CN111635284A - 一种聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，选择枸杞枝条为主要原料制备生物炭，直接以农业固体有机废弃物为原料经固体发酵生产含聚谷氨酸的有机肥，与生物炭复混得到含聚谷氨酸的生物炭基有机肥，在解决农业废弃物环境污染的同时将其资源化利用，兼具环境和经济效益。本发明方法制备的复合有机肥料能够促进作物养分吸收、改善土壤理化性质、提高肥料利用率。
Description
技术领域
本发明属于功能型肥料生产技术领域，特别涉及一种能够促进作物养分吸收、提高肥料利用率的聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法。
背景技术
肥料利用率低是制约我国农业发展的一大瓶颈。数据表示，2011年我国氮肥施用量2400万吨，因过挥发、淋溶和径流等途径损失数量巨大，直接损失肥料约1000余万吨，折合人民币约340亿元。同时，随之带来土壤肥力下降、农作物品质降低、环境污染严重等后果。因此提高肥料利用率，降低肥料流失，受到国内外农业工作者广泛的关注。
γ-聚谷氨酸(简称聚谷氨酸)是微生物发酵产生的水溶性多聚氨基酸，是由谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基形成肽键而聚合形成的一种高分子聚合物，具有生物可降解性、超强吸水和保水性、良好生物相容性、低免疫原性、对环境无污染、对人体无毒害等一系列独特的物理化学和生物学特性，广泛应用于农业、医药、食品、日化等许多领域。
生产γ-聚谷氨酸最普遍的方法是利用微生物进行液体发酵。由于γ-聚谷氨酸是一种高分子物质，液体发酵的后期，发酵液会变得越来越粘稠，导致发酵体系中通气不顺，氧气供应量不足，影响菌体的生长与代谢，最终影响的产量，一般γ-聚谷氨酸液体发酵的产量在10-50g/L之间。目前，国内外研究主要集中在聚谷氨酸产生菌的改良和基因研究，发酵过程研究和提取纯化过程研究，其应用研究不多，在农业方面研究更少。
生物质炭是将农作物稻秆、木屑等生物质材料在限制或隔绝氧气的环境条件下，经热解而形成的一种固态的、难溶的、稳定的、高度芳香化的富含碳的材料。生物炭不仅可以起到土壤改良的作用，还能吸附肥料养分，减少土壤养分淋失，同时赋予了肥料缓释和固碳的功能。生物炭可以提高肥料利用效率，可改变土壤的物理性状和结构，促进土壤生物化学与物理化学的交互作用而提高土壤肥力，间接地提高作物养分利用效率。同时，生物炭可有效吸附NO3 -与NH3，减少土壤中氨的挥发。生物炭可以提高土壤pH值，可以通过吸附或共沉淀作用，显著降低重金属污染物、除草剂、农药等在植物体内的积聚减少。单独使用生物炭对作物增产的贡献尚不十分明朗。
发明内容
本发明的目的针对现有技术的不足，提供一种含聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，利用农业废弃物(包括畜禽粪便、枸杞枝条等)为原料经固体发酵制作有机复合肥料，在解决农业废弃物环境污染的同时将其资源化利用，兼具环境和经济效益。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，包括如下步骤：
1)以枸杞枝条为原料，在惰性气体(氮气)气氛下，厌氧裂解制得生物炭(BC)；
2)聚谷氨酸有机肥的制备
在主要包含畜禽粪便的发酵基质中，接种解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciensC1，在常温条件下进行固体发酵，制得含聚谷氨酸(γ-PGA)的有机肥；
3)聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备
将步骤1)得到的枸杞枝条生物炭与步骤2)得到的含聚谷氨酸的有机肥混合并搅拌，干燥后即得所述的聚谷氨酸生物炭基有机肥。
所述的方法中，步骤1)中枸杞枝条其含水率低于10％(重量质量分数)，粉碎为颗粒，优选其粒径不大于1.5cm。
所述的方法中，步骤1)中裂解温度为400～600℃；优选在550℃条件下煅烧1～2h，升温速度10℃/min。
所述的方法中，步骤2)中的发酵基质主要为畜禽粪便，添加生物质调理剂，包括但不限于秸秆、稻壳、木屑、豆粕、玉米粉、味精粕、麸皮、菜饼等中的一种或几种。
所述的方法中，步骤2)中的发酵基质含水率45～55％，C/N比调至20～30：1。
所述的方法中，步骤2)中功能菌株B.amyloliquefaciens C1的接种量为3～5％。
所述的方法中，步骤2)得到的含聚谷氨酸有机肥的聚谷氨酸含量大于4.0％(w/w，干重)，平均分子量为>130kDa。
所述的方法中，步骤3)中枸杞枝条生物炭与含聚谷氨酸的生物有机肥的质量比为1:～5。
本发明以枸杞枝条为原料制备生物炭，并直接以固体发酵制备聚谷氨酸生物炭基有机肥，枸杞枝条木质素含量高，制备的生物炭的孔隙更加丰富。固体发酵是一种在饲料业、食品业、工业化学品生产和医药制剂等领域被广泛采用的生产方式。相比较于液体发酵，固体发酵具有耗能低，产生污水少，产量高和生产方式简单等优势。另外，利用农业生产的固体废弃物作为发酵基质，既可以提高微生物发酵的产量，又可以给固体废弃物资源化处理和环保行业提供一种全新的处理方式。
有益效果：本发明的聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，以枸杞枝条为主要原料制备生物炭，进而以农业固体有机废弃物为原料经固体发酵生产的含聚谷氨酸的有机肥和生物炭的复混生产含聚谷氨酸的生物炭基肥，在解决农业废弃物环境污染的同时将其资源化利用，兼具环境和经济效益。本发明方法制备的复合有机肥料能够促进作物养分吸收、改善土壤理化性质、提高肥料利用率。
附图说明
图1固体发酵培养基中，Bacillus amyloliquefaciens C1菌株生产的γ-PGA的SDS-PAGE图；
图2堆放的聚谷氨酸生物炭基有机肥照片。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
一种聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，包括如下步骤：
(1)枸杞枝条生物炭制备
经检测，枸杞枝条的主要组成成分及含量分别为木质素31.49％、纤维素28.97％、半纤维素17.05％、灰分含量9.51％，是一种制备生物炭的良好生物质材料，因此选取枸杞枝条作为制备生物炭得材料。
采用自然风干使枸杞枝条含水量低于10％(重量质量分数)，经粉碎后修剪成约1厘米(cm)长度得颗粒。
采用高温煅烧法制备枸杞枝条生物炭，并通过通入惰性气体(氮气)得方式维持反应体系内的缺氧条件。
优化了枸杞枝条制备生物炭的温度、升温速率、时间等参数，确定枸杞枝条制备生物炭的工艺条件为：枸杞枝条经过粉碎、压块制备枸杞枝条颗粒，在550℃缺氧条件下反应1-2h，升温速度10℃/min，获得生物炭。
反应结束后，自然冷却至室温(室温一般为20-30℃)，干燥，即得到所述生物炭材料。
采用针对负吸附行为拟合氮气吸附解吸等温线的方法，运用几种模型计算样品比表面积及微孔孔容，计算所得数据见表1。由表中相关系数可知，朗格缪尔模型比BET模型更加符合真实的吸附情况。随着温度的升高，利用朗格缪尔模型计算的比表面积呈现先增加后降低的趋势，550℃比表面积达到最大。由t-plot数据可知，总比表面积、微孔比表面积、微孔孔容均随温度的升高而增加，但是t-plot模型以BET多层吸附理论为基础，而600℃时比表面积无法用BET模型计算，因此降低了t-plot数据的可信度。对比微孔表面积占比数据可得，随着温度升高，孔隙发育愈完全，验证了负吸附行为的产生。
表1比表面积和孔径分布
(2)聚谷氨酸有机肥固体发酵
以腐熟牛粪、豆粕、玉米粉、味精粕、麸皮、菜饼等为主要基质，通过固体发酵得方式生产含聚谷氨酸的有机肥，所接种的功能菌株为申请人实验室保藏的一株根际促生菌解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens C1)，有关该功能菌株的分离筛选与鉴定，可参见何剑、雍晓雨等《一株γ-多聚谷氨酸生产菌的分离筛选与鉴定》(生物加工过程,2014,12:87-93.)，Xiaoyu Yong等，《Dynamics of bacterial communities during solid-statefermentation using agro-industrial wastes to produce poly-γ-glutamic acid,revealed by real-time PCR and denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)》(Applied Microbiology and Biotechnology,2011,92:717-725.)。公众可以从南京工业大学获得该功能菌株，并且专利申请人保证，从申请日起二十年内可向公众发放该生物材料。
固体发酵在室温中进行，在小规模的发酵条件下(20kg发酵基质，初始含水量50％)，C1接种量为5％。在含有5.51kg腐熟牛粪，1.91kg豆粕，0.57kg玉米粉，2.15kg味精粕，1.5kg麸皮，0.5kg菜饼的优化培养基中，30℃静置发酵70小时，期间每隔24h翻堆一次。
发酵完成后，取20g发酵产物加入100mL ddH2O震荡混匀后离心去除固体颗粒物，再加入3倍体积4℃预冷的无水乙醇沉淀γ-PGA过夜，120,00rpm离心收集γ-PGA沉淀。取纯化的γ-PGA样品0.2g放入水解管中，加入10mL 6mol/L的HCl，抽真空，110℃水解12，冷却后过滤，旋转蒸发仪除去盐酸浓缩，最后定容到10mL。采用Biochrom 30专用自动氨基酸分析系统对水解产物进行分析，同时测定对应的未水解发酵液中游离谷氨酸含量，两者之差即可认为是γ-PGA的产量。该法检测发酵产品中聚谷氨酸含量为4.37％(w/w,干重)。聚谷氨酸多以葡萄糖、柠檬酸、谷氨酸等液体发酵后提取纯化，成本高、工艺复杂。本发明固体发酵后聚谷氨酸的产量和液体发酵的产量(目前多是在20-70g/L范围)相当，且原料是废弃物，工艺简单，不需要提取纯化。
利用SDS-PAGE法测定在上述基质中经B.amyloliquefaciens C1菌株固体发酵生产的γ-PGA分子量为>130kDa。
(3)枸杞枝条生物炭与聚谷氨酸有机肥混合制备生物炭基有机肥
将经高温煅烧制备的枸杞枝条生物炭与经固体发酵制成的含聚谷氨酸的有机肥按质量比为1:3混合，充分搅拌，烘干即得生物炭基肥。经检测，该新型生物炭基肥有效活菌数浓度达到3.5×109CFU/g，有机质含量(以干重计)≥25％。
实施例2
盆栽试验每盆装土10kg，每盆播6粒露白的玉米种子，待玉米4片真叶时定植4棵，30天后收获。实验过程每组处理人为设置为低灌溉水平，试验共设七个处理，即
TR1:CF(化肥)；
TR2:0.5％PGA(C1菌株经固体发酵的含γ-PGA的有机肥)；
TR3:0.5％BC-PGA(混合后的聚谷氨酸生物炭基有机肥)；
TR4:1.0％PGA；
TR5:1.0％BC-PGA；
TR6:1.5％PGA；
TR7:1.5％BC-PGA；
重复5次。各处理分别用尿素、过磷酸钙和氯化钾补齐至相同的N、P、K水平，有机肥作为基肥一次施入，化肥分两次施入。
实验结束后测定玉米幼苗的农艺性状，独施用CF的玉米幼苗的农艺性状最差。施用PGA和BC-PGA均能促进玉米幼苗的生长，而施用BC-PGA的玉米幼苗的株高、叶长、叶宽和茎粗均显著高于同等养分条件下PGA处理，即TR7﹥RT6，TR5﹥TR4，TR3﹥TR2，且在所有处理中以TR7处理的农艺性状最好，并与其它各处理的差异均达了显著水平。施用0.5％的BC-PGA的玉米幼苗的农艺性状要高于施用1.0％PGA的处理，即TR5﹥TR6(表2)，说明在模拟干旱的条件下施用低含量的聚谷氨酸生物炭基有机肥促生效果要优于施用高含量的聚谷氨酸有机肥。
表2不同处理对玉米幼苗农艺性状的影响
Claims (10)
1.一种聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，包括如下步骤：
1)以枸杞枝条为原料，在惰性气体气氛下，厌氧裂解制得生物炭；
2)聚谷氨酸有机肥的制备
在主要包含畜禽粪便的发酵基质中，接种解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens C1在常温条件下进行固体发酵，制得含聚谷氨酸的有机肥；
3)聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备
将步骤1)得到的枸杞枝条生物炭与步骤2)得到的含聚谷氨酸的有机肥混合并搅拌，干燥后即得所述的聚谷氨酸生物炭基有机肥。
2.根据权利要求1所述的聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，其特征在于，所述的步骤1)中，枸杞枝条其含水率质量分数低于10％，粉碎为粒径不大于1.5cm的颗粒。
3.根据权利要求1所述的聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，其特征在于，所述的步骤1)中，裂解温度为400～600℃。
4.根据权利要求3所述的聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，其特征在于，裂解在温度550℃条件下煅烧1～2h，升温速度10℃/min。
5.根据权利要求1所述的聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，其特征在于，所述的步骤2)中，发酵基质主要为畜禽粪便，添加生物质调理剂。
6.根据权利要求5所述的聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，其特征在于，所述的生物质调理剂为秸秆、稻壳、木屑、豆粕、玉米粉、味精粕、麸皮、菜饼中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，其特征在于，所述的方法中，步骤2)中的发酵基质含水率45～55％，C/N比调至20～30：1。
8.根据权利要求1所述的聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，其特征在于，所述的方法中，步骤2)中功能菌株解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens C1的接种量为3～5％。
9.根据权利要求1所述的聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，其特征在于，所述的方法中，步骤2)得到的含聚谷氨酸有机肥以干重计，聚谷氨酸含量大于4.0wt％，平均分子量为>130kDa。
10.根据权利要求1所述的聚谷氨酸生物炭基有机肥的制备方法，其特征在于，所述的方法中，步骤3)中枸杞枝条生物炭与含聚谷氨酸的生物有机肥的质量比为1:1～5。
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