CN111699390A - 弹性蛋白测定 - Google Patents
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Abstract
本文描述了单克隆抗体、测定试剂盒和用于定量患者生物流体样品中具有C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的弹性蛋白片段的免疫测定方法，以及它们在检测或定量纤维化疾病诸如慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及弹性蛋白测定和其在评估纤维化疾病诸如COPD中的用途。
背景技术
慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征在于气道炎症、中性粒细胞和肥大细胞浓度过高(1，2)。中性粒细胞和肥大细胞在响应促炎介质而从中释放的颗粒中合成并存储预先形成的丝氨酸蛋白酶，如组织蛋白酶G(CG)和蛋白酶3(PR3)。这些蛋白酶在一起具有针对细胞外基质(ECM)的广谱活性(3，4)。弹性纤维是肺的细胞外基质的主要不溶性组分，并且对细胞外基质的结构、功能、弹力以及弹性来说至关重要。弹性纤维由包埋在原纤蛋白微纤维中的交联弹性蛋白的内核芯构成(5)。它们在整个呼吸树上形成细且高度分支的网络，以支持呼吸期间肺泡的扩张和回缩。它们的特征在于健康的成人组织中的高稳定性和较低的转化。除选定的MMP外，只有少数蛋白酶诸如丝氨酸蛋白酶能够通过破坏弹性蛋白核心和微纤维来裂解弹性蛋白纤维(6-8)。在正常的炎性反应中，通过分泌内源性蛋白酶抑制剂(例如，硫酸乙酰肝素)来维持蛋白酶-抗蛋白酶的平衡(9)。在病理状态下，这一平衡被打破，导致弹性丧失，而这是COPD和肺气肿的主要病理特征(10，11)。已经提出丝氨酸蛋白酶CG和PR3在COPD中均被上调，但是目前没有能够将弹性蛋白降解的增加与那些蛋白酶相联系的标志物。
本发明人现在已经开发了一种用于监测弹性蛋白的PR3降解的免疫测定，并证明了其在评估纤维化疾病，特别是COPD中的用途。
发明内容
相应地，本发明的第一方面涉及一种用于定量患者生物流体样品中具有C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的肽的免疫测定方法，所述方法包括使所述患者生物流体样品与和所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)特异性反应的单克隆抗体接触，并且确定所述单克隆抗体和所述C端氨基酸序列之间的结合量。
优选地，所述单克隆抗体不特异性识别或结合所述C端氨基酸序列的C伸展的延长版本或所述C端氨基酸序列的C截短的缩短版本。在这一方面，“所述C端氨基酸序列的C伸展的延长版本”是指一种或多种氨基酸伸展超过所述序列LPGGYGLPYT-COOH(SEQ ID NO:1)的C端。例如，如果所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT-COOH(SEQ ID NO:1)延长一个苏氨酸残基，那么相应的“C伸展的延长版本”将是LPGGYGLPYTT-COOH(SEQ ID NO:2)。类似地，“所述C端氨基酸序列的C截短的缩短版本”是指一种或多种氨基酸从所述序列LPGGYGLPYT-COOH(SEQID NO:1)的C端移除。例如，如果所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT-COOH(SEQ ID NO:1)缩短一个氨基酸残基，那么相应的“C截短的缩短版本”将是LPGGYGLPY-COOH(SEQ ID NO:3)。
所述患者生物流体样品可以为，但不限于血液、尿液、滑液、血清、BALF(支气管肺泡灌洗液)或血浆。
免疫测定可以为，但不限于竞争测定或夹心测定。类似地，免疫测定可以为，但不限于酶联免疫吸附测定或放射免疫测定。
在第二方面，本发明涉及一种用于检测或定量患者的纤维化疾病的免疫测定方法，所述方法包括使患者生物流体样品与和C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)特异性反应的单克隆抗体接触，确定所述单克隆抗体与包括所述C端氨基酸序列的肽之间的结合量，并且将所述结合量与以下相关联：i)与正常健康受试者相关的值和/或ii)与已知纤维化疾病严重程度相关的值和/或iii)在先前时间点从所述患者获得的值和/或iv)预定的截断值。
优选地，所述纤维化疾病为慢性阻塞性肺疾病(COPD)。
所述预定的截断值优选地为至少150.0ng/mL，更优选为至少175.0ng/mL，甚至更优选为至少200.0ng/mL，甚至更优选为至少225.0ng/mL，并且最优选为至少250ng/mL。在这一方面，通过各种统计学分析的结合使用，发现单克隆抗体(如上所述)与C端生物标志物之间的结合量为至少150.0ng/mL或更大时可以确定存在纤维化，诸如COPD。具有至少150.0ng/mL，更优选至少175.0ng/mL，甚至更优选至少200.0ng/mL，甚至更优选至少225.0ng/mL，甚至最优选至少250.0ng/mL的统计截断值时，有可能利用本发明的方法以高置信度诊断纤维化，诸如COPD。或者，换句话说，将统计截断值应用于本发明的方法是特别有利的，因为它实现独立的诊断测定；即，它不再需要与健康个体和/或疾病严重程度已知的患者进行任何直接比较来得出诊断结论。当利用该测定评估已经具有通常指示纤维化的医学征象或症状诸如COPD(例如，通过体格检查和/或与医学专业人员的咨询确定)的患者时，这也可能特别有利，因为它可以作为确证初始预后的快速且有力的工具，从而使得可能不再需要更具侵入性的程序诸如内窥镜检查或活检，并加快合适治疗方案的开始。快速的结论性诊断可使得疾病在早期被发现和治疗。优选地，预定的截断值对应于在人血液、血清或血浆中测量的截断值。
优选地，所述单克隆抗体不特异性识别或结合所述C端氨基酸序列的C伸展的延长版本或所述C端氨基酸序列的C截短的缩短版本。术语“C伸展的”和“C截短的”如上所述。
所述患者生物流体样品可以为，但不限于血液、尿液、滑液、血清、BALF或血浆。
在第三方面，本发明涉及一种确定患者对纤维化疾病诸如COPD的治疗是否有积极响应的方法，其中所述方法包括使用以上所述的方法来定量至少两种生物流体样品中的包括C端氨基酸序列LPGGYGLPYT的肽的量，所述生物流体样品是在向所述患者施用治疗期间于第一时间点和至少一个随后的时间点从所述患者获得的，并且其中在治疗期间，从所述第一个时间点到所述至少一个随后的时间点，包括所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT的肽量的减少表明所述患者对所述治疗有积极响应。
上述方法还可用于确定新型疗法对治疗纤维化疾病诸如COPD的功效。在该方面，如果在使用所述新型疗法治疗期间，从所述第一时间点到所述至少一个随后的时间点，包括所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的肽的量减少了，那么将认为所述新型疗法是有效的。
在第四方面，本发明涉及一种单克隆抗体，其和C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQID NO:1)特异性反应。如本文中所使用，术语“单克隆抗体”延伸至和C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)特异性反应的完整单克隆抗体及其抗体片段诸如Fab、Fv等。
在第五方面，本发明涉及一种测定试剂盒，包括和C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQID NO:1)特异性反应的单克隆抗体，和以下至少之一：
-链霉亲和素包被的孔板
-生物素化的肽生物素-L-LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:5)，其中L是任选的接头
-用于夹心免疫测定的二抗
-包括C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的校准品肽
-抗体生物素化试剂盒
-抗体HRP标记试剂盒
-抗体放射性标记试剂盒
优选地，本发明的单克隆抗体针对具有氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的合成肽提出。
定义
如本文中所使用，术语“C端”是指多肽的末端，即在多肽的C端末端，而不应解释为在其普通方向上的含义。
如本文中所使用，术语“竞争性ELISA”是指竞争性酶联免疫吸附测定，并且是本领域技术人员已知的技术。
如本文中所使用，术语“夹心免疫测定”是指使用至少两种抗体来检测样品中的抗原，并且是本领域技术人员已知的技术。
如本文中所使用，术语“结合量”是指抗体与生物标志物之间的结合的定量，所述定量是通过将生物流体样品中的生物标志物的测量值与校准曲线进行比较来确定的，其中所述校准曲线是使用已知浓度的生物标志物的标准样品产生的。在本文公开的在生物流体中测量具有C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的C端生物标志物的特定测定中，使用已知浓度的校准肽LPGGYGLPYT(SEQ NO:1)的标准样品产生校准曲线。将在生物流体样品中测得的值与校准曲线进行比较，以确定样品中生物标志物的实际量。本发明利用分光光度分析来产生标准曲线并测量生物流体样品中的结合量。在下面列出的实例中，所述方法利用HRP和TMB产生可测量的颜色强度，所述颜色强度与结合量成正比，并且可由分光光度计读取。当然，也可以使用任何其他合适的分析方法。
如本文中所使用，“截断值”是指经统计学上确定为指示患者的纤维化疾病诸如COPD的高可能性的结合量，因为患者样品中等于或高于统计截断值的生物标志物的测量值对应于纤维化疾病诸如COPD的存在或可能性的至少70％的概率，优选地至少80％的概率，优选地至少85％的概率，更优选地至少90％的概率，最优选地至少95％的概率。
如本文中所使用，术语“与正常健康受试者相关的值和/或与已知疾病严重程度相关的值”是指针对被认为是健康的，即没有纤维化疾病诸如COPD的受试者，通过上述方法确定的ELP-3的标准化量，和/或针对已知患有已知严重程度的纤维化疾病诸如COPD的受试者，通过上述方法确定的ELP-3的标准化量。
如本文中所使用，“ELP-3”是指具有C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的肽，而“ELP-3ELISA”是指本文公开的定量样品中的具有C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ IDNO:1)的肽的特异性竞争性ELISA。
附图说明
图1：健康受试者和COPD患者中的ELP-3的测量值。
具体实施方式
实例
本公开的实施例描述于以下实例中，对其进行阐述以辅助理解本公开，并且不应将其视为以任何方式限制所附权利要求书中限定的公开内容的范围。阐述以下实例以便为本领域普通技术人员提供完整的公开内容并教示如何制造和使用所述实施例，而并不意在限制本公开的范围，也不意在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已经尽力确保所使用数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。
在以下实例中，采用以下材料和方法。
试剂
所示出实验中的使用的所有应用试剂均为来自西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯)和默克公司(Merck)(美国新泽西州怀特豪斯站)的高质量化学品。所使用的96孔链霉亲和素包被的微量滴定板来自瑞士巴塞尔的罗氏(Roche)。所应用的测定缓冲液由50mM Tris缓冲盐水(TBS)2g NaCl，pH 8.0组成。3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)来自丹麦生化诊断科技公司(Kem-EN-Tec Diagnostics)。用于免疫和测定开发的合成肽为1)免疫原性肽：KLH-CGG-LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:4)、生物素化肽：生物素-LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:5)、3)标准肽：LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)以及4)延长肽：LPGGYGLPYTT(SEQ ID NO:2)。所有合成肽均购自美国多肽公司(American PeptideCompany)，美国加利福尼亚州桑尼维尔。应用于体外裂解的试剂：弹性蛋白(西格玛，E7152)人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)蛋白(艾博抗(Abcam)，ab91099)、PR3(EPC ML734)以及complete蛋白酶抑制剂(罗氏1186153001)。
靶序列的选择
弹性蛋白(Uniprot:P15502-ELN_人)中对PR3具有特异性的裂解位点先前已通过质谱法进行了鉴定(12)。使用NPS@：网络蛋白质序列分析，对PR3产生的弹性蛋白十肽与其他蛋白质的十肽序列进行同源性分析。基于此，选择序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)用于ELP-3测定抗体开发。通过体外对弹性蛋白的PR3裂解的质谱法内部分析来验证经鉴定的序列的存在。
抗体开发
针对每个选定的靶序列，使用弗氏不完全佐剂(KLH-CGG-LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:4)，对4-6周龄的6只小鼠，使用200ul的乳化抗原(每次免疫50ug)在腹部皮下进行免疫。每两周进行四次初始免疫，然后每四周进行另外四次免疫。选择具有最高血清滴度的小鼠进行融合。让小鼠休息一个月，然后在分离脾脏的三天前用在100ul的0.9％NaCl溶液中的50ul免疫原性肽静脉内加强免疫。如Gefter等人所述，将脾细胞与SP2/o骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，并将其在培养皿中克隆(13)。将克隆接种到96孔微量滴定板中，以使用有限稀释方法确保单克隆生长，从而进一步生长。在间接ELISA中，使用链霉亲和素包被的板筛选产生抗体的杂交瘤的上清液对标准肽和天然物质的反应性。将生物素-LPGGYGLPYT(SEQ IDNO:5)用作筛选肽，而将标准肽LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)用作校准品以测试克隆的进一步特异性。
ELISA法
收集来自针对靶序列的选定克隆的上清液，并使用HiTrap亲和柱(通用电气生命科学部(GE Healthcare Life Science)，英国白金汉郡Little Chalfront)纯化单克隆抗体。
基于收集的抗体，开发ELP-3测定作为竞争性ELISA测定。用溶解于测定缓冲液中的100ul生物素化筛选肽(生物素-LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:5))，在20℃振荡下包被96孔链霉亲和素包被的微量滴定板(罗氏，瑞士巴塞尔)30分钟。将板在洗涤缓冲液(20mM TRIS，50mM NaCl，pH 7)中洗涤五次。加入样品/标准品/对照(20ul)，然后加入(100ul)单克隆抗体，并在4℃振荡下孵育3小时。孵育后，将板在洗涤缓冲液中洗涤五次。加入体积100ul的HRP标记的山羊抗小鼠第二抗体，然后在20℃振荡下孵育1小时。接着洗涤板并添加TMB，并以650nm作为参照，通过SpectraMax M酶标仪(美谷分子仪器(Molecular Devices)，美国加利福尼亚州)在450nm下对板进行分析。使用4-参数数学拟合模型绘制标准曲线。每个ELISA板均包含试剂盒对照，以监测批间变异。在测定范围内测量所有样品。低于定量下限(LLOQ)水平的所有样品均被赋予值LLOQ。
技术评估
为了确定健康人血清(n＝4)的稀释度的线性，应用了肝素血浆(n＝4)、柠檬酸盐血浆(n＝4)以及EDTA血浆。抗体特异性计算为2倍稀释的标准肽(LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1))、延长肽(LPGGYGLPYTT(SEQ ID NO:2))、无义肽(PGGVPGGVFY(SEQ ID NO:6))以及无义包被剂(LPGGYGLPYT-K-生物素(SEQ ID NO:7))的信号抑制百分比。通过未稀释样品的回收百分比评估线性。通过在两次确定中进行7个质量对照样品的10次独立测量，确定了批内和批间变异。检测下限(LLOD)确定为21个空白(缓冲液)样品的平均值+3x标准偏差(SD)。检测上限(ULOD)确定为标准品A的平均值–3x SD测量值。定量下限(LLOQ)确定为在人血清中测得的最低浓度，误差低于30％。在加标有标准肽的健康人血清样品和血清中测量准确性，然后计算为缓冲液中加标的肽或血清的回收率。通过计算未加标的健康血清中的分析物与加标有脂质(低＝4.83mM、高＝10.98mM)、血红蛋白(低＝0.155mM、高＝0.310mM)以及生物素(低＝30ng/ml、高＝90ng/ml)的人血清相比的回收率来测试测定的干扰。
分析物稳定性
通过将三种健康人血清和血浆样品在4或20℃下孵育2、4和24小时来评估分析物的稳定性，并计算为保持在-20C的样品(0小时样品)的百分比。另外，测定了三种健康人血清和血浆样品的冻融稳定性，最多进行四次冻融。
裂解分析
为了在体外产生ELP-3片段，将弹性蛋白与PR3或HNE在37℃下孵育2、4、24或48小时。将弹性蛋白在缓冲液(Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5)中重构，达到浓度1mg/ml。裂解溶液含有用于PR3的终浓度为100ug/ml的弹性蛋白和1ug/ml的蛋白酶，和用于HNE裂解(缓冲液：Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5)的终浓度为100ug/ml的弹性蛋白和2ug/ml的蛋白酶。所有溶液立即冷冻直到分析。
道德声明
对小鼠进行的工作已获得国家主管部门的批准(动物实验检查局，批准号：2013-15-2934-00956)。根据动物福利指南对所有小鼠进行处理。
在先前由Sand等人描述的队列中对COPD患者进行ELP-3评估(14)。研究包含68名参与者，且符合赫尔辛基宣言和临床试验管理规范，并已得到当地道德委员会的批准(协议编号H-6-2013-014)。在所有与研究相关的评估之前，已征得所有参与者的知情同意。
入选标准为COPD诊断和FEV1<预测值的80％。排除标准为研究前四周内COPD急性加重导致住院。将COPD患者的ELP-3水平与健康供体的商用对照血清的水平进行比较(Valley Bio-Medial，美国弗吉尼亚州温彻斯特)。所有测量均采用盲法进行。
统计分析
使用双侧曼-惠特尼非配对t检验评估健康对照和COPD患者的ELP-3水平之间的差异。使用曼-惠特尼非配对t检验对健康对照与COPD患者的年龄进行了比较。如果p<0.05，则认为差异具有统计学意义。星号(*)指示如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。图形示出为平均值±平均值的标准误差。所有统计分析均以GraphPad Prism版本7(Graph Pad Software，美国加利福尼亚州拉荷亚)或MedCalc(比利时奥斯坦德)进行。
结果
克隆表征
在间接ELISA中，筛选产生抗体的杂交瘤的上清液对标准肽、延长肽以及截短肽的反应性。肽生物素-LPGGYGLPYT用于筛选反应性。选择抗体克隆NBH116/6A10-E7-D12用于ELP-3，并从上清液中纯化抗体。基于此，建立竞争性ELISA测定。在血清和血浆中观察到天然反应性，且使用延长肽或无义肽未观察到抑制。
技术评估
根据标准曲线的线性范围确定测量值。批内和批间的平均变异分别为2.4-10％和4.7-14.5％。
当将人血清和柠檬酸盐血浆(而非EDTA和肝素血浆)稀释1+3时，观察到稀释度的线性。血清样品中加标有七种不同浓度的肽或另一种血清样品。血清和肽的加标回收率均在可接受的范围内。参照加标样品的预期浓度，平均回收率％值在±20％以内，并且因此是可接受的。在4℃和20℃的短期储存(最多48小时)期间，于冷冻/循环过程中，分析物稳定性是可接受的，并且血红蛋白、脂质或生物素均没有减少用于两种测定中任一种的信号。
体外分析——ELP-3由PR3生成
将弹性蛋白与不同的弹性蛋白酶进行孵育，以确定ELP-3是否对蛋白酶3裂解具有特异性。ELP-3在2-48小时后由PR3裂解的弹性蛋白产生。由HNE裂解产生可检测水平的ELP-3识别的片段，但相较于相应的测定浓度要低得多。测定中没有观察到与完整弹性蛋白、缓冲液对照或蛋白酶对照的交叉反应性。
与健康对照相比COPD中的ELP-3水平增加
为了确定COPD中ELP-3水平是否增加，在先前描述的68例临床稳定COPD患者的队列中评估了ELP-3。其中26名患者还参与了四个星期后进行的随访。包括来自健康供体的二十二个样品，以用于比较。患者参数见表1，并且之前已由Sand等人描述(14)。
表1.患者参数。平均值(SD)
如图1所表明，与健康受试者相比，COPD患者的ELP-3在统计学上升高(p<0.0001)。
在本说明书中，除非另有明确指示，否则词“或”的含义在于当满足所述条件中的一个或两个时返回真值的运算符，而不是要求仅满足所述条件之一的“异或”的运算符。词“包括”的含义在于“包含”，而不是“由……组成”。上文承认的所有先前教示均通过引用并入本文。
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<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C端生物标志物
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<220>
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1 5 10
Claims (13)
1.一种用于定量患者生物流体样品中具有C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的肽的免疫测定方法，所述方法包括使所述患者生物流体样品与和所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)特异性反应的单克隆抗体接触，并且确定所述单克隆抗体和所述C端氨基酸序列之间的结合量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述单克隆抗体不特异性识别或结合所述C端氨基酸序列的C伸展的延长版本或所述C端氨基酸序列的C截短的缩短版本。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述患者生物流体样品是血液、尿液、滑液、血清、BALF或血浆。
4.一种用于检测或定量患者的纤维化疾病的免疫测定方法，所述方法包括使患者生物流体样品与和C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)特异性反应的单克隆抗体接触，确定所述单克隆抗体和包括所述C端氨基酸序列的肽之间的结合量，并且将所述结合量与以下相关联：i)与正常健康受试者相关的值和/或ii)与已知纤维化疾病严重程度相关的值和/或iii)在先前时间点从所述患者获得的值和/或iv)预定的截断值。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述纤维化疾病是慢性阻塞性肺疾病(COPD)。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述预定的截断值为至少150.0ng/mL。
7.根据权利要求4至6所述的方法，其中所述单克隆抗体不特异性识别或结合所述C端氨基酸序列的C伸展的延长版本或所述C端氨基酸序列的C截短的缩短版本。
8.根据权利要求4至7所述的方法，其中所述患者生物流体样品是血液、尿液、滑液、血清、BALF或血浆。
9.一种确定患者对纤维化疾病的治疗是否有积极响应的方法，其中所述方法包括使用根据权利要求1至3所述的方法来定量至少两种患者生物流体样品中的包括C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的肽的量，所述患者生物流体样品是在向所述患者施用治疗期间于第一时间点和至少一个随后的时间点从所述患者获得的，并且其中在治疗期间，从所述第一个时间点到所述至少一个随后的时间点，包括所述C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQID NO:1)的肽量的减少表明所述患者对所述治疗有积极响应。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述纤维化疾病为COPD。
11.一种单克隆抗体，其和C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)特异性反应。
12.一种测定试剂盒，包括和C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)特异性反应的单克隆抗体，和以下至少之一：
-链霉亲和素包被的孔板
-生物素化的肽生物素-L-LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:5)，其中L是任选的接头
-用于夹心免疫测定的二抗
-包括C端氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的校准品肽
-抗体生物素化试剂盒
-抗体HRP标记试剂盒
-抗体放射性标记试剂盒
13.根据权利要求12所述的测定试剂盒，其中所述单克隆抗体针对具有氨基酸序列LPGGYGLPYT(SEQ ID NO:1)的合成肽提出。
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