CN111642615A - 大球盖菇蛋白粉及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大球盖菇蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：包括以下步骤：S1、向大球盖菇粉中按料液比为1:30g/mL加水后调节pH为12，得待提取料；S2、待提取料在超声波功率为120‑160W、超声温度30‑50℃的条件下提取10‑30min后离心取上清液，得蛋白粗提取液；S3、蛋白粗提取液处理得大球盖菇蛋白粉。本发明还公开了一种大球盖菇蛋白粉。本发明具有获取并提高大球盖菇蛋白粉在高温、碱性环境中的加工特性的有益效果。

Description

大球盖菇蛋白粉及其制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白制备领域。更具体地说，本发明涉及一种大球盖菇蛋白粉及其制备方 法。

背景技术

大球盖菇(Stropharia rugosoannulata)属球盖菇科球盖菇属的一种珍稀食用菌，别名 斐氏球盖菇、斐氏假黑伞、酒红色球盖菇、皱环球盖菇、皱球盖菇等。大球盖菇中含有丰 富的营养物质，其主要成分有多糖类、蛋白、黄酮、酚类、甾醇等，其中，大球盖菇蛋白含量较高，一般在25％左右，高的达30-35％，且包括人体所需的8种必需氨基酸和多种 药效氨基酸，符合WHO/FAO参考模式，具有在食品工业领域的应用前景。

目前关于蛋白的研究，主要集中在植物蛋白(大豆蛋白、花生蛋白、谷物蛋白等)、动 物蛋白(带鱼、鸭肝等)和食用菌蛋白(金针菇、杏鲍菇、羊肚菌、灵芝、黑木耳等)。大球盖菇引入中国迟，近几年着重研究如何将大球盖菇产量扩增，目前已经成功“南菇北移”，有地区已经研究出了一套合理利用大球盖菇与当地资源结合的循环模式，在大球盖菇增产的同时，菌糠也得到了合理的利用。此外，还研究了大球盖菇中具有功效活性的多糖、酚 类物质、黄酮类物质等。但对大球盖菇蛋白功能特性的研究报道有限，蛋白质的功能特性 决定了该物质在食品行业的加工方向，在食品加工领域，热处理是常用的加工处理方法， 且有些面食、饮料等处于碱性环境，如何获取并提高大球盖菇蛋白粉在高温、碱性环境中 的加工特性是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种大球盖菇蛋白粉的制备方法，其能够获取并提高大球 盖菇蛋白粉在高温、碱性环境中的加工特性。

本发明还有一个目的是提供一种大球盖菇蛋白粉，其在高温和碱性环境中具有较优的 加工特性。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种大球盖菇蛋白粉的制备方法， 包括以下步骤：

S1、向大球盖菇粉中按料液比为1:30g/mL加水后调节pH为12，得待提取料；

S2、待提取料在超声波功率为120-160W、超声温度30-50℃的条件下提取10-30min后离心取上清液，得蛋白粗提取液；

S3、蛋白粗提取液处理得大球盖菇蛋白粉。

优选的是，大球盖菇清洗去杂后切片，50℃恒温干燥至恒重，磨碎过100目筛，得到大球盖菇粉。

优选的是，步骤S2中待提取料在超声波功率为140W、超声温度40℃的条件下提取20min。

优选的是，步骤S2中离心具体为8000r/min离心15min。

优选的是，步骤S3包括以下步骤：

滴加1mol/L HCl调节pH至等电点，静置80min后8000r/min离心10min取沉淀， 沉淀反复浸洗离心3-5次，得沉淀物；

调节pH至中性，加水复溶，磁力搅拌至溶解均匀，得溶解物；

溶解物于-40℃温度下预冻12h后进行真空冷冻干燥，得到大球盖菇蛋白粉。

利用如权利要求1-5任一项所述的大球盖菇蛋白粉的制备方法制备的大球盖菇蛋白粉。

本发明至少包括以下有益效果：

本申请采用超声辅助碱法提取制得的大球盖菇蛋白粉，采用凯氏定氮法测定了其纯度 为68.57％，其该种蛋白的氨基酸种类齐全，基本符合FAO/WHO标准模式谱。根据RC 值可知实施例1中限制性氨基酸含量最低的是含硫氨基酸，含量最多的氨基酸是芳香族氨 基酸，说明该大球盖菇蛋白粉在风味产品开发方向很有前景。根据SRC值实施例1制得 的大球盖菇蛋白粉营养评价略高于对比例1制得的大球盖菇蛋白粉。

在45-75℃条件下，通过对实施例1制得的大球盖菇蛋白粉的功能特定研究可知，实 施例1在相同温度下的溶解性、乳化性、乳化稳定性、锁水的能力、持油性都优于对比例1；在碱性条件下，通过对实施例1制得的大球盖菇蛋白粉的功能特定研究可知，实施例 1在相同pH下的溶解性、起泡性、乳化性较好。即，通过超声辅助提取提高大球盖菇蛋 白粉在高温、碱性环境中的加工特性，增加其在高温、碱性食品加工领域的应用。

进一步分析可知，通过ANS荧光分光光度计法测定两种蛋白的表面疏水性，对比例的S₀为199.89显著高于实施例1的S₀(167.13)；通过DSC法测定两种蛋白的热稳定性， 可知对比例1和实施例1的热变性温度T_d分别为63.03℃、63.14℃；热焓ΔH分别为1.433 J/g、1.701J/g，表明实施例1结构比对比例1结构更为稳定，更为有序，即通过超声波处 理后的大球盖菇蛋白粉的结构更为稳定，更为有序，且可降低其表面疏水性。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明 的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字 能够据以实施。

<实施例1>

大球盖菇蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：

S1、新鲜大球盖菇清洗去杂后切片，50℃恒温干燥至恒重，磨碎过100目筛，得到大球盖菇粉，向大球盖菇粉中按料液比为1:30g/mL加水后调节pH为12，得待提取料；

S2、待提取料在超声波功率为140W、超声温度40℃的条件下提取20min后8000 r/min离心15min，取上清液，得蛋白粗提取液；

S3、滴加1mol/L HCl调节pH至等电点，静置80min后8000r/min离心10min取 沉淀，沉淀反复加水浸洗离心(8000r/min离心10min)3次，得沉淀物；

调节pH至中性，加少量水复溶，磁力搅拌至溶解均匀，得溶解物；

溶解物于-40℃温度下预冻12h后进行真空冷冻干燥36h，得到大球盖菇蛋白粉。

<实施例2>

大球盖菇蛋白粉的制备方法，同实施例1，不同的是步骤S2中在超声波功率为120W、 超声温度40℃的条件下提取10min。

<实施例3>

大球盖菇蛋白粉的制备方法，同实施例1，不同的是步骤S2中在超声波功率为160W、 超声温度30℃的条件下提取20min。

<实施例4>

大球盖菇蛋白粉的制备方法，同实施例1，不同的是步骤S2中在超声波功率为140W、 超声温度30℃的条件下提取30min。

<实施例5>

大球盖菇蛋白粉的制备方法，同实施例1，不同的是步骤S2中在超声波功率为120W、 超声温度50℃的条件下提取20min。

<对比例1>

大球盖菇蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：

S1、新鲜大球盖菇清洗去杂后切片，50℃恒温干燥至恒重，磨碎过100目筛，得到大球盖菇粉，向大球盖菇粉中按料液比为1:30g/mL加水后调节pH为12(NaOH)，得待 提取料；

S2、待提取料在浸提温度45℃的条件下浸提60min后8000r/min离心15min，取 上清液，得蛋白粗提取液；

S3、滴加1mol/L HCl调节pH至等电点(4.2)，静置80min后8000r/min离心10min 取沉淀，沉淀反复加水浸洗离心(8000r/min离心10min)3次，得沉淀物；

调节pH至中性，加少量水复溶，磁力搅拌至溶解均匀，得溶解物；

溶解物于-40℃温度下预冻12h后进行真空冷冻干燥36h，得到大球盖菇蛋白粉。

实验结果

1、蛋白提取率计算

计算实施例1-5、对比例1的蛋白提取率，具体如下表1所示，其中，蛋白提取率/％＝ (大球盖菇蛋白粉中蛋白含量/样品中总蛋白含量)×100％，样品中总蛋白含量根据GB5009.5-2016第一法测定，大球盖菇蛋白粉中含量根据Bradford比色法测定；

表1蛋白提取率

	实施例1	实施例2	实施例3
				蛋白提取率％	42.14±0.47	38.88	37.98
	对比例1	实施例4	实施例5
				蛋白提取率％	37.54±0.24	38.87	39.28

其中个，表1中实施例1、对比例1进行平行实现后求方差获得提取率，由表1可知，相比于对比例1(碱法提取)，实施例1-7(超声波辅助碱法提取)获取的大球盖菇蛋白提 取率高，且用时短，其中，实施例1的蛋白提取率达到了42.14±0.47％。

2、氨基酸评价

取实施例1、对比例1制得的大球盖菇蛋白，与FAO/WHO标准模式、全蛋蛋白模式 进行比较进行氨基酸评价，分别计算RAA(氨基酸比值)、RC(氨基酸比值系数)、SRC (氨基酸比值系数分)，结果见表3，其中，表2为FAO/WHO标准蛋白模式与全蛋蛋白 模式(mg/g蛋白)，RAA＝(大球盖菇蛋白粉中某种必须氨基酸含量(mg/g蛋白)/FAO/WHO 标准模式中相应必须氨基酸含量(mg/g蛋白))；

式中，

为食品中各种氨基酸比值的平均值；

SRC＝100-CV×100，式中，

n为参与评价的氨基酸的种类数， 具体n＝7，RC_i为待评价氨基酸的氨基酸比值系数。

表2FAO/WHO标准蛋白模式与全蛋蛋白模式(mg/g蛋白)

氨基酸种类	Thr	Val	Met+Cys	Ile	Leu	Phe+Tyr	Lys
								FAO/WHO模式	40	50	35	40	70	60	55
全蛋蛋白模式	47	66	57	54	86	93	70

表3实施例1和对比例1的氨基酸比值系数分比较

根据氨基酸平衡理论：若待测蛋白氨基酸组成含量比例与模式谱一致，则RC值为1， SRC值为100。由表3可知，实施例1和对比例1的Val(缬氨酸)、Leu(亮氨酸)和Lys (赖氨酸)的RC值与1接近，Thr(苏氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Phe+Tyr(苯亮氨酸+酪 氨酸)的RC值大于1，说明这三种氨基酸相对过剩，而Phe+Tyr的RC值最大，作为芳 香族氨基酸，说明大球盖菇蛋白风味产品开发很有前景。Met+Cys(含硫氨基酸)的RC 值小于1，且为最小值，构成实施例1和对比例1制备的大球盖菇蛋白粉第一限制性氨基 酸；

SRC值与100进行比较，越接近说明待测物营养价值越高。实施例1和对比例1的SRC值分别为74.79、73.49，所以从营养价值来看，实施例1提取的大球盖菇蛋白粉具有 更高的开发优势。

3、溶解性测定

3.1、pH对蛋白溶解性的影响

称取实施例1、对比例1制得的大球盖菇蛋白粉加水配成2mg/mL的蛋白溶液，滴加NaOH或HCl调节pH至5-12(每隔1一个梯度)，室温磁力搅拌30min，8000r/min离心 10min弃不溶物，采用Bradford比色法测定上层溶液蛋白含量。

测定可知随着pH值的增加，实施例1、对比例1制得的大球盖菇蛋白粉在溶剂中的溶解度均明显增大，且实施例1在该范围某一pH值下的溶解度均大于对比例1在对应pH 值下的溶解度，在pH＝12时，实施例1、对比例1制得的大球盖菇蛋白粉的溶解性达到最 大值，分别为80.06％、67.91％。

即实施例1制得的大球盖菇蛋白粉中性及碱性环境下的较优的溶解性，且随着pH值 的增加，大球盖菇蛋白粉在溶剂中的溶解度明显增大，增强其在环境呈碱性的面食、饮料 等食品加工领域中的应用。

3.2、温度对蛋白溶解性的影响：

称取实施例1、对比例1制得的大球盖菇蛋白粉配制成浓度2mg/mL的溶液，调节pH至8.0，在不同高温温度下(45-75℃，每隔10℃一个梯度)恒温水浴振荡30min，8000r/min离心10min弃不溶物，采用Bradford比色法测定上层溶液蛋白含量。

测定可知，以45℃为基准，在45-75℃范围内，随着温度的升高实施例1制备的大球盖菇蛋白粉的溶解度增大，而对比例1制备的大球盖菇蛋白粉的溶解度呈现先降低后增大的趋势，且实施例1在该范围某一温度值下的溶解度均大于对比例1在对应温度值下的溶解度，在75℃时，实施例1制得的大球盖菇蛋白粉的溶解性达到最大值，对比例1制 得的大球盖菇蛋白粉在45℃时的溶解性最大。

即实施例1制得的大球盖菇蛋白粉在高温环境下的较优的溶解性，且随着温度值的增 加，大球盖菇蛋白粉在溶剂中的溶解度增大，在食品加工过程中，热处理是常用的加工处 理方法，增强其在需要进行热处理的食品加工领域中的应用。

4、持水性和持油性测定

4.1、持水性测定：蛋白质持水性是衡量物料经水化处理后能否锁住水的能力，会直 接影响食品的质地，因此持水性是食品加工行业一个重要性指标。首先烘干离心管至恒重， 分别称取实施例1、对比例1制得的大球盖菇蛋白粉(m₀)100mg于离心管中称重，记录质量m₁，向离心管中缓缓加水涡旋，直至样品成浆状，无水析出，置于不同温度下(45-75℃)水浴30min，5000r/min离心10min，擦拭管壁残留水，称重，记录质量m₂。计算公式如 下：

4.2、持油性测定：持油性是指蛋白分子中非极性链结合脂肪的能力，与分子表面亲 脂基的含量有关，含量越多，持油性越强，附着鲜味成分脂肪越多，食品质量提高。与持水性测定方法相同，把水换成大豆油，测定不同温度(45-75℃)对蛋白持油性的影响， 结果如下表4所示；

表4温度对实施例1和对比例1大球盖菇蛋白粉的持水性和持油性的作用结果

注：不同大写字母表示同一温度下组间差异显著(P<0.05)，不同小写字母表示不同温度下组内差异 显著(P<0.05)。

由表4可知，以45℃为基准，在45-75℃范围内，实施例1和对比例1制得的大球 盖菇蛋白粉锁水的能力随系统温度的提高均呈现一个减弱的趋势，但是，实施例1的大球 盖菇蛋白粉锁水的能力的减弱趋势明显低于对比例1的产品，且在温度高于65℃后，实 施例1的大球盖菇蛋白粉优于对比例1；

以45℃为基准，在45-75℃范围内，实施例1和对比例1制得的大球盖菇蛋白粉的持油性随温度的升高整体呈先增长后下降的趋势，温度为65℃时，实施例1制得的大球 盖菇蛋白粉的持油性与对比例1无显著性差异，其余温度实施例1制得的大球盖菇蛋白粉 的持油性优于对比例1，75℃时，优势更明显。

5、起泡性测定

利用特定仪器高速搅打蛋白溶液后起泡丰富度即蛋白质的起泡性。称取实施例1、对 比例1制得的大球盖菇蛋白粉配制成质量分数为0.2％的蛋白溶液，记录初始体积V₀，移入锥形瓶中，调节pH至6.0-12.0(每隔2一个梯度)，利用高速分散器进行搅打，室温下10000r/min高速搅打2min，立即移入100mL刻度量筒，记录体积V₁，计算蛋白的起泡能力， 公式如下：

测定可知，以pH＝6为基准，在6-12范围内，随着pH值的增大实施例1制备的大球盖菇蛋白粉的起泡能力增大，在pH＝12时达到最大为226.27％，而对比例1制备的大球盖菇蛋白粉的起泡能力则呈现一个先增大后降低的趋势，且pH＝8时达到最大为195.24％；

比较可知，中性条件pH＝6、pH＝8时，实施例1和对比例1的产品起泡性差异不显著(P>0.05)，而在碱性条件pH＝10、pH＝12时，实施例1的产品起泡性明显优于对比例1的 产品。

6、乳化性测定

在高速分散器强机械作用下油滴被打散的同时蛋白质分子会覆盖在油滴的表面以阻 止油滴再次聚集浮在表面，因此乳化活性反映的是两种及以上互不相溶的液体混合时，1g 蛋白粉可以稳定混合界面的面积。乳化稳定性反映蛋白维持油水界面稳定的能力。

6.1、pH对乳化性及其稳定性的作用结果

称取实施例1、对比例1制得的大球盖菇蛋白粉配置成浓度2mg/mL的蛋白溶液，调节pH至6-12(每隔2一个梯度)，分别取一定量蛋白溶液，与大豆油按照体积比3:1室温 下10000r/min匀浆2min，停止后马上从瓶底吸取50μL乳状液，1:100加入0.1％SDS溶 液混匀，于500nm处测OD值A₁，用水代替蛋白溶液进行调零。准确静置10min后，再 从底部吸取50μL，进行以上操作，得到OD值A₁₀。

计算乳化活性指数(EAI)与乳化稳定性(ESI)，其中，

式中B为总稀释倍数，c为2mg/mL，l为光程(0.01m)，0.25为油相体积分数，t 为静置时间；

测定可知，以pH＝6为基准，在6-12范围内，随着pH值的增大实施例1和对比例1 制备的大球盖菇蛋白粉的乳化性均呈现增加的趋势，在pH＝12时，实施例1和对比例1 制备的大球盖菇蛋白粉的EAI值均达到最大，分别为255.77m²/g、227.66m²/g。整体来看， 以pH＝6为基准，在8-12范围内，随着pH的增大，实施例1制得产品的乳化性要明显高 于对比例1的乳化性(P<0.05)。进一步，中性条件pH＝6、pH＝8时，实施例1产品的乳化 稳定性优于对比例1，而在碱性条件pH＝10、pH＝12时，实施例1的产品乳化稳定性与对 比例1的产品乳化稳定性差异不显著(P>0.05)。

6.2、温度对乳化性及其稳定性的作用结果

称取实施例1、对比例1制得的大球盖菇蛋白粉配置成浓度2mg/mL的蛋白溶液，调节pH至10，分别取一定量蛋白溶液，与大豆油按照体积比3:1在不同温度下(45-75℃， 每隔10℃一个梯度)水浴保温30min，10000r/min高速搅打2min，之后同6.1处理计 算乳化活性指数(EAI)与乳化稳定性(ESI)；

测定可知，以45℃为基准，在45-75℃范围内，同温度条件下实施例1制备的大球盖菇蛋白粉的EAI和ESI值均高于对比例1，原因可能在于超声处理后的蛋白作为乳化剂 形成乳液滴较小，使其稳定性强。

7、表面疏水性测定

取实施例1、对比例1制备的大球盖菇蛋白粉，以周位酸(ANS)作为荧光探针，用pH＝7.4、 0.01M磷酸缓冲液(PBS)配制成不同浓度的蛋白溶液，取配制好的蛋白溶液3.0mL于试管 中，加入30μL 8mmol/L ANS，涡旋混匀后避光放置10min后摇匀测定不同浓度蛋白样品的荧光强度并制图(蛋白浓度-荧光强度)，所得曲线斜率即为待测物的表面疏水性指数S₀，其中，参数设置：激发波长390nm，发射波长470nm，狭缝校正5nm。

测定实施例1的表面疏水性指数为167.13，显著小于对比例1的表面疏水性指数199.89。

8、热稳定性测定

DSC法是指在相同条件下进行等温度加热或冷却，利用有物相变化的物料和在测定温 度范围内没有任何热效应且不发生相变的参照物进行对比，当物料引发相变时，便会与参 照物之间出现一个温差。本次试验中扫描温度范围为20℃-110℃，10℃/min匀速升温， N₂作为气氛吹扫样品，流速为50mL/min。测定实施例1、对比例1制得的大球盖菇蛋白粉的热变性温度(Td)及变性热。

实施例1和对比例1产品的热变性温度T_d分别为63.14℃、63.03℃，热焓ΔH分别为1.701J/g、1.433J/g，即实施例1的T_d和ΔH均稳定于对比例1，T_d、ΔH越小，蛋白分 子热稳定性差，无序结构占比大，即实施例1比对比例1分子更为有序，热稳定性更好。

综上可知，本申请采用超声辅助碱法提取制得的大球盖菇蛋白粉，采用凯氏定氮法测 定了其纯度为68.57％，其该种蛋白的氨基酸种类齐全，基本符合FAO/WHO标准模式谱。 根据RC值可知实施例1中限制性氨基酸含量最低的是含硫氨基酸，含量最多的氨基酸是 芳香族氨基酸，说明该大球盖菇蛋白粉在风味产品开发方向很有前景。根据SRC值实施例1制得的大球盖菇蛋白粉营养评价略高于对比例1制得的大球盖菇蛋白粉。

在45-75℃条件下，通过对实施例1制得的大球盖菇蛋白粉的功能特定研究可知，实 施例1在相同温度下的溶解性、乳化性、乳化稳定性、锁水的能力、持油性都优于对比例1；在碱性条件下，通过对实施例1制得的大球盖菇蛋白粉的功能特定研究可知，实施例 1在相同pH下的溶解性、起泡性、乳化性较好。即，通过超声辅助提取提高大球盖菇蛋 白粉在高温、碱性环境中的加工特性，增加其在高温、碱性食品加工领域的应用。

进一步分析可知，通过ANS荧光分光光度计法测定两种蛋白的表面疏水性，对比例的S₀为199.89显著高于实施例1的S₀(167.13)；通过DSC法测定两种蛋白的热稳定性， 可知对比例1和实施例1的热变性温度T_d分别为63.03℃、63.14℃；热焓ΔH分别为1.433 J/g、1.701J/g，表明实施例1结构比对比例1结构更为稳定，更为有序，即通过超声波处 理后的大球盖菇蛋白粉的结构更为稳定，更为有序，且可降低其表面疏水性。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用， 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现 另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特 定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (6)

1.大球盖菇蛋白粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、向大球盖菇粉中按料液比为1:30g/mL加水后调节pH为12，得待提取料；

S2、待提取料在超声波功率为120-160W、超声温度30-50℃的条件下提取10-30min后离心取上清液，得蛋白粗提取液；

S3、蛋白粗提取液处理得大球盖菇蛋白粉。

2.如权利要求1所述的大球盖菇蛋白粉的制备方法，其特征在于，大球盖菇清洗去杂后切片，50℃恒温干燥至恒重，磨碎过100目筛，得到大球盖菇粉。

3.如权利要求1所述的大球盖菇蛋白粉的制备方法，其特征在于，步骤S2中待提取料在超声波功率为140W、超声温度40℃的条件下提取20min。

4.如权利要求1所述的大球盖菇蛋白粉的制备方法，其特征在于，步骤S2中离心具体为8000r/min离心15min。

5.如权利要求1所述的大球盖菇蛋白粉的制备方法，其特征在于，步骤S3包括以下步骤：

滴加1mol/L HCl调节pH至等电点，静置80min后8000r/min离心10min取沉淀，沉淀反复浸洗离心3-5次，得沉淀物；

调节pH至中性，加水复溶，磁力搅拌至溶解均匀，得溶解物；

溶解物于-40℃温度下预冻12h后进行真空冷冻干燥，得到大球盖菇蛋白粉。

6.利用如权利要求1-5任一项所述的大球盖菇蛋白粉的制备方法制备的大球盖菇蛋白粉。