CN111676243A - 一种胃粘膜上皮细胞特异性表达Cre酶的小鼠模型的制备方法 - Google Patents

一种胃粘膜上皮细胞特异性表达Cre酶的小鼠模型的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种胃粘膜上皮细胞特异性表达Cre酶的小鼠模型的制备方法，涉及小鼠模型技术领域；本发明将Cre‑2A基因序列插入Tff1基因起始密码子上游，最终实现小鼠胃黏膜上皮细胞特异性表达Cre酶，Cre酶的胃组织表达的特异性优于目前已经报道的同类模型，并且Tff1基因表达的胃黏膜上皮细胞与胃癌细胞起源一致，可将利用所述制备方法得到的小鼠模型用于胃癌领域的研究工作。

Description

一种胃粘膜上皮细胞特异性表达Cre酶的小鼠模型的制备 方法
技术领域
本发明属于小鼠模型技术领域，具体涉及一种胃粘膜上皮细胞特异性表达Cre酶的小鼠模型的制备方法。
背景技术
胃组织特异性的Cre小鼠模型，一直是胃相关疾病研究领域迫切需要的活体工具模型，截止目前全世界依然没有可商品化的科研用胃组织特异性的Cre小鼠模型，且现有的可用于胃疾病相关研究的Cre小鼠模型通常表现为其它组织器官与胃同时表达Cre酶(如Lgr5-Cre)，甚至还存在表达特异性差、Cre酶表达丰度以及稳定性低，导致目标基因编辑效率低、以及Cre酶的胃组织表达细胞与疾病起源细胞不完全一致，因此难以模拟疾病真实情况等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胃粘膜上皮细胞特异性表达Cre酶的小鼠模型的制备方法，利用Tff1基因启动子驱动Cre-2A基因在胃黏膜上皮细胞中特异表达，并且Tff1基因表达的胃黏膜上皮细胞与胃癌细胞起源一致，可将构建得到的小鼠模型用于胃癌领域的研究工作。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种胃粘膜上皮细胞特异性表达Cre酶的小鼠模型的方制备法，包括以下步骤：在小鼠Tff1基因起始密码子的5’段连接Cre-2A序列；所述Cre-2A序列如SEQID NO.1所示。
优选的，所述Cre-2A序列中的Cre来源于噬菌体，所述Cre的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
优选的，所述Cre-2A序列中的2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，在小鼠Tff1基因起始密码子的5’段连接Cre-2A序列后，形成的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述连接的方法包括CRISPR-Pro基因定点敲入法。
本发明提供了一种胃粘膜上皮细胞特异性表达Cre酶的小鼠模型的制备方法，将Cre-2A基因序列插入Tff1基因起始密码子上游，最终实现在小鼠胃黏膜上皮细胞特异性表达Cre酶，Cre酶的胃组织表达的特异性优于目前已经报道的同类模型，并且Tff1基因表达的胃黏膜上皮细胞与胃癌细胞起源一致，利用所述制备方法得到的小鼠模型可用于胃癌领域的研究工作。
附图说明
图1为Tff1-Cre小鼠DNA测序结果；
图2为Tff1-Cre小鼠中Cre特异性表达的实时荧光定量检测结果图；
图3为Tff1-Cre小鼠Cre蛋白的胃组织表达分布图。
具体实施方式
本发明提供了一种胃粘膜上皮细胞特异性表达Cre酶的小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：在小鼠Tff1基因起始密码子的5’段连接Cre-2A序列；所述Cre-2A序列如SEQID NO.1所示。
本发明优选将Cre-2A序列插入到小鼠Tff1基因起始密码子上游，且紧邻起始密码子ATG，所述插入的方法优选包括CRISPR-Pro基因定点敲入法。本发明对所述CRISPR-Pro基因定点敲入法的具体方法并没有特殊限定，利用本领域的常规CRISPR-Pro基因定点敲入法技术流程即可。本发明将所述Cre-2A序列插入到小鼠Tff1基因起始密码子上游，且紧邻起始密码子ATG，可实现利用Tff1基因启动子驱动Cre-2A基因转录，同时对内源Tff1基因自身转录形成的Tff1蛋白序列不产生额外的编辑影响。
在本发明中，所述Cre-2A序列中的Cre优选来源于噬菌体，更优选来源于噬菌体的pac-c1区域，所述Cre的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明中，所述Cre-2A序列中的2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：ggaagcggagccacgaacttctctgttaaagcaagcaggagatgttgaagaaaaccccgggcct。本发明所述2A序列优选来源于猪捷申病毒1型(Porcine Teschovirus-1)。本发明利用2A序列将所述Cre和Tff1基因序列进行连接，形成如SEQ ID NO.4所示的序列，由于2A肽的细胞内自我剪切特性，使转译完成后Cre与Tff1两个蛋白分开，独立进行折叠，互不影响蛋白正常生物学功能。
本发明利用所述制备方法得到的小鼠模型，在胃黏膜上皮细胞特异性表达Cre酶，并且Tff1基因表达的胃黏膜上皮细胞与胃癌细胞起源一致，可将利用所述制备方法得到的小鼠模型用于胃癌领域的研究工作。
下面结合实施例对本发明提供的胃粘膜上皮细胞特异性表达Cre酶的小鼠模型的制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.CRISPR载体构建
1)合成gRNA引物，引物退火
gRNA(匹配Tff1基因的反向链，SEQ ID NO.5):GTGCTCCATGGCAGCTTCACGGG；
退火的具体体系及程序如下：
引物序列：
F(SEQ ID NO.6):5'-CACCGGTGCTCCATGGCAGCTTCAC-3'；
R(SEQ ID NO.7):5'-AAACGTGAAGCTGCCATGGAGCACC-3'；
退火体系(10μL)：
Figure BDA0002483934370000031
退火PCR程序：37℃30min，95℃5min，95℃按5℃/min速度降温至25℃。
2)退火产物与线性化的pX330基本载体连接。
3)连接产物转化感受态，涂平板过夜培养；挑取单菌落，菌落PCR筛选阳性克隆；鉴定的阳性克隆进行测序验证；测序正确，说明已成功构建CRISPR载体。
2.Donor载体构建
1)为了设计Tff1基因靶向载体，利用C57BL/6文库中的BAC克隆RP24-186A14和RP23-371G13作为模板，通过高保真Taq DNA聚合酶PCR方法扩增具有重组同源臂的小鼠目的基因序列。
扩增引物序列及扩增程序如下：
引物序列：
5'arm-F(SEQ ID NO.8):5’-CTGGTACGCGGCCGCATTCTGGTACCACAGCCCGGCAGGACTAAGGAG-3’；
5'arm-R(SEQ ID NO.9):5’-GGACACCTTCCTCTTCTTCTTGGGCATGGCAGCTTCACGGGAAGAC-3’；
Cre-2A-F(SEQ ID NO.10):5’-GTCTTCCCGTGAAGCTGCCATGCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGTCC-3’；
re-2A-R(SEQ ID NO.11):5’-ACATCTCCTGCTTGCTTTAACAGAGAGAAGTTCGTGGCTCCGCTTCCATCGCCATCTTCCAGCAGGC-3’；
3'arm-F(SEQ ID NO.12):5’-TTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTATGGAGCACAAGGTGATCTGTGTCC-3’；
3'arm-R(SEQ ID NO.13):5’-AAGCTGTCGACGTACGTAGCAAGCTTCACTGTGCCCAGTGACAGAATAGG-3’。
扩增体系(50μL)：
Figure BDA0002483934370000041
扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火35s，72℃延伸60s，28个循环；72℃延伸5min。
2)将Cre-2A基因序列克隆进入Tff1基因ATG起始密码子上游，最终形成靶向Tff1基因Donor载体。
3.构建好的CRISPR载体和Cas9进行体外转录形成RNA
1)质粒线性化，体外转录试剂盒把线性化的DNA转录成RNA：
A.帽状RNA的合成
①在室温下加入试剂，按如下顺序设置转录反应:
线性化模板DNA与T7 RNAP启动子：1μg
10X MessageMAX T7转录缓冲液：2μL
MessageMAX ARCA Cap/NTP预混料：8μL
100mM DTT:2μL
ScriptGuard核糖核酸酶抑制剂:0.5μL
MessageMAX T7酶:2μL
RNase-Free H2O补足：20μL
②37℃孵育30分钟转录>500个碱基。37℃孵育2小时，观察转录本。
B.DNase I处理IVT反应
I.DNase I处理用于从IVT反应中去除DNA模板。
IVT反应(步骤A)：20μL
RNase-Free DNase I：1μL
反应总体积：21μL
II.37℃孵育15分钟。
III.继续RNA纯化。
C.转录产物的纯化。
2)PCR扩增gRNA，胶回收PCR产物，体外转录试剂盒把PCR产物转录成RNA：
A.组装反应混合物：
T7 10X 反应缓冲液 2μL
T7 ATP Solution(75mM) 2μL
T7 CTP Solution(75mM) 2μL
T7 GTP Solution(75mM) 2μL
T7 UTP Solution(75mM) 2μL
DNA<8μL
H20(Nuclease-free)to 20μL。
B.轻轻搅拌反应混合物
C.37℃孵育反应≥2小时
3)电泳鉴定转录的RNA是否降解，电泳合格的RNA用RNA纯化试剂盒纯化，电泳鉴定纯化后的RNA是否合格，纯化后的RNA用于后续受精卵注射。
4.转录RNA以及靶向Tff1基因Donor载体进行受精卵注射。
1)从交配后0.5天的供体母鼠子宫内获取受精卵。挑选形态良好、发育状态适中的受精卵，转移至注射皿的培养基内。
2)利用显微注射设备，将稀释后的RNA以及靶向Tff1基因Donor载体吸入注射针，将其逐个注射入细胞核。
5.代孕鼠制备及胚胎移植
1)选取适龄的母鼠与结扎公鼠合笼，获取代孕母鼠。
2)将注射RNA以及靶向Tff1基因Donor载体的受精卵移植入代孕母鼠的子宫内。
3)将代孕母鼠放在干净的笼盒中，并保温待其清醒后放回笼架饲养。
4)受精卵移植完成，待小鼠出生1周龄左右，剪小鼠脚趾送检PCR，编号，3周后进行分笼。
5)将得到的F0代小鼠进行目的基因的PCR扩增以及测序鉴定，筛选阳性鼠，结果如图1所示，Cre-2A基因序列成功插入Tff1基因起始密码子上游。
6.Trizol法提取小鼠胃、肺、肝、小肠等组织RNA，逆转录试剂盒将RNA逆转录形成cDNA，利用Cre特异性定量引物进行qPCR检测。检测用引物如下：
Cre-F(SEQ ID NO.14):ATTTGCCTGCATTACCGGTC；
Cre-R(SEQ ID NO.15):ATCAACGTTTTCTTTTCGG。
实时荧光定量检测结果如图2所示，仅在构建成的Tff1-Cre小鼠模型胃组织中检测到Cre的大量特异性表达，其它临近主要器官组织均未检测到Cre的mRNA表达，说明Tff1-Cre小鼠具有极高的胃组织Cre酶表达特异性。
7.将小鼠胃大弯组织纵切展开，结果如图3所示，取白色虚线部分组织利用Cre蛋白抗体进行Cre酶的免疫组织化学染色，染色结果表明Cre酶集中且特异的表达于Tff1-Cre小鼠胃体与胃窦部的黏膜上皮组织细胞中，与胃癌、胃炎等多数胃相关疾病起源定位一致。
综上可知，将Cre-2A基因序列插入Tff1基因起始密码子上游，可实现小鼠胃黏膜上皮细胞特异性表达Cre酶，并且Tff1基因表达的胃黏膜上皮细胞与胃癌细胞起源一致，可将利用所述制备方法得到的小鼠模型用于胃癌领域的研究工作。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 厦门大学附属中山医院
<120> 一种胃粘膜上皮细胞特异性表达Cre酶的小鼠模型的制备方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1114
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcccaaga agaagaggaa ggtgtccaat ttactgaccg tacaccaaaa tttgcctgca 60
ttaccggtcg atgcaacgag tgatgaggtt cgcaagaacc tgatggacat gttcagggat 120
cgccaggcgt tttctgagca tacctggaaa atgcttcagt ccgtttgccg gtcgtgggcg 180
gcatggtgca agttgaataa ccggaaatgg tttcccgcag aacctgaaga tgttcgcgat 240
tatcttctat atcttcaggc gcgcggtctg gcagtaaaaa ctatccagca acatttgggc 300
cagctaaaca tgcttcatcg tcggtccggg ctgccacgac caagtgacag caatgctgtt 360
tcactggtta tgcggcggat ccgaaaagaa aacgttgatg ccggtgaacg tgcaaaacag 420
gctctagcgt tcgaacgcac tgatttcgac caggttcgtt cactcatgga aaatagcgat 480
cgctgccagg atatacgtaa tctggcattt ctggggattg cttataacac cctgttacgt 540
atagccgaaa ttgccaggat cagggttaaa gatatctcac gtactgacgg tgggagaatg 600
ttaatccata ttggcagaac gaaaacgctg gttagcaccg caggtgtaga gaaggcactt 660
agcctggggg taactaaact ggtcgagcga tggatttccg tctctggtgt agctgatgat 720
ccgaataact acctgttttg ccgggtcaga aaaaatggtg ttgccgcgcc atctgccacc 780
agccagctat caactcgcgc cctggaaggg atttttgaag caactcatcg attgatttac 840
ggcgctaagg atgactctgg tcagagatac ctggcctggt ctggacacag tgcccgtgtc 900
ggagccgcgc gagatatggc ccgcgctgga gtttcaatac cggagatcat gcaagctggt 960
ggctggacca atgtaaatat tgtcatgaac tatatccgta acctggatag tgaaacaggg 1020
gcaatggtgc gcctgctgga agatggcgat ggaagcggag ccacgaactt ctctgttaaa 1080
gcaagcagga gatgttgaag aaaaccccgg gcct 1114
<210> 2
<211> 1050
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcccaaga agaagaggaa ggtgtccaat ttactgaccg tacaccaaaa tttgcctgca 60
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cgccaggcgt tttctgagca tacctggaaa atgcttcagt ccgtttgccg gtcgtgggcg 180
gcatggtgca agttgaataa ccggaaatgg tttcccgcag aacctgaaga tgttcgcgat 240
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gctctagcgt tcgaacgcac tgatttcgac caggttcgtt cactcatgga aaatagcgat 480
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ggctggacca atgtaaatat tgtcatgaac tatatccgta acctggatag tgaaacaggg 1020
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<210> 3
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaagcggag ccacgaactt ctctgttaaa gcaagcagga gatgttgaag aaaaccccgg 60
gcct 64
<210> 4
<211> 6197
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tacctgattg gctttccttc cctttttctt ttacttttct aaaaggaccc cactgcaaat 60
agggaatagt ctatggccac agcacccaga atgtccctgg tctcatctca aatagaaaaa 120
taaagaagga atcgcttagg tgagctggtc aagatgcacg tacagacatc agtgaggact 180
ctgagctctt gcaggttttc agggcccaag ctgtcagtgg ggcagactcc cgttgagtat 240
atttcctcag taagggacca aagagcaact tggtcatata ggcatgtgta aggatgaagc 300
aaatgatgca aagatgcacc ctacaggttc attccagcag aggagaggag caggccatca 360
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aaacaccttg taatcttacc cagcatggac cctcctttgg caaatgctcg ctcactctaa 780
gcaaatagac cggtggtata aagtcaagaa cgtggtgcaa gctcatccat cactcgtggt 840
cttcccgtga agctgccatg cccaagaaga agaggaaggt gtccaattta ctgaccgtac 900
accaaaattt gcctgcatta ccggtcgatg caacgagtga tgaggttcgc aagaacctga 960
tggacatgtt cagggatcgc caggcgtttt ctgagcatac ctggaaaatg cttcagtccg 1020
tttgccggtc gtgggcggca tggtgcaagt tgaataaccg gaaatggttt cccgcagaac 1080
ctgaagatgt tcgcgattat cttctatatc ttcaggcgcg cggtctggca gtaaaaacta 1140
tccagcaaca tttgggccag ctaaacatgc ttcatcgtcg gtccgggctg ccacgaccaa 1200
gtgacagcaa tgctgtttca ctggttatgc ggcggatccg aaaagaaaac gttgatgccg 1260
gtgaacgtgc aaaacaggct ctagcgttcg aacgcactga tttcgaccag gttcgttcac 1320
tcatggaaaa tagcgatcgc tgccaggata tacgtaatct ggcatttctg gggattgctt 1380
ataacaccct gttacgtata gccgaaattg ccaggatcag ggttaaagat atctcacgta 1440
ctgacggtgg gagaatgtta atccatattg gcagaacgaa aacgctggtt agcaccgcag 1500
gtgtagagaa ggcacttagc ctgggggtaa ctaaactggt cgagcgatgg atttccgtct 1560
ctggtgtagc tgatgatccg aataactacc tgttttgccg ggtcagaaaa aatggtgttg 1620
ccgcgccatc tgccaccagc cagctatcaa ctcgcgccct ggaagggatt tttgaagcaa 1680
ctcatcgatt gatttacggc gctaaggatg actctggtca gagatacctg gcctggtctg 1740
gacacagtgc ccgtgtcgga gccgcgcgag atatggcccg cgctggagtt tcaataccgg 1800
agatcatgca agctggtggc tggaccaatg taaatattgt catgaactat atccgtaacc 1860
tggatagtga aacaggggca atggtgcgcc tgctggaaga tggcgatgga agcggagcca 1920
cgaacttctc tgttaaagca agcaggagat gttgaagaaa accccgggcc tatggagcac 1980
aaggtgatct gtgtcctcgc tgtggtcctc atgctggcct tcggcagcct tgcccaggcc 2040
caggcccagg cccaggccca ggaaggtaag acaagacctc ttgtttccca ctgaccatgg 2100
ctgacagacg ctgggtccca gagcctattg tgatcgggta cttagttcta gcctttccct 2160
atgcagccaa tggtctgggc tcttgaaggc tgttaccatt tacaagaaca caagaactgg 2220
gatagatgga gcagcgggca gggccctagg acctatgagg atgcagggag aatgaagctt 2280
cttcagctgg gctccccttt gttgatgtga actgatctta tactgatctt agagcctcat 2340
ctccaaacgt gactttcagc ccaccgctcc cgggcaggca gccctgccca agtacttgtg 2400
ctgggactgg gccttcaaga gatccttcca gatcctgggc ccttggaccc ttaggatgca 2460
cccaggtctg ggagccaaac ccctcctgga cccctgtgtt atctccctag ccttcatccc 2520
tccttggagt ggaaggccat gtgacctagg acctttgccg gtaggatggg gacagcttct 2580
gccctcgtgg gtatcagtgg cttgtggcag cggctgtgtg taagctgagc tttgcccggc 2640
tgtgaagagc ttcgttctca gacacagtgc taaggaagag ggaacaggga agtttccagg 2700
ctgaggagca ttagagaaga gtgaagaatg ctctgcttac ccttttccag catcactgat 2760
gtcccttgag tgggaggagg tagttgggag agtggggagg agaaagggac cttataactg 2820
cctaggcccc tctgcaccag tctgtgacag aggacaagga gccagccagg ggactctgag 2880
ggagaagtaa atggctttgg agtagaaggt gaagggaggg gggtgcattc aacagctgct 2940
ccgtgctctc tccaggcccc cacccatacc ccagtaccag ccaccatgct ttcctctgcc 3000
ccatttcctg gaccagggct caacacctgt ttctgggtca catggtgacc ttgtttccat 3060
agaggtctat ctgtagatac gtagacatat cctataggat atggtggctg cctgcacctc 3120
tcctgaaggg agcttgcttt cagtaacttc ctcagatgac cacacaggtg caggcaggac 3180
agccatcttt aagtcctgct gggaaaggga gctggaagcc acaggggaac agcaacatcc 3240
cttcttcttc tggctactga ttctccacgg cctaaagggc tccttgtgac cccttattgt 3300
cctgtgctgt ggccagtgct catcttagct ttatattaga ggccagcacc cccgccccac 3360
aggtcaccag caagtagatg acaggtcccg atcttatctt gaaagataag agtccgttct 3420
tcaagaatgt ttcaggagat cctcacgcta ggaaagagtc ctagaggcaa cccctgatga 3480
atgcccccag gcttctggac cctgatacgt tcttgggaca cctactgtaa atgctcagcc 3540
ttctctacag ggacctttcc cctccctttc agtcttgacg tcctcagccc atctcgaggg 3600
ctcccgccag ccccaagcat aagccccaca cattgggatg gttgtactgt gtggctcacg 3660
tccttcatgg gtctgttagc ctctgaattc aggtgcaggg gtggagtcaa gcctgaaggt 3720
ctggcaaggt gttgcctttt cgttggctgg ctgtcatatt ggaaacaaag atacatcctc 3780
agatgtatcc tgctcaccag cttcccggaa gaaaaggaag ggggatgtaa gacctctgtt 3840
ttcgcctccc tattctgtca ctgggcacag tgtccttggc ttttgccaag tcagtacctc 3900
cacctagcca gcacacatat tgctcagtaa gtacttatta ggtgagcaga gtttactgag 3960
tgcagaagta caacaatgag caaacagtac atcacctaac aaatgcagct gaggaagcgg 4020
tggccctgga actgtcccag cgccaggctt gccgcatcta cagatgagga ctgtatcccc 4080
ttgcatattc aaacctggct tccccacagg cggcgtcctg tttcctcata gaaggaagca 4140
gtgtgacagc ccatgactca ccctgctttt tgtcctcact ttagaaacat gtatcatggc 4200
cccccgggag aggataaatt gtggcttccc cggtgtcacc gcccagcagt gcacggagag 4260
aggttgctgt tttgatgaca gtgtccgggg attcccgtgg tgcttccacc ccatggccat 4320
cgagaacact caagaaggta cagtcatctc tcagcacagt aggggataag gagttagtag 4380
ggagaatggc atgagactgt ggggccagtc cgtatctctg gttggtcttt ccctgtccct 4440
ggattcctgt gacatagctg aatccaggtc ttggggggtg aagggtcaag gctaaaagtc 4500
tggcaaagaa agggctcatt tttgcttggc cattccttgg gaatgctcac tggagcagtg 4560
aggggttggc aaaggaaatg tcaaggcagc ctctctgtgt gcagtgtgta cgtggttgtg 4620
gttgtgtgca tgcttgatgt gtggaggcca gatgtcaaca ccatgtctca tcactcagga 4680
gccactcttt ttttgagtca cccaccagga tgaatagata ggctggctgg ccagcaaatt 4740
tcaagaggcc ctcctgcctt catctccaca gtacagcttc ttgtgtggag ccggggactg 4800
aacacaggtc ctctaagctt gcaaggcggg cactttgcca acggagccat tccctcagtc 4860
ctgagtttgc actttgcaaa caatgttccc attgctgctt tgagtcaaag cttcccacaa 4920
ctgtttgtga aagagaaaga caacacttat tctcatgagt acccttgttg tatgaaacac 4980
caaaagacca ccaaggagcc aattccaatg ctatctcact tgggtcctta ttcaagctca 5040
agcttgggcc acaccaccat cagtgacaca gcaggacagg agggtgaagc cccgagccca 5100
gttgcaggca agcatttata gaggcaagca aacaagcaga gggtgtccag cctagcacac 5160
atctgatggg ggaggctatt atggaatttg atgcccttta aaagaattag ctggtgctgg 5220
gaaccaaacc ataaacttca cttctgcttt cttcctggtc agtagttatt agggagtgac 5280
tcagaaacta gtgctaggtg caggcttgtt ggttaactta ggtcaccttc tctaagatgg 5340
agcctgaacc caagatggag tttgtctggt ctctcaccct ttgttcttct ctctttagaa 5400
gaatgtccct tctaaggtcc atcctgagag aactggctac atcaagactt ggcaccctcc 5460
acctgggcac tggagccacc tggcccacct gctacataca cacctattct gtggctggat 5520
ctggctggtg acacagttca acccctcaga cttttagtcc tcgaattcgg cctgagaatt 5580
aaaagagatg aatgttattc tgtgttcgtc attctttaaa taaataaata aatatatata 5640
tatatacaca cacacacata tatatacaca cacatataat atatatatat acacacacac 5700
acacatacat acacacacac acacacacat atgccatttt cttttctctg atagtcaagg 5760
ggcactgttg ttttgtttac agactccttg tcatggatca gccattaacg ggagctgtcc 5820
agcggggtgg gggatgggag tgggtagctg tgagggtgat atatcctata gctgatgtag 5880
ttcggttgtt atcattgatg ttgagagcaa ggacagagac acccagggga ggacggattg 5940
accaagagct gagatcgatc ttccagtgat gctagggtta ttgtcaacgt gaggaccatt 6000
aaagacacaa tgaaaagcag aaaaaaggag atccatttaa tgtgggcaca ctggtaaggg 6060
aacaaggagg tccaatggtc ctccattcca ttcccgctcc acttttgggg tcctgtcatg 6120
aagtttaagt ttaaatacag gacaagaagt atgcacagct aagcagtctg gtcaatgcat 6180
ggttctatcc atcgcct 6197
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgctccatg gcagcttcac ggg 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccggtgct ccatggcagc ttcac 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaacgtgaag ctgccatgga gcacc 25
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctggtacgcg gccgcattct ggtaccacag cccggcagga ctaaggag 48
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggacaccttc ctcttcttct tgggcatggc agcttcacgg gaagac 46
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtcttcccgt gaagctgcca tgcccaagaa gaagaggaag gtgtcc 46
<210> 11
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acatctcctg cttgctttaa cagagagaag ttcgtggctc cgcttccatc gccatcttcc 60
agcaggc 67
<210> 12
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttaaagcaag caggagatgt tgaagaaaac cccgggccta tggagcacaa ggtgatctgt 60
gtcc 64
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aagctgtcga cgtacgtagc aagcttcact gtgcccagtg acagaatagg 50
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atttgcctgc attaccggtc 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atcaacgttt tcttttcgg 19

Claims (5)

1.一种胃粘膜上皮细胞特异性表达Cre酶的小鼠模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在小鼠Tff1基因起始密码子的5’段连接Cre-2A序列；所述Cre-2A序列如SEQ IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述Cre-2A序列中的Cre来源于噬菌体，所述Cre的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述Cre-2A序列中2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，在小鼠Tff1基因起始密码子的5’段连接Cre-2A序列后，形成的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求1或4所述制备方法，其特征在于，所述连接的方法包括CRISPR-Pro基因定点敲入法。
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