CN111714512B - 纳米硅凝胶的制备方法及纳米硅凝胶于抗菌和抗病毒的用途 - Google Patents

纳米硅凝胶的制备方法及纳米硅凝胶于抗菌和抗病毒的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种纳米硅凝胶的制备方法及纳米硅凝胶于抗菌和抗病毒的用途。其中，所述纳米硅凝胶，包含：硅，为无机黏土，含量为0.9～4.7％；脱层剂，为多醣类，由多个氨基葡萄糖(脱乙酰单位)和多个N‑乙酰葡糖胺，并通过β‑(1‑4)糖苷键组合而成，所述脱层剂含量为0.6～3.4％；酸，为酸性化合物，其含量0.3～2％；水，化学式为H2O，含量为92～98％；本发明所述纳米硅凝胶的粒径小于500nm。

Description

纳米硅凝胶的制备方法及纳米硅凝胶于抗菌和抗病毒的用途
技术领域
本发明专利提供一种新型纳米技术，特别是涉及将硅制成具有抗菌及抗病毒效果的纳米硅凝胶。
背景技术
猪流行性下痢(porcine epidemic diarrhea；PED)是一种高度传染性疾病PED病毒为冠状病毒属的一种，除了PED病毒外，传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)及猪凝集性脑脊髓炎病毒(HEV)也都属于冠状病毒属。PED病毒对于乙醚及氯仿相当敏感，市售大部分的消毒水都能有效的杀灭PED病毒，加热至摄氏60度以上也可以不活化此病毒。粪口传染是最常见的PED传播途径，但经由污染的设备、媒介物或人员传入阴性场的可能性也存在。发病猪只及其粪便和任何能沾染粪便的物体都可能传播PED病毒。被病毒污染的雨鞋、衣物、现场工作人员的手、设备或卡车都能传播此疾病。通常PED自病毒感染起约12-36小时后出现临床症状。当阴性猪场引进PEDV阳性猪只后，一般会在约4-5天内出现临床症状。PED的潜伏期通常较TGE长，感染猪只可持续排毒7-9天。PED症状的严重程度不一且与该发生猪场的流行病学历史相关，主要且通常是唯一的症状为急性水样下痢与呕吐。
自从欧盟(European Commission,EC)于2006年禁止抗生素添加于饲料中作为生长促进剂使用后，寻找天然且有效的替代品便成为现今重要的课题。而已知黏土矿物所具有的共同特色为高度吸附能力，因此具有的抑菌能力，且已被用于生产治疗人类腹泻药物的原料。在饲料中，含铝硅酸盐黏土像膨润土与蒙脱石等常用于饲料添加剂中作为霉菌毒素解毒剂。纳米硅凝胶(Nano-silica composites,NSC)是利用天然黏土脱层制成，为高度分散的纳米硅片，直径约300nm，具高表面积，离子交换能力及带电能力，这些独特的特性使NSC具有高度吸附能力附着于细菌表面。
为提升天然黏土的表面积，离子交换能力及带电能力，必须选用适当的插/脱层剂将天然黏土经由插层(intercalation)及脱层(exfoliation)等方式进行改质；其中，天然黏土的插层状态，指天然黏土层与层之间以固定距离的结晶型分散存在；而脱层状态则是指每单一层以不规则的距离及方向存在，黏土原料的插层与脱层通常可由插/脱层剂与黏土内的金属离子经由离子交换反应而得到纳米硅凝胶(Nano-silica composites,NSC)。
现有技术中，用于铝硅酸盐黏土像膨润土与蒙脱石的插层剂可为低分子型的四级铵盐，通过其正电基团铵盐官能基与层状无机物层间带电荷的表面官能基形成离子键的结合，并改变层状无机物如黏土的亲水性，使黏土成为亲有机溶剂的性质，提升黏土对有机单体或高分子的亲和性，以利后续的脱层反应。
现有的脱层剂，例如美国专利公开案第200500801801号中提出的以聚醚二胺(polyetherdiamine)及双酚A缩水甘油醚(diglycidyl ether of bisphenol-A,DGEBA)反应合成的脱层剂，经酸化后可使作为无机纳米材料的蒙托土(MMT)达到完全脱层的效果，或如中国台湾专利(I280261)中提出的以聚醚三胺(poly(oxypropylene)triamine)与双酚A缩水甘油醚反应合成两端具有胺基(NH2)的双酚A环氧寡聚物(amine-terminated BPAepoxy oligomer,AEO)脱层剂。
然而，前述脱层剂中的壬基苯酚及脱层剂中的双酚A(bisphenol A)均为环境荷尔蒙，当上述产品于使用后，存在于废弃产品中的壬基苯酚及双酚A在环境中均难以分解，造成环境污染与生物的危害，且因其难于环境中分解(有机化合物被生物分解的相对速率为：直链烷>支链烷>环状烷>芳香族化合物，Tran et al.,1997)，会通过生物累积(bioaccumulation)而留存在食物链中的顶端消费者体内，例如人类或大型的哺乳动物等。一般人亦容易通过接触壬基苯酚及双酚A所制造的产品，而藉由吸入或皮肤接触摄入壬基苯酚及双酚A。
依据中国台湾卫生研究院的报导，壬基苯酚具有雌激素活性，并可能影响神经与免疫系统发展以及造成肥胖；而双酚A经研究显示可能会影响脑部发展，或影响造血系统及提高子代肝癌与乳腺癌的发生率。
现有的壳聚醣插/脱层剂，如2009年「华南师范大学学报(自然科学版)壳聚醣/钠基蒙脱土的溶液插层研究」以及2005年Chemistry of Materials「Biopolymer-ClayNanocomposites Based on Chitosan Intercalated in Montmorillonite」提出的以醋酸溶液为介质酸化壳聚醣，通过溶液插层方法，作到了对蒙脱土插层。
总结来说，若以聚醚胺高分子AEO及BEO与蒙脱土所制得的纳米硅凝胶，因AEO内含有双酚A结构(即环境贺尔蒙)，生物安全方面有所顾忌。此外在酸性环境下期表现出的抗菌效果也不如预期。若以壳聚醣为插脱层剂，因学术界/业界只有作到插层、并未作到脱层，所以并未最大化天然黏土的表面积，离子交换能力及带电能力。
因此，如何制备一不具环境毒性且具有抗菌、抗病毒的纳米硅凝胶，为本发明欲解决的技术课题。
发明内容
纳米硅凝胶经由优异的表面改质，增强其负电荷的吸引力，成为改质硅凝胶复合物，使其特别能够与病毒表面的碱性胺基酸正电荷互相吸引而结合，抗病毒的机制为:1.纳米改质硅凝胶与病毒结合后，阻断病毒接触细胞，使其无法与细胞的受器(receptor)结合；2.纳米改质硅凝胶会干扰病毒的转录，并使受感染的宿主细胞所制造的病毒颗粒无法释放出来，而阻止病毒的复制和扩散。
本发明的抗菌机制如下:
(1)纳米硅凝胶上的电荷会对细菌、病原体的细胞壁表面的极性产生引力，贴合在表面后利用离子交换、氧化作用细胞壁萎缩破坏，细菌因而崩解；(2)细菌的细胞壁表面被纳米硅凝胶吸附住之后，细菌呼吸作用位置以及群聚感应(quorum sensing)的功能会被屏蔽，造成无法彼此沟通而丧失活性；(3)物理性的附着于细菌表面使其活动力丧失，交迭在一起而失去作用能力，例如使沙门氏菌的鞭毛交错无法活动。
由此，本发明提供一种纳米硅凝胶，其包含:硅，为无机黏土，含量为0.9～4.7％；脱层剂，为多醣类，由多个氨基葡萄糖(脱乙酰单位)和多个N-乙酰葡糖胺，并通过β-(1-4)糖苷键组合而成，所述脱层剂的含量为0.6～3.4％；酸，为酸性化合物，其含量为0.3～2％；水，化学式为H2O，其含量为92～98％；所述纳米硅凝胶的粒径小于500nm。
本发明的纳米硅凝胶通过以下步骤制备而成：
(a)提供硅，含量为0.9～4.7％重量比例；
(b)提供脱层剂，使所述脱层剂含量为0.6～3.4％重量比例，得到纳米硅凝胶中间体；
(c)提供分散剂，利用纳米研磨机，将所述纳米硅凝胶中间体于室温研磨2小时以上，得到平均粒径为500nm以下的纳米硅凝胶。
本发明又提供一种利用纳米硅凝胶对抗细菌及病毒的方法，其通过纳米硅凝胶，其包含:硅，为无机黏土，含量为0.9～4.7％；脱层剂，为多醣类，由多个氨基葡萄糖(脱乙酰单位)和多个N-乙酰葡糖胺，并通过β-(1-4)糖苷键组合而成，所述脱层剂的含量为0.6～3.4％；酸，为酸性化合物，其含量为0.3～2％；水，化学式为H2O，其含量为92～98％；所述纳米硅凝胶的粒径小于500nm。
较佳地，所述硅可为钙基膨润土、钠基膨润土、蒙脱土、白陶土、高岭土、白云石、硅藻土、沸石。
较佳地，所述多醣类可为壳聚醣、壳寡糖、几丁质、甲壳素。
较佳地，所述纳米研磨机为湿式纳米研磨机。
较佳地，所述纳米硅凝胶中间体为未完全脱层的纳米粒子，其粒径为1000nm以上。
较佳地，所述纳米研磨机具有研磨珠，以将所述纳米硅凝胶中间体进行浆料纳米化。所述研磨珠为氧化锆珠、玻璃珠、钢珠。
附图说明
图1为本发明纳米硅凝胶的结构示意图；
图2为壳聚醣不同浓度的特性比较；
图3为利用不同脱层剂做本发明纳米硅凝胶的特性比较；
图4为本发明纳米硅凝胶抑制赤痢螺旋体的生长百分比结果；
图5为实施例六中，含PEDv肠液与本发明纳米硅凝胶粉剂及水剂、PBS混和前后的病毒量变化；
图6为实施例六中，攻毒猪只肠液及粪便病毒量；
图7为实施例六中，本发明纳米硅凝胶的抗病毒效果的免疫荧光结果；
图8为实施例六中，各组猪只攻毒后8、10、22、26、30及32小时的情形；
图9为实施例六中，各组猪只攻毒后26、30、32小时粪便外观；
图10为实施例六的组织染色图；
图11为实施例七中，预防性投予本发明纳米硅凝胶的结果比较；
图12为实施例七中，预防性投予本发明纳米硅凝胶的结果比较。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例一至实施例五为本发明不同纳米硅凝胶的成分。实施例二至实施例七所使用的本发明纳米硅凝胶成分为纳米硅浓度为6％，其中实施例六及实施例七为活体试验。
实施例一：本发明纳米硅凝胶的制备流程及结果
如图1所示，为本发明纳米硅凝胶的结构示意图。
原料：(1)硅土：层状硅矿土。(2)醋酸：合成工业原料股份有限公司的食品级冰醋酸。(3)壳聚醣：G.T.C.Bio Corporation的壳聚醣。
合成步骤：步骤(a)，将硅土于水中，80℃下搅拌2小时后静置过夜，得混合物A。步骤(b)，醋酸溶于水中，再加入壳聚醣，室温搅拌2小时得水溶液B。步骤(c)，将水溶液B滴定入料至混合物A中，温度60℃下反应6小时，即得纳米硅凝胶。
实施例二：利用不同脱层剂做本发明纳米硅凝胶的特性比较
本实施例以不同厂牌壳聚醣和不同浓度壳聚醣的特性比较，其结果如表一及图3所示。
LP2：步骤(a)，将硅土10g配成2％混合液，80℃下搅拌2小时后静置过夜，得混合物A。步骤(b)，醋酸2.5g溶于水中，再加入壳聚醣(G.T.C.Bio Corporation的AC-2)5g配成2％水溶液，室温搅拌2小时得水溶液B。步骤(c)，将水溶液B滴定入料至混合物A中，温度60℃下反应6小时，即得LP2。在XRD数据中：2％时讯号强度减弱至40％，推测为部份脱层。稀释至1％时检测，讯号强度减弱至18％且无讯号峰，推测达到几乎完全脱层。
LP3：步骤(a)，将硅土10g配成2％混合液，80℃下搅拌2小时后静置过夜，得混合物A。步骤(b)，醋酸6g溶于水中，再加入壳聚醣(G.T.C.Bio Corporation的AC-2)12g配成2％水溶液，室温搅拌2小时得水溶液B。步骤(c)，将水溶液B滴定入料至混合物A中，温度60℃下反应6小时，即得LP3。在XRD数据中：2％时检测，讯号强度减弱至31％，推测为部份脱层。稀释至1％时检测，讯号强度减弱至10％以下且无讯号峰，推测达到几乎完全脱层。
LP4：步骤(a)，将硅土10g配成2％混合液，80℃下搅拌2小时后静置过夜，得混合物A。步骤(b)，醋酸2.5g溶于水中，再加入壳聚醣(诚丽实业的N65)5g配成2％水溶液，室温搅拌2小时得水溶液B。步骤(c)，将水溶液B滴定入料至混合物A中，温度60℃下反应6小时，即得LP4。在XRD数据中：2％时检测，讯号强度减弱至31％，推测为部份脱层。
LP5：步骤(a)，将硅土10g配成2％混合液，80℃下搅拌2小时后静置过夜，得混合物A。步骤(b)醋酸6g溶于水中，再加入壳聚醣(诚丽实业的N65)12g配成2％水溶液，室温搅拌2小时得水溶液B。步骤(c)将水溶液B滴定入料至混合物A中，温度60℃下反应6小时，即得LP5。在XRD数据中：2％时检测，讯号强度减弱至36％，推测为部份脱层。
LP7：步骤(a)，将硅土7g配成6％混合液，80℃下搅拌2小时后静置过夜，得混合物A。步骤(b)，醋酸3g溶于水中，再加入壳聚醣(诚丽实业的N65)3g配成6％水溶液，室温搅拌2小时得水溶液B。步骤(c)，将水溶液B滴定入料至混合物A中，温度60℃下反应6小时，即得LP7。在XRD数据中：稀释至1％时检测，讯号强度减弱至10％以下且无讯号峰，推测达到几乎完全脱层。
各样本的名称说明如表一所示：
Figure GDA0003761893680000051
Figure GDA0003761893680000061
表一、不同脱层剂的特性比较
于以下实施例中，使用纳米硅凝胶粉剂和纳米硅凝胶水剂皆为含有2～6％纳米硅的浓度，其二者成分完全相同，只是剂型不同。
实施例三：本发明纳米硅凝胶对抗大肠杆菌及沙门氏菌的结果
本实施例采用灭菌标准方法，减菌率＝100(接菌量－接触时间后菌数)/接菌量，进行灭菌效果测试。采样品的不同稀释浓度来测试灭菌率，将纳米硅凝胶与菌液混合成1:10(100x倍稀释)与:100(1000x倍稀释)比例(纳米材料溶液:菌液,vol/vol)，而后直接涂布于培养基，24小时后计算数，重复三次来纪录实验结果，其结果如表二、表三所示。
Figure GDA0003761893680000062
表二、体外灭菌实测菌数
Figure GDA0003761893680000063
Figure GDA0003761893680000071
表三、体外灭菌效率
实施例四：本发明纳米硅凝胶的抗病毒效果
本实施例的测试方法为，混合稀释样品(9Vol.)(纳米硅凝胶)和病毒(1Vol.)(猪传染性胃肠炎病毒TGEV,力价为104.6/0.1mL)，并且培养于20℃30分钟。采取TCID50作为病毒滴定测试法，进一步使用免疫荧光技术确认病毒感染程度。重复六次以测试半数细胞培养物感染量。测试病毒采用传染性胃肠炎病毒(TGEV)，为一种冠状病毒相似于流行性腹泻病毒(PEDV)。其结果如表四所示。
Figure GDA0003761893680000072
表四、本发明纳米硅凝胶的抗病毒效果
测试结果显示纳米硅凝胶在稀释倍率25X和50X之下皆能有效阻止病毒感染细胞，在100X,200X之下阻抗效果稍微下降，但依旧能阻止病毒感染，在各个浓度(25X,50X,100X,200X)减少病毒的感染量分别为>103.1、>103.1、101.2、100.6。备注:6/6表示出现CPE(细胞病变效应)孔数的百分比为100％；0/6表示没有出现细胞病变效应。
本发明纳米硅凝胶的抗病毒效果的免疫荧光结果如图7所示，结果显示在稀释200x的本发明纳米硅凝胶浓度，病毒有感染细胞，但纳米硅凝胶干扰了病毒的转录机制，使其无法从细胞复制扩散出来。本发明纳米硅凝胶稀释倍率在100至200倍仍可阻碍冠状病毒感染细胞，稀释50倍则为最佳倍率，在高倍的稀释浓度之下，部分病毒虽有染细胞，但其转录复制的能力已被干扰，使其病毒颗粒无法从细胞中扩散出来，因此在持续使用纳米硅凝胶之下，将减少被感染的机会，也使病毒无法大量复制。
实施例五：本发明纳米硅凝胶的抗禽流感病毒效果
本实施例使用材料如下:
1.禽流感病毒(TW/031209(H5N2)strain)
2.细胞：狗肾细胞株(Madin-Darby Kidney cell line,MDCK)。
本实施例的试验分组：
1.杀病毒组：制备4管混合液，分别含纳米硅凝胶水剂25、50、100、200倍稀释与1/10体积的禽流感病毒
2.病毒对照组：试验程序除了不添加纳米硅凝胶之外，其余测试步骤相同
3.纳米硅凝胶毒性组：试验程序除了不添加禽流感病毒之外，其余步骤相同，观察纳米硅凝胶是否对细胞具有毒性。
4.阴性对照组：不添加纳米硅凝胶与病毒，观察细胞是否正常
试验原理：以细胞感染法测定纳米硅凝胶与禽流感病毒(H5N2)于室温(25℃)作用30分钟后，实验组与对照组病毒量的差异。病毒量以细胞病变作为判断指标，计算纳米硅凝胶对禽流感病毒的不活化率。结果判定：病毒感染强度计算：以50％细胞感染剂量(TCID50)表示。其结果如表五所示，结果显示，禽流感病毒的病毒力价为105.64TCID50/0.1ml不活化禽流感病毒效力对数值(Log-Reduction Value,LRV)，即在不同的稀释倍率下所减少的禽流感对数值。
克毒宁稀释倍数 LRV
25倍 3.14
50倍 3.04
100倍 2076
200倍 2.39
表五、本发明纳米硅凝胶对禽流感病毒的抑制效果
稀释倍数为25倍、50倍、100倍、200倍的纳米硅凝胶，于体外不活化禽流感病毒(TW/031209(H5N2)strain)的清除效力(LRV)分别为3.14、3.04、2.76和2.39。纳米硅凝胶最佳抑制禽流感病毒的稀释倍数为50倍，而纳米硅凝胶稀释倍数为200倍仍可具某些程度抑制禽流感病毒感染细胞。
实施例六：本发明纳米硅凝胶的抗猪流行性下痢病毒效果
本实施例由田间所收集含有猪流行性下痢病毒(Porcine Epidemic Diarrheavirus；PEDv)小肠肠液，进行产品抑制性试验后并进行猪只攻毒试验，针对欲测试商品评估是否具有降低猪流行性下痢病毒(Porcine Epidemic Diarrhea virus；PEDv)活性的能力试验。
实验材料：
A.纳米硅凝胶-粉剂及水剂(由合记生技股份有限公司提供)批号：粉剂－201707061B；水剂－201709081D制造日期：粉剂－2017.07.06；水剂－2017.09.08
B.已灭菌磷酸盐缓冲生理食盐水；PBS(嘉义大学兽医学系提供)
C.感染PEDv肠道的肠液(嘉义大学兽医学系提供)
D.攻毒用实验猪只(嘉义大学兽医学系购买)
E.实时定量聚合酶链锁反应(Real-time polymerase chain reaction；RT-PCR)检验相关套组及仪器(嘉义大学兽医学系提供并执)
F.肠道组织病理学评估相关材料与仪器(嘉义大学兽医学系提供并执)
II.实验流程
A.试验分组:猪只随机分成对照组及试验组，每组各3头，空白组1头
B.攻毒试验:取3份确认含有PEDv的肠道，将其中2份具有活性的PEDv肠液分别与2％粉剂原剂及2％水剂原液混合，于37℃环境中作用30分钟，另1份具有活性的PEDv肠道内容物则与已灭菌的PBS混合，于相同温度及环境中作用，2组试验组及对照组猪只并分别喂予10mL肠液，于攻毒后第2小时开始分别口服喂予5gm粉剂、5mL水剂及PBS，一天2次，每次间隔6小时，并观察24～48小时后发病情形(如图11)。
C.病理剖检将所有试验猪只牺牲后，记录猪只肠道剖检病变并进行组织病理学采样。
D.病毒量测定：取与药品混合前后的肠液、剖检时抽取的肠液，以实时定量聚合酶链锁反应，测定其内所含的病毒量。
E.组织病理学检测：取牺牲猪只的各段肠道(十二指肠、空肠、回肠及盲肠)，观察其绒毛的病理学变化。
III.试验结果
本实施例的试验结果图8至图12所示，如图8所示，含PEDv的肠液与纳米硅凝胶粉剂及水剂、PBS混合后，病毒量已有明显下降，由105-6Copynumber/μL病毒下降至101-3Copynumber/μL病毒；在攻毒试验过程中，猪只的临床症状评估中，除了空白组猪只粪便型态正常外，其他试验组猪只均出现黄色水样及成形粪便的情形，但其无法排除水样便是由成形粪便与尿液混合的结果或是因感染PEDv病毒所引发的下痢症状，须配合实时定量聚合酶链锁反应结果及肠道组织病理学结果，加以辅助判定；如图9所示，攻毒后肠液及粪便所测得的病毒量，水剂组及粉剂组攻毒后在肠液中的病毒量均有下降的情形(由10Copynumber/μL-127Copynumber/μL病毒下降至3Copynumber/μL-9Copynumber/μL病毒)，而在粪便的病毒含量检测中，除了在水剂组中有增加的情形(由127Copynumber/μL病毒上升至197Copynumber/μL-332Copynumber/μL病毒)，在同组其他猪只及粉剂组均可以见到病毒下降的情形(由10Copynumber/μL-127Copynumber/μL病毒下降至4Copynumber/μL-9Copynumber/μL病毒)，反观无口服投予此产品的对照组病毒量均有明显上升的情况(由4864Copynumber/μL病毒上升至数百万Copynumber/μL病毒)，初步结果推测猪只经人工感染后，通过每天以口服方式投予测试此产品，可能具有降低病毒活性的能。
Figure GDA0003761893680000101
Figure GDA0003761893680000111
表六、实施例六中各猪只粪便状况、病毒量、绒毛及腺窝比
根据表六及图7，可见PBS的对照组猪只绒毛与腺窝比，较空白组猪只的绒毛与腺窝比具有显著性差异，于空肠及回肠的肠段其比值最低，此结果符合了PEDv主要于在空肠及回肠造成严重的萎缩性小肠炎的显微病变[Linda et al.,2012]；而水剂组及粉剂组猪只十二指肠绒毛及腺窝比虽略低于空白组猪只的绒毛及腺窝比，但空肠及回肠的肠绒毛及腺窝比大部分与空白组相似，仅有少数略低于空白组，且无如对照组般低，推测经人工感染PEDv的猪只，可能因每日口服使用此产品后，使肠道绒毛产生萎缩性小肠炎病变的程度大幅降低，虽仍可能造成肠道绒毛些微程度的影响，但尚未到达会造成猪只严重萎缩性小肠炎病变的程度。
由图8的组织结构看来，(a)使用纳米硅凝胶组的空肠绒毛维持正常高度，(b)对照组的空肠绒毛呈现严重萎缩，(c)使用纳米硅凝胶组的回肠绒毛正常，(d)对照组的回肠绒毛呈现萎缩。
依据本实施例结果，可证实本发明纳米硅凝胶对于PEDv具有降低病毒活性的能力，但在现场实际使用的情形，仍须经田野试验的后方能有确切证据显示其确实具有降低PEDv病毒活性的能力。田野试验结果请参考实施例七。
实施例七、本实施例纳米硅凝胶抑制禽畜肠道细菌的效果
于田间爆发猪流行性下痢(Porcine Epidemic Diarrhea；以下简称PED)的牧场进行商品化产品试验，观察母猪及仔猪是否于使用商品化饲料添加剂后的影响，并通过分子生物学检测方式，观察粪便中PED病毒量变化情形。
实验材料：
A.纳米硅凝胶-粉剂及水剂(由合记化学股份有限公司提供)
B.采样用品(无菌纱布、夹链袋及灭菌磷酸盐缓冲生理食盐水)
C.TacoTMDNA/RNA Extraction Kit商业化套组及仪器
D.实时定量聚合酶链锁反应(Real-time polymerase chain reaction；RT-PCR)检验
II.实验方法与流程
A.试验场本次试验于四场PED爆发牧场进行，分别位于云林县麦寮乡、云林县斗六市、嘉义县民雄乡及彰化县芳苑乡(简称为麦寮场、斗六场、民雄场及芳苑场)，其中斗六场及芳苑场为传统开放式分娩舍，而麦寮场及民雄场则为水濂式分娩舍，四间牧场于试验前皆未对试验母猪进行反饲(Feed Back)主动感染，但先前病史数据中除了彰化场外，其他三场皆曾执行过母猪反饲。试验进行前于各牧场分娩舍针对具有下痢临床症状的仔猪进行病性鉴定，确诊为PED感染后，进行试验。
B.试验过程：从各场分娩舍发病仔猪挑选3只猪只进行病性鉴定，于组织病理学检测结果可见小肠绒毛严重萎缩至坏死，并将肠道内容物进行RT-PCR检测PED病毒量，确认四间牧场的下痢猪只皆具有PED阳性讯号(approximate value:104-106copynumber/μL)，最终确诊为PED感染。
母猪服用本发明纳米硅凝胶后对仔猪的影响
(1)本试验于芳苑场进行。
(2)将待测的粉剂产品以2,000ppm(2kg/ton)的浓度添加于分娩前1-2周及分娩后母猪饲料中，试验期间每周以RT-PCR方式检测1公克粪便中PEDV病毒量，同时评估分娩后仔猪健康情形，包括仔猪存活率及是否发生下痢的临床症状。
(3)将预测试水剂产品以5mL口服方式喂与PED已感染仔猪，每日两次并连续投予三天，试验期间若有猪只死亡则进行解剖确认其病因，试验时间为期一周并统计存活率，此外于试验第二日及第七日针对环境采样并进行PEDV检测。
Figure GDA0003761893680000121
Figure GDA0003761893680000131
Figure GDA0003761893680000141
表七.仔猪数统计结果及下痢指数(5/23开始试验)
预防性投予本发明纳米硅凝胶对猪只的影响
(1)本次试验于民雄场、麦寮场及斗六场三间牧场进行。
(2)将粉剂产品以1,500ppm(1.5kg/ton)的浓度添加于分娩前2周母猪饲料中，连续喂与至分娩后1周，试验期间每周随机挑选10头母猪及针对分娩舍环境，以灭菌磷酸盐缓冲生理食盐水润湿的无菌纱布针对母猪粪便及环境进行采样，并将样本以RT-PCR方式检测其粪便与环境中PEDV病毒量，并于母猪分娩后观察仔猪的健康情形，若仔猪有下痢及呕吐症状则进行解剖以了解病因。
Figure GDA0003761893680000142
Figure GDA0003761893680000151
表八、牧场的母猪粪便中PED病毒量检测结果(单位：copynumber/μL)
本实施例的实验结果而言，猪流行性下痢病毒(porcine epidemic diarrheavirus；PED)为引起仔猪急性下痢、呕吐、脱水及小于2周龄的新生仔猪高死亡率疾病，造成养猪产业严重经济损失。虽有许多PED疫苗被研发及现场使用，但由于目前中国台湾尚未具有有效及合法PED疫苗可供使用，因此许多牧场仅能采用反饲方式(feedback)处理或预防PED的感染，此法的优点虽可刺激母猪消化道黏膜并快速产生免疫反应，使仔猪能在出生后几天内藉由初乳及乳汁获得的母源移行抗体IgA获得保护而不被PED感染，然而却有极大的风险会造成其他病原的传播(如：猪第二型环状病毒、猪生殖与呼吸综合症及沙门氏菌等)[Daesub et al.,2015]，因此在无有效及完善的疫苗可供使用下，找寻取代反饲的方法变得极其重要。近年来在人类医学中研究及研发出的纳米药物，已被用于治疗病毒性疾病，其中包括A、B及C型肝炎、人类免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒及疱疹病毒等[Lavanya et al.,2017]，而随着纳米药物的研究及发展，逐渐应用于畜牧产业。
本次试验使用合记股份有限公司所提供的“纳米硅凝胶”，针对PED感染场的母猪及仔猪进行检测，观察PED的感染情形并收集数据。于彰化场试验中，为了解分娩后1周内及分娩后1-2周龄仔猪于连续使用水剂的测试品3天后的情况，以及分娩前后于母猪使用粉剂商品后，其粪便的PEDV病毒量情形进行检测。
母猪试验结果如表七所示，结果显示分娩前2周或分娩后母猪，投予粉剂产品两周后，针对试验母猪的粪便，其检体的PEDV病毒量下降。表十四显示牧场于开始使用产品后，环境采样结果PEDV病毒量降低(病毒量变化情形：104～105→101～104copynumber//μL)，但该场分娩舍于早晚均定期使用消毒剂(virkon 1：100)进行消毒，可能此方法减少环境中病毒载量。
图12显示仔猪存活率及下痢指数，仔猪存活率分别为0％(分娩后1周龄内仔猪)、48％(分娩后1-2周龄仔猪)及86％(分娩前2周母猪产下的仔猪)，从存活率及下痢指数观察记录结果显示，投予待测商品后并无有效改善仔猪下痢症状，且1周龄内仔猪死亡率高达100％。而分娩前2周母猪于使用粉剂产品后，产下仔猪存活率达86％，虽有零星下痢仔猪，但经由病性鉴定后PED皆为阴性，并确诊为细菌性感染所引起下痢。
预防性投予产品试验结果如表八及图12所示，于表八可见三间牧场自分娩前2周母猪至分娩后1周母猪每周连续采样粪便，经由RT-PCR测得PEDV病毒量变化情形，发现三间牧场病毒量变化情形与彰化场完全不同，所测得病毒量结果大多为阴性，推测原因为三间牧场皆有反复发生PED疫情的病史，且通过反饲的方式来进行控制，然而牧场内生物安全及反饲可能操作不当，使牧场内环境中仍有PEDV伺机性感染母猪及仔猪，曾感染过PED的母猪因体内产生抗体保护而不被PEDV所感染，因此粪便中PEDV检测结果多为阴性或病毒极低，仔猪却因存在环境中的PED不断消耗母源移行抗体进而感染PED，然而与未反饲过的彰化场比较，由于仔猪能通过母源移行抗体来避免PED的前期感染，随着仔猪的日龄越大，肠道绒毛的再生能力也会增强，故疫情相对较不严重[Moon et al.,1973]，如图11、图12所示。
本次试验所挑选的牧场，除了彰化场以外其他三间牧场曾有进行过反饲，三间牧场的仔猪可能因藉由从初乳中所获得的母源移行抗体而免于PEDV感染，因此除了结合测试商品的预防性投予外，亦需结合生物安全的措施，方能改善田间PED流行状况。
综上所述，本发明所提供的纳米硅凝胶可抗菌、抗病毒，依据本实施例结果，可证实本发明纳米硅凝胶对于PEDv具有降低病毒活性的能力；此外，在活体实验中证实可降低猪只饲养场所的病毒数量，分娩前2周或分娩后母猪投予本发明纳米硅凝胶后，其母猪的粪便检体的PEDv病毒量下降，猪仔的粪便中，PEDv的病毒数量亦下降。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种脱层纳米硅凝胶的制备方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，将硅土10g配成2%混合液，80°C下搅拌2小时后静置过夜，得混合物A；
步骤(b)，醋酸2.5g溶于水中，再加入壳聚醣5g配成2%水溶液，室温搅拌2小时得水溶液B；
步骤(c)，将水溶液B滴定入料至混合物A中，温度60°C下反应6小时，即得纳米硅凝胶；所述纳米硅凝胶在稀释至纳米硅的浓度为1%时，即得所述脱层纳米硅凝胶。
2.一种脱层纳米硅凝胶的制备方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，将硅土10g配成2%混合液，80°C下搅拌2小时后静置过夜，得混合物A；
步骤(b)，醋酸6g溶于水中，再加入壳聚醣12g配成2%水溶液，室温搅拌2小时得水溶液B；
步骤(c)，将水溶液B滴定入料至混合物A中，温度60°C下反应6小时，即得纳米硅凝胶；所述纳米硅凝胶在稀释至纳米硅的浓度为1%时，即得所述脱层纳米硅凝胶。
3.一种脱层纳米硅凝胶的制备方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，将硅土7g配成6%混合液，80°C下搅拌2小时后静置过夜，得混合物A；
步骤(b)，醋酸3g溶于水中，再加入壳聚醣3g配成6%水溶液，室温搅拌2小时得水溶液B；
步骤(c)，将水溶液B滴定入料至混合物A中，温度60°C下反应6小时，即得纳米硅凝胶；所述纳米硅凝胶在稀释至纳米硅的浓度为1%时，即得所述脱层纳米硅凝胶。
4.一种如权利要求1至3中任一权利要求所述的脱层纳米硅凝胶的制备方法制成的脱层纳米硅凝胶在制备抗细菌及病毒的粉剂产品或水剂产品的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌、沙门氏菌、赤痢螺旋体、链球菌、金黄色葡萄球菌、海洋弧菌。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌为抗药性金黄色葡萄球菌。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述病毒为冠状病毒、禽流感病毒、新型流感病毒、正黏液病毒科、副黏液病毒科。
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石光等.壳聚糖/钠基蒙脱土的溶液插层研究.《华南师范大学学报（自然科学版）》.2009,(第4期),61-64. *

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