接受0.3％CMC；
组2：东莨菪碱组(1mg/kg i.p.)；
组3：多奈哌齐(3mg/kg)+东莨菪碱(1mg/kg i.p)组；
组4：喜来芝(50mg/kg)+东莨菪碱(1mg/kg i.p.)组；
组5：3-OH-DBP(尿石素B:B)(50mg/kg)+东莨菪碱(1mg/kg i.p.)组；
组6：3,8-(OH)2-DBP(尿石素A:A)(50mg/kg)组+东莨菪碱(1mg/kg i.p.)组；
组73-OH-DBP(B)(10mg/kg):3,8-(OH)2-DBP(A)(50mg/kg)+东莨菪碱(1mg/kgi.p)；
组8：3-OH-DBP(B)(50mg/kg):3,8-(OH)2-DBP(A)(50mg/kg)+东莨菪碱(1mg/kgi.p)。
将药物溶液在0.3％CMC中新鲜制备，并且通过口服管饲法每天施用一次，持续7天。简而言之，整个实验进行了8天。将东莨菪碱(1mg/kg)(毒蕈碱受体拮抗剂)溶解于生理盐水(0.9％NaCl)中，并第7天在药物施用后1h腹膜内施用。
按照实例9A和9B进行行为测试。
实例9A
通过Y-迷宫测试范例评估短期记忆。通过遵循标准方案(Dellu,F.,Mayo,W.,Cherkaoui,J.,Le Moal,M.,Simon,H.,“A two-trial memory task with automatedrecording:study in young and aged rats[具有自动记录的两次试验记忆任务：对年轻和年老大鼠进行研究]”Brain Res.[大脑研究](1992)588:132-139)进行Y-迷宫测试基本上是为了评估空间识别记忆、一般探索行为和焦虑样行为。Y-迷宫设备由三个相同的臂(长50cm，宽16cm，高32cm)组成，彼此成120°角，从中心点放射出去。将由彩色建筑纸和实验室玻璃器皿制成的视觉提示放置在迷宫的周边周围和黑色有机玻璃侧面的顶部上方，并且每次测试不重复这些提示以保持对动物的新奇性。Y-迷宫的新臂被阻塞，并且允许大鼠探访迷宫的其他两个臂15min。第一阶段后四小时，动物能够自由接近所有三个臂5min。在5min的时间内记录每个臂中的进入数目。测量了因变量，例如所有臂(试验1和2的5分钟内)中进入的总数目，试验2的5min时间内已知臂和新臂中的进入％以及在试验2期间花费在新臂的时间与花费在所有臂和设备中央的时间的比率的百分比。所有臂(在试验1和2的5分钟内)的总进入数目表明一般探索态度(好奇)，并且在试验2的5分钟内已知臂相对于新臂的进入％被认为是臂辨别力(空间识别记忆)的量度。通过试验2期间花费在新臂上的时间与花费在所有臂和设备中央上的时间的比率的百分比，来估计对新环境的应对策略或行为。对新环境的应对行为的减少被认为是焦虑样行为的增加。当头部和两个前爪位于臂内时，则计数为臂进入，而当头部和两个前爪再次位于臂外时，则臂探访的时间结束。
DBP(尿石素A和B)及其组合对Y-迷宫测试中认知和好奇行为的影响：图14A和图14B分别描绘了尿石素B:3-OH-DBP(50mg/kg口服)、尿石素A:3,8-(OH)2-DBP(50mg/kg口服)、多奈哌齐(3mg/kg口服)、喜来芝(50mg/kg口服)和组合B:A(10:50mg/kg口服)与B:A(50:50mg/kg口服)对试验1和试验2中东莨菪碱(Sc)诱导的一般探索行为(好奇)的改变的影响。施图登特-纽曼-柯尔斯检验表明，与媒介物组大鼠相比，施用东莨菪碱导致好奇行为的显著减少。然而，3-OH-DBP(B)50mg/kg口服和3,8-(OH)2-DBP(A)50mg/kg口服剂量减弱了试验1和试验2中东莨菪碱诱导的好奇行为的减少。值得注意的是，组合B:A(10:50mg/kg口服)和B:A(50:50mg/kg口服)以类似于标准多奈哌齐的方式减弱了东莨菪碱诱导的好奇行为的减少。此外，与在试验1和试验2中单独使用DBP相比，以组合形式的DBP显著增加了好奇行为。25mg/kg b.i.d剂量的喜来芝不能有效减弱试验1和试验2中东莨菪碱诱导的好奇行为的减少。
DBP及其组合对Y-迷宫中新环境应对行为的影响：图14C示出了试验2期间以花费在设备的新臂的时间的百分比表示的大鼠的应对行为。统计分析表明，组[F(7,47)＝21.73,p<0.05]之间存在显著差异。施图登特-纽曼-柯尔斯检验表明，与媒介物组大鼠相比，东莨菪碱治疗组动物的应对行为有显著损失。然而，在50mg/kg口服剂量下的3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)减弱了东莨菪碱诱导的新环境应对策略的减少，但并不类似于媒介物组。值得注意的是，组合B:A(10:50mg/kg口服)和B:A(50:50mg/kg口服)减弱了东莨菪碱诱导的应对策略减少，这类似于媒介物和标准多奈哌齐组。
DBP及其组合对Y-Maze测试中空间识别记忆的影响：在图14D中描绘了实验药物对东莨菪碱诱导的空间识别记忆的改变的协同效应。双因素ANOVA表明，在Y-迷宫测试范例中，试验2期间各组([F(7,80)＝0.098；P<0.05])之间、已知臂和新臂([F(1,80)＝107；P<0.05])之间的臂辨别行为存在显著差异，并且组与臂([F(7,80)＝24；P<0.05])之间存在显著的相互作用。事后分析显示，与媒介物组相比，东莨菪碱诱导的组未能区别出已知臂相对于新臂的臂进入百分比，这表明空间识别记忆受损。在50mg/kg剂量下的3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)显著逆转了东莨菪碱诱导的失败的辨别行为，但不类似于媒介物组。值得注意的是，组合B:A(10:50mg/kg口服)和B:A(50:50mg/kg口服)通过增加新环境中臂进入的百分比而显著减轻了东莨菪碱诱导的空间识别记忆受损。值得注意的是，在已知臂和新臂进入方面，媒介物、多奈哌齐和组合B:A(10:50mg/kg口服)和B:A(50:50mg/kg口服)之间没有显著差异。
实例9B
被动回避(PA)测试：PA任务是一项用于评估CNS障碍的啮齿动物模型的学习和记忆的恐惧加剧的测试。在此测试中，受试者学习避免其中在先前递送厌恶刺激(例如足部电击)的环境。动物可以自由探索室的明亮和黑暗隔间，并在隔间的一侧递送温和的足部电击。动物最终通过不进入暗室来学习避免足部电击。简而言之，逐步式被动回避设备由一个透明塑料制成的亮室(20cm×20cm×30cm)和一个其壁由深色不透明塑料制成的暗室(20cm×20cm×30cm)组成。两个室的地板均由相隔1cm的不锈钢棒(直径3mm)组成。使用电机发生器使暗室的地板带电。矩形开口(6cm×8cm)位于两个室之间，并且可以用不透明的闸门关闭。在第七天施用东莨菪碱或媒介物后三十分钟，将大鼠置于明亮的隔间中使其经受PA测试。30s的适应期后，闸门打开并在大鼠进入黑暗隔间后自动关闭。受试者在黑暗的隔间中受到了低强度的足部电击(0.5mA；10s)。记录动物从一个隔间到另一个隔间的转移，并以秒为单位计算转移等待时间(TLT)。试验持续270s。第一试验用于习得，并在第一试验后24h进行的第二试验中测试保留。保留试验中未递送电击以避免重新习得。将学习标准作为与习得试验相比保留试验的TLT增加。
DBP及其组合对被动回避任务的影响。
图15中描绘了3-OH-DBP(B)(50mg/kg)和3,8-(OH)2-DBP(A)(50mg/kg)对被动回避任务中在药物治疗日程的第7天东莨菪碱诱导的保留和回忆的改变的影响。双因素ANOVA的统计分析表明，治疗组[F(7,80)＝13,p<0.05]与时间[F(1,80)＝443,p<0.05]之间的转移等待期存在显著差异以及组与时间([F(7,80)＝18.8；P<0.05])之间的相互作用。事后分析表明，八组之间在习得试验(TLa)期间的转移等待期没有显著差异。但是在保留试验中，观察到与媒介物组相比东莨菪碱治疗组中转移等待期(TLr)显著降低，这表明学习和记忆受损。如保留试验的TLT与采集试验相比没有显著增加所显示的，习得试验前30min施用东莨菪碱导致了记忆受损。如与习得试验相比保留试验的TLT显著增加所显示的，用在50mg/kg剂量下的3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)治疗7天预防了东莨菪碱诱导的大鼠痴呆，但与媒介物治疗组相比效果较差。值得注意的是，与习得试验相比，组合B:A(10:50mg/kg口服)和B:A(50:50mg/kg口服)通过增加保留试验的TLT而显著减轻了东莨菪碱诱导的学习和记忆受损，这类似于媒介物组。此外，与3-OH-DBP(B)、3,8-(OH)2-DBP(A)和标准多奈哌齐相比，B:A(10:50mg/kg口服)和B:A(50:50mg/kg口服)在保留试验中显著增加了转移等待期，因此表明有协同效应。此外，如与习得试验相比保留试验中的TLT没有显著增加，但与东莨菪碱治疗组相比保留试验中的TLT显著增加所显示的，在25mg/kg b.i.d剂量下的喜来芝导致了记忆受损。
根据实例9C和9D评估乙酰胆碱能系统。
实例9C
样品制备：通过斩首处死动物，并在冰冷的条件下解剖脑组织，并储存在-80℃下直至使用。用Potter-Elvehjem匀浆器将组织在1.0ml的0.1M高氯酸中均质化。将匀浆在聚丙烯管中保持15分钟，然后添加40μl的4M乙酸钾以将pH调节至4.0，然后在4000×g下离心15min。将上清液用于估计乙酰胆碱和AChE活性。
乙酰胆碱酯酶活性的荧光分光光度测定：使用Amplex Red分析试剂盒(美国分子探针公司)测量脑组织中的乙酰胆碱酯酶活性。将乙酰胆碱酯酶标准曲线在每个实验中使用。简而言之，通过添加0.1ml的对照(10μM H2O2)开始反应，并将组织匀浆放入两个单独的聚丙烯管中，然后将0.1ml的400μM Amplex Red试剂(含有2U/mL HRP、0.2U/mL胆碱氧化酶和100μM乙酰胆碱)的工作溶液添加到每个管中。孵育45min后，借助于分光荧光计在530nm激发和590nm发射波长下记录荧光。使用标准方案(Lowry,O.H.,Rosebrough,N.J.,Farr,A.L.,Randall,R.J.,“Protein measurement with the Folin phenol reagent[用Folin苯酚试剂进行蛋白质测量]”J.Biol.Chem.[生物化学杂志](1951)193:265-275)来确定蛋白质含量。
统计分析：结果表示为平均值±标准误差平均值(SEM)。通过单因素ANOVA之后通过施图登特-纽曼-柯尔斯检验进行测量组间变化。然后采用双因素随后邦费罗尼检验以发现Y-迷宫测试中的组间变化，其中将组和臂作为两个独立变量。通过使用Graph Pad prism版本5(加利福尼亚州圣地亚哥)完成统计分析。接受p<0.05的水平为统计上显著。
测试了尿石素B:3-OH-DBP(50mg/kg口服)、尿石素A:3,8-(OH)2-DBP(50mg/kg口服)、多奈哌齐(3mg/kg口服)、喜来芝(25mg/kg，一日两次，口服)以及DBP组合对东莨菪碱诱导的HIP匀浆中乙酰胆碱酯酶活性的改变的影响(参见图16)。单因素ANOVA表明脑区域([F(7,23)＝25.76,p>0.05])之间的乙酰胆碱酯酶活性存在显著差异。施图登特-纽曼-柯尔斯检验表明，与媒介物组相比，施用东莨菪碱导致乙酰胆碱酯酶活性显著增加。然而，在50mg/kg剂量下的3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)减弱了脑区域之间的东莨菪碱诱导的乙酰胆碱酯酶活性的增加，但在媒介物组情况下是统计上显著的。将多奈哌齐用作参考标准，其可显著逆转东莨菪碱诱导的增加的乙酰胆碱酯酶活性，与3-OH-DBP(B)50mg/kg组相似。3,8-(OH)2-DBP(A)-50mg/kg组不如3-OH-DBP(B)50mg/kg有效。然而，东莨菪碱诱导的乙酰胆碱酯酶活性的增加被以组合形式的DBP逆转，并相似于媒介物组。有趣的是，发现B:A(10:50mg/kg口服)比多奈哌齐更有效。B:A(50:50mg/kg口服)也逆转了东莨菪碱诱导的增加的乙酰胆碱酯酶活性，但当与多奈哌齐相比时在统计学上不显著。另外，在25mg/kg b.i.d剂量下的喜来芝不能有效减弱HIP组织中东莨菪碱诱导的乙酰胆碱酯酶活性的增加。
实例9D
如实例9C中制备样品。使用Amplex red分析试剂盒(美国分子探针公司)测量脑组织中乙酰胆碱的量。将乙酰胆碱标准曲线在每个实验中使用。简而言之，通过添加0.1ml的对照(10μM H2O2)开始反应，并将组织匀浆放入两个单独的聚丙烯管中，然后将0.1ml的400μM Amplex Red试剂(含有2U/mL HRP、0.2U/mL胆碱氧化酶和1U/mL乙酰胆碱酯酶)的工作溶液添加到每个管中。孵育45min后，借助于分光荧光计在530nm激发和590nm发射波长下记录荧光。使用标准方案确定蛋白质含量(Lowry等人，1951)。
统计分析：结果表示为平均值±标准误差平均值(SEM)。通过单因素ANOVA之后通过施图登特-纽曼-柯尔斯检验进行测量组间变化。然后采用双因素随后邦费罗尼检验以发现Y-迷宫测试中的组间变化，其中将组和臂作为两个独立变量。通过使用Graph Pad prism版本5(加利福尼亚州圣地亚哥)完成统计分析。接受p<0.05的水平为统计上显著。
测量了DBP及其组合对海马乙酰胆碱(ACh)水平的影响。
单因素ANOVA表明脑区域([F(7,23)＝25.76,p>0.05])之间的ACh水平存在显著差异。施图登特-纽曼-柯尔斯检验表明，与媒介物组大鼠相比，施用东莨菪碱导致ACh水平显著降低(参见图17)。然而，3-OH-DBP(B)(50mg/kg)和3,8-(OH)2-DBP(A)(50mg/kg)剂量减弱了脑区域之间的东莨菪碱诱导的ACh水平的降低，但在媒介物组情况下是统计上显著的。基于多奈哌齐的ACh水平与3-OH-DBP(B)(50mg/kg)组相同。观察到多奈哌齐治疗与3,8-(OH)2-DBP(A)50mg/kg组之间存在显著差异。然而，东莨菪碱诱导的ACh水平的降低被组合B:A(10:50mg/kg口服)和B:A(50:50mg/kg口服)逆转，这类似于多奈哌齐和媒介物组。此外，喜来芝50mg/kg剂量不能有效减弱HIP组织中的东莨菪碱诱导的ACh水平的降低。
先前的研究已证明，东莨菪碱(1mg/kg i.p)导致了脑功能障碍，并导致学习和记忆受损(Ohja,R.等人，2010)。本文观察到东莨菪碱导致了Y-迷宫任务中和被动回避任务中的记忆受损，这两者均被认为分别涉及学习和记忆的空间和保留以及回忆方面。
结果的显著发现表明，东莨菪碱导致Y-迷宫范例中行为指标的数目变化发生改变，所述指标像一般探索态度(好奇)，对新环境的应对行为(焦虑样行为)以及试验2中已知臂相对于新臂的进入％(空间识别记忆)以解决任务(Joshi,R.等人,“Silibininameliorates LPS-induced memory deficits in experimental animals[水飞蓟宾改善实验动物中LPS诱导的记忆缺陷]”Neurobiology of learning and memory[学习与记忆的神经生物学](2014)12月；116:117-313；和Tripathi,A.等人,2017)。这些结果表明东莨菪碱已减少了好奇行为，这表明短期记忆受损。3-OH-DBP(B)(50mg/kg)和3,8-(OH)2-DBP(A)(50mg/kg)减弱了试验1和试验2中东莨菪碱诱导的好奇行为的减少。值得注意的是，DBP组合B:A(10:50mg/kg口服)和B:A(50:50mg/kg口服)减轻了试验1和试验2中东莨菪碱诱导的好奇行为的减少，这类似于多奈哌齐。此外，喜来芝50mg/kg确实改变了好奇行为，但不如DBP的组合改变显著。
此外，东莨菪碱减少了Y-迷宫任务中对新环境的应对策略，并缩短了被动回避测试中的保留试验期间的转移等待期。这些结果表明，东莨菪碱导致焦虑样行为的增加(Y-迷宫任务)，并减弱了被动回避任务中的保留和回忆能力或学习能力。
喜来芝改变了应对行为和转移等待期，但不如多奈哌齐有效。3-OH-DBP(B)(50mg/kg)和3,8-(OH)2-DBP(A)(50mg/kg)比喜来芝更显著地逆转了东莨菪碱诱导的减少的应对行为和转移等待期(保留试验)。然而，最值得注意的是，与喜来芝和单独DBP相比，以组合形式的DBP显著减轻了东莨菪碱诱导的应对行为和转移等待期的减少。研究期间，另一个值得注意的事实是，被动回避反应可以受到疼痛阈值或恐惧的影响。此外，还已知隔膜中的病损导致恐惧状况受损以及防御和攻击的增加。这些发现指出了东莨菪碱诱导的被动回避反应受损的可能性是由于疼痛阈值或恐惧的改变。
此外，确定了在Y-迷宫任务中东莨菪碱诱导了空间识别记忆的减少。这些发现表明东莨菪碱降低了在试验2中的臂辨别力，这表明短期记忆受损。在50mg/kg剂量下的3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)逆转了东莨菪碱诱导的空间识别记忆的降低。最值得注意的是，以组合形式的DBP通过增加新环境中臂进入的百分比而显著减轻了东莨菪碱诱导的空间识别记忆受损。
值得注意的是，与3-OH-DBP(B)(50mg/kg口服)和3,8-(OH)2-DBP(A)(50mg/kg口服)相比，组合B:A(10:50mg/kg口服)和B:A(50:50mg/kg口服)通过显著增加空间识别记忆而证明了协同效应。
乙酰胆碱被广泛认为是参与认知功能调节的最重要的神经递质。这是使用AChE抑制剂用于对症治疗与受损的认知有关的疾病(例如，处于早期的阿尔茨海默病)的主要原因。有大量证据将中枢胆碱能系统与记忆联系起来。已表明认知功能障碍与胆碱能功能受损有关，并且相反地，促进中枢胆碱能活性能改善记忆。乙酰胆碱酯酶活性的增加通常也会导致学习和形成新记忆的能力下降(Meena,J.等人，“Asparagus racemosuscompetitively inhibits in vitro the acetylcholine and monoamine metabolizingenzymes[芦笋在体外竞争性抑制乙酰胆碱和单胺代谢酶]”Neurosci.Lett.[神经科学快报](2011)503(1):6-9)。因此，在治疗大鼠的海马体中评估这些酶的活性。在所述研究中，东莨菪碱增加了海马中的与ACh浓度成反比的AChE活性。3-OH-DBP(尿石素B)和3,8-(OH)2-DBP(尿石素A)减弱了东莨菪碱诱导的乙酰胆碱酯酶活性的增加以及导致的ACh水平降低。最值得注意的是，组合B:A(10:50wt/wt)和B:A(50:50wt/wt)分别比B或A更显著地减轻了东莨菪碱诱导的乙酰胆碱酯酶活性的增加和ACh水平的降低。此外，测量了喜来芝、单独DBP等效于多奈哌齐。
总而言之：3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)(10:50wt/wt)的组合显示出体外协同乙酰胆碱酯酶活性。观察到与人乙酰胆碱酯酶相同的作用，因此强调了所观察到的活性的临床潜力。
3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)(10:50wt/wt)的组合显示出抑制β-淀粉样蛋白聚集的体外协同活性。
在动物中施用东莨菪碱会产生短期学习和记忆缺陷，这被认为是AD的胆碱能功能障碍的特征。因此，东莨菪碱诱导的失忆模型已被广泛接受为认知障碍的药理学模型，用于筛选潜在的认知增强剂。
3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)(10:50wt/wt)的组合显示出东莨菪碱诱导的失忆大鼠模型体内的几个参数的衰减。
所有臂中的进入的总数目(试验1和2)表明被东莨菪碱降低的一般探索态度(好奇)。3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)(10:50wt/wt)的组合减弱了这种影响。这表明这种组合通过增加新环境中臂进入的百分比而显著减轻了东莨菪碱诱导的空间识别记忆受损。在试验2的5分钟内，已知臂相对于新臂的进入百分比被认为是臂辨别力(空间识别记忆)的量度。东莨菪碱降低了空间记忆，这被3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)(10:50wt/wt)的组合逆转。
通过试验2期间花费在新臂上的时间与花费在所有臂和设备中央上的时间的比率的百分比，来估计新环境中的应对策略或行为。在新环境中的应对行为的减少被认为是焦虑样行为的增加。因此，3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)(10:50wt/wt)的组合通过增加应对行为而显示出抗焦虑活性。
因此，在上述实例中，在已接受东莨菪碱(Sc)注射的大鼠中，组合B:A(10:50wt/wt)和B:A(50:50wt/wt)显示出改善短期记忆、空间记忆缺陷、受损的学习和回忆能力的协同效应。
当与多奈哌齐相比时，在B:A的较低的组合剂量(10:50wt/wt)下的活性显示出大致相当的作用。
从机理上讲，降低的乙酰胆碱水平通常导致学习和形成新记忆的能力下降。脑中乙酰胆碱的浓度被AChE的活性动态调节。AChE将乙酰胆碱水解为乙酸和胆碱，并且因此AChE抑制剂延长了乙酰胆碱突触的作用并增强了胆碱能神经传递。
因此，但不受任何理论的束缚，在海马体中评估了这些酶的AChE活性。东莨菪碱增加了海马体中的AChE活性并降低了ACh浓度。
因此，如上述实例中所示，组合3-OH-DBP(B):3,8-(OH)2-DBP(A)(10:50wt/wt)和3-OH-DBP(B):3,8-(OH)2-DBP(A)(50:50wt/w)在已接受东莨菪碱注射的大鼠中降低了AChE活性并提高了ACh水平。
B:A的较低的组合剂量(10:50wt/wt)显示出更大的协同效应，其与多奈哌齐一样有效。
这些结果表明，在东莨菪碱诱导的失忆大鼠模型中实验药物的协同效应可能仅仅是由于AChE的直接抑制所致，所述AChE的抑制与乙酰胆碱浓度的增加呈负相关。
B:A(10:50wt/wt)的组合比其他比率的组合显示出更好的协同活性。药理作用分别比喜来芝、3-OH-DBP(B)和3,8-(OH)2-DBP(A)更有效。在大多数情况下，所述组合等效于多奈哌齐。
本发明的这些营养组合物可以与营养上可接受的载体组合施用。在此类配制品中可以包含从按重量计1％至按重量计99％、或可替代地按重量计0.1％至按重量计99.9％的活性成分。“营养上可接受的载体”是指与该配制品中的其他成分兼容并且对使用者无害的任何载体、稀释剂或赋形剂。根据一个实施例，合适的营养上可接受的载体可以包括乙醇、乙醇水溶液混合物、水、果汁和/或蔬菜汁及其组合。
本发明的这些药物组合物可以与药学上可接受的载体组合施用。在此类配制品中可以包含从按重量计1％至按重量计99％、或可替代地按重量计0.1％至按重量计99.9％的活性成分。“药学上可接受的载体”是指与该配制品中的其他成分兼容并且对使用者无害的任何载体、稀释剂或赋形剂。
递送系统
适合的剂型包括片剂、胶囊剂、溶液、混悬剂、粉剂、胶质、以及糖果。舌下递送系统包括，但不局限于，舌头下和舌头上可溶的药片、液滴、以及饮料。可以使用可食用膜、亲水性聚合物、口服可溶的膜或口服可溶的条。其他有用的递送系统包括口腔喷雾或鼻腔喷雾或吸入器、等。
对于口服施用而言，可以将喜来芝、尿石素A、尿石素B、或其组合进一步与一种或多种固体无活性成分进行合并以用于片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒或其他适合剂型的制备。例如，可以将所述活性剂与至少一种赋形剂进行组合，这些赋形剂是例如填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、溶液阻滞剂、吸收促进剂、润湿剂、吸收剂、或润滑剂。其他有用的赋形剂包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、甘露醇、木糖醇、甜味剂、淀粉、羧甲基纤维素、微晶纤维素、硅石、明胶、二氧化硅等。
本发明的组分连同一种常规的佐剂、载体、或稀释剂因此可以被放置为药物组合物及其单位剂量的形式。此类形式包括固体，并且特别是片剂、填充的胶囊剂、粉剂以及球粒形式，以及液体，特别是全部用于口服使用的水性或非水性溶液、混悬剂、乳剂、酏剂、以及填充有它们的胶囊剂，用于直肠施用的栓剂，以及用于非消化道使用的无菌可注射溶液。此类药物组合物及其单位剂型可以包括处于常规比例的常规成分，具有或不具有另外的活性化合物或要素，并且此类单位剂型可以包含任何适合的有效量的与待应用的预期每日剂量范围相当的活性成分。
本发明的组分能以多种多样的口服剂型和非消化道剂型给予。对本领域的普通技术人员将显而易见的是，以下剂型可以包括作为活性组分的本发明的一种化学化合物或本发明的一种化学化合物的药学上可接受的盐。
对于由本发明的一种化学化合物制备药物组合物，药学上可接受的载体可以是固体的或液体的。固体形式的制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂、以及可分散的颗粒剂。固体载体可以是一种或多种以下物质，这些物质还可以作为稀释剂、调味剂、增溶剂、滑润剂、助悬剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂、或胶囊化材料。
在粉剂中，所述载体是与精细分散的活性组分处于混合物形式的精细分散的固体。在片剂中，该活性组分被与处于适合的比例的具有必需的结合能力的载体混合并且被压实为所希望的形状和尺寸。
这些粉剂和片剂优选地包含从百分之五或百分之十至约百分之七十的一种或多种活性化合物。适合的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可油、以及类似物。术语“制剂”旨在包括所述活性化合物与作为提供胶囊的载体的胶囊化材料的配制品，在所述胶囊中所述活性组分(具有或不具有载体)被一种载体包围，因此所述活性组分与所述载体相关。类似地，包括扁囊剂和锭剂。包括片剂、粉剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂、以及锭剂。可以将片剂、粉剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂、以及锭剂用作适于口服施用的固体形式。
液体制剂包括溶液、混悬剂、以及乳剂，例如水或水-丙二醇溶液。例如，非消化道注射液体制剂可以被配制为处于聚乙二醇水溶液中的溶液。根据本发明的化学化合物因此可以被配制为用于非消化道施用(例如，通过注射，例如弹丸注射或连续输注)并且能以用于安瓿、预填充的注射器、小体积的输注中或用于具有添加的防腐剂的多剂量容器中的单位剂量存在。这些组合物可以采用这样一些形式，如在油性或水性运载体中的混悬剂、溶液、或乳剂，并且可以包含多种配制剂，如助悬剂、稳定剂、和/或分散剂。可替代地，所述活性成分可以处于在使用之前用一种适合的运载体(例如无菌的无热原水)复水的粉末形式，所述粉末通过无菌固体的消毒分离或通过从溶液中冻干而获得。
可以通过将活性组分溶解于水中并且按需要添加适合的着色剂、调味剂(flavor)、稳定剂以及增稠剂来制备适于口服使用的水溶液。可以通过用粘性材料(例如天然的或合成的胶质、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、或其他熟知的助悬剂)将细碎的活性组分分散于水中来制造适于口服使用的水性混悬剂。
适用于口腔中局部施用的组合物包括锭剂，所述锭剂包含在调味基质中的活性剂，所述调味基质通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶；软锭剂，所述软锭剂包含在惰性基质中的活性成分，所述惰性基质是例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶；和漱口水，所述漱口水包含在合适的液体载体中的活性成分。
通过常规手段直接将溶液或混悬剂施用至鼻腔，例如用滴管、移液管或喷雾。这些组合物能以单一或多剂型被提供。在用来向呼吸道施用的组合物(包括鼻内组合物)中，该化合物将通常具有小的颗粒尺寸，例如5微米的量级或更小。可以通过本领域已知的手段获得这样的颗粒尺寸，例如通过微粒化。
这些药物制剂优选地处于单位剂型。在这样的形式中，所述制剂被再分为包含适当数量的活性组分的单位剂量。该单位剂型可以是一种包装制剂，该包装包含不连续数量的制剂，例如小瓶或安瓿中的包装的片剂、胶囊剂、以及粉剂。而且，该单位剂型本身可以是一种胶囊剂、片剂、扁囊剂、或锭剂，或它可以是适当数目的任何这些包装形式。
用于口服施用的片剂、胶囊剂以及锭剂以及用于口服使用的液体是优选的组合物。用于施用至鼻腔或呼吸道的溶液或混悬剂是优选的组合物。用于局部施用至表皮的透皮贴剂是优选的。
用于配制和施用的技术的另外的细节可以在最新版本的雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿，宾夕法尼亚)中找到。
除了上述列举的营养组合物成分或化合物以外，用于口服施用的固体营养组合物可以任选地含有：载体材料，如玉米淀粉、明胶、阿拉伯胶、微晶纤维素、高岭土、磷酸二钙、碳酸钙、氯化钠、海藻酸等；分解剂，包括微晶纤维素、海藻酸等；粘合剂，包括阿拉伯胶、甲基纤维素，羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素等；以及润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸、硅酮流体、滑石、蜡、油、胶体二氧化硅等。此类赋形剂的有用性在本领域内是熟知的。
在一个优选的实施例中，所述营养组合物可以是液体的形式。根据本实例，提供了制备液体组合物的方法。
可以在水或其他水性媒介物中制备与预防和/或治疗炎症、感冒和/或流感的方法有关地口服施用的液体营养组合物。除了上述列举的成分或化合物之外，液体营养组合物可以包括助悬剂，例如，如甲基纤维素、海藻酸盐、黄芪胶、果胶、海藻酸钠、角叉菜胶、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等。液体营养组合物可以是以溶液、乳剂、糖浆剂、凝胶或酏剂的形式，包括或含有连同以上列举的成分或化合物、润湿剂、甜味剂以及着色剂和调味剂。不同液体和粉末营养组合物可以通过常规方法制备。预期了各种即饮配制品(RTD)。
施用途径
这些组合物可以通过任何合适的途径来施用，包括但不局限于，口服、舌下、口腔、眼睛、肺部、直肠、以及非消化道施用，或作为口腔喷雾或鼻腔喷雾(例如喷雾状的蒸汽、液滴或固体微粒的吸入)。非消化道施用包括，例如，静脉内、肌内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、膀胱内(例如，向膀胱)、真皮内、经皮、局部、或皮下施用。还预期在本发明的范围内的是将药物组合物以控制的配制品的形式滴注至患者的体内，其中该药物的全身性或局部释放在较晚的时间发生。例如，该药物可以被定位于一个储存处用于至循环的控释，或用于释放至一个局部位点。
本发明的药物组合物可以是适于口服、直肠、支气管、鼻、肺、局部(包括口腔和舌下)、透皮、阴道或非肠道(包括皮肤、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、动脉内、脑内(intracerebal)、眼内注射或输注)施用的那些，或处于适于通过吸入或吹入(包括粉剂和液体气溶胶)施用、或通过缓释系统施用的形式的那些。缓释系统的适合的实例包括含有本发明的化合物的固体疏水性聚合物的半透性基质，这些基质可以处于已定形的物品的形式，例如薄膜或微囊剂。
在描述目前要求保护的发明的上下文中(尤其是权利要求书的上下文中)，术语“一个/一种(a/an)”、“所述(the)”以及相似指代词的使用应解释为涵盖单数和复数两者，除非在此另外指示或明显地与上下文矛盾。在此叙述值的范围仅旨在用作个别参考所述范围内的每个单独数值的简写方法，除非在此另外指示，并且将每个单独数值结合在说明书中，就好像它在此个别引用一样。术语“约”的使用旨在描述高于或低于该范围中的所述值大约±10％的值；在其他实施例中，这些值可在高于或低于该范围中的所述值大约±5％的值的范围内；在其他实施例中，这些值可在高于或低于该范围中的所述值大约±2％的值的范围内；在其他实施例中，这些值可在高于或低于该范围中的所述值大约±1％的值的范围内。上述范围旨在根据上下文确定，并且未隐含进一步限制。在此描述的所有方法能以任何适合的顺序进行，除非在此另外指示或明显地与上下文矛盾。在此提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地描述本发明并且不对本发明的范围构成限制，除非另外指示。说明书中的任何语言都不应当解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。
尽管在前述说明书中，已经就本发明的某些实施例对其进行了描述，并且为了说明的目的已经提出了许多细节，但是对本领域普通技术人员显而易见的是本发明易受另外的实施例的影响并且在此所描述的某些细节可以在不偏离本发明的基本原则下进行相当大的改变。
本文所引用的所有参考文献均通过引用以其整体而并入。在不偏离本发明的精神或基本属性的情况下，可以将其以其他具体形式呈现，并且因此应该参考指明本发明的范围的所附权利要求书，而非参考前述说明书。

Claims (18)

1.一种组合物，所述组合物包含尿石素A和尿石素B，其中尿石素B与尿石素A的wt./wt.比率是从约0.2:1至约0.6:1。
2.如权利要求1所述的组合物，其中尿石素B与尿石素A的wt./wt.比率是约0.2:1。
3.如权利要求1所述的药物组合物或营养组合物，所述组合物进一步包含药学上或营养上可接受的载体。
4.如权利要求1所述的组合物，其中治疗有效剂量是从约100mg至约1000mg。
5.如权利要求1所述的组合物，其中治疗有效剂量是从约100mg至约500mg。
6.如权利要求3所述的药物组合物，用于在治疗或预防人受试者的痴呆相关的障碍的方法中使用。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述痴呆相关的障碍是阿尔茨海默病。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其中以约1.5mg/kg至约8.0mg/kg的日剂量施用所述组合物。
9.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述组合物针对乙酰胆碱酯酶活性的抑制具有约0.05微克/ml至约0.06微克/ml的抑制浓度(IC50)。
10.如权利要求3所述的药物组合物，用于在治疗或预防人受试者的焦虑障碍的方法中使用。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中以约1.5mg/kg至约8.0mg/kg的日剂量施用所述组合物。
12.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述组合物针对乙酰胆碱酯酶活性的抑制具有约0.05微克/ml至约0.06微克/ml的抑制浓度(IC50)。
13.一种用于治疗或预防个体的认知障碍的方法，所述方法包括向需要这种治疗的个体施用治疗有效量的包含尿石素A和尿石素B的组合物，其中尿石素B与尿石素A的wt./wt.比率是从约0.2:1至约0.6:1。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述认知障碍选自由以下组成的组：痴呆相关的障碍、应激诱导的痴呆、焦虑、抑郁和阿尔茨海默病。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述组合物具有尿石素B与尿石素A的wt./wt.比率是约0.2:1，并且针对人乙酰胆碱酯酶活性的抑制具有约40微克/ml至约80微克/ml的抑制浓度(IC50)。
16.如权利要求15所述的方法，其中人乙酰胆碱酯酶的抑制比尿石素A或尿石素B所显示的抑制分别大至少5倍。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述治疗有效量在人中是以从约100mg至约1000mg的日剂量。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述治疗有效量在人中是以从约1.5mg/kg至约10.0mg/kg的日剂量。
CN201880089033.4A 2018-02-19 2018-10-12 用于改善认知能力或认知功能的尿石素a和b的协同组合 Pending CN111727040A (zh)

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