CN111643671B - 一种促进毛细胞再生和听力恢复的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种促进毛细胞再生和听力恢复的组合物及其用途。所述组合物包括Wnt激动剂与以下一种或多种试剂：(a)VEGFR抑制剂；(b)Tgfbr抑制剂；(c)ERG抑制剂。所述VEGFR抑制剂包括瑞格菲尼、甲磺酸阿帕替尼、卡博替尼和盐酸帕佐帕尼及上述药物的药用盐或衍生物。本发明通过类器官平台验证了将EGFR‑TGFB1‑ERG的信号轴中任意一种抑制剂与Wnt激动剂组合制备成组合物，能够实现高效的毛细胞分化、成熟和存活，对于听力恢复具有重要价值。

Description

一种促进毛细胞再生和听力恢复的组合物及其用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种促进毛细胞再生和听力恢复的组合物及其用途。
背景技术
听力损失是最常见的感觉缺陷，影响着全世界超过3.2亿的人口。耳蜗感觉毛细胞的退化是造成感音神经性听力损失的主要原因。耳蜗毛细胞的退行可能由遗传缺陷、噪声暴露、衰老、耳毒性药物和其他环境损害等引起。在受到耳毒药物或噪声损伤后，鸟类和两栖动物可以由周围的支持细胞再生出新的毛细胞，从而恢复听觉功能。然而，在出生后的哺乳动物耳蜗中，尽管存在多个耳蜗支持细胞，但是这些细胞都是有丝分裂后的细胞，无法再生毛细胞。因此，哺乳动物的耳蜗毛细胞损伤会导致永久性听力损失。
近年来的工作中，研究者尝试诱导原本处于静息状态中的哺乳动物支持细胞来进行增殖分化，其中Lgr5+支持细胞是最有价值的候选者。Lgr5是Wnt的共同受体，也是多种组织(包括肠，肝和皮肤等)公认的祖细胞标志物。在新生小鼠耳蜗的Lgr5+支持细胞中激活Wnt信号可以诱导其向毛细胞转化；这个过程可以通过表达Atoh1，敲低Sox2或是抑制Notch来进一步促进。然而，听觉功能的恢复仍然是一项重大挑战，因为诱导的毛细胞不成熟并且最终死亡。尽管Notch抑制作用在成年体内可以促进毛细胞转分化和功能，但是效率仍然很低，并且毛细胞再生是以支持细胞的减少为代价的。因此，高效的毛细胞分化、成熟和存活所需的其他信号和途径仍有待确定。为了鉴定毛细胞毒性、保护或是再生的调控因子，高通量的筛选方法目前仍局限于斑马鱼侧线模型或是耳蜗HEI-OC1细胞系。然而，与哺乳动物的毛细胞不同，斑马鱼的毛细胞可以自发再生，而培养的HEI-OC1细胞不具有天然毛细胞的结构和功能特征。因此，这些高通量模型用于研究哺乳动物毛细胞分化有很大的局限性和生理学相关性。组织类器官的最新发展和应用为疾病建模、组学分析和高通量筛选研究提供了前所未有的机会。近年来听觉领域也已经开发了来自多能干细胞的内耳类器官或是来自新生小鼠耳蜗祖细胞的耳蜗类器官模型。这些类器官能够很好的模拟一些关键的内耳发育过程，并且可以分化为与天然毛细胞具有显著结构和功能相似的毛细胞。
发明内容
1.要解决的问题
针对现有技术中通过表达Atoh1，敲低Sox2或是抑制Notch来进一步促进听觉功能的恢复容易出现因诱导的毛细胞不成熟最终死亡的问题，以及促进毛细胞转分化的效率仍然很低的缺陷，难以实现高效的毛细胞分化、成熟和存活，本发明探索和揭示了一条新的信号轴，即发现VEGFR、TGFB1和ERG的串联是毛细胞再生的抑制信号，通过将EGFR-TGFB1-ERG的串联通路中任意一种抑制剂与Wnt激动剂组合制备成组合物，来促进毛细胞再生和成熟，能够实现高效的毛细胞分化、成熟和存活的目的。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种促进毛细胞再生和听力恢复的组合物，所述组合物包括Wnt激动剂与以下一种或多种试剂：
(a)VEGFR抑制剂；
(b)Tgfbr抑制剂；
(c)ERG抑制剂。
优选的所述组合物的组合方式包括：
1)Wnt激动剂、VEGFR抑制剂；
2)Wnt激动剂、Tgfbr抑制剂；
3)Wnt激动剂、ERG抑制剂；
4)Wnt激动剂、VEGFR抑制剂和Tgfbr抑制剂；
5)Wnt激动剂、ERG抑制剂和Tgfbr抑制剂；
6)Wnt激动剂、VEGFR抑制剂、ERG抑制剂和Tgfbr抑制剂。
优选的，所述组合物的使用中：所述VEGFR抑制剂的使用浓度为0.5～1.5μM，和/或所述Tgfbr抑制剂的使用浓度为0.5～10μM，和/或所述ERG抑制剂的使用浓度为0.05～0.5μM。
优选的，所述Wnt激动剂的使用浓度为2μM。
优选的，所述VEGFR抑制剂包括瑞格菲尼(Regorafenib)、甲磺酸阿帕替尼(Apatinib mesylate)、卡博替尼(Cabozantinib)和盐酸帕佐帕尼(Pazopanib HCl)及上述药物的药用盐或衍生物。
优选的，所述Tgfbr抑制剂为SB431542及上述药物的药用盐或衍生物，和/或所述ERG抑制剂为YK-4-279及上述药物的药用盐或衍生物。
优选的，所述Wnt激动剂为Chir99021及上述药物的药用盐或衍生物。
优选的，所述的促进毛细胞再生和听力恢复的组合物可用于制备促进内耳毛细胞再生和听力恢复药物。
优选的，本发明提供了一种促进内耳支持细胞群体再生与分化的方法，该方法使内耳支持细胞群体与上述任意一种促进毛细胞再生和听力恢复的组合物接触，其中所述一种或多种试剂与Wnt激动剂协同促进内耳支持细胞群体扩增和分化为内耳毛细胞。
优选的，所述内耳支持细胞群体包括类器官或离体组织，所述内耳支持细胞群体来源为新生耳蜗的祖细胞，和/或所述内耳支持细胞群体来源包括扩增的Lgr5+支持细胞、Lgr5-支持细胞和Sox2+非感觉支持细胞。
优选的，所述VEGFR抑制剂的使用浓度为1～5μM，和/或所述Tgfbr抑制剂的使用浓度为0.5～10μM，和/或所述ERG抑制剂的使用浓度为0.05～0.5μM，和/或Wnt激动剂的使用浓度为2μM。
优选的，所述方法包括以下步骤：
1)获得内耳支持细胞群体的单细胞；
2)将所述单细胞重悬在扩增/分化培养基中进行培养，所述的扩增/分化培养基中包括无血清的Advanced DMEM/F12，Glutamax I，N2补充剂，B27补充剂，表皮生长因子，纤维母细胞生长因子，胰岛素样生长因子1和所述的促进内耳毛细胞再生和听力恢复的组合物，所述组合物包括Wnt激动剂与以下一种或多种试剂：
(a)VEGFR抑制剂；
(b)Tgfbr抑制剂；
(c)ERG抑制剂。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明的促进毛细胞再生和听力恢复的组合物，以用于毛细胞重编程和再生研究的耳蜗类器官作为有效的体外模型，通过建立耳蜗类器官平台，验证了将EGFR-TGFB1-ERG的信号轴中任意一种抑制剂与Wnt激动剂组合制备成组合物，可以实现高效的毛细胞再生与分化能力，通过本发明的组合物能够重现耳蜗毛细胞的胚胎发育，包括毛细胞标记物的动态表达，静纤毛和动纤毛的调控以及突触的形成，有效促进毛细胞再生和成熟，能够实现高效的毛细胞分化、成熟和存活的目的，在促进听力恢复方面具有重要的价值。
(2)本发明的促进毛细胞再生和听力恢复的组合物，以Wnt与EGFR-TGFB1-ERG信号之间的相互作用来促进毛细胞的再生，可以不依赖于经典的参与毛细胞分化的Notch信号通路来促进毛细胞重编程和成熟，本发明的结果还具体揭示了：1)VEGFR抑制剂瑞格菲尼通过下调Tgfb1的表达和抑制Tgfβ信号传导来促进毛细胞再生；2)瑞格菲尼通过TGFB1下调转录因子ERG促进毛细胞再生；而现有技术中均是以Wnt和Notch信号之间的相互作用来促进毛细胞再生的方式，本发明相对现有技术无疑是一项重大的突破。
(3)本发明的促进毛细胞再生和听力恢复的组合物，以瑞格菲尼和Wnt激动剂进行组合使用时，与现有Notch抑制剂DAPT和Wnt激动剂组合相比，更有助于促进毛细胞再生和突触成熟，实验结果表明：尽管Notch抑制剂DAPT有效的促进了毛细胞再生，但是大多数再生的毛细胞都没有Ctbp2+带状突触(图9D)。然而，瑞格菲尼诱导再生的毛细胞的带状突触明显多于DAPT处理(图9D)。本发明的VEGFR抑制剂瑞格菲尼和Wnt激动剂协同更能有效促进毛细胞再生和突触成熟，效果更优异。
附图说明
图1展示了3D培养中耳蜗类器官的高效扩增和分化示意图。
图1A展示了DIV2-16耳蜗类器官的明场图片，比例尺，200μm。
图1B展示了在扩增阶段(DIV2-10)，耳蜗类器官的直径逐渐增加。误差杠代表平均值±SD。**p<0.01,***p<0.001为one-way ANOVA。
图1C展示了DIV14，16，18和20，类器官表达毛细胞标记物Myo7a的比例逐渐增加。误差杠代表平均值±SEM。*p<0.05为one-way ANOVA。
图1D展示了在DIV14，16和18，在耳蜗类器官Pou4f3+细胞中，共表达Myo7a的比例在增加。比例尺，20μm。误差杠代表平均值±SEM。**p<0.01为one-way ANOVA。
图1E展示了在DIV14，20和26，在耳蜗类器官Myo7a+细胞中表达Ctbp2+带状突触点的比例在增加。比例尺，20μm。误差杠代表平均值±SEM。***p<0.001为one-way ANOVA。
图1F展示了在DIV16-26类器官中，乙酰化微管蛋白(acetylated tubulin)的免疫荧光强度相对降低。误差杠代表平均值±SEM。**p<0.01为one-way ANOVA。
图2展示了分化中的耳蜗类器官逐步表达毛细胞标记物；在分化的类器官中(DIV10-20)，关键毛细胞基因(Atoh1，Pou4f3，Myo7a，Gfi1，Tmc1，Vglut3，Chrna9和Cav1.3)和Sox2的mRNA表达。N＝6，误差杠代表平均值±SEM。
图3展示了Lgr5+和Lgr5-耳蜗祖细胞都能够扩增和分化为毛细胞。
左，Sox2-CreER，Lgr5-CreER或是Plp1-CreER追踪的Myo7a阳性和Myo7a阴性的类器官(DIV18)谱系比例。
右，Lgr5-CreER的Myo7a阳性类器官的谱系追踪的比例。
图4展示了传代的耳蜗类器官保留了组成成分和毛细胞分化的效率。
图4A展示了单细胞分离后扩增4，6，8天的原代(DIV4-8)和传代(DIV12-16)类器官的明场图像。比例尺，500μm。
图4B展示了DIV10-16的传代耳蜗类器官的直径逐渐增加。DIV8是原代类器官的对照。误差杠代表平均值±SD。*p<0.05，**p<0.01,***p<0.001为one-way ANOVA；
图4C展示了原代(DIV4,6,8)和传代(DIV12,14,16)的耳蜗类器官的明场和Lgr5-EGFP的荧光图像。比例尺，500μm；
图4D展示了Lgr5阳性类器官的百分比。误差杠代表平均值±SEM；
图4E展示了分化10天后Myo7a阳性类器官的百分比。误差杠代表平均值±SEM。
图5展示了Wnt激活和Notch抑制分别是类器官存活和毛细胞分化所必须的。
图5A展示了在存在或不存在CHIR99021或LY411575的情况下分化出的DIV18耳蜗类器官的明场图像。比例尺，500μm。
图5B展示了在分化过程中，耳蜗类器存活需要CHIR99021，误差杠代表平均值±SEM。**p<0.01为one-way ANOVA。
图5C展示了LY411575是耳蜗类器官有效分化毛细胞所必需的。误差杠代表平均值±SEM，***p<0.001为one-way ANOVA；
图6展示了用耳蜗类器官筛选FDA批准小分子药物确定瑞格菲尼Regorafenib促进毛细胞分化图；
图6A展示了在分化的Pou4f3(EGFP/+)报告类器官(DIV26)中EGFP+毛细胞的共聚焦图像。毛细胞和Myo7a共标记。比例尺，20μm。
图6B展示了瑞格菲尼促进了Pou4f3(EGFP/+)耳蜗类器官中的毛细胞分化。总共用了1004个FDA批准的小分子药物进行筛选，其中载体溶液(Vehicle)和10μM的LY411575分化为阴性和阳性对照。瑞格菲尼为箭头标示，左侧y轴显示EGFP+(含毛细胞)类器官的百分比，右y轴显示小分子药物处理的类器官的相对存活度。
图6C展示了瑞格菲尼以剂量依赖的方式促进耳蜗类器官中毛细胞分化。DMSO，载体溶液，阴性对照；LY，LY411575(10μM)，误差杠代表平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001为one-way ANOVA。
图6D展示了在载体溶液，LY411575(10μM)或是瑞格菲尼(5μM)处理的耳蜗类器官的共聚焦图像。比例尺，20μm。
图6E展示了含有Ctbp2的毛细胞的类器官的百分比。
图6F展示了每个毛细胞上Ctbp2的数量。DMSO，载体溶液；LY，LY411575(10μM)；瑞格菲尼(5μM)。误差杠代表平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001为one-way ANOVA。
图7展示了在耳蜗离体组织中，瑞格菲尼促进毛细胞再生；
图7A展示了用载体溶液，DAPT(10μM)或是瑞格菲尼(1μM)处理5天后，Myo7a和Pou4f3代表耳蜗离体组织的免疫荧光共聚焦图像。比例尺，20μm。
图7B展示了用DAPT或是瑞格菲尼处理的耳蜗离体组织的毛细胞数量增加。误差杠代表平均值±SEM。*p<0.05,***p<0.001为one-way ANOVA。
图7C展示了低浓度DAPT(5μM)和瑞格菲尼(0.5μM)能够协同促进毛细胞再生，Myo7a和Pou4f3代表耳蜗离体组织的免疫荧光共聚焦图像。比例尺，20μm。
图7D展示了低浓度DAPT(5μM)和瑞格菲尼(0.5μM)协同处理的耳蜗离体组织的毛细胞数量增加。误差杠代表平均值±SEM。**p<0.01,***p<0.001为one-way ANOVA。
图8展示了VEGFR是瑞格菲尼促进毛细胞再生的最可能靶点；
图8A展示了基于供应商信息的瑞格菲尼家族小分子的激酶选择性和效力；
(图8B-F)VEGFR是促进耳蜗离体组织中毛细胞重编程的小分子的共同靶点。包括(图8B)Apatinib mesylate,(图8C)Cabozantinib和(图8D)Pazopanib HCl。未靶向VEGFR的小分子(图8E)Masitinib and(图8F)Imatinib mesylate无法促进毛细胞重编程。误差杠代表平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001为one-way ANOVA。
图9展示了在新霉素损伤的耳蜗离体组织中，瑞格菲尼可以促进毛细胞的再生和成熟；
(图9A和图9B)DAPT和瑞格菲尼促进了新霉素损伤的耳蜗离体组织中毛细胞的再生。(图9A)载体DMSO，DAPT(10μM)或是瑞格菲尼(1μM)共同处理的新霉素损伤的耳蜗离体组织的共聚焦图像。(图9B)毛细胞计数。用Myo7a和Pou4f3对原位的和再生的毛细胞进行免疫荧光标记。比例尺，20μm。误差杠代表平均值±SEM。***p<0.001为one-way ANOVA。
(图9C)DAPT和瑞格菲尼均可以促进Sox2阳性支持细胞向毛细胞的转分化(图9D)在与新霉素和DAPT或是Regorafenib共同处理后，原位的或是再生的毛细胞中Ctbp2的平均数目。误差杠代表平均值±SEM。***p<0.001为one-way ANOVA。比例尺，20μm。
图10展示了DAPT和瑞格菲尼在耳蜗离体组织中调节不同的信号通路；
图10A展示了Notch信号通路在DAPT处理的耳蜗离体组织差异调节的前10个基因本体(GO)生物学过程中富集图；
图10B展示了在处理1天和5天的耳蜗离体组织中，DAPT而非瑞格菲尼能够调节Notch通路基因。通过RT-qPCR检测Notch信号通路基因Hey1，Hes1，Hes5，Jag1，Dll1和Dll3的表达。误差杠代表平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001为one-way ANOVA；
图10C展示了在耳蜗离体组织中瑞格菲尼调节Tgfβ信号传导途径；
图10D展示了在瑞格菲尼而非DAPT处理1天和5天的耳蜗离体组织中调节Tgfβ信号传导基因。通过RT-qPCR检测Tgfβ通路基因Tgfbi,Fshb,Cdh5,Cx3cr1,Nos3 and Clec3b的表达。误差杠代表平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001为one-way ANOVA；
图11展示了瑞格菲尼通过VEGFR-MEK-TGFB1通路促进毛细胞再生；
图11A展示了在耳蜗离体组织中瑞格菲尼处理降低了Tgfb1的表达，但是DAPT处理未将其下调。误差杠代表平均值±SEM。***p<0.001为one-way ANOVA；
图11B展示了瑞格菲尼通过MAPK途径下调Tgfb1的表达。MAPK(MEK)抑制剂U0126而不是PI3K抑制剂Wortmannin抵消了瑞格菲尼对Tgfb1表达的影响。误差杠代表平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001为one-way ANOVA；
图11C展示了用TgfβI型受体抑制剂SB431542处理的耳蜗离体组织的毛细胞计数。误差杠代表平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001为one-way ANOVA；
图11D展示了用TgfβI型受体抑制剂SB431542处理的耳蜗离体组织的共聚焦图像。比例尺，20μm；
图11E分别用瑞格菲尼(1μM)或与Tgfβ重组蛋白(0.25,0.5或1ng/ml)处理的耳蜗离体组织的毛细胞标记的共聚焦图像。比例尺，20μm；
图11F分别用瑞格菲尼(1μM)或与Tgfβ重组蛋白(0.25,0.5或1ng/ml)处理的耳蜗离体组织的毛细胞计数。单独使用DAPT(10μM)和单独使用Tgfβ1(1ng/ml)作为对照。误差杠代表平均值±SEM。***p<0.001为与载体DMSO对照相比的one-way ANOVA。^p<0.05,^^^p<0.001为与单用Regorafenib相比的one-way ANOVA；
图12展示了瑞格菲尼通过TGFB1下调转录因子ERG促进毛细胞再生；
图12A展示了在耳蜗离体组织中瑞格菲尼处理下调了ERG的表达，Tgfβ1重组蛋白共处理抑制了瑞格菲尼对ERG的调控。误差杠代表平均值±SEM。***p<0.001为one-wayANOVA；
图12B展示了在耳蜗离体组织中，ERG抑制剂YK-4-279促进毛细胞再生。误差杠代表平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001为one-way ANOVA；
图12C展示了在耳蜗类器官中，利用慢病毒过表达ERG能够抑制瑞格菲尼对毛细胞再生的作用。慢病毒表达的ERG需要他莫昔芬调控入核，进而调控转录。误差杠代表平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01为one-way ANOVA；
图13展示了VEGFR-TGFB1-ERG信号轴促进毛细胞再生和成熟的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例
实验材料：小鼠品系包括：
1、Lgr5-EGFP-IRES-CreER(#008875)(Barker et al.,2007)；
2、Plp1-CreER(#005975)(Doerflinger et al.,2003)；
3、Sox2-CreER(#017593)(Arnold et al.,2011)和Rosa26-ACTB-mTmG(#007676)(Muzumdar et al.,2007)小鼠从Jackson实验室获得。
4、Rosa26-CAG-STOP-Cas9-tdTomato(Rosa26-tdTomato)小鼠从中国的Gempharmatech Inc获得。
5、Pou4f3-EGFP-IRES-CreER(Pou4f3(EGFP/+))敲入小鼠使用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得：使用了两种切割策略将EGFP-IRES-CreER盒插入Pou4f3基因座。将两个Pou4f3sgRNA：5’-AGTACGGGGTGCATGCCGAA-3’和5’-TGAACGGATGATTCTTGCCG-3’克隆到PX330质粒中，并使用MEGA shortscript试剂盒(美国的Ambion,Am1354)，通过体外转录(T7作为启动子)产生sgRNA。为了保持Pou4f3调控元件完整，在Pou4f3的第一个ATG密码子上整合了EGFP-IRES-CreER盒。将供体质粒(其中EGFP-IRSE-CreER盒两侧有两个约1.6kb的同源臂)用作同源重组的修复模板。然后将两个sgRNA，供体质粒和Cas9蛋白共注射到单细胞受精卵中进行基因编辑。从首代(F0)小鼠的尾巴中提取基因组DNA。将引物设计在同源臂的外部以排除随机插入。PCR产物直接测序。这项研究使用了C57BL6背景的雄性和雌性小鼠。
所有动物操作程序均经中国南京大学模式动物研究中心的机构动物护理和使用委员会批准，规程批准号为#WGQ01。
本实施例的实验过程具体包括：
3D耳蜗类器官培养和FDA批准药物添加
在3D培养系统中，培养来自Pou4f3(EGFP/+)小鼠的耳蜗类器官，以进行扩增。在第8天，将原代的耳蜗类器官用含有每毫升200酶活单位的DNase I的TrypLE处理以得到单细胞。然后将其重悬于Matrigel和层粘连蛋白培养基中，放置于96孔超低附着U底板，作为传代类器官。
传代类器官培养基是无血清的Advanced DMEM/F12，添加Glutamax I，N2补充剂，B27补充剂，表皮生长因子EGF(25ng/ml)，纤维母细胞生长因子FGF(50ng/ml)，胰岛素样生长因子1(IGF-1)(50ng/ml)和CHIR99021(2μM),VPA(1mM),pVc(100mg/mL),616452(2μM)。类器官每两天以1：2扩增培养。在第16天，将扩增培养基换成分化培养基，该培养基由无血清的Advanced DMEM/F12，添加Glutamx I，N2补充剂，B27补充剂，CHIR99021和FDA批准的药物库的单个小分子(10μM)。分别添加DMSO和LY411575(10μM)作为阴性和阳性对照。每两天更换一半分化培养基。后续试验中小分子药物根据相应的试验目的选择不同的浓度试验。
具体的，在第26天，将96孔板中的类器官与Hoechst33342一起孵育以染色活细胞的细胞核。毛细胞用EGFP(Pou4f3)标记。成像使用带有Airyscan的LSM880共聚焦显微镜(德国Zeiss)或是Celldiscoverer 7活细胞成像系统(德国Zeiss)进行。计数每种条件下的EGFP+类器官占总体类器官的数目。相对类器官的生存能力的计算为每种条件下的类器官的数量与所有条件下类器官的平均数之比。确定了诱导效率在40％以上的EGFP+类器官和1.2存活度的小分子，以供进一步验证。
耳蜗离体组织培养
从三天的小鼠中分离出耳蜗感觉上皮，并在铺有胶原蛋白的35mm培养皿中培养。耳蜗离体组织培养在无血清的AdvancedDMEM/F12，添加有Glutamax I，N2补充剂，B27补充剂和青霉素G。在24小时后，将新鲜培养基更换为无生长因子，含有CHIR99021和小分子药物的诱导培养基。小分子试用的浓度已在图表说明中指示。每两天更换一次新鲜培养基，直到收集和分析样品。
为了进行谱系追踪实验，在4-羟甲基-他莫昔芬诱导作用下，将Sox2-CreER:Rosa26-tdTomato的耳蜗离体组织培养在无血清的Advanced DMEM/F12，添加Glutamax I，N2补充剂，B27补充剂和青霉素G培养基中。关于新霉素损伤实验中，用0.15M新霉素处理24小时后，将培养基替换为同时包含CHIR99021和小分子药物的诱导培养基。每两天更换一次新鲜培养基，直到收集和分析样品。
免疫荧光
耳蜗类器官或是离体组织用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤三次，然后在室温下用4％多聚甲醛/PBS固定20分钟，然后用PBS洗涤三次。在室温下，在封闭缓冲液(含有0.3％Triton X-100和5％热灭活的正常马血清的PBS中)进行通透和封闭1小时。然后将类器官或是离体组织与稀释的一抗(0.3％Triton X-100和1％热灭活的正常马血清的PBS中)一起4℃孵育过夜。毛细胞被Pou4f3，Myo7a，Parvalbumin和Calbindin2的标记物免疫染色。突触带状点被Ctbp2标记。分别用鬼笔环肽和乙酰化微管蛋白观察毛细胞的静纤毛和动纤毛。用Sox2免疫标记支持细胞。以1:500稀释(Alexa 488,Alexa Fluor 568,and Alexa Fluor647偶联)。细胞核通过DAPI标记。
RNA提取和逆转录荧光定量PCR
将类器官收集在1.5ml离心管中，并且以1000rpm离心4分钟。然后向沉淀的类器官中加入1ml RNAiso Plus(日本Takara)。耳蜗离体组织用PBS洗涤一次，并加入1ml RNAisoPlus。按照制造商的说明分离总RNA。使用PrimeScriptTM RT试剂盒(Takara)进行逆转录。SYBR Green qPCR使用
Figure BDA0002551021070000101
qPCR
Figure BDA0002551021070000102
Green Master Mix(No Rox)试剂盒(Yeasen)。GAPDH用作内参基因。
RNA测序实验和分析
使用RNAiso Plus提取来自耳蜗离体组织的总RNA。总RNA质量由2100Bioanalyser(安捷伦)确定，并使用ND-2000(NanoDrop Technologies)进行定量。仅使用高质量的RNA样品(OD260/280＝1.8～2.2,OD260/230≥2.0,RIN≥6.5,28S:18S≥1.0,>2μg)构建测序文库。
RNA纯化，逆转录，文库构建和测序是根据制造商的指导(位于加利福尼亚州圣地亚哥的Illumina)在上海Majorbio Bio-pharm生物技术有限公司进行。按照Illumina的TruSeqTM RNA样品制备试剂盒，用1μg总RNA制备RNA-seq转录组文库。然后，根据polyA选择方法，通过oligo(dT)珠子分离信使RNA，然后首先通过片段缓冲液进行片段化。其次，使用SuperScript双链cDNA合成试剂盒(Invitrogen,CA)，用随机六聚体(Illumina)合成双链cDNA。然后根据Illumina的文库构建方案对合成的cDNA进行末端修复，磷酸化和‘A’碱基添加。选择大小为2％低范围超琼脂糖上200-300bp的cDNA目标片段大小，然后使用PhusionDNA聚合酶(NEB)进行15个PCR循环进行PCR扩增。通过TBS380定量后，用Illumina Novaseq6000(2×150bp读取长度)对双端RNA-seq测序文库进行测序。
原始配对末端读数被修整，并由SeqPrep和Sickle使用默认参数进行质量控制。然后使用TopHat(2.1.1版)软件将清楚的读数分别以定向模式与参考基因组比对。作图的标准如下：测序读段应与基因组唯一匹配，允许多达2个错配，且不得插入或缺失。然后根据位点深度扩展基因区域，获得操纵子。另外，整个基因组被分成多个共享5kb的15kb窗口。新的转录区域被定义为2个以上连续的窗口，没有重叠的基因区域，其中每个窗口在相同方向上至少映射2个读数。
为了鉴定两个不同样品之间的DEG(差异表达基因)，根据每百万个外显子每千个碱基对的片段数(FPKM)方法，计算每个转录本的表达水平。RSEM用于定量基因丰度。R统计软件包EdgeR用于差异表达分析。此外，还进行了功能增强分析(包括GO和KEGG)，以确定与整个转录组背景相比，在Bonferroni校正的P值≤0.05时，哪些差异表达基因在GO和KEGG中显著富集。将使用DAVID GO Annotation完成基因本体(GO)分析。将根据KEGG数据库中的信息确定不同信号途径的重要基因清单。RNA-seq数据可在GEO数据库中获得，登录号为GSE139485。
统计分析
使用Graphpad Prism 6进行统计测试。结果报告为平均值±SEM。图例中描述了每个实验中使用的特定统计检验。
实验结果
一、3D培养的耳蜗类器官可以高效扩增和分化成毛细胞
在3D培养中，来自新生耳蜗的祖细胞可以作为耳蜗类器官进行扩增并且分化形成毛细胞样的细胞。为了验证该耳蜗类器官中，祖细胞的扩增和毛细胞分化的效率，将出生后三天(P3)小鼠的耳蜗感觉上皮细胞分离，并且进行逐步培养来扩增和分化。耳蜗类器官在扩增阶段大小逐渐增加(DIV0-10，图1A和1B)。
经过10天体外(DIV10)培养扩增，用分化培养基替换扩增培养基从而诱导毛细胞分化和毛细胞标记物(包括Pou4f3和Myo7a)的表达。首先在分化后4天(DIV14)观察到Myo7a的表达，而在DIV18有60％以上的类器官含有Myo7a阳性毛细胞(图1C)。为了检测诱导的毛细胞是否成熟，进一步分析了耳蜗类器官的毛细胞标记物和结构的动态变化过程。分化类器官(DIV10-DIV20)的QPCR分析显示多个毛细胞特异的基因(包括Atoh1，Pou4f3，Myo7a，Gfi1，Tmc1，Vglut3，Chrna9和Cav1.3)的表达水平是随着时间增加的(图2)。Pou4f3和Myo7a都是经典的毛细胞标记物。然而，Pou4f3首先在胚胎第13天(E13)小鼠的耳蜗毛细胞中被检测到，而Myo7a的表达则是直到E15.5天才被发现。相应地，在DIV14的耳蜗类器官中，只有60％的Pou4f3阳性毛细胞共表达Myo7a(图1D)。而在DIV16和18，Pou4f3和Myo7a的共表达比例显著增加至80％以上，这与它们在胚胎发育过程中的表达模式一致。带状突触是毛细胞的功能性结构特征，在传入突触时包裹突触前囊泡，并且可以用特异性标记Ribeye/Ctbp2标记。虽然在DIV14时只有约50％的Myo7a阳性细胞显示Ctbp2标记，但是在DIV20和DIV26时几乎所有诱导的毛细胞均表达Ctbp2带状点(图1E)。毛细胞纤毛是毛细胞机械传导必不可少的，在DIV24和DIV26中逐渐失去了在不成熟的耳蜗毛细胞中存在的动纤毛(图1F)。这些发现表明，耳蜗类器官能够高效扩增和分化，并且类器官中的毛细胞随分化时间而逐渐发育成熟。
二、耳蜗类器官来自Lgr5阳性和Lgr5阴性的祖细胞
耳蜗感觉上皮由毛细胞和多种亚型的Sox2阳性非感觉支持细胞组成。先前的报道表明，Lgr5阳性支持细胞是常驻的耳蜗祖细胞；它们在Notch抑制和Wnt激活，或是Wnt激活的条件下可以增殖和分化。此外，Plp1阳性的inner border和inner phalangeal细胞在损伤的新生耳蜗中可以自发再生。但是，这些细胞是否可以扩增并且重编程为毛细胞仍然未知。
为了检测支持细胞亚型对耳蜗类器官生长和分化的贡献，我们使用与Lgr5-EGFP-IRESCreER，Sox2-CreER或是Plp1-CreER小鼠交配的Rosa26-ACTBmTmG的出生三天的幼鼠进行谱系追踪实验。
我们在用Lgr5-CreER，Sox2-CreER和Plp1-CreER追踪的耳蜗类器官系谱实验中观察到稳定的重组和mGFP标记。在DIV18，我们发现超过90％或大约80％的耳蜗类器官分别来自Sox2+或Lgr5+细胞，而Plp1+细胞仅占总类器官的约20％(图3，Cre+)。尽管Myo7a+毛细胞全部来自Sox2+细胞谱系，但是不是所有的Sox2+细胞都可以分化形成毛细胞，这表明某些支持细胞保留了增殖能力，但是在目前的实验条件下无法分化成毛细胞。相比之下，尽管Plp1+类器官比例较小(约20％)，但是几乎所有Plp1+类器官都可以成功分化为毛细胞(图3)，突出了inner border和inner phalangeal细胞作为毛细胞祖细胞的潜能。与Sox2+类器官相似，并非所有的Lgr5+类器官可以分化成毛细胞(图3)。这与之前的报道一致，当强制过表达Atoh1和β-catenin的活性形式时，只有一部分Lgr5+细胞可以转化成毛细胞样细胞。然而，我们在一小群Lgr5-(可能是Sox2+)细胞中同样观察到毛细胞分化(图3)。这些Myo7a+/Lgr5-类器官的比例从DIV16到DIV20逐渐增加(图3)，表明Lgr5-细胞亚群也可以作为祖细胞，但其分化动力学较Lgr5+细胞更慢。总而言之，我们的研究表明Lgr5+和Lgr5-细胞都有可能有助于耳蜗类器官的扩增和毛细胞分化。
三、瑞格菲尼促进毛细胞分化
为了提高耳蜗类器官的高通量实验的效率，我们优化了传代和进一步扩增培养的条件。通过对类器官的传代和培养可以使样品的通量提高6000倍，即从单个耳蜗感觉上皮中衍生出6000个类器官。DIV10到DIV16类器官的直径增加证明了经过传代的耳蜗类器官的生长，但是它们的整体大小明显小于原代类器官(图4A和4B)。尽管传代的类器官形态较小，但是其Lgr5阳性类器官的比例(图4C和4D)和诱导毛细胞分化的能力(图4E)与原代类器官之间没有区别。
现有技术的报道显示在耳蜗类器官中，Wnt激活和Notch抑制可以协同促进毛细胞分化。我们发现，有效的毛细胞分化的确依赖Notch抑制(LY411575)(图5A和5C)。此外，CHIR99021激活Wnt对于LY411575诱导分化的耳蜗类器官的存活至关重要(图5A和5B)。因此，为了发现促进毛细胞分化的新信号，我们在存在CHIR99021和不存在LY411575的情况下，在分化的耳蜗类器官中筛选了1004个FDA批准的小分子药物(图6A)。为此，使用来自Pou4f3(EGFP/+)小鼠的传代耳蜗类器官，其是一种毛细胞命运报告小鼠模型，其中分化的毛细胞可以通过Pou4f3驱动的EGFP的表达进行标记。
通过对小分子药物的高通量筛选，我们确定了91个候选物有潜力促进毛细胞分化并且不影响类器官的存活率(图6B)。在候选的小分子中，我们发现瑞格菲尼(Regorafenib)在1到5μM以剂量依赖性的方式促进毛细胞分化(图6C)。更高剂量的瑞格菲尼(10或是15μM)严重影响类器官的存活(图6C)。重要的是，5μM的瑞格菲尼在毛细胞诱导的效率与阳性对照LY411575(10μM)相当。此外，相对于LY411575，瑞格菲尼处理还促进诱导毛细胞中突触的形成(图6D-F)。因此本发明建立了一个高通量的耳蜗类器官筛选平台，并且发现瑞格菲尼作为一种新的小分子候选者可以促进毛细胞分化和成熟。
四、在耳蜗离体组织中，瑞格菲尼通过抑制VEGFR促进毛细胞再生
为了验证瑞格菲尼对耳蜗组织的作用，我们培养出生后第三天耳蜗的离体组织，并且在五天的培养过程中使用单独CHIR99021处理(载体)或是用Notch抑制剂DAPT或是瑞格菲尼处理。正如预期，DAPT处理显著增加了耳蜗离体组织中毛细胞的数量(图7A和7B)。重要的是，瑞格菲尼还以剂量依赖的方式促进毛细胞分化，范围是从0.5到1.5μM(图7A和7B)。此外，我们发现低剂量的DAPT和瑞格菲尼能够协同作用促进毛细胞的再生(图7C和7D)。这些发现表明瑞格菲尼与CHIR99021组合可以促进耳蜗离体组织中从支持细胞向毛细胞的转分化。
为了解析瑞格菲尼在促进毛细胞再生中的特异靶点，我们评估了其他瑞格菲尼家族分子的作用，这些分子有着共同但是不重叠的激酶靶点(图8A)。在另外五种抑制剂中，Apatinibmesylate(图8B)、Cabozantinib(图8C)和Pazopanib HCl(图8D)显著诱导毛细胞再生。VEGFR和Kit是瑞格菲尼和这三个分子的共同靶点(图8A)。同时，Kit激酶抑制剂Masitinib(图8E)和Imatinib mesylate(图8F)没有发挥任何作用。因此，我们得出结论，VEGFR是瑞格菲尼促进毛细胞再生的靶点。
五、在新霉素损伤的耳蜗离体组织中，瑞格菲尼可以促进毛细胞的再生和成熟
噪声暴露、衰老、耳毒药物和遗传缺陷等可以造成毛细胞退行。接下来，我们检测了瑞格菲尼是否可以促进耳毒性药物新霉素损伤的耳蜗组织中毛细胞的再生。
在新霉素处理24小时后，我们单独加入CHIR99021(载体培养基)(浓度为2μM)或是与DAPT(浓度为10μM)或瑞格菲尼(浓度为1μM)一起加入。在载体培养基的耳蜗离体组织中，新霉素处理导致毛细胞明显丢失(图9A)。值得注意的是，DAPT和瑞格菲尼均可以显著促进毛细胞再生(图9A和9B)。Sox2阳性支持细胞的谱系追踪表明，载体无法诱导毛细胞重编程，但是DAPT和瑞格菲尼均可以促进Sox2阳性支持细胞向毛细胞的转分化(图9C)。
由于Notch抑制剂DAPT和瑞格菲尼均可以促进耳蜗类器官的毛细胞中Ctbp2的表达，同时也检测耳蜗离体组织中再生的毛细胞是否也显示了突触的形态。研究结果表明：尽管DAPT有效的促进了毛细胞再生，但是大多数再生的毛细胞都没有Ctbp2+带状点(图9D)。然而，瑞格菲尼诱导再生的毛细胞的带状突触明显多于DAPT处理(图9D)。因此，表明瑞格菲尼可以在损伤的耳蜗组织中促进毛细胞再生和突触成熟。
六、瑞格菲尼通过抑制Tgfb1的表达调节Tgfβ信号通路
对用DAPT和瑞格菲尼处理1天和5天的耳蜗离体组织进行了RNA-seq分析。GO分析显示DAPT调控了多个Notch信号参与的生物过程(图10A)。利用RT-qPCR验证了DAPT在第1天和第5天对Notch信号传导靶点和配体，包括Hey1、Hes1、Hes5、Jag1、Dll1和Dll3(图10B)。瑞格菲尼处理并未影响Notch信号传导相关基因的表达(图10B)，这表明瑞格菲尼通过一种Notch非依赖性的机制促进毛细胞的再生和成熟。
瑞格菲尼处理的耳蜗离体组织的RNA-seq分析表明，参与血管生成，趋化性和炎症的多种途径受到特定调节(图10C)，这与VEGFR信号传导在这些过程中的已知作用一致。瑞格菲尼也参与了对Tgfβ刺激的细胞应答的基因(图10C)，而Tgfβ信号对于细胞命运决定和重编程极为重要。通过RT-qPCR对列出的靶基因(Tgfbi、Fshb、Cdh5、Cx3cr1、Nos3和Clec3b)进行验证，发现瑞格菲尼而非DAPT能够特异的调节Tgfβ信号传导(图10D)。
然后，基于RNA-seq和RT-qPCR分析(图11A)确定了瑞格菲尼处理可以下调Tgfβ配体Tgfb1的表达。VEGFR信号传导可能促进Tgfb1的表达，然后激活Tgfβ信号传导来抑制毛细胞重编程。由于MEK和PI3K是VEGFR信号下游的两个关键激酶，因此我们接下来使用U0126(MEK抑制剂)和Wortmannin(PI3K抑制剂)研究这些激酶是否参与了通过VEGFR信号调节Tgfb1的表达。U0126以剂量依赖的方式抑制瑞格菲尼对Tgfb1表达下调的作用，而Wortmannin没有这种作用(图11B)。
这些数据表明，VEGFR抑制剂瑞格菲尼不会影响Notch信号传导，但是会通过MEK依赖的Tgfb1表达的下调来调节Tgfβ信号传导。
七、Tgfβ1信号介导瑞格菲尼对毛细胞再生的促进作用
进而，我们在耳蜗离体组织上用CHIR99021和Tgfb受体(Tgfbr)抑制剂SB411542共同处理。与单独CHIR99021(载体)处理相比，使用SB411542(使用浓度为0.5～10μM)共同处理的离体组织显示出更多的毛细胞，这表明对Tgfbr的直接抑制也有效地促进了毛细胞的再生(图11C和11D)。
重要的是，尽管瑞格菲尼可以促进毛细胞再生，但是通过Tgfβ1重组蛋白可以完全消除其作用(图11E和11F)。单独的Tgfβ1不会对耳蜗离体组织的毛细胞密度产生任何影响(图11E和11F)。因此，Tgfβ1可以作为抑制信号，阻碍耳蜗支持细胞向毛细胞转分化。总之，这些数据提供了有力的证据，表明VEGFR抑制剂瑞格菲尼通过下调Tgfb1的表达和抑制Tgfβ信号传导来促进毛细胞再生。
八、瑞格菲尼通过TGFB1下调转录因子ERG促进毛细胞再生
最后，我们对瑞格菲尼和Tgfβ1的共处理的耳蜗离体组织进行了RT-qPCR分析，鉴定出转录因子ERG可能是Tgfβ信号通路的下游靶点(图12A)。瑞格菲尼能够显著下调ERG的表达，而Tgfβ1重组蛋白的共处理完全抑制了ERG的下调(图12A)，由此确定了VEGFR-TGFB1-ERG信号轴。重要的是，在耳蜗离体组织中，ERG抑制剂YK-4-279(使用浓度为0.05～0.5μM)同样能够促进毛细胞的再生(图12B)。最后，我们构建了Lenti-ERG-ER的慢病毒，ERG的入核受到他莫昔芬的调控。在耳蜗类器官中，感染了ERG-ER慢病毒本身不会影响瑞格菲尼或DAPT诱导毛细胞的分化(图12C)。然而，在类器官扩增和分化阶段(DIV0-20)或分化阶段(DIV10-20)加入他莫昔芬诱导ERG入核可以明显抑制瑞格菲尼(而非DAPT)对毛细胞分化的作用(图12C)。这些数据说明了VEGFR-TGFB1-ERG信号轴是一个新的毛细胞命运的调控机制。
结论
通过建立高通量的耳蜗类器官模型，本发明发现了VEGFR抑制剂通过Tgfβ-ERG依赖机制，而非Notch依赖机制，在天然和受损的耳蜗离体组织中诱导毛细胞再生和成熟。本发明确定了VEGFR-TGEB1-ERG信号轴是毛细胞再生的新靶点，具体的过程如图13所示。
VEGFR-TGFB1-ERG信号轴
本发明揭示了VEGFR、TGFB1和ERG的串联是毛细胞再生的抑制信号。VEGFR在耳蜗中广泛表达，包括Corti器官，血管纹，螺旋韧带和螺旋神经节细胞。Tgfb1在血管纹，内毛细胞的支持细胞和Deiter’s细胞中表达。VEGFR1和VEGFR2均在耳蜗支持细胞和螺旋神经节神经元中表达，表明这些细胞对VEGF信号有应答。本发明的数据表明，在耳蜗支持细胞中的VEGFR信号是通过MEK通路调节Tgfβ1的表达，这与VEGFR和Tgfβ1在这些细胞中共定位一致。由于Tgfβ1受体Tgfbr1和Tgfbr2在这些支持细胞中也表达，因此Tgfβ1可能作为自分泌或是旁分泌信号来抑制毛细胞的转分化。
Tgfβ是众所周知的参与胚胎和体干细胞的增殖和分化的信号通路。在胚胎干细胞衍生的内耳类器官的早期分化阶段，Tgfβ信号的抑制对于非神经外胚层的诱导很重要。此外，由于Tgfβ调节细胞静息，为了有效的扩增Lgr5阳性耳蜗祖细胞必须抑制Tgfβ。我们的数据表明，可能在支持细胞中通过VEGFR调节Tgfβ信号传导在毛细胞再生中也起着重要的抑制作用。在体内，哺乳动物耳蜗中Tgfβ信号的药理学或是直接基因操作将是进一步了解Tgfβ在毛细胞发育和再生中作用的重要步骤。
ERG是Ets转录因子家族成员，并在血管发生、血细胞和骨骼发育中起重要作用。此外，ERG还是肌肉瘤和白血病的致癌基因之一，并通过与TMPRRSS2融合突变引发前列腺癌，ERG在内耳和毛细胞发育中的作用仍然未知。之前有报道ERG能够受到Tgfβ调控，从而促进间充质细胞分化。本发明证明了TGFB1-ERG信号轴可能参与了多个细胞分化的过程。
最后，VEGFR-TGFB1-ERG轴促进毛细胞重编程和成熟不依赖于经典的参与毛细胞分化的Notch信号通路。此外，抑制VEGFR-TGFB1-ERG而不是抑制Notch信号会促进重编程毛细胞中突触的形成，这表明Tgfβ信号可能在突触形成中发挥独特的作用。迄今为止，人们认为Wnt和Notch信号之间的相互作用有助于毛细胞命运的确定和再生，大多研究也集中在关键转录因子如Sox2和Atoh1上。因此，本发明的研究确定的VEGFR-TGFB1-ERG信号轴成为研究哺乳动物耳蜗毛细胞发育，成熟和再生的另一个靶点。

Claims (9)

1.一种促进毛细胞再生组合物，其特征在于：所述组合物包括Wnt激动剂与以下一种或多种试剂组合：
VEGFR抑制剂，所述VEGFR抑制剂为瑞格菲尼及其药用盐，
ERG抑制剂，所述ERG抑制剂为YK-4-279及其药用盐，
所述Wnt激动剂为Chir99021及其药用盐。
2.根据权利要求1所述的促进毛细胞再生组合物，其特征在于：所述组合物包括Wnt激动剂与以下三种试剂组合：(a) VEGFR抑制剂；(b) Tgfbr抑制剂；(c) ERG抑制剂。
3.根据权利要求2所述的促进毛细胞再生组合物，其特征在于：所述VEGFR抑制剂的使用浓度为0.5 ~ 1.5 µM，和/或所述Tgfbr抑制剂的使用浓度为0.5 ~ 10 µM，和/或Wnt激动剂的使用浓度为2 µM。
4.根据权利要求1或2所述的促进毛细胞再生组合物，其特征在于：所述ERG抑制剂的使用浓度为 0.05 ~ 0.5 µM。
5.权利要求1~4所述的促进毛细胞再生组合物在制备促进内耳毛细胞再生药物中的应用。
6.一种以非治疗目的促进内耳支持细胞群体再生与分化的方法，其特征在于：该方法使内耳支持细胞群体与权利要求1~5任意一项所述的促进毛细胞再生组合物接触，其中所述一种或多种试剂与Wnt激动剂协同促进内耳支持细胞群体扩增和分化为内耳毛细胞。
7.根据权利要求6所述的以非治疗目的促进内耳支持细胞群体再生与分化的方法，其特征在于：所述内耳支持细胞群体包括类器官或离体组织，所述内耳支持细胞群体来源为新生耳蜗的祖细胞，和/或所述内耳支持细胞群体来源包括扩增的Lgr5+支持细胞、Lgr5-支持细胞和Sox2+非感觉支持细胞。
8.根据权利要求7所述的以非治疗目的的促进内耳支持细胞群体再生与分化的方法，其特征在于：所述VEGFR抑制剂的使用浓度为0.5 ~ 1.5 µM，和/或所述Tgfbr抑制剂的使用浓度为0.5 ~ 10 µM，和/或所述ERG抑制剂的使用浓度为0.05 ~ 0.5 µM，和/或Wnt激动剂的使用浓度为2 µM。
9.根据权利要求8所述的以非治疗目的的促进内耳支持细胞群体再生与分化的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1）获得内耳支持细胞群体的单细胞；
2）将所述单细胞重悬在扩增/分化培养基中进行培养，所述的扩增/分化培养基中包括无血清的Advanced DMEM/F12，Glutamax I，N2补充剂，B27补充剂，表皮生长因子，纤维母细胞生长因子，胰岛素样生长因子1和所述的促进内耳毛细胞再生组合物，所述组合物包括Wnt激动剂与以下一种或多种试剂：
(a) VEGFR抑制剂；
(b) Tgfbr抑制剂；
(c) ERG抑制剂。
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