CN111655864A - 评价未分化细胞的状态的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于，提供能够在不破坏细胞的情况下评价未分化细胞的状态的方法。通过提供一种评价未分化细胞的状态的方法来解决上述课题，所述评价未分化细胞的状态的方法包括：测定包含未分化细胞的液体的液相级分中的选自miR371、miR372和miR373中的至少1种miRNA的工序；和基于该miRNA的测定值评价该未分化细胞的状态的工序。

Description

评价未分化细胞的状态的方法及其应用
技术领域
本发明涉及评价未分化细胞的状态的方法。本发明涉及试剂盒。本发明涉及扩增产物的检测方法。本发明涉及监测未分化细胞的诱导操作的方法。
背景技术
多能干细胞作为对实现细胞移植等再生医疗而言发挥重要作用的细胞源而备受期待。但是，目前所建立的干细胞株为未分化程度各异的不均匀的细胞团，细胞株间的分化特性、多分化能力不同。例如，以往的人胚胎干细胞(ES细胞)不仅包含处于植入前胚阶段的未分化细胞，而且包含处于各种发生阶段的未分化细胞。另外已知，以往的人诱导多能干细胞(iPS细胞)也是重编程为各种发生阶段的不均匀的细胞团。故而，即使使用同一方案对多能干细胞进行分化诱导，分化诱导的效率也会产生大的偏差。
近年来，提出将多能干细胞分类为原始型(naive state)和始发型(primedstate)的方案。原始型多能干细胞已知为具有相当于植入前胚的性质的细胞，可以维持均匀且稳定的基态(ground state)。另外，始发型多能干细胞已知为具有相当于植入后胚的性质的细胞，是发生阶段比原始型有了进展的细胞。原始型多能干细胞具有高于始发型多能干细胞的自复制能力和多分化能力，因此在再生医疗领域中受到关注。因此，期望建立具有维持基态的原始型性质的干细胞株。近年来，相继报道了建立具有高均匀性且显示维持基态的原始型表型的人干细胞的方法。
如上所述，期望将原始型的人干细胞应用于再生医疗中。但是，如果干细胞团并非均匀地具有原始型表型则分化诱导效率会产生偏差。为了将高品质的未分化细胞用于再生医疗，需要评价未分化细胞的状态的手段。目前，作为原始型多能干细胞的评价方法，有原始相关基因的表达分析等。例如，非专利文献1公开了在原始型多能干细胞中转录因子TFE3定位于核内这一点。非专利文献2公开了：与始发型多能干细胞相比，原始型多能干细胞的微RNA(miRNA)的miR371-373簇的细胞内表达量增加。但是，这些表达分析为破坏性检查，会由于品质评价而消耗贵重的未分化细胞。
作为非破坏性检查的例子，已知根据细胞集落形态的差异来区分始发型和原始型的方法。但是，用显微镜观察全部细胞样品的方法需要巨大的劳动量。另外，其为基于细胞形态观察的检查，因此并不客观。非专利文献3公开了通过测定多能干细胞的培养上清中的miRNA量来评价该细胞的多能性的方案。但是，非专利文献3中成为检测对象的miRNA为已知仅存在于小鼠中的miRNA。另外，非专利文献3中，对于依据miRNA量判别人多能干细胞的原始型和始发型这一点没有进行研究。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Gafni O.等,Derivation of novel human ground state naivepluripotent stem cells,Nature,2013,vol.504,p.282-286
非专利文献2:Rosa A.等,Regulatory non-coding RNAs in pluripotent stemcells,Int.J.Mol.Sci.,2013,vol.14,p.14346-14373
非专利文献3:Zhang Y.等,A non-invasive method to determine thepluripotent status of stem cells by culture medium microRNA expressiondetection,Sci.Rep.,2016,6:22380
发明内容
本发明的目的在于，提供能够在不破坏细胞的情况下评价未分化细胞的状态的方法。本发明人新发现，与发生阶段进一步进展的未分化细胞相比，更接近早期胚的未分化细胞会向细胞外释放大量的miR371、miR372和miR373。并且发现，通过测定细胞培养液的液相成分中的miR371、miR372和miR373可以评价未分化细胞的状态，从而完成了本发明。
用于解决课题的手段
因此，本发明提供一种评价未分化细胞的状态的方法，其包括：测定包含未分化细胞的液体的液相级分中的选自miR371、miR372和miR373中的至少1种miRNA的工序；和基于该miRNA的测定值评价该未分化细胞的状态的工序。
本发明提供一种试剂盒，其为用于上述方法的试剂盒，其包含至少一种能够与选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA杂交的引物。
本发明提供一种扩增产物的检测方法，其包括：取得包含未分化细胞的液体的液相级分的工序；将该液相级分中所含的选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA、引物和聚合酶混合而制备反应液的工序；和在该反应液中扩增包含上述miRNA的cDNA的DNA片段并检测扩增产物的工序。
本发明提供一种监测未分化细胞的诱导操作的方法，其中，在从始发型未分化细胞向原始型未分化细胞的诱导操作前，取得包含未分化细胞的液体的液相级分，取得该液相级分中的选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA的第1测定值，在从始发型未分化细胞向原始型未分化细胞的诱导操作中取得包含未分化细胞的液体的液相级分，取得该液相级分中的选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA的第2测定值，对该第1测定值和该第2测定值进行比较，从而监测上述未分化细胞的诱导操作。
本发明提供一种监测未分化细胞的诱导操作的方法，其中，在从始发型未分化细胞向原始型未分化细胞的诱导操作中的第1时刻取得包含未分化细胞的液体的液相级分，取得该液相级分中的选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA的第1测定值，在从始发型未分化细胞向原始型未分化细胞的诱导操作中的第2时刻取得包含未分化细胞的液体的液相级分，取得该液相级分中的选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA的第2测定值，对该第1测定值和该第2测定值进行比较，从而监测上述未分化细胞的诱导操作。
本发明提供一种试剂盒，其包含选自3’末端侧具有下述(1)的碱基序列的引物、3’末端侧具有下述(2)的碱基序列的引物、3’末端侧具有下述(3)的碱基序列的引物和3’末端侧具有下述(4)的碱基序列的引物中的至少一种。
5’-ACACT-3’···(1)
5’-GCACT-3’···(2)
5’-ACGCT-3’···(3)
5’-ACACC-3’···(4)
本发明提供一种混合液，其包含未分化细胞的细胞培养液的液相级分、逆转录酶、能够与选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA杂交的引物和dNTPs。
发明的效果
根据本发明，能够在不破坏细胞的情况下评价未分化细胞的状态。
附图说明
图1A为实施例1中制备的始发型iPS细胞的明视野图像。
图1B为实施例1中制备的原始型iPS细胞的明视野图像。
图2为具有定位于核内的TFE3的细胞的明视野图像和免疫染色图像。
图3为对于原始型iPS细胞和始发型iPS细胞，分别示出具有定位于核内的TFE3的细胞的比例的图表。
图4为对于miR371、miR372和miR373，分别将始发型iPS细胞的培养上清中的表达量设为1时的原始型iPS细胞的培养上清中的相对表达量的图表。
具体实施方式
[1.未分化细胞的评价方法]
本实施方式的未分化细胞的评价方法(以下也简称为“方法”)中，测定包含未分化细胞的液体的液相级分中的选自miR371、miR372和miR373中的至少1种miRNA。
本实施方式的方法中使用的试样为包含未分化细胞的液体的液相级分。“包含未分化细胞的液体”是指：在培养容器中处于与未分化细胞相接触的状态或浸渍未分化细胞的状态的、可以以能够使其存活的方式保持未分化细胞的液体。在包含未分化细胞的液体中，未分化细胞既可以在可以以能够使其存活的方式保持未分化细胞的液体中悬浮，也可以在该液体中沉降或附着于培养容器的底部。
可以以能够使其存活的方式保持未分化细胞的液体只要不会在规定时间内使未分化细胞死亡或严重损伤未分化细胞就没有特别限定。例如，可列举未分化细胞用的液体培养基、生理盐水、缓冲液(例如PBS、HEPES)等。这些中，优选未分化细胞用的液体培养基。在使用液体培养基作为可以以能够使其存活的方式保持未分化细胞的液体的情况下，本说明书中也将包含未分化细胞的液体称为“未分化细胞的细胞培养液”。
本说明书中，“液相级分”是指包含未分化细胞的液体的溶液部分中的全部或一部分，基本上不含细胞。包含未分化细胞的液体的液相级分优选为培养上清。培养上清为未分化细胞的细胞培养液的液相级分。
可以从公知的液体培养基中根据未分化细胞的种类适当选择未分化细胞用的液体培养基。作为这样的液体培养基，可列举例如IMDM培养基、Medium 199培养基、EMEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、MEF-CM、StemPro(商标)34(Invitrogen公司)、Essential 8(商标)(Thermo Fisher Scientific公司)、hPSC Growth Medium DXF(商标)(宝生物公司)、StemFit(商标)AK02N(宝生物公司)、ReproNaive(商标)(ReproCELL公司)、和这些的混合培养基等。
培养基可以包含细胞的增殖和维持所必需的成分。可列举例如：血清、白蛋白、转铁蛋白、血清替代品(Knockout(商标)SerumReplacement)(KSR公司)、N2补充剂(Invitrogen公司)、B27补充剂(Invitorogen公司)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、2-巯基乙醇、硫代甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax(商标)(Invitorogen公司)、非必需氨基酸、维生素、生长因子、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等。
当未分化细胞为多能干细胞时，可以向培养基中添加维持存活或未分化状态所必需的成分。作为这样的成分，可列举白血病抑制因子(LIF)、活化素、成纤维细胞增殖因子(FGF)、干细胞因子(stem cell factor)、MEK抑制剂、GSK3抑制剂、ROCK抑制剂等。
本实施方式中，未分化细胞只要是具有分化能力的细胞就没有特别限定。作为未分化细胞，可列举干细胞和祖细胞。作为干细胞，有多能干细胞和体干细胞。多能干细胞为具有分化成源自外胚层、内胚层和中胚层的细胞的能力(分化多能性；pluripotency)且具有增殖能力的干细胞。作为多能干细胞，可列举例如人工多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)、核移植ES细胞(ntES细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)等。
iPS细胞是通过将Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2等规定的重编程因子(DNA或蛋白质)导入皮肤细胞等体细胞而制作的、具有多分化能力和增殖能力的干细胞。ES细胞是源自哺乳动物囊胚的内部细胞块的干细胞，是具有多分化能力和增殖能力的干细胞。ntES细胞是由源自克隆胚的囊胚内部细胞块建立的ES细胞，其中，所述克隆胚是将未受精卵的核与体细胞的核置换而得到的。ntES细胞具有与ES细胞几乎相同的性质。EG细胞是由胎生期的原始生殖细胞建立的、具有与ES细胞同样的多能性的细胞。EG细胞可通过在LIF、碱性FGF(bFGF)、干细胞因子等物质的存在下培养原始生殖细胞从而建立。
体干细胞是存在于各种组织、在该组织供给新细胞的干细胞。体干细胞的分化能力与多能干细胞相比是受到限制的。作为体干细胞，可列举例如间充质干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、肝干细胞、生殖干细胞、造血干细胞、骨骼肌干细胞等。
祖细胞是由干细胞产生并分化为终末分化细胞的细胞。终末分化细胞是指：不具有分化能力、在胚胎学上的细胞谱系中达到终末分化的细胞。作为祖细胞，可列举例如血小板祖细胞、肝脏祖细胞、心脏祖细胞、神经祖细胞等。
未分化细胞优选为多能干细胞，更优选为iPS细胞、ES细胞、ntES细胞或EG细胞。在本实施方式中，未分化细胞可以是处于从不具有分化能力的细胞向具有分化能力的细胞进行诱导的中间阶段的细胞。作为这样的细胞，可列举例如为了制作iPS细胞而导入了规定的重编程因子的体细胞等。
未分化细胞可以是从生物体采集的未分化细胞，也可以是对从生物体采集的分化细胞进行重编程、从而人工制备的细胞。从再生医疗研究和临床应用的观点出发，优选人工制备的多能干细胞。未分化细胞的来源没有特别限定。优选为人、猴、狗、猫、马、小鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠、兔、绵羊、猪、牛等哺乳动物来源。
近年来，提出将多能干细胞分类为原始型和始发型的方案。“原始型多能干细胞”是指：发生阶段相当于植入前胚的多能干细胞。“始发型多能干细胞”是指：发生阶段相当于植入后胚的多能干细胞。已知的是，通常，原始型多能干细胞为与始发型多能干细胞相比维持着均匀的基态、显示高多分化能力的细胞。另外，作为原始型和始发型的多能干细胞各自的特征，已知以下特征。
＜原始型多能干细胞的特征＞
·细胞的集落小且具有圆台状的形态
·整个基因组的DNA普遍去甲基化
·X染色体为活化状态(XaXa)
·规定的转录因子(例如TFE3)定位于核内的比例高
＜始发型多能干细胞的特征＞
·细胞的集落大且具有平坦的形态
·DNA的甲基化
·X染色体为非活化状态(XaXi)
·规定的转录因子(例如TFE3)定位于核内的比例低
在小鼠ES细胞的情况下，可以通过用包含LIF、MEK抑制剂和GSK3抑制剂的化学合成培养基2i/LIF培养基进行培养来得到原始型的ES细胞。另一方面，在以往的培养方法的情况下，人ES细胞和人iPS细胞显示相当于植入后胚的性质，被分类为始发型。近年来，报道了通过向始发型的人多能干细胞中导入NANOG基因和KLF2基因而诱导为原始型的方法(参照Takashima Y.等,Cell,vol.158,p1254-1269,2014)。另外，还已知不进行基因导入也能从始发型诱导为原始型的液体培养基(以下也称为“诱导培养基”)。作为这样的诱导培养基，可列举ReproNaive(商标)(ReproCELL公司)等。
一实施方式中，未分化细胞为始发型多能干细胞、原始型多能干细胞或它们的混合物，但是为哪一种是不明确的。另一实施方式中，未分化细胞为通过与本发明的方法不同的方法而判断为始发型和原始型中的何者的细胞。这种情况下，可以利用本实施方式的方法对为始发型多能干细胞和原始型多能干细胞中的何者进行再验证。另外，未分化细胞可以为处于从始发型向原始型进行诱导的中间阶段的多能性细胞。作为这样的细胞，可列举例如导入了NANOG基因和KLF2基因的多能干细胞、将液体培养基更换为诱导培养基的多能干细胞。
关于未分化细胞的培养方法，可以根据未分化细胞的种类从公知的培养方法中适当选择。细胞培养中，通常使用悬浮培养、粘附培养或将这些组合使用。悬浮培养是指：在对于培养容器无粘附性的条件下进行的培养。悬浮培养中，细胞未必需要分散在液体培养基中，也可以是细胞沉降到培养容器的底部。悬浮培养中使用的培养容器没有特别限定，可列举例如烧瓶、培养皿、平板、室、管等。悬浮培养中使用的培养容器优选为非细胞粘附性的。培养容器优选为疏水性的材质或者表面以用于防止细胞粘附的涂敷剂(例如，聚甲基丙烯酸羟基乙酯共聚物等)被覆。
粘附培养是指：将细胞粘附于支撑体而进行的培养。作为支撑体，使用培养容器。粘附培养中使用的培养容器没有特别限定。粘附培养中，可以使用与悬浮培养中使用的培养容器同样的培养容器，培养容器的表面或内部优选被使细胞粘附的涂敷剂(也被称为细胞培养基质、粘附基质等)被覆。作为涂敷剂，可列举例如明胶、层粘连蛋白、胶原蛋白、聚-D-赖氨酸、聚鸟氨酸、纤连蛋白、玻连蛋白等。也可以使用包含层粘连蛋白511-E8片段的iMatrix-511(nippi公司)等市售品。另外，作为支撑体，也可以使用公知的支架。通过使用支架，未分化细胞以支架为立足点而增殖，能够进行三维培养。作为这种支架，可以使用市售品，可列举例如Matrigel(商标)(康宁公司)、QGel(商标)MT 3D Matrix(Qgel SA公司)、3-D Life Biomimetic(Cellendes公司)、Puramatrix(3D MATRIX公司)、alvetex(reinnavate公司)等。
根据需要，也可以与饲养细胞一起培养未分化细胞。饲养细胞的种类没有特别限定，可以从公知的饲养细胞中适当选择。可列举例如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、小鼠胚胎成纤维细胞株(STO)、SL10细胞、SNL细胞等。
可以根据未分化细胞的种类来适当调整培养条件。例如，培养温度优选为约30～40℃，二氧化碳浓度优选为约1～10％。
本实施方式的方法中，作为要测定miRNA的试样，采集包含未分化细胞的液体的液相级分。从包含未分化细胞的液体中取得液相级分的方法没有特别限定。作为取得液相级分的方法，在悬浮培养的情况下，可通过对包含未分化细胞的液体进行离心，取得离心后的上清来作为本实施方式的液相级分。细胞在液体中会沉降，因此可以在分散细胞的基础上从培养容器的下部取得液相级分。也可以用过滤器过滤包含未分化细胞的液体而分离为包含细胞的级分和液相级分，从而取得液相级分。
在粘附培养的情况下，细胞粘附在培养容器的底部，因此可以通过用移液管等抽吸培养容器内的上清来取得本实施方式的液相级分。
在取得的液相级分中可能混入有细胞时，可以通过对该液相级分进行离心分离或过滤器过滤等来分离·除去细胞。
从包含未分化细胞的液体中取得液相级分的时期没有特别限定。在向收容有可以以能够使其存活的方式保持未分化细胞的液体、优选液体培养基的培养容器中播种未分化细胞后，可以在任意的时刻采集液相级分。另外，可以在培养基交换后采集液相级分。例如，可以在从培养容器内所培养的未分化细胞中除去液体培养基、更换为可以以能够使其存活的方式保持未分化细胞的液体后，在1～168小时后采集液相级分。或者，可以将预先适当培养的未分化细胞转移到收容有可以以能够使其存活的方式保持未分化细胞的液体的另一培养容器中并在1～168小时后采集液相级分。
成为本实施方式的测定对象的miRNA为miR371、miR372和miR373。miR371形成包含miR371a和miR371b的家族。人的编码miR371、miR372和miR373的基因簇存在于19号染色体，形成miR371-373簇。本说明书中，“miR371-373簇的miRNA”是指：由这些基因转录而得的miRNA。以下，将“测定选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA”也称为“测定miR371-373簇的miRNA”。
miRNA在由基因转录后经过pri-miRNA和pre-miRNA而成熟。在本实施方式中，优选测定成熟miRNA。将miR371a、miR371b、miR372和miR373的成熟miRNA的核苷酸序列分别示于序列号1～4。需要说明的是，在GenBank数据库中，编码这些miRNA的基因分别如表1那样进行了公开。
[表1]
基因 GenBank登录号
miR371a基因 NR_029864.1
miR371b基因 NR_039909.1
miR372基因 NR_029865.1
miR373基因 NR_029866.1
miRNA的测定方法没有特别限制，可以使用公知的方法。可列举例如：利用探针的杂交的测定法、利用核酸扩增法的测定法、利用质量分析法的测定法、利用测序的测定法等。作为利用探针的杂交的测定法，可列举例如：微阵列法、Northern杂交法、RNase保护分析等。作为利用核酸扩增法的测定方法，可列举例如定量RT-PCR法、定量RT-LAMP法等。作为定量RT-PCR法，可列举例如SYBR(商标)Green法、TaqMan(商标)法等。由于扩增对象即miRNA短，因此在利用核酸扩增的方法中通常使用茎环引物、poly(A)添加法等。
本实施方式的方法中，基于miRNA的测定值来评价未分化细胞的状态。miRNA的测定值可以是miR371a的测定值、miR371b的测定值、miR372的测定值和miR373的测定值中的任一种，也可以是这些中的至少2种测定值的合计值。另外，miR371的测定值可以是miR371a的测定值、miR371b的测定值、或这些的合计值。
本说明书中“测定值”为反映液相级分中的miRNA的存在量的值。可列举例如：光学测定值(荧光强度、浊度、吸光度等)、光学测定值达到规定的基准值时的反应循环数或反应时间、使用标准曲线计算而得的miRNA定量值(拷贝数、质量、浓度)等。可根据表示miRNA的存在量或浓度的值的种类来适当设定规定的基准值。例如，在使用定量RT-PCR法的情况下，可以以规定的循环数为基准值来设定核酸扩增反应显示指数扩增时的荧光强度的变化量。
在多能干细胞中，miR371、miR372和miR373具有在细胞内与特定的mRNA结合、抑制其翻译为蛋白质的功能，因此而知晓其存在于细胞内。但是，并不知晓miR371、miR372和miR373会释放到多能干细胞的细胞外。本发明人意外地发现miR371、miR372和miR373会被释放到多能干细胞的细胞外。特别是发现了：与始发型多能干细胞相比，原始型多能干细胞会向细胞外释放更大量的miR371、miR372和miR373。因此，在本实施方式中，当未分化细胞为多能干细胞时，可以使用miRNA的测定值作为包含未分化细胞的液体中的原始型多能干细胞的存在指标。
从始发型未分化细胞向原始型未分化细胞的诱导操作是指：用于将始发型未分化细胞向原始型未分化细胞诱导的、对始发型未分化细胞所进行的规定处理。作为这样的处理，可列举例如上述的基因导入和其后的细胞培养、在诱导培养基中的培养等。诱导操作中是指：诱导操作的开始后且完成前。
如上所述，与始发型多能干细胞相比，原始型多能干细胞更接近早期胚，因此认为原始型多能干细胞在再生医疗中是有用的。至完成诱导、即由始发型未分化细胞得到原始型未分化细胞通常需要数小时至数周。本实施方式的方法中，上述miRNA的测定值成为原始型多能干细胞的存在指标，因此可以监测诱导操作中的多能干细胞的状态。这种情况下，从由始发型向原始型的诱导操作中的多能干细胞的细胞培养液中采集液相级分，将该液相级分用于miRNA测定。
例如，在从始发型未分化细胞向原始型未分化细胞的诱导操作开始前和诱导操作中测定液相级分的miRNA，对得到的2个测定值进行比较。在诱导操作开始前的miRNA测定值与诱导操作中的miRNA测定值之间没有明显差异时，判断诱导操作未能很好地进行，可以中断诱导操作。当诱导操作中的miRNA测定值高于诱导操作开始前的miRNA测定值时，判断很好地进行了诱导操作，可以继续进行诱导操作。或者，判断始发型多能干细胞已被诱导为原始型多能干细胞而可以结束诱导操作。
在另一例中，在诱导操作中的多个时刻测定miR371-373簇的miRNA，对测定值进行比较，由此可以监测向原始型的诱导进行情况。具体而言，首先在向原始型的诱导操作中的第1时刻从细胞培养液中采集液相级分，测定miR371-373簇的miRNA而取得第1测定值。接着，在向原始型的诱导操作中的第2时刻从细胞培养液中采集液相级分，测定miR371-373簇的miRNA而取得第2测定值。然后对第1测定值和第2测定值进行比较，可以评价诱导的进行情况。例如，当第2测定值高于第1测定值时，判断很好地进行了诱导，可以继续进行诱导操作。或者判断为始发型已被诱导为原始型，可以结束诱导操作。
又一实施方式中，将结束了向原始型的诱导操作后的包含多能干细胞的液体的液相级分用于miRNA测定。即使诱导操作本身已结束，多能干细胞也未必全部成为原始型，可能残留始发型多能干细胞。如上所述，始发型和原始型的多能干细胞混杂的细胞团会产生分化诱导效率的偏差，因此作为用于再生医疗的多能干细胞而言品质下降。因此，作为结束了诱导操作后的细胞团的品质检查，基于miRNA的测定值来判定多能干细胞为原始型或是混杂有始发型。该判定结果可以用于例如评价多能干细胞的品质等。判定可以通过比较miRNA的测定值和规定的阈值来进行。例如，当miRNA的测定值为第1阈值以上时，可以判定未分化细胞为原始型多能干细胞。这种情况下，可以作出如下判断：诱导后的多能干细胞可用于再生医疗或用于再生医疗研究等中。当miRNA的测定值低于第1阈值时，可以判定未分化细胞中混有始发型多能干细胞。这种情况下，可以作出如下判断：进一步进行诱导操作等。
又一实施方式中，在从始发型向原始型的诱导中和诱导结束后进行多能干细胞的状态的评价。这种情况下，可以进行诱导的进行情况的监测和诱导后的多能干细胞的品质检查。
另一实施方式中，可以将本实施方式的方法与其它方法组合来判定未分化细胞是原始型还是始发型。例如，可以综合考虑集落的形态、核内的TFE3定位、本实施方式的方法等来进行判定。另一例中，可以用本实施方式的方法验证利用集落的形态、核内的TFE3定位等方法得到的判断结果。
上述的任一实施方式中，可以在开始进行从始发型向原始型的诱导时在将培养基更换为新培养基时将原培养基用于miRNA测定。
根据试验、研究等的目的，有时也需要始发型多能干细胞。在又一实施方式中，基于miRNA的测定值判定多能干细胞是否为始发型。可以通过miRNA的测定值与规定的阈值的比较来进行判定。与原始型多能干细胞相比，始发型多能干细胞向细胞外释放的miR371、miR372和miR373的量少。因此，规定的阈值优选为低于上述的第1阈值的值。这里，将低于第1阈值的规定的阈值称为第2阈值。miRNA的测定值低于第2阈值时，可以判定未分化细胞为始发型多能干细胞。miRNA的测定值为第2阈值以上时，可以判定未分化细胞中混有原始型多能干细胞。
优选在实施本实施方式的方法前预先设定规定的阈值。例如，分别准备多个仅包含原始多能干细胞的细胞培养液的液相级分、包含处于从始发型向原始型的诱导操作中的多能干细胞的细胞培养液的液相级分、和仅包含始发型多能干细胞的细胞培养液的液相级分，对各液相级分测定miR371-373簇的miRNA。然后，将可以以最好的精度区分仅包含原始型多能干细胞的细胞培养液的值设定为第1阈值。同样地，将可以以最好的精度区分仅包含始发型多能干细胞的细胞培养液的值设定为第2阈值。
本实施方式中包括对原始型多能干细胞的存在量进行半定量检测的方案。半定量检测是指：将多能干细胞的存在量以“-”、“+”、“++”(阴性、弱阳性、强阳性)等方式来分等级示出。原始型多能干细胞的半定量检测可以通过将miRNA的测定值与多个阈值进行比较来进行。作为多个阈值，可以使用例如上述的第1阈值和第2阈值。具体的判定如下所述。当miRNA的测定值低于第2阈值时，可以判定为不存在原始型多能干细胞的“-”。当miRNA的测定值为第2阈值以上且低于第1阈值时，可以判定为存在少量的原始型多能干细胞的“+”。当miRNA的测定值为第1阈值以上时，可以判定为存在原始型多能干细胞的“++”。
[2.试剂盒]
本发明的范围中还包括用于上述本实施方式的评价未分化细胞的状态的方法的试剂盒。本实施方式的试剂盒包含至少一种能够与选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA杂交的引物。该引物可以是用于上述miRNA的逆转录反应的引物(以下也称为“RT引物”)，也可以是用于扩增由上述miRNA合成的cDNA的正向引物和/或反向引物(以下也称为“cDNA扩增用引物”)。本实施方式的试剂盒可以包含RT引物和cDNA扩增用引物这两者。
在使用引物测定成熟miRNA的情况下，由于成熟miRNA的核苷酸长度较短，因此可以使用茎环引物作为逆转录用引物和/或cDNA扩增用引物。上述的引物可以结合于平板、粒子等固相。
本发明的范围还包含一种试剂盒，其包含选自3’末端侧具有下述(1)的碱基序列的引物、3’末端侧具有下述(2)的碱基序列的引物、3’末端侧具有下述(3)的碱基序列的引物、和3’末端侧具有下述(4)的碱基序列的引物中的至少一种。
5’-ACACT-3’···(1)
5’-GCACT-3’···(2)
5’-ACGCT-3’···(3)
5’-ACACC-3’···(4)
该试剂盒可以用于上述本实施方式的评价未分化细胞的状态的方法。另外，该试剂盒也可以用于后述的扩增产物的检测方法。
上述(1)～(4)的碱基序列分别为与序列号1～4的碱基序列的3’末端起的5个碱基互补的序列。上述引物由于在3’末端侧具有这些碱基序列，因此可以与miR371a、miR371b、miR372和miR373的各成熟miRNA进行杂交。并且通过聚合酶而延长引物的3’末端，从而合成该成熟miRNA的5’末端侧的互补链。这些引物中，可以在上述(1)～(4)的碱基序列的5’末端侧添加任意的碱基序列。
这些引物可以是RT引物，也可以是cDNA扩增用引物。这些引物的形状可以为线性引物，也可以为茎环引物。这些引物可以结合于平板、粒子等固相。
上述任一试剂盒中，均可以包含缓冲液、dNTPs(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)、聚合酶等其它试剂。
[3.扩增产物的检测方法]
本发明的范围中还包括一种检测扩增产物的方法(以下也称为“检测方法”)，其检测液相级分中所含的源自选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA的扩增产物。本实施方式的检测方法中，首先取得包含未分化细胞的液体的液相级分。关于未分化细胞、包含该细胞的液体、该液体的液相级分和该液相级分的取得的详细情况，与对于上述本实施方式的方法的描述相同。
然后，将液相级分中所含的选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA、引物和聚合酶混合而制备反应液。在本实施方式中，优选从液相级分中提取miRNA。可以通过公知的方法来进行miRNA的提取。例如，通过对液相级分进行苯酚/氯仿提取，可以回收包含miRNA的总RNA。需要说明的是，也可以使用市售的试剂盒来进行miRNA自液相级分的提取和纯化。
作为引物，可列举用于逆转录反应的引物、cDNA扩增用引物。在通过2步、即分次进行自miRNA的cDNA合成和cDNA扩增的情况下，用于逆转录反应的引物可以是随机引物，也可以是能够与miR371、miR372和miR373的各成熟miRNA杂交的引物。在通过1步、即同时进行自miRNA的cDNA合成和cDNA扩增的情况下，作为用于逆转录反应的引物，使用能够与miR371、miR372和miR373的各miRNA杂交的引物。作为cDNA扩增用引物，使用能够对由上述miRNA合成的cDNA进行扩增的正向引物和反向引物。可以根据miR371、miR372和miR373的各成熟miRNA的碱基序列来适当设计各引物。
可以从公知的逆转录酶和公知的DNA聚合酶中适当选择聚合酶。作为逆转录酶，可列举例如AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶等。作为DNA聚合酶，可列举例如Taq聚合酶、Pfu聚合酶、Tth聚合酶等。另外，也可以使用市售的RT-PCR试剂盒或实时RT-PCR试剂盒来制备反应液。
在本实施方式中，在以1步来进行自miRNA的cDNA合成和cDNA扩增的情况下，例如可以如下制备反应液。将由液相级分制备的包含miRNA的液体、能够与作为测定对象的miRNA杂交的逆转录用引物、能够对由该miRNA合成的cDNA进行扩增的正向引物和反向引物、以及逆转录酶和DNA聚合酶混合。可以向其中进一步加入缓冲液、dNTPs等核酸扩增反应所必需的试剂。
在以2步来进行自miRNA的cDNA合成和cDNA扩增的情况下，例如可以如下制备反应液。首先，将由液相级分制备的包含miRNA的液体、逆转录用引物和逆转录酶混合，由此制备逆转录用反应液。可以向其中进一步加入缓冲液、dNTPs等核酸扩增反应所必需的试剂。然后使用逆转录用反应液进行逆转录反应。然后，将反应结束后的逆转录用反应液、能够对cDNA进行扩增的正向引物和反向引物、和DNA聚合酶混合。由此可以得到cDNA扩增用反应液。可以向其中进一步加入缓冲液、dNTPs等核酸扩增反应所必需的试剂。
在本实施方式中，在制备的反应液中扩增包含上述miRNA的cDNA的DNA片段并检测扩增产物。可以在适合于miRNA的逆转录和cDNA的扩增的公知条件下进行扩增反应。另外，扩增反应可以使用市售的热循环仪、实时PCR装置来进行。
本说明书中，“检测”包括：定性判定扩增产物是否存在；对扩增产物进行定量；及半定量地检测扩增产物的存在量。半定量的检测是指：将扩增产物的存在量以“-”“+”“++”(阴性、弱阳性、强阳性)等方式分等级地示出。
检测扩增产物的手段没有特别限定，可以从公知的方法中适当选择。例如，可以通过从供于核酸扩增反应后的反应液中取得荧光强度、浊度、吸光度等光学信息来检测扩增产物。例如，可以通过使用SYBR(商标)Green等能够与双链DNA结合的荧光物质的嵌入剂法测定荧光强度，来检测扩增产物。另外，可以通过使用TaqMan(商标)探针等、用荧光物质修饰5'末端且用淬灭物质修饰3'末端的探针的方法来检测由该探针产生的荧光，从而检测扩增产物。这样的探针可按照与检测对象的扩增产物中不同于上述引物所杂交的区域的区域进行杂交的方式来设计。
例如，在得到检测到扩增产物这一结果的情况下，该结果表示液相级分中包含上述miRNA。如上所述，本发明人发现原始型多能干细胞会向细胞外释放miR371、miR372和miR373。因此，在本实施方式中，检测结果也可以作为包含未分化细胞的液体中的原始型多能干细胞的存在指标来使用。
在本实施方式中，在取得液相级分之前，可以在包含未分化细胞的液体中将该未分化细胞诱导为原始型多能干细胞。例如，在未分化细胞为始发型多能干细胞时，可以通过上述的基因导入或在诱导培养基中的培养将始发型多能干细胞诱导为原始型多能干细胞。在本实施方式中，可以使用由诱导后的包含未分化细胞的液体采集的液相级分来制备反应液，并且检测源自选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA的扩增产物。这种情况下，检测结果可以用于监测从始发型向原始型的诱导状况。
本发明的另一实施方式为一种混合液，其包含未分化细胞的细胞培养液的液相级分、逆转录酶、能够与选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA杂交的引物、和dNTPs。能够与选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA杂交的引物为选自3’末端侧具有下述(1)的碱基序列的引物、3’末端侧具有下述(2)的碱基序列的引物、3’末端侧具有下述(3)的碱基序列的引物、和3’末端侧具有下述(4)的碱基序列的引物中的至少一种。
5’-ACACT-3’···(1)
5’-GCACT-3’···(2)
5’-ACGCT-3’···(3)
5’-ACACC-3’···(4)
上述的混合液可以进一步包含用于扩增由miRNA合成的cDNA的DNA聚合酶。关于逆转录酶、DNA聚合酶和引物的详细情况，如上述所述。
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例限制。
实施例
实施例1
(1)iPS细胞的制备
实施例1中，使用由iPS PORTAL公司获得的人iPS细胞HPS0063(201B7克隆)来作为iPS细胞。HPS0063细胞为始发型iPS细胞，在用通常的ES/iPS细胞用培养基培养时维持始发型。始发型iPS细胞可以通过用ReproNaive(商标)等原始型iPS细胞诱导培养基培养而在不进行基因导入的情况下诱导为原始型。实施例1中，按照下述步骤培养HPS0063细胞，分别得到始发型iPS细胞和原始型iPS细胞。
(1.1)始发型iPS细胞的制备
向维持培养的培养基Stem Fit(商标)AK02N(宝生物公司制)中，以终浓度达到10μM的方式加入10mM Y-27632，混合，制备培养基。将制备的培养基(1mL)添加到内部涂敷有细胞培养基质iMatrix-511(nippi公司制)的6孔板(Iwaki公司制)中。向其中添加用上述培养基预先培养的iPS细胞(105cells/1.0mL)，在CO2培养箱内(37℃、5％CO2)培养1天。培养后回收培养上清。图1A示出培养后的细胞的明视野图像。
(1.2)原始型iPS细胞的制备
向ReproNaive(商标)Basal Medium(5mL,ReproCELL公司制)中加入ReproNaive(商标)Supplement(34.0μL,ReproCELL公司制)、10μg/mL LIF(10μL)和10mM Y-27632(5μL)而制备培养基。将制备的培养基(1mL)添加到播种有SL10饲养细胞的6孔板(Iwaki公司制)中。向其中添加用上述培养基预先培养的iPS细胞(105cells/1.0mL)，在CO2培养箱内(37℃、5％CO2)培养1天。培养后，回收培养上清。图1B示出培养后的细胞的明视野图像。
(1.3)测定样品的制备
将上述(1.1)中回收的上清50μL和上述(1.2)中回收的上清50μL作为测定样品。另外，作为阴性对照，使用不含细胞的未供于细胞培养的培养基Essential 8(Gibco公司制)50μL。
(2)转录因子TFE3的免疫染色
在播种有SL10饲养细胞的6孔板(Iwaki公司制)上，与上述(1.1)同样地培养人iPS细胞(201B7株)。另外，在用iMatrix-511(nippi公司制)进行了涂敷的另一6孔板上，与上述(1.2)同样地培养201B7株。将这些孔板上的iPS细胞用含有2％多聚甲醛的PBS固定。用PBS洗涤固定后的iPS细胞，用含有0.5％皂甙和0.1％BSA的PBS进行透明处理。然后，将iPS细胞与用含有0.5％皂甙和0.1％BSA的PBS溶液稀释成1：50的Alexa Fluor(商标)647标记兔抗TFE3抗体(ab210650、Abcam公司制)的溶液、稀释成1：1000的Hoechst(同仁化学公司制)的溶液一起在室温下孵育30分钟。将iPS细胞用含有0.5％皂甙和0.1％BSA的PBS洗涤3次。用成像流式细胞仪(ImageStreamX MarkII Imaging FlowCytometer、Amnis公司制)观察由此进行了免疫染色的iPS细胞。图2示出具有定位于核内的TFE3的细胞的一例。图2中，左侧示出明视野图像(BF)、核、TFE3和核/TFE3(Merge)。
(3)TFE3定位于核内的iPS细胞的计数
对上述(2)中进行了免疫染色的6孔板上的细胞中的、具有定位于核内的TFE3的iPS细胞进行计数，计算其比例。图3中，对于原始型iPS细胞和始发型iPS细胞，分别示出具有定位于核内的TFE3的细胞的比例。
(4)培养上清中的miRNA的测定
使用High Pure miRNA isolation kit(Roche Diagnostics公司)，从上述(1)中取得的各测定样品中回收总RNA。对得到的总RNA(1μL)进行定量RT-PCR，分别测定miR302d、miR367、miR371、miR372和miR373。定量RT-PCR使用TaqMan(商标)MicroRNAReverseTranscription Kit、TaqMan(商标)MicroRNA Assays和TaqMan(商标)UniversalMaster Mix II、Applied Biosystems(商标)7500fast(ThermoFisher Scientific公司制)按照添付方案来进行。图4中，对于各miRNA，示出将始发型iPS细胞的培养上清中的表达量设为1时的原始型iPS细胞的培养上清中的相对表达量。
(5)结果
如图1A所示，在维持始发型的培养条件下，iPS细胞形成平坦且大的集落。这是始发型细胞的集落的特征性形态，表示可以制备始发型iPS细胞。如图1B所示，在诱导为原始型的培养条件下，iPS细胞形成圆台状且小的集落。这是原始型细胞的集落的特征性形态，表示可以制备原始型iPS细胞。另外，如图3所示，在制备的原始型iPS细胞中，可以以高于始发型iPS细胞的比例确认TFE3的核内定位。如非专利文献1也记载那样，TFE3具有如下特征：在原始型iPS细胞中定位于核内，在始发型iPS细胞中分散于细胞质整体。由这些结果可确认，本实施例中能分别了制备原始型iPS细胞和始发型iPS细胞。
如图4所示，可知：与始发型iPS细胞的培养上清相比，原始型iPS细胞的培养上清中，miR371、miR372和miR373的量显著多。这表明，可以基于未分化细胞的培养上清中所含的miR371、miR372和miR373的测定值来判定该未分化细胞处于原始型和始发型中的哪一种状态。另一方面，培养上清中的miR302和miR367的量在始发型iPS细胞的培养上清与原始型iPS细胞的培养上清之间未观察到差异。在此，已知miR302和miR367在原始型iPS细胞中的表达量高。此次的定量测定结果中，也确认miR302和miR367的测定值高于miR371、miR372和miR373。由此，即使原始型iPS细胞中miRNA的表达量高，表达量高的miRNA也未必释放到细胞外，不能说可以将该miRNA用于本实施方式的评价方法。
序列表
<110> 希森美康株式会社
<120> 评价未分化细胞的状态的方法及其应用
<130> 18066WO1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 1
aagugccgcc aucuuuugag ugu 23
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 2
aagugccccc acaguuugag ugc 23
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 3
aaagugcugc gacauuugag cgu 23
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人
<400> 4
gaagugcuuc gauuuugggg ugu 23

Claims (20)

1.一种评价未分化细胞的状态的方法，其包括：
对包含未分化细胞的液体的液相级分中的选自miR371、miR372和miR373中的至少1种miRNA进行测定的工序；和
基于所述miRNA的测定值评价所述未分化细胞的状态的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述未分化细胞为多能干细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述多能干细胞为iPS细胞、ES细胞、ntES细胞或EG细胞。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述miRNA的测定值为所述液体中的原始型多能干细胞的存在指标。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的方法，其中，所述miRNA的测定值为第1阈值以上时，判定所述未分化细胞为原始型多能干细胞。
6.根据权利要求2～5中任一项所述的方法，其中，所述miRNA的测定值低于第2阈值时，判定所述未分化细胞为始发型多能干细胞。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述包含未分化细胞的液体为所述未分化细胞的细胞培养液。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述miR371为miR371a或miR371b。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述miRNA的测定值为miR371a测定值、miR371b测定值、miR372测定值、miR373测定值或这些中的至少2个测定值的合计值。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述miRNA的测定值是通过定量RT-PCR法测定的。
11.一种试剂盒，其为用于权利要求1～10中任一项所述的方法的试剂盒，其包含至少一种能够与选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA杂交的引物。
12.一种扩增产物的检测方法，其包括：
取得包含未分化细胞的液体的液相级分的工序；
将所述液相级分中所含的选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA、引物和聚合酶混合而制备反应液的工序；和
在所述反应液中对包含所述miRNA的cDNA的DNA片段进行扩增，检测扩增产物的工序。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述检测结果成为所述液体中的原始型多能干细胞的存在指标。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其进一步包含下述工序：在所述取得工序之前，在所述液体中将所述未分化细胞诱导为原始型多能干细胞。
15.一种监测未分化细胞的诱导操作的方法，其中，
在从始发型未分化细胞向原始型未分化细胞的诱导操作前，取得包含未分化细胞的液体的液相级分，取得所述液相级分中的选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA的第1测定值；
在从始发型未分化细胞向原始型未分化细胞的诱导操作中取得包含未分化细胞的液体的液相级分，取得所述液相级分中的选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA的第2测定值；
对所述第1测定值和所述第2测定值进行比较，从而监测所述未分化细胞的诱导操作。
16.一种监测未分化细胞的诱导操作的方法，其中，
在从始发型未分化细胞向原始型未分化细胞的诱导操作中的第1时刻，取得包含未分化细胞的液体的液相级分，取得所述液相级分中的选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA的第1测定值；
在从始发型未分化细胞向原始型未分化细胞的诱导操作中的第2时刻，取得包含未分化细胞的液体的液相级分，取得所述液相级分中的选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA的第2测定值；
对所述第1测定值和所述第2测定值进行比较，从而监测所述未分化细胞的诱导操作。
17.一种试剂盒，其包含选自3’末端侧具有下述(1)的碱基序列的引物、3’末端侧具有下述(2)的碱基序列的引物、3’末端侧具有下述(3)的碱基序列的引物、和3’末端侧具有下述(4)的碱基序列的引物中的至少一种，
5’-ACACT-3’ ···(1)
5’-GCACT-3’ ···(2)
5’-ACGCT-3’ ···(3)
5’-ACACC-3’ ···(4)。
18.一种混合液，其包含未分化细胞的细胞培养液的液相级分、逆转录酶、能够与选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA杂交的引物、和dNTPs。
19.根据权利要求18所述的混合液，其中，所述引物为选自3’末端侧具有下述(1)的碱基序列的引物、3’末端侧具有下述(2)的碱基序列的引物、3’末端侧具有下述(3)的碱基序列的引物、和3’末端侧具有下述(4)的碱基序列的引物中的至少一种，
5’-ACACT-3’ ···(1)
5’-GCACT-3’ ···(2)
5’-ACGCT-3’ ···(3)
5’-ACACC-3’ ···(4)。
20.根据权利要求18或19所述的混合液，其中，所述液相级分包含选自miR371、miR372和miR373中的至少一种miRNA。
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