CN111658223A

CN111658223A - 一种受体牛的筛选方法

Info

Publication number: CN111658223A
Application number: CN202010528112.XA
Authority: CN
Inventors: 曾凡一; 曾溢滔; 黄淑帧; 邱瑾
Original assignee: Shanghai Taohua Biomedicine Technology Partnership Enterprise LP
Current assignee: Shanghai Taohua Biomedicine Technology Partnership Enterprise LP
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2020-06-11
Publication date: 2020-09-15

Abstract

本发明公开了一种受体牛的筛选方法。选择发情0天孕酮≤0.64nmol/L，且4‑8天孕酮2‑9nmol/L的牛为适合胚胎移植受体牛。本发明的方法对自然发情空怀牛、配种牛和胚胎移植受体牛不同生殖周期血液中的孕酮水平进行系统测定，以此为依据来检测跟踪牛的发情情况、并选择适合的移植受体牛，监测配种或胚胎移植受体牛的妊娠情况，建立标准化检测和跟踪方法，为提高配种或受体牛的妊娠率和生产效率提供参考依据。

Description

一种受体牛的筛选方法

技术领域

本发明属于现代畜牧业生产技术领域，具体涉及一种受体牛的筛选方法。

背景技术

哺乳动物的发情周期有着非常普遍的规律，通过对生殖激素变化的检测来辅助再生医学的实践已成为常态，而对于现代畜牧业生产、胚胎工程的研究及其高效应用同样也离不开精准的检测手段。精确判断母牛发情状态的技术手段是奶牛的人工授精及体外受精的胚胎移植能否成功的先决条件之一。在胚胎移植实验中，胚胎与受体的同步与否是妊娠能否成功建立的关键。胚胎移植成功的基本条件之一就是要保持受体母牛生理阶段与胚胎发育的一致性，这将直接影响受体牛怀孕及生产。

孕酮作为一种生殖激素，在母畜的发情周期和妊娠期呈规律性变化，且在妊娠的建立和维持过程中发挥着重要作用，可为观察和监测母畜妊娠以及提高人工授精、胚胎移植等胚胎工程技术的效率提供重要保障。然而在畜牧业生产过程中的常规和普遍操作仍是利用观察爬跨行为、情绪躁动、阴部粘液等表征等人工观察方法来判定其发情情况，而缺乏一个能有效利用孕酮检测方法的详细系统研究。这样的系统性研究对于提高现代繁育技术尤其是复杂的胚胎工程技术的成功率有着极其重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种受体牛的筛选方法。

一种受体牛的筛选方法，选择发情0天孕酮≤0.64nmol/L，且4-8天孕酮2-9nmol/L的牛为适合胚胎移植受体牛。

所述5天孕酮4-6nmol/L的牛为适合胚胎移植受体牛。

所述孕酮的检测采用尾静脉采血。

所述4天孕酮2-5nmol/L的牛为适合胚胎移植受体牛。

所述6天孕酮5-7nmol/L的牛为适合胚胎移植受体牛。

所述8天孕酮6-9nmol/L的牛为适合胚胎移植受体牛。

在母牛250-270天妊娠期内孕酮降至≤0.64nmol/L，判定为母牛流产或者返情。

本发明的有益效果：本发明的方法对自然发情空怀牛、配种牛和胚胎移植受体牛不同生殖周期血液中的孕酮水平进行系统测定，以此为依据来检测跟踪牛的发情情况、并选择适合的移植受体牛，监测配种或胚胎移植受体牛的妊娠情况，建立标准化检测和跟踪方法，为提高配种或受体牛的妊娠率和生产效率提供参考依据。

附图说明

图1为空怀母牛发情周期中血清孕酮浓度的变化(n＝16)。

图2为自然配种牛妊娠期血清孕酮浓度的变化(n＝13)。

图3为妊娠终止/不同时期返情母牛孕酮浓度变化(怀孕牛n＝10)。

图4为受体牛妊娠期血清孕酮浓度变化(n＝22)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

实验材料与方法

1、实验动物

所有实验用牛由上海滔滔转基因工程有限公司提供，选取营养状况良好、发育及繁殖正常、无临床可见病的适龄母牛。实验小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK(沪)2017-0005。

2、牛血样采集

将牛绑定，用注射器从牛尾部静脉采血3ml，缓慢注入到促凝采血管中，标注牛号和采血日期，-20℃冰箱储存。

3、发情与妊娠期的人工观察与血样采集

实验人员每日观察牛的行为，当牛出现爬跨行为、情绪躁动、阴部粘液等表征时判定其发情，观察到发情的当天定义为0d，并于发情0d采集血液检测孕酮浓度，之后每隔5d定期采血检测至20d。

配种或移植牛第一个发情周期(21d左右)结束时，若未观察到牛有返情表征，即初步判定为着床成功，同时每隔20d对受孕牛进行定期采血及孕酮测定。妊娠60d左右进行直肠触诊诊断受孕情况。受孕牛若出现返情症状，及时采血检测孕酮。

4、血清孕酮的检测方法

将收集血样放入Beckman低温离心机，经3500rpm/15min离心，取上清血清，利用Immulite2000(西门子)全自动化学发光免疫分析仪及配套孕酮试剂盒定量检测血清中的孕酮浓度。(注：可检测到的孕酮最低浓度为0.64nmol/L。)

5、胚胎移植

选择培养至7d的内细胞团致密、形态正常的A级/B级囊胚或桑椹胚装入移植管中，然后移入同期发情的受体母牛子宫角处。

6、统计分析

采用Excel进行数据统计分析，组间两两差异采用卡方检验分析，以P<0.05认为差异有统计学意义。

实施例1血清孕酮浓度在空怀母牛自然发情周期的检测

人工观察空怀母牛的行为。当牛出现爬跨行为、情绪躁动、阴部粘液等表征判定其发情，当天定义为0d，采集血液检测孕酮浓度，之后在5d、10d、15d和20d进行采血检测。

检测结果如图1所示，血清孕酮浓度在空怀母牛发情周期中的变化规律，牛发情0d血清孕酮浓度处于最低值(≤0.64nmol/L)，随后逐渐升高；发情5d的孕酮浓度约为4.83nmol/L；发情第10d左右达到峰值，孕酮浓度约为9.09nmol/L；发情15d之后孕酮浓度开始迅速下降，到最低值时进入下一个发情周期(一个发情周期平均为21天左右)。孕酮浓度呈先上升后下降的变化趋势。

实施例2血清孕酮浓度在母牛配种或者人工授精妊娠周期的检测人工观察母牛的行为，发情0d进行配种，在妊娠60d通过直肠触诊来诊断受孕情况，并在妊娠早期第20d、第40d，妊娠中期第60d、第90d、120d以及妊娠晚期第180d、第240d和第270d，进行尾静脉采血，检测血清孕酮浓度。

由图2可见，成功怀孕至生产的母牛，配种当天，即0d，孕酮浓度最低(≤0.64nmol/L)，之后逐渐升高，15d之后无孕酮浓度降低现象，且整个妊娠期维持较高水平；虽有轻微波动，但无显著降低，直到围产期(约270d)降到低水平。

当人工观察到怀孕母牛有返情或流产迹象时，采血检测孕酮。图3列举了多头在妊娠不同时期返情或发生了妊娠终止母牛的孕酮动态检测数据。妊娠终止后，母牛的血清孕酮浓度迅速降低到最低点。

实施例3血清孕酮浓度在胚胎移植受体牛发情、移植与妊娠期的检测

受体牛的选择：

人工观察牛的发情行为，实验组分别在发情0d和5d采血，测定血清孕酮浓度，进一步辅助判断牛发情时间，结合人工触摸黄体，选择适合的受体牛进行同步胚胎的移植。

基于以上对发情牛及配种牛怀孕的孕酮变化规律的研究，发现正常发情牛在发情0天的孕酮浓度均≤0.64nmol/L，第5天孕酮浓度集中在5nmol/L左右。因此我们初步筛选发情0天孕酮≤0.64nmol/L，且5天孕酮2-8nmol/L的牛为适合胚胎移植受体牛。

表1受体牛发情人工观察与孕酮检测结果

表1显示，根据孕酮检测方法测定发情0d和5d的血清孕酮浓度，从人工观察到有发情表征的247头候选受体牛中，筛选出发情正常、适合胚胎移植的受体牛120头，占人工观察到发情数的48.6％，排除了一半以上不符合移植要求的受体牛。

在胚胎移植实验中，胚胎与受体的同步与否是妊娠能否成功建立的关键。本研究采用的孕酮筛选法，保证了实际移植的受体牛准确的同步发情状态，避免了克隆胚胎的浪费。

血清孕酮浓度在胚胎移植受体牛整个妊娠期的检测

根据发情0d和5d的孕酮浓度选择受体牛进行胚胎移植，一个情期后(约21d)，孕酮处于高水平且未观察到牛有返情表征的母牛，初步判定为胚胎着床成功。之后在妊娠期早期、中期和晚期的不同阶段动态测定孕酮浓度，结果如图4所示。受体牛与自然配种牛妊娠期血清孕酮浓度的变化规律一致，受体牛整个妊娠期血清孕酮浓度维持在高水平，围产期孕酮浓度降低。

发明人的研究发现，通常情况下在母牛平均21天一个发情周期中发情0d血清孕酮浓度处于低于设备可测量的最低值(≤0.64nmol/L)，随后逐渐升高，在发情第10d左右达到峰值(9.09nmol/L)。而自然配种成功的母牛妊娠期血清孕酮浓度逐渐升高，整个妊娠期虽有轻微波动但基本维持较高水平，直到围产期再次降到低水平。对于某些妊娠提前终止及不同时期返情母牛孕酮浓度变化的观察发现，当妊娠终止后，其孕酮浓度迅速降低到最低点。

通过人工观察和人工观察结合孕酮检测的实验对比研究(表2)，发现后者远远优于传统手段。由此建立了利用孕酮检测来观察母牛发情情况和观测妊娠状态以及运用到胚胎移植受体牛选择的标准技术流程和方案。

表2胚胎移植受体牛妊娠率情况总结

注：同一列相同字母a代表差异不显著(P>0.05)；同一列不同字母a、b代表差异显著(P<0.05)。对照组：人工观察选择的受体牛的妊娠情况，实验组：在人工观察的基础上结合孕酮筛选的受体牛的妊娠情况。

在人工观察到发情的母牛中，通过孕酮检测0d和5d数值来判断得出的受体牛用于胚胎移植同期发育的囊胚或桑椹胚，在不同妊娠阶段继续追踪观察受体牛生理状态和监测血清孕酮水平，直至牛犊出生。值得注意的是，对照组受体牛在妊娠60d前显示的怀孕率高于实验组，尤其是20d妊娠率显著高于实验组，这和对照组的数据只采用了人工观察的方法监测返情，存在错看、漏看等问题，且未能及时排除返情及流产的受体牛相关，以致存在大量假阳性妊娠牛的情况。通常情况，在胚胎移植受体牛第一个发情周期结束时，若未观察到受体牛有返情表征，即初步判定为着床成功。但实际上会存在部分观察遗漏，如夜间返情观察不到，或返情现象不明显等。另一个情况可能因为凭借人工观察有些母牛存在假发情的情况，或者虽然发情但由于卵巢或子宫的生理状态不太好，胚胎移植到这部分牛之后会使胚胎无法着床从而浪费掉宝贵的胚胎。

选择合适的移植受体有助于胚胎移植后在子宫的着床和发育，对移植后受体准确的妊娠诊断能够减少受体牛的空怀期，提高受体牛的利用率，节约生产成本，这对于胚胎移植这一类系统性工程尤其重要。本研究实验组产犊率达到11.7％，且显著高于对照组的1.65％和领域里的均值，说明利用孕酮检测辅助筛选受体牛有助于提高胚胎移植效率。结合孕酮水平的测定，我们能较为准确地排除掉着床失败的受体牛。另外，相比人工观察需要实验人员具备专业技术、丰富的经验和大量时间的跟群观察，采用孕酮测定的操作更为简单准确。

本研究利用血清孕酮来检测母牛的发情状态，找到能准确评估母牛生理情况的参考指标，建立可靠有效的检测方法。并由此延伸，通过改善受体牛的选择策略来提高胚胎移植的效率。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种受体牛的筛选方法，其特征在于，选择发情0天孕酮≤0.64nmol/L，且4-8天孕酮2-9nmol/L的牛为适合胚胎移植受体牛。

2.根据权利要求1所述受体牛的筛选方法，其特征在于，所述5天孕酮4-6nmol/L的牛为适合胚胎移植受体牛。

3.根据权利要求1所述受体牛的筛选方法，其特征在于，所述孕酮的检测采用尾静脉采血。

4.根据权利要求1所述受体牛的筛选方法，其特征在于，所述4天孕酮2-5nmol/L的牛为适合胚胎移植受体牛。

5.根据权利要求1所述受体牛的筛选方法，其特征在于，所述6天孕酮5-7nmol/L的牛为适合胚胎移植受体牛。

6.根据权利要求1所述受体牛的筛选方法，其特征在于，所述8天孕酮6-9nmol/L的牛为适合胚胎移植受体牛。

7.根据权利要求1所述受体牛的筛选方法，其特征在于，在母牛250-270天妊娠期内孕酮降至≤0.64nmol/L，判定为母牛流产或者返情。