CN111629716A - 治疗炎症的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开了通过以任何组合靶向促炎性MRP2/HXA3途径和/或抗炎性P‑gp/内源性大麻素途径和/或抗炎性MRP1/L‑AMEND途径来治疗嗜中性粒细胞介导的炎症的方法和组合物，包括向受试者施用治疗有效量的(a)抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和羟基环氧素A3(HXA3)合酶中一种或多种的活性和/或水平的一种或多种第一化合物，和/或(b)增加一种或多种N‑酰基乙醇胺(NAE)的水平和/或活性的一种或多种第二化合物，和/或(c)增加多药抗性蛋白1(MRP1)的水平和/或活性的一种或多种第三化合物，其中所述治疗量的第一、第二和第三化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。

Description

治疗炎症的方法和组合物
本申请要求2017年7月14日提交的共同待审的美国临时申请系列号62/532,539的优先权，该申请通过引用并入本文。
联邦资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院(NIH)授予的编号为DK056754的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本公开的技术涉及通过以任何组合靶向促炎性MRP2/HXA3途径和/或抗炎性P-gp/内源性大麻素途径和/或抗炎性MRP1/L-AMEND途径来治疗嗜中性粒细胞介导的炎症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的(a)抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和羟基环氧素A3(hepoxilin A3，HXA3)合成酶中的一种或多种的活性和/或水平的一种或多种第一化合物，和/或(b)增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的水平和/或活性的一种或多种第二化合物，和/或(c)增加多药抗性蛋白1(MRP1)的水平和/或活性的一种或多种第三化合物，其中治疗量的第一、第二和第三化合物可减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
背景
炎症，尤其是慢性炎性疾病(CID)，在全球范围内非常普遍，被认为是导致各种疾病如癌症、心血管疾病、糖尿病、肥胖症、骨质疏松症、类风湿性关节炎、炎症性肠病、哮喘和中枢神经系统相关疾病例如抑郁症和帕金森氏病发展的主要原因之一。上皮细胞响应肠炎沙门氏菌血清型变种鼠伤寒沙门氏菌(鼠伤寒沙门氏菌)或多种其他病原体的感染而显著增加膜ABC转运蛋白多药抗性蛋白2(MRP2)的表面表达。类花生酸HXA3的细胞内生物合成途径同时被上调，并且表面上增加的MRP2起到将HXA3转运到肠腔中的作用。这样跨上皮建立了HXA3的浓度梯度，该梯度将嗜中性粒细胞的趋化性从基底外侧导向了内腔，从而导致严重的炎症过程。该MRP/HXA3途径在肺和肠上皮细胞内多种病原体的感染期间是保守的。但是，没有证据表明在没有感染的情况下它是否还会引起炎症。
与增加的MRP2水平同时，鼠伤寒沙门氏菌可在表面主动降低另一种ABC转运蛋白P-糖蛋白(P-gp)，其重要性目前尚不清楚。P-gp内的缺陷与炎症性肠病(IBD)相关，其中在IBD患者的上皮中观察到P-gp降低以及编码P-gp的mdr1基因单核苷酸多态性，与IBD风险增加相关。缺乏编码P-gp的mdr1a基因的小鼠会发生自发性肠道炎症。但是，这一炎症过程的潜在机制尚不清楚。因此，仍然需要减少炎症的组合物和方法。
概述
一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的哺乳动物受试者的靶组织中的嗜中性粒细胞介导的炎症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和羟基环氧素A3(HXA3)合酶中的一种或多种的一种或多种第一化合物，其中治疗量的第一化合物可减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的一种或多种第二化合物，其中该治疗量的第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的增加多药抗性蛋白1(MRP1)的一种或多种第三化合物，其中该治疗量的第三化合物减少了嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的增加多药抗性蛋白1(MRP1)的一种或多种第二化合物，其中该治疗量的第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在一些实施方案中，施用步骤选自局部施用和在靶组织的腔表面施用。
在一些实施方案中，将减少嗜中性粒细胞向靶组织中迁移的第一化合物缀合至聚合物。
在一些实施方案中，炎症是非感染性炎症。
在一个方面，本公开提供了一种用于治疗需要其的哺乳动物受试者的靶组织中的嗜中性粒细胞介导的炎症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的一种或多种第一化合物，其中所述治疗量的第一化合物可减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和HXA3合酶中的一种或多种的一种或多种第二化合物，其中所述治疗量的第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的增加多药抗性蛋白1(MRP1)的一种或多种第三化合物，其中该治疗量的第三化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在一些实施方案中，增加一种或多种NAE的所述一种或多种第一化合物是大麻素受体2型(CB2)激动剂。
在一些实施方案中，将减少嗜中性粒细胞向靶组织中迁移的第一化合物缀合至聚合物。
在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的增加多药抗性蛋白1(MRP1)的一种或多种第二化合物，其中该治疗量的第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在一个方面，本公开提供了一种在有需要的哺乳动物受试者的靶组织中治疗嗜中性粒细胞介导的炎症的方法，包括向该受试者施用治疗有效量的增加多药抗性蛋白1(MRP1)的一种或多种第一化合物，其中所述治疗量的第一化合物可减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在一些实施方案中，该方法进一步包括施用抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和羟基环氧素A3(HXA3)合酶中一种或多种的一种或多种第二化合物，其中该治疗量的第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在一些实施方案中，该方法进一步包括向该受试者施用治疗有效量的增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的一种或多种第三化合物，其中该治疗量的第三化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种第二化合物，所述一种或多种第二化合物增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)，其中该治疗量的第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在一些实施方案中，施用是局部或在靶组织的腔表面处的一种或多种。
在一些实施方案中，减少嗜中性粒细胞向靶组织中迁移的第一化合物被缀合至聚合物。
在本文公开的方法的一些实施方案中，炎症是非感染性炎症。在一些实施方案中，所述炎症是感染性炎症。
在本文公开的方法的一些实施方案中，所述抑制MRP2的化合物包含具有下式的丙磺舒-聚合物缀合物
Figure BDA0002392142680000041
其中X是包含一个或多个原子的连接基，而POLY是聚合物。
在一些实施方案中，X是选自取代或未取代的C1-CX亚烷基、亚杂烷基(heteroalkylene)、亚烯基或亚杂烯基(heteroalkenylene)的连接基，其中x可以是1至12的任何整数。
在一些实施方案中，POLY是选自以下的聚合物：葡聚糖，聚乙二醇(PEG)，高碘酸盐氧化的葡聚糖，聚唾液酸(PSA)，透明质酸(HA)，糊精，羟乙基淀粉(HES)，聚(2-乙基2-
Figure BDA0002392142680000042
唑啉)(PEOZ)，聚谷氨酸(PGA)，聚乳酸(PLA)，聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLA/PLGA)，聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)，聚甘油，25聚酰胺基胺(PAMAM)，聚乙烯亚胺(PEI)，多肽及其任意组合。在一些实施方案中，POLY是40kDa葡聚糖。在一些实施方案中，POLY是10kDa葡聚糖。在一些实施方案中，X是己胺，而POLY是高碘酸盐氧化的40kDa葡聚糖。在一些实施方案中，POLY是40kDa的2臂分支的PEG胺。
一方面，本公开提供具有下式的化合物：
Figure BDA0002392142680000051
其中X是连接基并且POLY是聚合物。
在一些实施方案中，X是选自取代或未取代的C1-CX亚烷基、亚环烷基(cycloakylene)、环烷基亚烷基(cycloalkylalkylene)、亚杂烷基(heteroalkylene)、亚烯基(alkenylene)或亚杂烯基(heteroalkenylene)的连接基，其中x可以是1至12的任何整数。
在一些实施方案中，POLY是选自以下的聚合物：葡聚糖，聚乙二醇(PEG)，高碘酸盐氧化的葡聚糖，聚唾液酸(PSA)，透明质酸(HA)，糊精，羟乙基淀粉(HES)，聚(2-乙基2-
Figure BDA0002392142680000052
唑啉)(PEOZ)，聚谷氨酸(PGA)，聚乳酸(PLA)，聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLA/PLGA)，聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)，聚甘油，25聚酰胺基胺(PAMAM)，聚乙烯亚胺(PEI)，多肽及其任意组合。在一些实施方案中，POLY是40kDa葡聚糖。在一些实施方案中，X是己胺，而POLY是高碘酸盐氧化的40kDa葡聚糖。在一些实施方案中，POLY是10kDa葡聚糖。
在一些实施方案中，X是选自取代或未取代的C1-CX亚烷基、亚环烷基、环烷基亚烷基、亚杂烷基、亚烯基或亚杂烯基的连接基，其中x可以是1至12的任何整数，并且POLY是高碘酸盐氧化的10kDa葡聚糖。
在一些实施方案中，POLY是PEG。在一些实施方案中，POLY是40kDa的2臂分支的PEG胺。
在一些实施方案中，相对于未治疗的对照，本发明的化合物能够减轻有需要的受试者中嗜中性粒细胞介导的炎症。
在一些实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含治疗有效量的式I化合物和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本公开涉及用于治疗或预防需要其的受试者中的炎症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的式I化合物。
在一些实施方案中，炎症是由选自以下的炎症性疾病引起的：肠道疾病，包括直肠炎，睾丸炎，克罗恩氏病，结肠炎例如溃疡性结肠炎，感染性/非感染性小肠结肠炎，和炎性肠病(IBD)；炎症性肺部疾病，包括肺炎球菌感染，哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺纤维化；炎性皮肤疾病，包括皮炎(湿疹)，酒渣鼻，脂溢性皮炎和牛皮癣；眼病，例如葡萄膜炎，视网膜炎，角膜炎和黄斑变性；泌尿生殖系统疾病，包括尿路感染；性传播疾病，包括盆腔炎，淋病，衣原体感染和疱疹；和尿道炎。
在一些实施方案中，炎症包括嗜中性粒细胞介导的炎症。
在一些实施方案中，施用包括使上皮细胞与有效量的所述化合物接触。
在一些实施方案中，治疗减少了沿基底外侧向顶端方向迁移的嗜中性粒细胞的数量。
在一些实施方案中，炎症与炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩氏病(CD)或感染性和/或非感染性小肠结肠炎有关。
在某些实施方式中，炎症与克罗恩病有关，并且所述治疗或预防还包括施用一种或多种美沙拉敏产品，皮质类固醇制剂，回肠释放布地奈德，糖皮质激素/EEN免疫调节剂，包括硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤和甲氨蝶呤，抗肿瘤坏死因子(TNF)药物，包括英夫利昔单抗、阿达木单抗和赛妥珠单抗，聚乙二醇(pegol)，抗α-4β-7整联蛋白抗体维多珠单抗，ABT-494和非洛替尼(filgotinib)。
在一些实施方案中，所述炎症与溃疡性结肠炎有关，并且所述治疗或预防还包括施用下述中的一种或多种：5-氨基水杨酸盐，美沙拉敏，皮质类固醇，多基质布地奈德，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，抗TNF药物(包括英夫利昔单抗，阿达木单抗，和戈利木单抗(golimumab))，维多珠单抗(vedolizumab)，托法替尼(tofacitinib)，ABT-494和非洛替尼。
在一些实施方案中，炎症与选自以下的感染性和/或非感染性炎性肺病有关：肺炎球菌感染，哮喘，慢性阻塞性肺病(COPD)和肺纤维化。
在一些实施方案中，炎症与选自以下的炎症性皮肤病相关：皮炎(湿疹)，酒渣鼻，脂溢性皮炎和牛皮癣。
在一些实施方案中，该方法进一步包括施用一种或多种选自以下的抗生素和/或抗炎剂：达巴万星(Dalbavancin)，奥利万星(Oritavancin)，克必信(Cubicin)，特地唑胺(Tedizolid)，头孢比洛(Ceftobiprole)，头孢比洛(Ceftobiprole)，头孢唑烷-他唑巴坦(Ceftolozane-tazobactam)，莫匹罗星(mupirocin)，硫酸新霉素，杆菌肽，多粘菌素B，1-氧氟沙星(1-ofloxacin)，克林霉素磷酸酯(clindamycin phosphate)，硫酸庆大霉素，甲硝唑(metronidazole)，己基间苯二酚(hexylresorcinol)，氯化苄乙氧铵(methylbenzethoniumchloride)，苯酚，季铵盐化合物，茶树油，甾类药物例如皮质类固醇如氢化可的松，羟基三安西松(hydroxyltriamcinolone)，α甲基地塞米松(alphamethyl dexamethasone)，地塞米松磷酸酯(dexamethasonephosphate)，倍氯米松二丙酸酯(beclomethasonedipropionate)，氯倍他索戊酸酯(clobetasol valerate)，地索奈德(desonide)，去氧甲米松(desoxymethasone)，去氧皮质酮乙酸酯(desoxycorticosterone acetate)，地塞米松(dexamethasone)，二氯松(dichlorisone)，醋酸双氟拉松(diflorasone diacetate)，戊酸双氟可龙(diflucortolone valerate)，氟氢缩松(fluadrenolone)，氟氯缩松丙酮化物(fluclarolone acetonide)，氟轻松(fluocinonide)，氟可丁酯(flucortinebutylester)，氟可龙(fluocortolone)，氟泼尼定(fluprednidene)，醋酸氟泼尼定(fluprednylidene acetate)，氟氢缩松(flurandrenolone)，哈西奈德(halcinonide)，醋酸氢化可的松，丁酸氢化可的松，甲基强的松龙(methylprednisolone)，曲安奈德(triamcinolone acetonide)，可的松(cortisone)，可托多松(cortodoxone)，flucetonide，氟氢可的松(fludrocortisone)，difluorosone diacetate，fluradrenaloneacetonide，甲羟松(medrysone)，amciafel，安西非特(amcinafide)，倍他米松(betamethasone)，氯泼尼松(chlorprednisone)，醋酸氯泼尼松(chlorprednisoneacetate)，氯考特酮(clocortelone)，clescinolone，二氯松酮(dichlorisone)，二氟泼尼酯(difluprednate)，氟氯奈德(flucloronide)，氟尼缩松(flunisolide)，氟米龙(fluoromethalone)，氟培龙(fluperolone)，氟泼尼松龙(fluprednisolone)，氢化可的松戊酸酯(hydrocortisone valerate)，氢化可的松环戊基丙酸酯(hydrocortisonecyclopentylproprionate)，氢可他酯(hydrocortamate)，甲泼尼松(meprednisone)，对氟米松(paramethasone)，泼尼松龙(prednisolone)，泼尼松(prednisone)，倍氯米松二丙酸酯(beclomethasone dipropionate)，倍他米松二丙酸酯(betamethasone dipropionate)，曲安西龙(triamcinolone)，非甾类药剂例如COX抑制剂，LOX抑制剂，p38激酶抑制剂，免疫抑制剂如环孢菌素和细胞因子合成抑制剂，四环素，米诺环素(minocycline)和强力霉素(doxycycline)，或其任何组合。
在一些实施方案中，该方法进一步包括施用一种或多种选自以下的抗体：靶向艰难梭菌毒素的抗体，靶向肿瘤坏死因子(TNF)的抗体，靶向白介素的抗体和靶向金属蛋白酶-9的抗体。
附图的简要说明
图1A-1I。HXA3在DSS结肠炎期间驱动炎症。用5％DSS处理7天的小鼠的粘膜刮屑富含脂质，并且通过LC/MS/MS定量了HXA3的量(图1A)。将C57BL/6小鼠用3％DSS处理7天，并在第9天处死(图1B-1I)。从第4天开始，每天对PBS对照(载体)或丙磺舒缀合物进行直肠给药。所有数据均为平均值+/-S.E.M.，每组n＝10只小鼠，通过Mann-Whitney单尾非参数U检验进行统计学显著性分析。对结肠中段和远端结肠的石蜡包埋的切片进行H&E染色，并由对样品身份不知情的训练有素的研究者进行评分(图1C和1D)。箭头突出了嗜中性粒细胞在肠腔中的积累(图1D)。在8分钟内(参见方法)通过ADHP测定法从粪便(图1E)或结肠组织(图1F)测量髓过氧化物酶(mpo)活性，并通过线性回归计算斜率。对于组织，将斜率标准化为总蛋白质含量。分离总固有层白细胞(lamina propria leukocytes)并染色以进行流式细胞术(图1G-1I)。嗜中性粒细胞的特征是活的/CD45+/CD11bhi/Ly6G+。图1G显示了嗜中性粒细胞百分比。图1H显示了嗜中性粒细胞的数目。图1I显示了结肠组织中嗜中性粒细胞的代表性图。
图2A-2F。上皮细胞分泌抑制嗜中性粒细胞迁移的P-gp依赖性内源性大麻素。来自T84上皮单层的上清液富含脂质，并在96孔改良Boyden腔试验中测试了抑制HXA3诱导的迁移的能力(图2A)。为了在使用不同供体的实验之间进行比较，将单个实验中的迁移值标准化为使用媒介物处理的富集HXA3。对于图2A-2C，数据是3个独立实验的平均比率+/-S.E.M，单向方差分析＊＝p<0.05。如图2A所示进行图2B，来自细胞系的上清表达不同的shRNA构建体以敲低P-gp表达(B4-mdr1和B5-mdr1)。图2C按照图2A进行，但是在用于迁移测定之前，将富集的T84上清液在37℃下用FAAH或MAGL预处理30分钟。用运载体或维拉帕米处理T84单层以抑制P-gp功能，然后收集上清液和脂质富集。通过HPLC分离制剂，在维拉帕米处理的细胞中不存在椭圆形的突出峰(图2D)。将来自对照或B4-mdr1敲低细胞系的富集的T84上清液进行电喷雾电离质谱分析。箭头表示大麻素Na+加合物的峰(图2E)。在96孔迁移试验中测试了市售的内源性大麻素和相关化合物(图2F)。化合物以可溶于PBS的最高浓度使用。数据是至少3个独立实验的平均值+/-SEM，＊＝p<0.05和＊＊＝p<0.01(通过单向ANOVA)。有关更多信息，请参见方法。
图3A和3B。AMEND存在于小鼠肠中。合并来自5只野生型(wt)或mdr1a-/-小鼠的结肠刮取物，富集脂质，并如图2A所示在96孔迁移试验中进行测试。数据是来自三个独立实验的平均值+/-SEM，＊＊＝p<0.01(通过单向ANOVA)。在图3B中，指示的样品用FAAH在37℃下预处理30分钟。
图4A-4H。缺乏CB2的小鼠易患严重肠道炎症，伴有嗜中性粒细胞反向迁移增加。用3％DSS处理Wt或cnr2-/-小鼠7天，并在第9天处死。对于所有实验，数据均为平均值+/S.E.M，使用曼恩·惠特尼单尾非参数U检验进行统计分析。组织病理学评分，髓过氧化物酶活性测量和流式细胞术分析的方法与图1E-1I相同。重量显示为第0天体重的百分比，n＝15只wt和14只cnr2-/-小鼠，p值指第9天体重(图4A)。图4B和4C：中远端结肠的组织病理学，如图1所示。箭头突出了嗜中性粒细胞在肠腔中的积累(图4C)。组织mpo活性，n＝13只wt和11只cnr2-/-小鼠(图4E)。粪便mpo活性，n＝14只wt和12只cnr2-/-小鼠(图4D)。通过流式细胞术分析组织嗜中性粒细胞的数目(图4F)和百分比(图4G)。固有层嗜中性粒细胞的代表性图(图4H)。图4F-4H：n＝13只wt和12只cnr2-/-小鼠。
图5。丙磺舒缀合物有效抑制HXA3诱导的嗜中性粒细胞迁移。HCT-8上皮单层细胞在倒置的Transwell插入物上生长，并用100μM丙磺舒缀合物预处理1小时。然后用鼠伤寒沙门氏菌SL1344菌株在顶端感染单层1小时，然后洗涤并倒置。将嗜中性粒细胞添加到孔的顶部(基底外侧)，并使其迁移两个小时，然后按照所述方法对mpo进行定量。显示的数据为代表性实验的平均值+/-S.D.。
图6。T84细胞中P糖蛋白的shRNA敲低。用载有靶向mdr1a的shRNA构建体的慢病毒颗粒感染T84细胞。细胞系B4-B8包含独立的靶向构建体，并与未转染的细胞(泳道1)和用对照shRNA转染的细胞(泳道2)进行了比较。通过凝胶电泳分离裂解物，将其转移至硝酸纤维素膜，并用于探测(a)P-gp或(b)GAPDH上样对照。由于Western印迹显示所有构建物均通过诱导了P-gp表达的显著敲低，因此选择了克隆B4和B5进行进一步分析。
图7。AMEND分泌是P-gp依赖性的。用媒介物或40μM盐酸维拉帕米(一种P-gp抑制剂)处理T84上皮细胞。制备富集的上清液级分，并在无细胞迁移测定中评估AMEND抑制活性。用维拉帕米预处理可抑制AMEND抑制性化合物的分泌。显示的数据是代表性的两个独立实验的平均值±SD。＊＝p<0.05(通过单向方差分析)。
图8。FAAH和MAGL测定是内源性大麻素特异性的，不影响脂氧素(Lipoxin)A4的抑制活性。如图2C所示进行实验并标准化。脂蛋白的浓度为10nM。数据为来自两个独立实验的结合的平均值+/-S.E.M.。
图9。P-gp缺陷小鼠的DSS结肠炎。如图1所示用DSS处理FVB野生型和mdr1a-/-小鼠。每组n＝5只小鼠。
图10。肠上皮中的抗炎性P-gp/内源性大麻素和促炎性MRP2/HXA3途径。在稳态肠中，P-糖蛋白从上皮表面分泌内源性大麻素。分泌的N-酰基乙醇胺(NAE)通过嗜中性粒细胞上的CB2受体发挥作用，从而抑制迁移并维持抗炎状态。在炎症过程中，P-gp被下调(在鼠伤寒沙门氏菌中通过Caspase-3降解)，并且MRP2/HXA3途径被激活。磷脂酶A2从膜上释放花生四烯酸，然后其被转化为HXA3，并通过表面MRP2分泌到腔中。HXA3形成一个浓度梯度，吸引嗜中性白血球穿过上皮层进入腔内，在其中引起炎症性损伤和病理。值得注意的是，NAE的FAAH代谢会产生花生四烯酸，也可能会进入促炎性MRP2/HXA3途径。
图11。人12-脂氧合酶(Alox12)mRNA，完整cds，gi|187170|gb|M58704.1|HUMLIPXYG(SEQ ID NO：01)。
图12。人ATP结合盒亚家族C成员2(ABCC2)，mRNA>gi|594191052|ref|NM_000392.4|(SEQ ID NO：02)。
图13。人ATP结合盒，亚家族B(MDR/TAP)，成员1(ABCB1)，mRNA>gi|318037598|ref|NM_000927.4|(SEQ ID NO：03)。
图14。大鼠ALOX15：褐家鼠花生四烯酸15-脂氧合酶(Alox15)，mRNA>gi|31542124|ref|NM_031010.2|(SEQ ID NO：04)。
图15。人FAAH：人脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)，mRNA>gi|166795286|ref|NM_001441.2|(SEQ ID NO：05)。
图16。肺炎链球菌感染过程中，顶表面的MRP1蛋白减少，而MRP2增加。顶表面生物素化的蛋白质印迹分析，比较未感染和感染的NIH-H292细胞。感染细胞，洗涤，然后在感染后于37度静置1小时。然后用生物素标记顶端表面并裂解。将样品标准化为GAPDH表达，将其暴露于域左栏中指定的蛋白质交联的抗体的珠子，并使用链霉亲和素-HRP进行探测。感染后MRP4和5几乎没有增加。当暴露于肺炎链球菌时，MRP1显示减少93％，而MRP2显示增加230％。
图17A和17B。感染过程中MRP的免疫荧光。用10MOI的肺炎链球菌感染极化的NIH-H292，固定后再染色以检测MRP2。IF图像被分成单独的通道，并测量MRP2占据的顶表面积。在图17A中，红色框区域表示细胞单层顶表面上的感兴趣区域。F-肌动蛋白用于检查细胞边界和定位顶表面。通过在斐济完成的计算，确定了给定基因的蛋白质表达所占面积的百分比。图17A中显示了未感染的和肺炎链球菌H292细胞的MRP2和F-肌动蛋白切片。对MRP1，MRP4和MRP5重复该过程(图17B)。比较未感染的样本与感染的样品时，肺炎链球菌感染会降低MRP1表面表达，增加MRP2表面表达，但对MRP4或MRP5没有影响，从而确认了图1的生物素化数据。(每个样品n＝8)。
图18。MRP1和MRP2在小鼠肺中的表达。通过气管内途径用肺炎链球菌感染小鼠，并在感染后2天处死。切除肺，重新充气，切片，对Mrp1和Mrp2染色。与PBS处理的小鼠相比，Mrp1表达在受感染的小鼠肺中似乎减少(上图)。Mrp2似乎具有增加的表达，尤其是在细胞周围(底部)。
图19A-19E。在体内抑制MRP2。使用嗜中性粒细胞迁移的体外模型，我们检查了MRP2抑制的结果。经由丙磺舒治疗的MRP2抑制导致嗜中性粒细胞按基底外侧向顶端方向的迁移减少(图19A)。取得这一体外结果后，用PBS或丙磺舒治疗C57/B16小鼠，随后感染肺炎链球菌。用丙磺舒治疗的小鼠在从感染的肺中分离出的支气管肺泡灌洗液(BAL)中具有较少的Cd11b阳性/Ly6g阳性细胞(嗜中性粒细胞)(图19B)。丙磺舒还减少了菌血症小鼠的数量和总体的菌血症(图19C)。由D1菌血症数据的Mann-Whitney测试得出的统计数据(图19D)显示Cd11b+/Cd45+/Ly6g-粒细胞无差异，表明作用可能是嗜中性粒细胞特异性的。当比较未发生菌血症的小鼠时，丙磺舒可能具有保护作用，因为这些小鼠在细菌CFU中具有约2倍的差异，尽管这些数目未能达到统计学意义(图19E)。发生菌血症的小鼠在肺部的细菌载量方面似乎没有差异。
图20A-20D。分泌的上清液具有抗炎(MRP1)或炎性(MRP2)表型。通过合并来自感染的H292单层的顶端上清液，分离出促炎性脂质(图20A中的三角形表示)。将其施加到C-18柱上，并在甲醇中洗脱以存储(图20A)。甲醇在恒定的氮气流中蒸发，然后重悬于HBSS中，用作嗜中性粒细胞的化学吸引剂。显示的是从H292单层的基底外侧室到顶端室迁移到所示刺激的嗜中性粒细胞的数量。从加扰的对照或MRP2敲低的细胞中分离出脂质提取物，并将其应用于幼稚的H292细胞的顶端室(图20B)。与混杂的对照相比，来自MRP2敲低细胞的脂质显示出嗜中性粒细胞迁移减少，这意味着MRP2外排促炎性刺激。fMLP充当阳性对照。将HBSS+施加到混杂对照细胞或MRP1敲低细胞的顶端表面以产生条件培养基(图20C)。将促炎性脂质重悬于未条件化培养基，来自混杂对照的条件培养基或来自MRP1敲低细胞(MRP1KD)的条件培养基中。未条件化培养基促进了嗜中性粒细胞的最大迁移。具有完整MRP1的混杂对照细胞显示嗜中性粒细胞数量减少；MRP1敲低细胞诱导的嗜中性粒细胞数量与未条件化培养基相当，这表明MRP1可能有助于嗜中性粒细胞抑制活性。在利用细菌感染代替促炎性脂质的相似模型中，MRP2抑制剂丙磺舒(100uM)以大约相同的效率减少嗜中性粒细胞的迁移(图20D)。
图21A-B。感染期间的MRP查询。感染NIH-H292细胞，然后通过3种不同的技术生成MRP图：mRNA RT-PCR定量，蛋白质Western印迹和细胞表面生物素化(结合Western印迹)。研究了MRP1、2、3、4、5和P-pg在肺炎链球菌感染后的可能变化。RT-PCR显示在肺炎球菌感染期间MRP1略有减少，MRP2和MRP5略有增加(图21B)。总细胞裂解物显示出增加或减少，示于Western印迹右边，相对于GAPDH标准化并通过ImageJ分析(图21A)。这些方法均无法检测到P-gp和MRP3。
图22A和22B。测试MRP敲低细胞的凋亡。将具有对照构建体，MRP1shRNA或MRP2shRNA的H292细胞进行针对感染前(图22A)或感染后(图22B)凋亡的染色。在两种情况下，染色过程中细胞凋亡均没有显著增加。
图23。MRP1的人蛋白质序列，NCBI参考序列：NP_004987.2(SEQ ID NO：06)。
详细说明
1.定义
本文使用以下术语，其定义仅供参考。
通常，“取代的”是指如下定义的有机基团(例如，烷基)，其中与其中包含的氢原子的一个或多个键被与非氢或非碳原子的键取代。取代的基团还包括其中与碳原子或氢原子的一个或多个键被一个或多个与杂原子相连的键(包括双键或三键)取代的基团。因此，除非另有说明，否则取代基被一个或多个取代基取代。在一些实施方案中，取代的基团被1、2、3、4、5或6个取代基取代。本领域技术人员将理解，本技术的取代基是化学稳定的基团，其允许具有它们的化合物的分离。取代基的实例包括：卤素(即，F，Cl，Br和I)；和羟基，烷氧基，烯氧基，芳氧基，芳烷氧基，杂环基，杂环基烷基，杂环基氧基和杂环基烷氧基；羰基(氧代)；羧酸盐；酯；氨基甲酸酯；肟羟胺；烷氧基胺；芳烷氧基胺；硫醇；硫化物；亚砜；砜；磺酰；磺酰胺；胺；N-氧化物；叠氮化物；酰胺；尿素；脒；胍；硝基；腈(即CN)；等等。
烷基包括具有(除非另有说明)1至12个碳原子，并且通常具有1至10个碳，或者在一些实施方案中具有1至8、1至6或1至4个碳原子的直链和支链烷基。烷基可以是取代的或未取代的。直链烷基的实例包括诸如甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基的基团。支链烷基的实例包括但不限于异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、新戊基、异戊基和2,2-二甲基丙基。代表性的取代的烷基可被诸如上文所列的取代基取代一次或多次，并且包括但不限于卤代烷基(例如三氟甲基)、羟烷基、硫代烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、烷氧基烷基、羧基烷基等。在一些实施方案中，烷基被1、2或3个取代基取代。
烯基包括如上定义的直链和支链烷基，除了在两个碳原子之间存在至少一个双键外。烯基可以是取代的或未取代的。烯基具有2至12个碳原子，并且通常具有2至10个碳，或者在一些实施方案中，具有2至8、2至6或2至4个碳原子。在一些实施方案中，烯基具有一个、两个或三个碳-碳双键。实例包括但不限于乙烯基，烯丙基，-CH＝CH(CH3),-CH＝C(CH3)2,-C(CH3)＝CH2,-C(CH3)＝CH(CH3),-C(CH2CH3)＝CH2等。代表性的取代的烯基基团可以被单取代或取代一次以上，例如但不限于被诸如上述那些取代基进行单、二或三取代。
杂烷基和杂烯基分别是包括选自N、O和S的1至6个杂原子的烷基(如本文所定义)和烯基(如本文所定义)。应理解，存在的每个杂原子均键合至所述杂烷基或杂烯基内的至少一个碳原子。在一些实施方案中，杂烷基或杂烯基包括1、2或3个杂原子。杂烷基和杂烯基可以是取代的或未被取代的。杂烷基的实例包括但不限于CH3CH2OCH2,CH3NHCH2,CH3CH2N(CH3)CH2,CH3CH2SCH2,CH3CH2OCH2CH2OCH2CH2。杂烯基的实例包括但不限于CH2＝CHOCH2,CH2＝CHN(CH3)CH2和CH2＝CHSCH2。代表性的取代的杂烷基或杂烯基可被上述取代基取代一次或多次(例如1、2或3次)，并且包括但不限于卤代杂烷基(例如三氟甲氧基乙基)，羧烷基氨基烷基，丙烯酸甲酯等。
环烷基包括在环中具有3至12个碳原子(或者在一些实施方案中，具有3至10、3至8或3至4、5或6个碳原子)的单、双或三环烷基。环烷基可以是取代的或未取代的。示例性的单环的环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。在一些实施方案中，环烷基具有3至8个环成员，而在其他实施方案中，环碳原子数为3至5、3至6或3至7。双环和三环系统包括桥连的环烷基和稠环，例如但不限于双环[2.1.1]己烷，金刚烷基，十氢萘基等。取代的环烷基可以被如上定义的非氢和非碳基团取代一次或多次。然而，取代的环烷基还包括被如上定义的直链或支链烷基取代的环。代表性的取代的环烷基可以是单取代的或被取代一次以上，例如但不限于2,2-、2,3-、2,4-、2,5-或2,6-二取代的环己基，其可以被诸如上面列出的那些取代基取代。
环烷基烷基是如上定义的烷基，其中烷基的氢或碳键被与如上定义的环烷基的键取代。环烷基烷基可以是取代的或未取代的。在一些实施方案中，环烷基烷基具有4至16个碳原子，4至12个碳原子，并且通常4至10个碳原子。取代的环烷基烷基可在该基团的烷基、环烷基或烷基和环烷基两者上被取代。代表性的取代的环烷基烷基基团可以是单取代的或被取代一次以上，例如但不限于被诸如上述那些取代基进行单、二或三取代。
本文描述的在本技术的化合物内具有两个或更多个连接点(即二价，三价或多价)的基团通过使用后前缀“亚”表示。例如，二价烷基为亚烷基，二价环烷基是亚环烷基，二价杂烷基是亚杂烷基，二价烯基是亚烯基，等等。与本技术的化合物具有单连接点的取代的基团不以“亚”来指代。因此，例如氯乙基在本文中不称为亚氯乙基。
术语“向受试者施用”分子是指将分子递送至受试者。“施用”包括组合物的预防性施用(即，在疾病和/或疾病的一种或多种症状可检测之前)和/或组合物的治疗性施用(即，在疾病和/或疾病的一种或多种症状可检测之后)。本技术的方法包括施用一种或多种化合物。如果要施用一种以上的化合物，则这些化合物可以基本上同时地一起施用和/或以任何顺序在不同的时间施用。而且，本技术的化合物可以在另一种类型的药物或治疗程序(例如手术)的施用之前、同时和/或之后施用。
当提及相对于第二样品(或相对于第二受试者)而言第一样品(或第一受试者)内的任何分子(例如，多药抗性蛋白2(MRP2)，多药抗性蛋白1(MRP1)，羟基环氧素A3(HXA3)合酶，N-酰基乙醇胺(NAE)，氨基酸序列，核酸序列，抗体等)、细胞和/或现象(例如，多药抗性蛋白2(MRP2)和/或多药抗性蛋白1(MRP1)和/或羟基环氧素A3(HXA3)合酶和/或N-酰基乙醇胺(NAE)的活性水平，基因的表达水平，疾病症状，两种分子的结合水平(例如激素配体与其激素受体的结合水平)，两种分子结合的特异性，两种分子结合的亲和力，疾病症状，对疾病的特异性，对疾病的敏感性，结合亲和力，酶活性等)的水平，术语“改变”和“修饰”是指增加和/或减少。
“大麻素2型受体”(“CB2”)是来自大麻素受体家族的G蛋白偶联受体，在人类中由CNR2基因编码。CB2受体的主要内源性配体是2-花生四烯酰基甘油(2-AG)。
当提及缀合目标分子和聚合物时，术语“缀合”和语法等效物是指将目标分子与聚合物共价连接。连接可能是直接的。备选地，连接可以经由连接基团或部分而间接地进行。缀合至聚合物的方法是本领域已知的，包括缀合至多肽以产生融合蛋白的方法(Pasut，Polymers 6：160-178(2014)；Medscape，Nanomedicine 5(6)：915-935(2010))。在一些实施方案中，缀合物的示例为通过连接基团二氨基己烷将丙磺舒化学缀合至高碘酸盐氧化的40kDa葡聚糖(实施例3)。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”或“药学有效量”是指足以实现期望的治疗和/或预防作用的量，例如导致有需要的受试者中与炎症(例如与嗜中性粒细胞迁移至靶标组织有关的炎症)相关的疾病或病症或症状全部或部分缓解的量。在治疗或预防应用的情况下，给予受试者的组合物的量将取决于疾病的类型和严重性以及个体的特征，例如总体健康、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。这也将取决于疾病的程度、严重性和类型。技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。所述组合物还可与一种或多种其他治疗化合物组合施用。在一些实施方案中，给予多次剂量。另外或可替代地，在一些实施方案中，施用多种治疗组合物或化合物。在本文所述的方法中，可以将治疗性化合物施用于患有与炎症(例如，与嗜中性粒细胞向组织内迁移增加有关的炎症)相关的疾病或病症的一种或多种体征或症状的受试者。
“内源性大麻素”(“ECs”)是与大麻素受体CB1和CB2以及最近描述的非典型受体GPR55和GPR119结合的化合物。类二十烷酸型EC的两个主要类别是”N-酰基乙醇胺”(“NAE”)和单酰基甘油(MAG)，它们分别由脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)和单酰基甘油脂酶(MAGL)代谢。”N-酰基乙醇胺”是内源大麻素，这是在几种类型的酰基之一与乙醇胺的氮原子连接时形成的一种脂肪酸酰胺。N-酰基乙醇胺被脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)代谢。示例性的N-酰基乙醇胺内源性大麻素包括乙醇胺，花生四烯酸乙醇胺(N-花生四烯酰基乙醇胺)，这是花生四烯酸(20：4ω-6)的酰胺(AEA)(图2E)，油酰基乙醇酰胺(OEA)和α-亚麻酸乙醇酰胺(α-LEA)(图2F)。
“上皮组织”包含上皮细胞，即具有明显的顶部、侧面和基底质膜区域/局域的极化细胞类型。上皮细胞通过它们的侧膜相互连接，形成上皮片，该片在整个动物体内排列成腔和表面。每个质膜结构域具有不同的蛋白质组成，赋予它们不同的特性，并允许分子跨上皮片定向运输。上皮细胞的“顶部”区域定义为位于紧密连接上方的区域，并包含面向组织内腔或外表面的顶部膜。上皮细胞的“基底侧”区域是紧密连接下方的一侧，包含与基底层接触的基底侧膜。
“脂肪酸酰胺水解酶”，”FAAH”和”EC 3.5.1.99”可互换地是指丝氨酸水解酶家族的成员。它首先被证明可以分解大麻素。在人类中，它由基因FAAH编码，示例是由mRNA SEQID NO：05编码的人FAAH(图15)。
“羟基环氧素A3合酶”，”HXA3合酶”，”ALOX12”，”12-脂氧合酶”，“花生四烯酸12-脂氧合酶”，”12S-脂氧合酶”，”12-LOX”和”12S-LOX”可互换地指代脂氧合酶型酶(即一种催化含顺式，顺式-1,4-戊二烯结构的脂质中多不饱和脂肪酸双氧合的酶)，在人体内由ALOX12基因编码，该基因与其他脂氧合酶一起位于染色体17p13.3。Alox12的例子有由mRNA SEQID NO：01编码的人Alox12(图11)。Alox12也以大鼠Alox15为例，它可以将花生四烯酸转化为15S-氢过氧二十二碳四烯酸，并作用于花生四烯酸的C-12和亚油酸。大鼠Alox15由mRNASEQ ID NO：04编码(图14)。
当涉及化合物例如N-酰基乙醇胺时，术语“增加”是指增加N-酰基乙醇胺的水平和/或活性。在针对第一样品(或第一受试者)相对于第二样本(或第二受试者)而言任何分子(例如，多药抗性蛋白2(MRP2)，多药抗性蛋白1(MRP1)，羟基环氧素A3(HXA3)合酶，N-酰基乙醇胺(NAE)，氨基酸序列以及核酸序列，抗体等)、细胞和/或现象(例如多药抗性蛋白2(MRP2)和/或多药抗性蛋白1(MRP1)和/或羟基环氧素A3(HXA3)合酶的活性水平和/或N-酰基乙醇胺(NAE)的水平，基因表达水平，疾病症状，两种分子的结合水平，例如激素配体与其激素受体的结合，两种分子结合的特异性，两种分子结合的亲和力，疾病症状，对疾病的特异性，对疾病的敏感性，结合的亲和力，酶活性，等等)的水平使用术语“增加”、“升高”，“提高”和语法等价形式(包括“更高”，“更大”等)时，是指第一样品(或第一受试者)中的分子、细胞和/或现象的量比第二样品(或第二受试者)中的分子、细胞和/或现象的量高出使用任何本领域公认的统计分析方法具有统计学意义的任何量。在一个实施方案中，第一样品(或第一受试者)中的分子、细胞和/或现象的量比第二样品(或第二受试者)中相同分子、细胞和/或现象的量大至少10％、至少25％、至少50％、至少75％和/或至少90％。这包括但不限于第一样品(或第一受试者)中的分子、细胞和/或现象的量比第二样品(或第二受试者)中相同分子、细胞和/或现象的量大至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和/或至少95％。在一个实施方案中，第一样品(或第一受试者)的示例有、但不限于已经使用本技术的组合物和/或方法处理过的样品(或受试者)。在另一个实施方案中，第二样品(或第二受试者)的示例有、但不限于未使用本技术的组合物和/或方法进行操作的样品(或受试者)。在一个替代实施方案中，第二样品(或第二受试者)的示例有、但不限于与第一受试者相比已经使用本技术的组合物和/或方法以不同剂量和/或不同持续时间和/或通过不同的给药途径操作的样品(或受试者)。在一个实施方案中，第一样品和第二样品(或受试者)可以是相同的，例如在一个样本(或受试者)上寻求确定本技术的组合物和/或方法的不同方案(例如剂量，持续时间，施用途径等)的效果时。在另一个实施方案中，第一样品和第二样品(或受试者)可以不同，例如当对一个样品(受试者)(例如参加临床试验的患者)与医院内的另一个体比较本技术的组合物和/或方法的效果时。
当涉及化合物例如多药抗性蛋白2(MRP2)，羟基环氧素A3(HXA3)合酶等使用时，术语“抑制”意指抑制HXA3的活性和/或水平。在针对第一样品(或第一受试者)相对于第二样本(或第二受试者)而言任何分子(例如，多药抗性蛋白2(MRP2)，多药抗性蛋白1(MRP1)，羟基环氧素A3(HXA3)合酶，N-酰基乙醇胺(NAE)，氨基酸序列以及核酸序列，抗体等)、细胞和/或现象(例如多药抗性蛋白2(MRP2)和/或多药抗性蛋白1(MRP1)和/或羟基环氧素A3(HXA3)合酶的活性水平和/或N-酰基乙醇胺(NAE)的水平，基因表达水平，疾病症状，两种分子的结合水平，例如激素配体与其激素受体的结合，两种分子结合的特异性，两种分子结合的亲和力，疾病症状，对疾病的特异性，对疾病的敏感性，结合的亲和力，酶活性，等等)的水平使用术语“抑制”、“降低”、“减少”、“阻抑”、“减小”和语法等价形式(包括“更低”，“更小”等)时时，是指第一样品(或第一受试者)中的分子、细胞和/或现象的量比第二样品(或第二受试者)中的分子、细胞和/或现象的量要低使用任何本领域公认的统计分析方法具有统计学意义的任何量。在一个实施方案中，第一样品(或第一受试者)中的分子、细胞和/或现象的量比第二样品(或第二受试者)中相同分子、细胞和/或现象的量低至少10％，低至少25％，低至少50％，低至少75％比和/或低至少90％。在另一个实施方案中，第一样品(或第一受试者)中的分子、细胞和/或现象的量比第二样品(或第二受试者)中相同分子、细胞和/或现象的量低从5％到100％的任何数值百分比，例如但不限于10％到100％，20％到100％，30％到100％，40％到100％，50％到100％，60％到100％，70％到100％，80％到100％，和90％至100％。在一个实施方案中，第一样品(或第一受试者)的示例有、但不限于已经使用本技术的组合物和/或方法处理过的样品(或受试者)。在另一个实施方案中，第二样品(或第二受试者)的示例有、但不限于未使用本技术的组合物和/或方法进行过操作的样品(或受试者)。在一个替代实施方案中，第二样品(或第二受试者)的示例有、但不限于已经使用本技术的组合物和/或方法以与第一受试者相比不同的剂量和/或不同的持续时间和/或通过不同的给药途径操作过的样品(或受试者)。在一个实施方案中，第一样品和第二样品(或受试者)可以是相同的，例如组合物和/或方法的不同方案(例如剂量，持续时间，施用途径等)的作用。在一个实施方案中，第一样品和第二样品(或受试者)可以是相同的，例如在一个样本(或受试者)上寻求确定本技术的组合物和/或方法的不同方案(例如剂量，持续时间，施用途径等)的效果时。在另一个实施方案中，第一样品和第二样品(或受试者)可以不同，例如当对一个样品(受试者)(例如参加临床试验的患者)与医院内的另一个体比较本技术的组合物和/或方法的效果时。
“粘膜组织”是指衬着各种管状结构的粘膜组织。粘膜组织包括上皮、固有层，以及在消化道中还有一层平滑肌(粘膜肌层)。
“多药抗性相关蛋白2”、“多药抗性蛋白2”(“MRP2”)、“小管多特异性有机阴离子转运蛋白1”(“cMOAT”)、”ATP结合盒亚家族C成员2”(“ABCC2”)可互换使用，是指在人类中由ABCC2基因编码的蛋白质。MRP2的示例有mRNA SEQ ID NO：02编码的人MRP2(图12)。
“多药抗性蛋白1”、“MRP1”和“ABCC1”可互换使用，是指具有广泛底物特异性(包括重要的治疗药物)的单向外排转运蛋白。该转运蛋白的一些主要作用是：(i)外源性和内源性代谢产物的外流；(ii)炎症介质(例如LTC4)的运输；(iii)抵抗氧化应激。190kDa MRP1具有一个核心结构，该结构由两个跨膜结构域(TMD)组成，每个结构域后面都是一个核苷酸结合结构域(NBD)。与MRP2、3、6和7相同，MRP1包含第三个TMD(TMD0)，具有五个预测的跨膜片段和一个额外的胞质NH2末端，该末端通过连接子区域(L0)连接到核心结构(Rosenberg等，J.Biol.Chem.276(19)：13076-16082(2001))。TMD0对于MRP1转运到质膜似乎很重要(Bakos等人，J.Cell Sci.113(Pt 24)：4451-4461(2000))，并且TMD0和L0的确切作用、机制和依赖性是重要研究的主题(Westlake等人，Mol.Biol.Cell 16(5)：2483-2492(2005))。MRP1具有广泛的底物特异性，可运输疏水性和阴离子分子、葡糖醛酸苷和谷胱甘肽缀合物以及内源性谷胱甘肽。尽管许多MRP1底物与谷胱甘肽缀合，但经常观察到游离谷胱甘肽的共转运，并且似乎刺激长春新碱和柔红霉素的转运(Hooijberga等人，FEBS Letters 469：47-51(2000))。谷胱甘肽本身是MRP1的低亲和力底物(Km＝1-5mM)。推测有多个变构协调性的、不重叠的底物结合位点，这可以解释为什么各种底物都具有交叉抑制和交叉刺激作用(Bakos等人，Pflugers Arch-Eur J Physiol 453：621–641(2007))。炎性细胞因子LTC4及其主要代谢物LTD4是一些亲和力最高的MRP1底物，提示MRP1在LTC4产生细胞的细胞因子释放中起关键作用。实际上，在mrp1(-/-)小鼠中观察到了细胞内LTC4的积累(Robbiani等人，Cell103：757-768(2000))。此外，尽管敲除的mrp1(-/-)小鼠是存活、健康和可育的并具有正常表型，但它们对细胞毒性药物高度敏感(Wijnholds等人，Nat.Med.3：1275-1279(1997))。MRP1的实例有DNA序列NCBI参考序列NG_028268.1编码的人蛋白质序列NCBI参考序列NP_004987.2(SEQ ID NO：06)(图23)。在MRP1中鉴定出至少15个自然发生的突变，并且发现其中许多突变会影响其体外转运活性。He et al.,Curr.Med.Chem.18:439-481(2011)中对多态性和诱变研究进行了综述。尽管已知许多MRP1SNP，但据报道它们在人群中的发生率相对较低。在中国大陆人群中，Cys43Ser(128G>C)，Thr73Ile(218C>T)，Arg723Gln(2168G>A)和Arg1058Gln(3173G>A)的MRP1多态性等位基因频率分别为0.5％、1.4％、5.8％和0.5％(Ji-Ye Yin等人，Pharmacogenet.Genomics 19(3)：206-216(2009))。
“P-糖蛋白”(“P-gp”)是一种外排膜转运蛋白，负责限制异生物质和有毒物质的细胞摄取和分布。P-gp的例子有由mRNA SEQ ID NO：03编码的人P-gp(图13)。
“聚合物”是具有主要或全部由键合在一起的大量相似单元组成的分子结构的物质。聚合物可以天然存在(例如，纤维素，多肽，核苷酸序列等)，或是人造的(例如，塑料，树脂等)。聚合物可以用作与其缀合的药物的载体，并可以增强所缀合的药物的溶解度，改善其药代动力学特性，保护药物免于降解，在某些条件下释放药物，例如pH的变化或者酶例如酯酶、脂肪酶或蛋白酶的存在。另外，还可将靶向部分或增溶剂引入缀合物中以提高其治疗指数(Medscape，Nanomedicine 5(6)：915-935(2010))。聚合物还可用于例如通过防止缀合的药物跨入特定的身体区室(例如，从胃肠腔到下面的组织)来限制与其缀合的药物的分布。聚合物可以是天然聚合物和/或合成的线性聚合物，包括聚乙二醇(PEG)，葡聚糖，高碘酸盐氧化的葡聚糖，聚唾液酸(PSA)，透明质酸(HA)，糊精，羟乙基淀粉(HES)，聚(2-乙基2-
Figure BDA0002392142680000231
唑啉)(PEOZ)，聚谷氨酸(PGA)，聚乳酸(PLA)，聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLA/PLGA)，聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)，聚甘油，25聚酰胺基胺(PAMAM)，聚乙烯亚胺(PEI)和多肽。在一些实施方案中，该聚合物是高碘酸盐氧化的40葡聚糖，例如与高碘酸盐氧化的40kDa葡聚糖化学缀合的丙磺舒(实施例3)。
“SipA”和“沙门氏菌T3SS效应蛋白”可互换使用，是指由沙门氏菌产生的蛋白质，例如肠沙门氏菌肠型亚种鼠伤寒杆菌血清型(Salmonella enterica subsp.entericaserovar Typhimurium)SL1344株的DNA序列(Locus taq)SL1344_2861，完整的基因组序列(NCBI参考序列：NC_016810.1)编码的肠型鼠伤寒杆菌肠沙门氏菌肠型亚种鼠伤寒杆菌血清型SL1344株的氨基酸序列(GenBank：AAA86618.1)。SipA序列由WO 2015/089268提供。
可能患有炎症的“靶组织”包括但不限于上皮组织、粘膜组织等。示例性的上皮组织和/或粘膜组织包括胃肠道、肺(例如支气管组织)、肝、胃、结肠、脑、胆囊、肾脏、女性生殖道、眼、泌尿道等，导致“炎性疾病”诸如肠道疾病(例如直肠炎，睾丸炎，克罗恩病，结肠炎(例如溃疡性结肠炎，也称为溃疡性结肠炎))，传染性/非传染性小肠结肠炎，炎性肠病(IBD)等)，炎性肺部疾病(如肺炎球菌感染，哮喘，慢性阻塞性肺病(COPD)和肺纤维化)，炎性皮肤病(如皮炎(湿疹))，酒渣鼻，脂溢性皮炎和牛皮癣)，眼部疾病(例如葡萄膜炎，视网膜炎，角膜炎，黄斑变性等)，泌尿生殖系统疾病(例如尿路感染)，性传播疾病(例如盆腔炎，包括以淋病和/或衣原体感染为例的炎性疾病，以疱疹为例的溃疡性疾病)，尿道炎等。如本文所用，“靶组织”还涵盖解剖空间，例如肠腔。
本文所用的“在治疗”、“进行治疗”、“被治疗”或“治疗”涵盖在受试者(例如人)中治疗本文所述的疾病或病症(例如炎症)，包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发展；(ii)减轻疾病或病症，即引起该病症的消退；(iii)减缓疾病的进展；和/或(iv)抑制、减轻或减缓该疾病或病症的一种或多种症状的进展。症状可以通过本领域已知的方法进行评估，例如活检和组织学以及血液测试以确定相关的酶水平、代谢物或循环抗原或抗体(或其他生物标记物)，生活质量调查表，患者报告的症状评分和影像测试。
如本文所用，“预防”或“防止”病症或病状是指这样的化合物，其在统计样品中相对于对照样品而言减少了被治疗样品中所述病症或病状的发生，或延迟了该病状或病症的一种或多种症状的发作。
还应理解，所描述的医学疾病和病症的各种治疗或预防方式旨在表示“实质性”，其包括总的或少于总的治疗或预防，并且其中实现了一些生物学或医学上相关的结果。
如本文所用，术语“受试者”、“个体”或“患者”可以是个体生物，脊椎动物，哺乳动物或人。“哺乳动物”包括人类、非人类的灵长类动物、鼠类(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、绵羊、牛、反刍动物、兔形目、猪、山羊、马、犬、猫、ave等。在一些实施方案中，哺乳动物是鼠。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
根据本技术的方法和/或组合物的“需要”治疗的受试者包括“遭受”炎症的受试者(即，正在经历和/或表现出炎症的一种或多种临床和/或亚临床的受试者)和处于炎症“风险中”的受试者。“需要”治疗的受试者包括炎症的动物模型。处于炎症“风险中”的受试者是指当前不表现出炎症症状并且倾向于表达该疾病的一种或多种症状的受试者。这种倾向可能基于家族病史，遗传因素，环境因素例如暴露于环境中存在的有害化合物等。这并不意味着本技术限于任何特定的体征或症状。因此，意图是本技术涵盖经历从亚临床症状到全面炎性疾病的任何疾病范围的受试者，其中受试者表现出与炎性疾病相关的至少一种指征(例如体征和症状)。
在针对任何分子(例如，多药抗性蛋白2(MRP2)，多药抗性蛋白1(MRP1)，羟基环氧素A3(HXA3)合酶，N-酰基乙醇胺(NAE)，氨基酸序列以及核酸序列，抗体等)、细胞和/或现象(例如多药抗性蛋白2(MRP2)和/或多药抗性蛋白1(MRP1)和/或羟基环氧素A3(HXA3)合酶的活性水平和/或N-酰基乙醇胺(NAE)的水平，基因表达水平，疾病症状，两种分子的结合水平，例如激素配体与其激素受体的结合，两种分子结合的特异性，两种分子结合的亲和力，疾病症状，对疾病的特异性，对疾病的敏感性，结合的亲和力，酶活性，等等)的水平提及“基本相同”、“基本没有改变”、“基本未改变”和语法等价形式时，是指第一样品(或第一受试者)中的分子、细胞和/或现象的量相比于第二样品(或第二受试者)中的分子、细胞和/或现象的量没有提高或降低统计学意义的量。因此，在一个实施方案中，第一样品(或第一受试者)中的分子、细胞和/或现象的量为第二样品(或第二受试者)的数的90％至100％(包括例如91％至100％，92％至100％，93％至100％，94％至100％，从95％至100％，从96％至100％，97％至100％，98％至100％和/或99％到100％)。
如本文所用，除非特别相反地指出，否则组分的“重量百分比”是基于包含该组分的制剂或组合物的总重量。
2.总述
本技术提供了用于治疗嗜中性粒细胞介导的炎症的方法和组合物。特别地，本技术提供了一种在有需要的哺乳动物受试者的靶组织中治疗嗜中性粒细胞介导的炎症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的增加多药抗性蛋白1(MRP1)的水平和/或活性的一种或多种第一化合物，其中治疗量的第一化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移，和/或施用治疗有效量的抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和羟基环氧素A3(HXA3)合酶中一种或多种的一种或多种第二化合物，其中治疗量的第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移，和/或施用治疗有效量的增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的一种或多种第三化合物，其中治疗量的第三化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在一个实施方案中，本公开提供了通过靶向促炎性MRP2/HXA3途径来治疗嗜中性粒细胞介导的炎症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和羟基环氧素A3(HXA3)合酶中一种或多种的活性和/或水平的一种或多种化合物，其中该治疗量的化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在另一个实施方案中，本公开还提供了通过靶向抗炎性P-gp/内源性大麻素途径来治疗嗜中性粒细胞介导的炎症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的水平和/或活性的一种或多种化合物，其中该治疗量的化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在另一个实施方案中，本公开进一步提供了用于治疗嗜中性粒细胞介导的炎症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的增加多药抗性蛋白1(MRP1)的水平和/或活性的一种或多种第二化合物，其中该治疗量的化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
在又一个实施方案中，本公开提供了通过靶向抗炎性P-gp/内源性大麻素和促炎性MRP2/HXA3途径两者来治疗嗜中性粒细胞介导的炎症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的(A)抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和羟基环氧素A3(HXA3)合酶中一种或多种的活性和/或水平的一种或多种第一化合物，和(B)提高一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的水平和/或活性的一种或多种第二化合物，其中治疗量的第一和第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
细菌是下呼吸道感染的最常见原因，并且与许多其他感染(例如人类免疫缺陷病毒(HIV)和疟疾)相比，在世界范围内产生更大的疾病负担。疾病控制与预防中心(CDC)估计，肺炎链球菌(肺炎球菌)，这种引起细菌性社区获得性肺炎最多的细菌，在美国每年导致50万例肺炎。在这些病例中，多达30％还会发生菌血症，总的病死率可达5-7％，每年导致约35,000例死亡。诊断为菌血症后的死亡率要高得多-接近20％的病例(Moore和Pilishvilli,“Pneumococcal Disease”.Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases.Centers for Disease Control and Prevention.Epidemiologyand Prevention of Vaccine-Preventable Diseases.Hamborsky and Wolfe,第13版，Washington D.C.Public Health Foundation,2015；Pilishvili,et al.,“PneumococcalDisease”.第11章，2012.Manual for the surveillance of vaccine-preventablediseases.Roush and Baldy,第5版，Centers for Disease Control and Prevention,Atlanta,GA,2008)。此外，尽管已有疫苗和抗生素治疗，但肺炎球菌疾病每年仍导致约50-100万青少年死亡(Moore和Pilishvilli,2015；Pilishvili,et al.,“PneumococcalDisease”.Chapter 11.2012.Manual for the surveillance of vaccine-preventablediseases.Roush和Baldy编，第5版，Centers for Disease Control and Prevention,Atlanta,GA,2008；World Health Organization.“Pneumococcal Vaccines”.No.14,2012,87,129-144。有关肺炎球菌疫苗的答辩论文(2012年4月)。
在导致肺炎的呼吸道感染期间，一个标志性的病理学是多形核细胞(PMN或嗜中性粒细胞)从肺毛细血管募集到腔空间(Loosli和Baker，Trans.Am.Clin.Climatol.Assoc.74：15-28(1962)。尽管这种反应起初可以清除细菌感染，但也直接导致了肺损伤和肺功能障碍(Baird等，J.Appl.Physiol.61(6)：2224-2229(1986)；Flick等，Circ.Res.48(3)：344-351(1981)；Menendez等人，Thorax 63(5)：447-452(2008))。实际上，过度炎症是肺炎球菌性肺炎治疗中早期治疗失败和死亡的主要原因(Menendez等，(2008))。此外，越来越多的文献表明，发炎期间PMN浸润到腔空间中可以介导细菌向血液的浸润(Marks等人，Infect.Immun.75(4)：1586-1597(2007))；Clarke等人，Cell Host Microbe 9(5)：404-414(2011)；Attali等人，Infect.Immun.76(11)：5350-5356(2008)；Bhowmick等人，J.Immunol 191(10)：5115-5123(2013))。
为了更好地了解肺炎球菌感染过程中PMN流入调控的基本机制，研究了肺炎链球菌诱导的PMN迁移的宿主介体以及炎症在肺炎球菌肺感染后败血症中的作用。观察到，在肺炎球菌感染期间PMN迁移到肺气道需要产生脂质化学吸引剂羟基环氧素A3(HXA3)，这是一种通过肺上皮细胞中12-脂氧合酶(LOX)的作用而由花生四烯酸衍生的类花生酸(Bhowmick等人，(2013年))。12-LOX的药理抑制或遗传消除极大地减少了PMN流入肺炎链球菌感染的小鼠的肺部，并导致小鼠在本来致命的肺炎球菌肺部攻击中一致地存活(Bhowmick等，(2013))。这些发现表明，高水平菌血症和全身感染需要肺炎球菌肺部炎症，至少部分是通过依赖12-LOX的HXA3产生和随后的PMN上跨皮迁移破坏肺上皮导致的。
最初集中在肠道上皮的研究表明，ATP结合盒(ABC)转运蛋白多药抗性相关蛋白2(MRP2；也称为ABCC2或c-MOAT)促进了HXA3的释放，并且其分泌受调节粘膜表面处的炎性事件的条件所调控(Pazos等人，J.Immunol.181(11)：8044-8052(2008))。HXA3向上皮细胞顶表面的分泌会跨肠上皮紧密连接复合物建立梯度，并产生趋化梯度，PMN会使用该趋化梯度靶向炎症部位的粘膜腔(Mrsny等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(19)：7421-7426(2004))。尽管ABC转运蛋白最初是由于其具有挤出多种细胞毒性药物的能力促成临床多药抗性而鉴定的，但新出现的报道进一步证明了ABC转运蛋白可能在宿主防御中发挥作用，并参与免疫效应细胞向炎症部位的迁移。此外，许多内源性ABC转运蛋白底物均表现出免疫调节作用(Furugen等人，Prostaglandins Other Lipid Mediat 106：37-44(2013)；Lin等人，Mol.Pharmacol.73(1)：243-251(2008)；van der Deen等人，Virchows Arch 449(6)：682-688(2006)；Blokzijl等人，J.Biol.Chem.283(51)：35630-35637(2008)；Englund等人，Inflamm.Bowel Dis.13(3)：291-297(2007)；Panwala等人，J.Immunol.161(10)：5733-5744(1998)；Yacyshyn等人，Hum.Immunol.60(8)：677-687(1999))。然而，在炎症事件期间在肺中介导这种活性的这种ABC转运蛋白仍然未知。
对细菌诱导的肺炎的标志性免疫反应是PMN从脉管系统侵袭到肺的腔空间(Loosli and Baker，(1962))。尽管此应答可增强先天免疫力，但也直接导致肺损伤和肺功能障碍(Baird等，J.Appl.Physiol.61(6)：2224-2229(1986)；Flick等，Circ Res，48(3)：344-351(1981))。尽管对趋化性的机制以及PMN的杀微生物功能已有很多了解，但管控PMN募集到肺/气道上皮的机制尚不十分清楚。实际上，在肺炎球菌性肺炎感染期间介导先天免疫应答的许多分子对于PMN募集是多余的和/或可有可无的。例如，TLR介导来自肺炎链球菌的信号传导，但是在肺炎球菌性肺炎期间TLR2和TLR4缺乏均不损害PMN浸润(Knapp等人，J.Immunol.172(5)：3132-3138(2004)；Branger等人，Infect.Immun.72(2)：788-794(2004))。Selectins、VLA-4和PCAM-1是在许多炎症反应期间PMN募集所必需的，但在肺炎球菌性肺炎期间则不需要(Mizgerd等，J.Exp.Med.184(2)：639-645(1996)；Tasaka等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.166(1)：53-60(2002)；Doyle等人，J.Clin.Invest.99(3)：526-533(1997)；Tasaka等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.167(2)：164-170(2003))。据信CD11/CD18和ICAM-2在使肺部各种刺激引起的PMN募集最大化方面发挥作用，但它们在肺炎球菌性肺炎期间对PMN募集没有显著贡献(Mizgerd等，J.Immunol。163(2)：995-999(1999)；Mizgerd等，J.Leukoc.Biol.64(3)：291-297(1998))。ICAM-1可能在完全激发嗜中性粒细胞迁移中起作用，但是据信这种作用在24小时后消失(Mizgerd等，(1998))。同样，尽管有很多文献表明CXC趋化因子在肺炎球菌性肺炎的PMN转运中发挥了重要作用，但它们在PMN募集中的功能冗余限制了其作为治疗剂的功效(Jones等，J.Immunol.175(11)：7530-7535(2005)；Eliasson等人，Microbes Infect。12(7)：565-573(2010)；Seyoum等人，Vaccine 29(45)：8002-8011(2011))。
已经表明在肺和肠上皮细胞中多种病原体的感染期间MRP/HXA3途径是保守的，检查了其在没有感染的情况下是否也引起炎症(实施例3)。
缺乏编码P-gp的mdr1a基因的小鼠会发生自发性肠道炎症。缺乏P-gp会促进炎症的证据以及已知外源P-gp底物的特征导致了以下假设：P-gp可能分泌内源性的生物活性脂质，其可以拮抗HXA3介导的迁移。分析了稳态上皮细胞的P-gp依赖性分泌脂质组，以鉴定能够抑制HXA3介导的嗜中性粒细胞迁移的脂质。(实施例4)。
实施例3-10中的数据对于理解嗜中性粒细胞反迁移(transmigration)的调节具有意义，例如示例性的肠腔(实施例3-7)和示例性的肺(实施例8-10)。
本文的数据(实施例3-7)已经定义了抗炎的P-gp/内源性大麻素途径，该途径起到抵消促炎的MRP2/HXA3轴的作用(图10)。此外，这种提议的动态关系为一些科学问题提供了潜在的解释，包括：1)P-gp功能障碍与结肠炎之间的相关性；2)P-gp的内源性非异源底物的存在；3)CB2激动剂抑制结肠炎症状的报道的机制。因此，调节肠腔内表面的促炎性MRP2/HXA3和/或抗炎性P-gp/内源性大麻素途径代表了开发用于治疗炎性疾病例如肠疾病的局部治疗剂的新途径。此外，MRP2/HXA3途径在感染性和非感染性肺部炎症中均保持保守，这表明该途径和P-gp/内源性大麻素途径可能类似地调节其他黏膜表面的炎症。
因此，在一个实施方案中，本技术提供了一种通过靶向促炎性MRP2/HXA3途径来治疗嗜中性粒细胞介导的炎症的方法(图10)。在一个特定的实施方案中，用于治疗需要其的哺乳动物受试者的靶组织中的嗜中性粒细胞介导的炎症的方法包括向该受试者施用治疗有效量的抑制下述一种或多种的活性和/或水平的一种或多种第一化合物：a)多药抗性蛋白2(MRP2)；b)羟基环氧素A3(HXA3)合酶，其中治疗量的所述第一化合物可减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。本文的数据表明，MRP2/HXA3的促炎作用在肺部(实施例8-10)和肠(实施例3-7)以及在非感染性(无菌)和由病原体引起的感染性(有菌)炎症中相似。
在一些实施方案中，可能期望通过也靶向抗炎性P-gp/内源性大麻素途径来治疗炎症(图10)。因此，在一个实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的水平和/或活性的一种或多种第二化合物，其中所述治疗量的第二化合物减少了嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
获得本文的数据(实施例8-10)，以确定呼吸道上皮中的ABC转运蛋白是否在肺炎链球菌感染期间发挥调节PMN迁移的免疫调节作用。如本文所证明，ABC转运蛋白MRP1和MRP2不仅在肺炎球菌感染期间不同地表达，而且还主动排出在控制PMN迁移中具有相反作用的底物。表征这种独特的关系，MRP1似乎在稳态中排出抑制PMN迁移的底物，但在肺炎链球菌感染期间，该转运蛋白在顶部表面的表达显著减少。相反，MRP2释放促进PMN迁移的底物，而在肺炎球菌感染过程中，该转运蛋白在顶部表面高度富集。因此，实施例8-10中的数据证实，肺系统中的ABC转运蛋白可能在调节抑制PMN应答的稳态途径与在对病原体例如肺炎链球菌的应答期间激活的炎性途径之间的平衡中发挥作用。这种平衡的失调支配着先天性炎症反应的一个非常特殊但有用的部分。
实施例8-10中提供的数据揭示了上皮特异性反平衡(counterbalance)系统，其中在肺炎链球菌感染期间外排的转运蛋白协调跨肺上皮细胞的PMN迁移。具体而言，在未感染的基础状态下，MRP1表达介导免疫抑制分子(即L-AMEND)的流出，以维持体内平衡并防止非特异性PMN迁移引起的任何附带损害。在相同的稳态下，MRP2的表面表达非常低，从而增强了该途径的抗炎作用。但是，引入肺炎链球菌后，MRP1的表达降低，从而降低了感染部位抗炎分子的有效浓度。相反，MRP2的顶部表达增加，促进脂质PMN趋化剂(可能是HXA3，一种类花生酸)的外排，其反过来可以将PMN吸引到感染/损伤部位，并已显示出在许多其他细菌感染中起作用(Pazos等，(2008)；Mrsny等，(2004)；Hurley等人，J.Immunol.173(9)：5712-5720(2004)；Mumy等人，Infect.Immun.76(8)：3614-3627(2008)；Boll等人，CellMicrobiol，14(1)：120-132(2012))。最近有关这种有效的PMN趋化剂在炎症性疾病如牛皮癣和感染性/非感染性小肠结肠炎(Mrsny)中的存在和功能增强的报道进一步证明了HXA3是一种引导PMN跨过上皮屏障募集的促炎性介质(Mrsny等人，(2004)；Antón等人，J.Invest.Dermatol.110(4)：303-310(1998))。还已经在大鼠肺中检测到HXA3(Pace-Asciak等人，Biochim.Biophys.Acta，875(2)：406-409(1986))，但其在因细菌肺感染导致的PMN募集过程中的确切作用仍然在研究之中。
实施例8-10的结果表明，HXA3/MRP2和L-AMEND/MRP1轴是有助于控制肺部炎症的通用机制的一部分。在炎症状态期间，MRP2的极化表达和该HXA3/MRP2轴的活性大大增加，并且该途径不是其他驱动PMN募集的化学吸引剂(例如IL-8)的冗余。本文提供的数据与其他数据一致，表明MRP1的表达和活性与抗炎状态相对应，而HXA3/MRP2轴在粘膜表面是保护免受病原细菌侵害的保守机制(Pazos等，(2008)；Blokzijl等人，(2008)；Agbor等人，(2011))。此外，在实施例8-10中，发现在肺炎链球菌感染期间对MRP2的阻断极大地减少了PMN向肺炎链球菌感染的小鼠的肺中的流入，并且相应地减少了感染后血液中检测的细菌的数量。这些发现支持了由肺炎球菌肺部炎症引起的PMN流入可能促进了细菌感染的病理学的观点。
Schultz等人先前报道了整体性Mrp1敲除小鼠在肺炎球菌感染期间受到保护，而野生型同窝幼仔则屈服于感染(Schultz等，J.Immunol.166(6)：4059-4064(2001))。在实施例8-10中，显示了在感染后48小时，Mrp1-/-BALF中的细胞外白三烯C4(LTC4)低于野生型小鼠。可以理解，发现细胞内LTC4更高，从而得出通过消除鼠Mrp1抑制了LTC4释放的结论。在这项特殊研究中，LTC4的保留被认为具有细胞毒性(Blokzijl等，(2008))，这可能导致PMN凋亡并减少BALF中的嗜中性粒细胞数量，正是Schultz证明的感染后48小时的结果。在这种情况下，这种减少的嗜中性粒细胞数量将防止上皮壁破裂并减少细菌浸润，从而允许其他细菌清除手段消除肺炎球菌感染，正如Marks等和Bhowmick等的暗示。该数据显示的明显悖论似乎与我们的假设相符，即MRP1活性有助于抑制PMN反迁移。为确保感染的上皮细胞不经历LTC4诱导的凋亡，对MRP1缺陷上皮细胞和对照细胞中感染前后的膜联蛋白V染色进行了测试(图22A和22B)，表明与MRP1缺乏相关的PMN迁移的任何增加不是由上皮细胞毒性引起的。
MRP1/L-AMEND决定抗炎状态(实施例8-10)而MRP2/HXA3决定促炎状态(实施例3-7)的假设结合了上皮细胞(通过调节ABC外排转运蛋白)充当整合信号的传感器从而确定何时引发PMN反迁移的概念。因此，建立了一个稳态设定点，该设定点限制了不适当的炎症反应，但准备对病原体例如肺炎链球菌(或其他促炎性刺激物)的存在作出反应。尽管这种PMN反应可能在控制已有感染中发挥作用，但长期嗜中性粒细胞活化也被认为对健康具有有害影响，突显了宿主的成本－收益关系。本文提供的数据表明，更好地了解肺炎球菌感染过程中PMN流入的调控机制可能有助于设计改进的疗法，从而最终控制感染但同时减轻有害的肺部炎症。
因此，在本技术的另一个实施方案中，可能希望向受试者施用治疗有效量的增加多药抗性蛋白1(MRP1)的水平和/或活性的一种或多种化合物，其中治疗量的所述一种或多种化合物减少了嗜中性粒细胞向靶组织的迁移(实施例8-10)。在一些实施方案中，当用L-AMEND和/或其他抗炎性的大麻素治疗疾病时，可能不需要MRP1上调(尽管可以任选地包括)。
可以通过例如转染编码MRP-1的mRNA序列，使用在组织特异性启动子下携带MRP-1基因插入片段的病毒载体(Hao等，Cancer Biology&Therapy，5(3)：261-266，DOI：10.4161/cbt.5.3.2381)，使用小分子如伊维菌素
Figure BDA0002392142680000341
(Raza等人，Parasites&Vectors 9：522，DOI：10.1186/s13071-016-1806-9(2016))以及例如抗癌药来提高多药抗性蛋白1(MRP1)的水平。已经报道了许多化学治疗剂(包括但不限于阿霉素和长春碱)可以诱导MRP1表达，并且已经报道了通过CAR调节核激素的作用(Bakos等人，Pflugers Arch-Eur J Physiol 453：621–641(2007)。
在一些实施方案中，本技术的方法可以任选地进一步包括施用一种或多种抗生素和/或抗炎剂。在本技术的方法中单独或组合使用的抗生素/抗炎药的实例包括但不限于达巴万星
Figure BDA0002392142680000342
奥利万星
Figure BDA0002392142680000343
达托霉素
Figure BDA0002392142680000344
特地唑胺
Figure BDA0002392142680000345
头孢比洛
Figure BDA0002392142680000346
头孢唑烷-他唑巴坦
Figure BDA0002392142680000347
莫匹罗星，硫酸新霉素，杆菌肽，多粘菌素B，1-氧氟沙星，克林霉素磷酸酯，硫酸庆大霉素，甲硝唑，己基间苯二酚，氯化苄乙氧铵，苯酚，季铵盐化合物，茶树油，甾类药物例如皮质类固醇如氢化可的松，羟基三安西松，α甲基地塞米松，地塞米松磷酸酯，倍氯米松二丙酸酯，氯倍他索戊酸酯，地索奈德，去氧甲米松，去氧皮质酮乙酸酯，地塞米松，二氯松，醋酸双氟拉松，戊酸双氟可龙，氟氢缩松，氟氯缩松丙酮化物，氟轻松，氟可丁酯，氟可龙，氟泼尼定，醋酸氟泼尼定，氟氢缩松，哈西奈德，醋酸氢化可的松，丁酸氢化可的松，甲基强的松龙，曲安奈德，可的松，可托多松，flucetonide，氟氢可的松，difluorosone diacetate，fluradrenalone acetonide，甲羟松，amciafel，安西非特，倍他米松，氯泼尼松，醋酸氯泼尼松，氯考特酮，clescinolone，二氯松酮，二氟泼尼酯，氟氯奈德，氟尼缩松，氟米龙，氟培龙，氟泼尼松龙，氢化可的松戊酸酯，氢化可的松环戊基丙酸酯，氢可他酯，甲泼尼松，对氟米松，泼尼松龙，泼尼松，倍氯米松二丙酸酯，倍他米松二丙酸酯，曲安西龙，非甾类药剂例如COX抑制剂，LOX抑制剂，p38激酶抑制剂，免疫抑制剂如环孢菌素和细胞因子合成抑制剂，四环素，米诺环素和强力霉素，或其任何组合。
在一些实施方案中，本技术的方法可以任选地进一步包括施用一种或多种抗体，所述抗体靶向艰难梭菌毒素、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素、金属蛋白酶-9中的一种或多种(例如抗体GS-5745，吉利德(Gilead)。
例如，在克罗恩氏病中，可能希望本技术中的任何一种方法进一步包括施用一种或多种美沙拉敏产品，皮质类固醇制剂，常规皮质类固醇和回肠释放布地奈德，糖皮质激素/EEN免疫调节剂(如硫唑嘌呤)，6-巯基嘌呤和甲氨蝶呤)，抗肿瘤坏死因子(TNF)药物(例如英夫利昔单抗(Remicade，Janssen)，阿达木单抗(Humira，AbbVie)和赛妥珠单抗聚乙二醇(Cimzia，UCB))，抗α4β7整合素抗体维多珠单抗(Entyvio，Takeda)，JAK抑制剂ABT-494(AbbVie)和非洛替尼(GLPG0634，Galapagos和Gilead)(Sandborn，Sandborn,The Presentand Future of Inflammatory Bowel Disease Treatment Gastroenterology&Hepatology，第12卷，第7期，2016年7月)。
对于溃疡性结肠炎，可能需要本技术中的任何一种方法进一步包括施用5-氨基水杨酸酯，美沙拉敏，常规皮质类固醇或多基质布地奈德(Uceris，Salix)(其将药物递送至结肠)，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，抗TNF药物(例如英夫利昔单抗，阿达木单抗和戈利木单抗(Simponi，Janssen))，威多珠单抗，Janus激酶(JAK)抑制剂(例如托法替尼(Xeljanz，Pfizer)ABT-494(AbbVie)，和非洛替尼(GLPG0634，Galapagos和Gilead))(Sandborn 2016)中的一种或多种。
III.本技术的化合物
本技术提供了用于治疗嗜中性粒细胞介导的炎症及其相关病症的组合物。在一些实施方案中，本技术提供了包含一种或多种增加多药抗性蛋白1(MRP1)的水平和/或活性的第一化合物、抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和羟基环氧素A3(HXA3)合酶中一种或多种的第二化合物和/或增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的第三种化合物的组合物。
A.增加MRP1的化合物
在一些实施方案中，例如，通过使用编码MRP-1的mRNA序列的转染，使用在组织特异性启动子下携带MRP-1基因插入物的病毒载体，(Hao等人，Cancer Biology&Therapy，5(3)：261-266，DOI：10.4161/cbt.5.3.2381)，使用小分子例如伊维菌素
Figure BDA0002392142680000364
(Raza等人，Parasites&Vectors 9：522，DOI：10.1186/s13071-016-1806-9(2016))以及例如抗癌药可以实现多药抗性蛋白1(MRP1)水平的增加。据报道，许多化学治疗剂，包括但不限于阿霉素和长春碱，可以诱导MRP1表达，并且已报道了具有通过CAR调节核激素的作用(Bakos等，Pflugers Arch-Eur J Physiol453：621–641(2007)。
B.MRP2抑制剂
在一些实施方案中，抑制多药抗性蛋白2(MRP2)的化合物的实例有一种或多种MRP2RNAi；3-([3-(2-[7-氯-2-喹啉基]乙烯基)苯基-(3-二甲基氨基-3-氧丙基)-硫代甲基]硫)丙酸(也称为”MK571”和CysLT1(LTD4)白三烯受体反向激动剂)(Tocris，明尼阿波利斯，美国)(Genuuso等人(2004)PNAS 101：2470-2475)；丙磺舒(也称为“PROBALANTM”)，以丙磺舒抑制MRP2为例(实施例3)；
Figure BDA0002392142680000361
Figure BDA0002392142680000362
和
Figure BDA0002392142680000363
在一些实施方案中，抑制MRP2的化合物的实例为抑制羟基环氧素A3合酶的一种或多种化合物，例如羟基环氧素A3合酶RNAi。
在一些实施方案中，抑制MRP2的化合物的实例为一种或多种抑制脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)的化合物，例如FAAH RNAi；FAAH抑制剂I(PubChem CID：295380)4-苯基甲氧基苯基)N-丁基氨基甲酸酯)；URB597(PubChem CID：1383884)3'-氨基甲酰基-[1,1'-联苯]-3-基环己基氨基甲酸酯；FAAH抑制剂1(PubChem CID：1190414)N-(4-(6-甲基苯并[d])噻唑-2-基)苯基)-1-(噻吩-2-基磺酰基)哌啶-4-羧酰胺；FAAH抑制剂2l(PubChem CID：71699786)；FAAH抑制剂2i(PubChem CID：71699785)N-环己基氨基甲酸4-(二甲基氨基)-3-苯基苯基酯；FAAH抑制剂2h(PubChem CID：71699784)N-环己基氨基甲酸4-(羟甲基)-3-苯基苯酯；FAAH抑制剂2j(PubChem CID：58801136)；FAAH抑制剂2e(PubChem CID：58801135)；FAAH抑制剂2a(PubChem CID：58801134)；FAAH抑制剂2b(PubChem CID：58801129)；FAAH抑制剂2f(PubChem CID：58801126)氨基甲酸，环己基-，6-甲基[1,1'-联苯]-3-基酯；FAAH抑制剂，2k(PubChem CID：58801125)；FAAH抑制剂2c(PubChem CID：57582480)；FAAH抑制剂，2g(PubChem CID：44626363)；FAAH抑制剂，2d(PubChem CID：44626362)；AM374，棕榈磺酰氟；ARN2508，氟比洛芬的衍生物；BIA 10-2474；BMS-469908；CAY-10402；JNJ-245；JNJ-1661010；JNJ-28833155；JNJ-40413269；JNJ-42119779；JNJ-42165279；LY-2183240；卡那比二醇；MK-3168；MK-4409；MM-433593；OL-92；OL-135；PF-622；PF-750；PF-3845；PF-04457845；PF-04862853；RN-450；SA-47；SA-73；SSR-411298；ST-4068；TK-25；URB524；URB597(KDS-4103，Kadmus Pharmaceuticals)；URB694；URB937；VER-156084；V-158866；和来自
Figure BDA0002392142680000371
Biochemicals(Dallas,Texas)的多种FAAH抑制剂。
在一些实施方案中，抑制MRP2的化合物的实例为一种或多种抑制P-糖蛋白(P-gp)的化合物，例如P-gp RNAi；SipA；以及小分子(例如，唑喹达三盐酸盐(zosuquidartrihydrochloride，LY335979)；
Figure BDA0002392142680000382
(PSC833)(P-gp介导的MDR的抑制剂)；CP 100356盐酸盐(Sigma-Aldrich)；和依克立达盐酸盐(Elacridar hydrochloride，R&DSystems)。另请参见WO 2004071498 A1；WO 2014106021 A1；WO 2005033101 A1；WO2004009584 A1；WO 2002030915 A2；US 20100029755 A1；以及US 20060073196 A1)。
尽管无意限制施用本技术的化合物的组合物的类型，但是在一些实施方案中，本技术的化合物(例如，减少嗜中性粒细胞向靶组织迁移的化合物和/或抑制MRP2和HXA3合酶中一种或多种的活性和/或水平的化合物，和/或增加N-酰基乙醇胺(NAE)的水平和/或活性的化合物，和/或增加多药抗性蛋白1(MRP1)的化合物)与聚合物缀合。
本技术的丙磺舒缀合物
在一些实施方案中，本技术公开了由式I定义的丙磺舒-聚合物缀合物：
Figure BDA0002392142680000381
其中X是连接基并且POLY是聚合物。
在一些实施方案中，POLY是选自葡聚糖，聚乙二醇(PEG)，高碘酸盐氧化的葡聚糖，聚唾液酸(PSA)，透明质酸(HA)，糊精，羟乙基淀粉(HES)，聚(2-乙基2-
Figure BDA0002392142680000383
唑啉)(PEOZ)，聚谷氨酸(PGA)，聚乳酸(PLA)，聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLA/PLGA)，聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)，聚甘油，25聚酰胺基胺(PAMAM)，聚乙烯亚胺(PEI)和多肽。在一些实施方案中，PEG聚合物被胺(NH2)和醛(CHO)官能化，包括线性单胺和单醛，线性双胺和双醛，多臂胺和多臂醛，支链的单、双和多臂胺和醛，以及多臂分叉的胺和醛。这些聚合物可以具有本文所述的任何分子量。
在一些实施方案中，聚合物具有在约100Da至约800kDa范围内的平均分子量。(除非另有说明，“平均分子量”是指重均分子量。)在一些实施方案中，聚合物的平均分子量为约1kDa至约800kDa。在一些实施方案中，聚合物具有小于1kDa的平均分子量。在一些实施方案中，聚合物的平均分子量小于10kDa。在一些实施方案中，聚合物的平均分子量为约10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、125kDa、150kDa、175kDa、200kDa、225kDa、250kDa、275kDa、300kDa、325kDa、350kDa、375kDa、400kDa、425kDa、450kDa、475kDa、500kDa、550kDa、600kDa、650kDa、700kDa、750kDa、800kDa、或介于这些值中的两个之间的任何范围(包括这两个值)。
本文所述的聚合物可具有多种不同的几何形状中的任何一种。例如，在一些实施方案中，聚合物是线性聚合物，支化聚合物，叉状聚合物或任何这些聚合物中的组合。
在一些实施方案中，丙磺舒通过连接基X连接至聚合物。在一些实施方案中，该连接基可以用作间隔基以使丙磺舒化合物和聚合物间隔开，从而避免干扰，例如结合能力。连接基包含一个或多个原子，例如选自C、N或O的一个或多个原子。在一些这样的实施方案中，连接基可进一步包含一个或多个H原子，例如NH、N(CH3)或CH2。
在一些实施方案中，连接基是可生物降解的连接基。在一些实施方案中，可生物降解的连接基包含具有2至10个氨基酸残基的寡肽。残基可以选自天然氨基酸。
在一些实施方案中，连接基包含取代或未取代的C1-CX亚烷基，亚环烷基，环烷基亚烷基，亚杂烷基，亚烯基或亚杂烯基，其中x可以是1至12的任何整数，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。例如，连接基可包含C1-Cx氟烷基，其中一个或多个氢原子为氟原子，例如1、2或3个或更多个氟。在一些实施方案中，X是含有一个或两个NH基的亚杂烷基，包括但不限于(C1-C10亚烷基)-NH(例如CH2CH2NH,CH2CH2CH2NH,CH2CH2CH2CH2NH,CH2CH(CH3)CH(CH3)CH2NH),(Cn亚烷基)NH(Cp亚烷基)，其中n、p独立为1-10的整数，但n+p不超过10(例如CH2CH2CH2NHCH2CH2)，NH-(C1-C10亚烷基)NH(例如NH(CH2)5NH,NH(CH2)6NH,NH(CH2)8NH)或NH(Cn亚烷基)NH(Cp亚烷基)，其中n和p是先前定义的整数(例如NHCH2CH2CH2NH CH2CH2,NH(CH2)6NHCH2)。在一些实施方案中，X是含有一个或两个氧原子的亚杂烷基，包括但不限于(C1-C10亚烷基)-O(例如，CH2CH2O,CH2CH2CH2O,CH2CH2CH2CH2O,CH2CH(CH3)CH(CH3)CH2O)，(Cn亚烷基)O(Cp亚烷基)，其中n、p独立为1-10的整数，但n+p不超过10(例如CH2CH2CH2OCH2CH2),O-(C1-C10亚烷基)O(例如O(CH2)5O,O(CH2)6O,O(CH2)8O))或O(Cn亚烷基)O(Cp亚烷基)，其中n和p是如先前所定义的整数(例如，OCH2CH2CH2O CH2CH2,O(CH2)6OCH2))。在一些实施方案中，X是含有O和NH基团的亚杂烷基，包括但不限于NH-(C1-C10亚烷基)O，(例如，NH(CH2)5O,NH(CH2)6O,NH(CH2)8O)或NH(Cn亚烷基)O(Cp亚烷基)，其中n和p是如前定义的整数(例如，NHCH2CH2OCH2CH2,O(CH2)6NHCH2)。
丙磺舒-聚合物缀合物可以使用本领域已知的标准技术来制备。在一些实施方案中，可以使用标准的酯、硫酯和酰胺键形成技术来缀合含有包含选自N、O和S的杂原子的至少两个官能团的双官能连接基，其中一个官能团被保护。例如，其中氨基之一被氨基甲酸酯保护基团(例如Boc.Cbz等)保护的二氨基亚烷基连接基可以在偶联剂(例如DCC，EDC/HOBt等)的存在下偶联至丙磺舒。或者，可以制备丙磺舒的活性酯、混合酸酐或酰基卤衍生物，并使其与单保护的二胺反应。(参见，例如，Bodansky，M.&Bodanszky，A.，The Practice ofPeptide Synthesis，Springer-Verlag，纽约，1984)。可以除去保护基，并使游离胺与聚合物的醛衍生物在还原条件下反应，以提供缀合物。类似地，可以将具有保护的醛(例如，1，1-二甲氧基)和胺的连接基偶联至丙磺舒，脱保护以形成醛，并用含氨基的聚合物进行还原胺化以形成缀合物。使用α,ω-羧基胺、α,ω-氨基醇、α,ω-羧基醇、α,ω-氨基硫醇等连接丙磺舒和聚合物的这些方案的变化对本领域技术人员而言将是容易理解的。
C.增加NAE的化合物
尽管无意限制增加N-酰基乙醇胺(NAE)的化合物的类型，但在一些实施方案中，增加NAE的化合物是2型大麻素受体(CB2)“激动剂”(即与CB2特异性结合并使之激活的化合物)。示例性的CB2激动剂包括GW-405,833；AM-1241；HU-308；JWH-015；JWH-133；L-759,633；L-759,656；β-石竹烯；花生四烯酰基环丙基酰胺；和花生四烯酰基-2’-氯乙酰胺。
IV.本技术的组合物的用途
本技术提供了用于治疗、预防或改善需要其的哺乳动物受试者的靶组织中的嗜中性粒细胞介导的炎症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的抑制一种或多种多药抗性蛋白2(MRP2)和羟基环氧素A3(HXA3)合酶的一种或多种第一化合物，其中治疗有效量的第一化合物可减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。在一些实施方案中，第一化合物是丙磺舒缀合物。在一些实施方案中，丙磺舒缀合物是丙磺舒-高碘酸盐氧化的40kDa葡聚糖缀合物。在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种第二化合物，其增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)，其中该治疗量的第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。在另一个实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的增加多药抗性蛋白1(MRP1)的水平和/或活性的一种或多种第二和/或第三化合物，其中所述治疗量的一种或多种第二和/或第三化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。在另一个实施方案中，将本技术的化合物单独或以任何组合施用至靶组织的局部表面和/或靶组织的腔表面。在另一个实施方案中，将减少嗜中性粒细胞迁移到靶组织中的第一化合物与聚合物缀合。在另一个实施方案中，所述炎症是非感染性和/或感染性炎症。
本技术还提供了用于治疗、改善或预防需要其的哺乳动物受试者的靶组织中的嗜中性粒细胞介导的炎症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的一种或多种第一化合物，其中所述治疗量的第一化合物可减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。在一个实施方案中，该方法进一步包括向该受试者施用治疗有效量的抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和HXA3合酶中一种或多种的一种或多种第二化合物，其中该治疗量的第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。在一些实施方案中，第二化合物是丙磺舒缀合物。在一些实施方案中，丙磺舒缀合物是丙磺舒-高碘酸盐氧化的40kDa葡聚糖缀合物。在另一个实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的增加多药抗性蛋白1(MRP1)的水平和/或活性的一种或多种第二和/或第三化合物，其中所述治疗量的一种或多种第二和/或第三化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。在另一个实施方案中，所述增加一种或多种NAE的一种或多种第一化合物是大麻素受体2型(CB2)激动剂。在另一个实施方案中，减少嗜中性粒细胞向靶组织中的迁移的所述第一化合物与聚合物缀合。
一方面，本技术的方法和组合物涉及由式I定义的丙磺舒-聚合物缀合物：
Figure BDA0002392142680000421
其中X是连接基且POLY是聚合物，
以及这些缀合物中的一种或多种用于在有此需要的受试者的靶组织中治疗、改善或预防嗜中性粒细胞介导的炎症的用途。在其他实施方案中，丙磺舒缀合物与一种或多种化合物(例如，增加MRP1的水平和/或活性的化合物，或增加NAE的化合物)的组合将在这方面显示出协同作用。
在一些实施方案中，本技术的方法和组合物涉及一种或多种式I的丙磺舒缀合物用于治疗、改善或预防炎性肠病(IBD)例如溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩氏病(CD)和传染性/非传染性小肠结肠炎的用途。在其他实施方案中，丙磺舒缀合物与一种或多种化合物(例如，增加MRP1的水平和/或活性的化合物，或增加NAE的化合物)组合将在这方面显示出协同作用。
在一些实施方案中，本技术的方法和堆肥涉及一种或多种式I的丙磺舒缀合物用于治疗、改善或预防感染性和非感染性炎性肺部病症，包括但不限于：肺炎球菌感染，哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺纤维化。在其他实施方案中，丙磺舒缀合物与一种或多种化合物(例如，增加MRP1的水平和/或活性的化合物，或增加NAE的化合物)组合将在这方面显示出协同作用。
在一些实施方案中，本技术的方法和组合物涉及一种或多种式I的丙磺舒缀合物用于治疗、改善或预防炎性皮肤疾病，包括但不限于皮炎(湿疹)，酒渣鼻，脂溢性皮炎和牛皮癣。在其他实施方案中，丙磺舒缀合物与一种或多种化合物(例如，增加MRP1的水平和/或活性的化合物，或增加NAE的化合物)组合将在这方面显示出协同作用。
本技术的方法可用于治疗“炎症”，这是一种局部的身体状况，其中身体的一部分对损伤和/或感染做出反应。炎症的典型症状是发热，发红，肿胀，疼痛和/或功能丧失。这些是炎症过程中发生的生理变化的表现。该过程的三个主要组成部分是：(1)血管口径的变化和通过血管的血流速率(血流动力学变化)；(2)增加毛细血管的通透性；(3)白细胞渗出。“嗜中性粒细胞介导的炎症”是指白细胞渗出和炎症阶段，其中嗜中性粒细胞移至小血管的内皮层(边缘化)，并以紧密堆积的形式排列内皮(铺装)。最终，这些嗜中性粒细胞穿过内皮空间并逃逸到血管外空间(移出)。一旦它们位于血管外，它们就可以自由移动，并通过趋化作用被吸引到受伤部位。炎症区域中的嗜中性粒细胞(和巨噬细胞)的积聚通过吞噬作用中和外来颗粒。
炎症包括急性炎症，通常是突然发作，其特征是发热，发红，肿胀，疼痛和功能丧失的典型体征，并且其中以血管和渗出过程为主。卡他性炎症，主要影响粘膜表面，以粘液和上皮碎片大量排出为特征；慢性炎症，主要是通过新的结缔组织形成而引起的长期持续炎症。它可以是急性形式的延续，也可以是长期低等形式的延续；间质性炎症，主要是影响器官基质的炎症；创伤性炎症，是指受伤或受伤后发生的炎症；溃疡性炎症，其中在表面或其附近的坏死会导致组织丧失和局部缺损(溃疡)的形成。
炎症可能是感染性和/或非感染性的。“感染性”炎症是指与正常在体内不存在的微生物如细菌，病毒和寄生虫的入侵和繁殖相关和/或由其引起的炎症。相反，“非感染性”炎症是指与通常不存在于体内的微生物如细菌，病毒和寄生虫的入侵和繁殖无关和/或不是由其引起的炎症。
在另一个实施方案中，本技术提供了一种通过靶向促炎性MRP2/HXA3途径来治疗嗜中性粒细胞介导的炎症的方法(图10)。在一个特定的实施方案中，该用于治疗需要其的哺乳动物受试者的靶组织中的嗜中性粒细胞介导的炎症的方法包括向该受试者施用治疗有效量的抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和羟基环氧素A3(HXA3)合酶中一种或多种的活性和/或水平的一种或多种第一化合物，其中所述治疗量的第一化合物可减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。在一些实施方案中，该化合物是丙磺舒缀合物。
确定本技术的丙磺舒缀合物的生物效应
在各种实施方案中，进行合适的体外或体内测定以确定本技术的特定组合物的作用以及其施用是否用于治疗。在各种实施方案中，可以利用基于细胞的代表性测定，例如嗜中性粒细胞迁移测定，进行体外测定。在其他实施方案中，以动物模型为代表的体内模型可用于确定给定的丙磺舒缀合物单独或者与一种或多种其他化合物(例如抑制MRP2和HXA3合酶中一种或多种的其他化合物，增加MRP1的水平和/或活性的化合物，或增加NAEs的化合物)相组合是否在治疗疾病或病症中发挥所需的作用。在用于人类受试者的测试之前，可以在合适的动物模型系统(包括但不限于大鼠，小鼠，鸡，牛，猴子，兔子等)中测试用于治疗的化合物。类似地，对于体内测试，可以在施用于人类受试者之前使用本领域已知的任何动物模型系统。
V.丙磺舒缀合物和其他治疗剂的联合治疗
在一些实施方案中，本技术的丙磺舒缀合物可以与一种或多种另外的治疗剂组合，用于预防、改善或治疗疾病或病症。
在一个实施方案中，将另外的治疗剂与本技术的丙磺舒缀合物组合给予受试者，从而产生协同治疗效果。
在一些实施方案中，本技术的丙磺舒缀合物与上述IIIA节中所述的增加多药抗性蛋白1(MRP1)水平的一种或多种化合物组合。
在一些实施方案中，本技术的丙磺舒缀合物与上文IIIB部分中描述的抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和羟基环氧素A3(HXA3)合酶中一种或多种的一种或多种其他化合物组合。
在一些实施方案中，本技术的丙磺舒缀合物与上述IIIC部分中所述的增加N-酰基乙醇胺(NAE)的一种或多种其他化合物组合。
在一些实施方案中，本技术的丙磺舒缀合物与用于治疗嗜中性粒细胞介导的炎症和与其相关的病症的一种或多种其他治疗剂组合，所述炎症和病症包括但不限于溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。在一些实施方案中，本技术提供了组合物，其包含一种或多种增加多药抗性蛋白1(MRP1)的水平和/或活性的第一化合物，抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和羟基环氧素A3(HXA3)合酶中一种或多种的第二化合物(例如丙磺舒缀合物)，和/或增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的第三化合物。
可以以任何顺序或甚至同时施用所述多种治疗剂(例如丙磺舒缀合物，增加MRP1的水平和/或活性的化合物，另外的MRP2和HXA3合酶的抑制剂和/或增加NAE的化合物)。如果同时使用，则可以以单一、统一的形式或以多种形式(仅作为示例，作为单一制剂或作为两个分开的制剂)提供所述多种治疗剂。其中一种治疗剂可以多剂量给予，或者两种都可以多剂量给予。如果不同时施用，则多次给药之间的时间间隔可能从大于零周到小于四周不等。另外，组合方法、组合物和制剂不限于仅使用两种药剂。
在一些实施方案中，本技术的方法还包括向受试者施用治疗有效量的增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的水平和/或活性的至少一种化合物，其中所述治疗量的化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
尽管无意限制增加NAE的化合物的类型，但是在一个实施方案中，增加NAE的化合物是大麻素受体2型(CB2)“激动剂”(即，特异性结合并激活CB2的化合物)。CB2激动剂的实例有GW-405,833；AM-1241；HU-308；JWH-015；JWH-133；L-759,633；L-759,656；β-石竹烯；花生四烯酰基环丙基酰胺；和花生四烯酰基-2’-氯乙酰胺。
在一些实施方案中，本技术的方法可以进一步包括施用一种或多种抗生素和/或抗炎剂。在本技术的方法中单独或组合使用的抗生素/抗炎剂的实例包括但不限于达巴万星
Figure BDA0002392142680000461
奥利万星
Figure BDA0002392142680000462
达托霉素
Figure BDA0002392142680000463
特地唑胺
Figure BDA0002392142680000464
头孢比洛
Figure BDA0002392142680000465
头孢唑烷-他唑巴坦
Figure BDA0002392142680000466
莫匹罗星，硫酸新霉素，杆菌肽，多粘菌素B，1-氧氟沙星，克林霉素磷酸酯，硫酸庆大霉素，甲硝唑，己基间苯二酚，氯化苄乙氧铵，苯酚，季铵盐化合物，茶树油，甾类药物例如皮质类固醇如氢化可的松，羟基三安西松，α甲基地塞米松，地塞米松磷酸酯，倍氯米松二丙酸酯，氯倍他索戊酸酯，地索奈德，去氧甲米松，去氧皮质酮乙酸酯，地塞米松，二氯松，醋酸双氟拉松，戊酸双氟可龙，氟氢缩松，氟氯缩松丙酮化物，氟轻松，氟可丁酯，氟可龙，氟泼尼定，醋酸氟泼尼定，氟氢缩松，哈西奈德，醋酸氢化可的松，丁酸氢化可的松，甲基强的松龙，曲安奈德，可的松，可托多松，flucetonide，氟氢可的松，difluorosonediacetate，fluradrenalone acetonide，甲羟松，amciafel，安西非特，倍他米松，氯泼尼松，醋酸氯泼尼松，氯考特酮，clescinolone，二氯松酮，二氟泼尼酯，氟氯奈德，氟尼缩松，氟米龙，氟培龙，氟泼尼松龙，氢化可的松戊酸酯，氢化可的松环戊基丙酸酯，氢可他酯，甲泼尼松，对氟米松，泼尼松龙，泼尼松，倍氯米松二丙酸酯，倍他米松二丙酸酯，曲安西龙，非甾类药剂例如COX抑制剂，LOX抑制剂，p38激酶抑制剂，免疫抑制剂如环孢菌素和细胞因子合成抑制剂，四环素，米诺环素和强力霉素，或其任何组合。
在一些实施方案中，本技术的方法可以进一步包括施用一种或多种抗体，例如靶向艰难梭菌毒素、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素、金属蛋白酶-9中的一种或多种的抗体(例如抗体GS-5745，Gilead)。
在一些实施方案中，本公开内容涵盖用于治疗、改善或预防克罗恩氏病的方法，包括将一种或多种本技术的化合物与下述联合施用：至少一种或多种美沙拉敏产品，皮质类固醇制剂，常规皮质类固醇和回肠类药物释放布地奈德二者，糖皮质激素/EEN免疫调节剂(例如硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤和甲氨蝶呤)，抗肿瘤坏死因子(TNF)药物(例如英夫利昔单抗(Remicade，Janssen)，阿达木单抗(Humira，AbbVie)和赛妥珠单抗聚乙二醇(Cimzia，UCB))，抗α-4β-7整联蛋白抗体维多珠单抗(Entyvio，Takeda)，JAK抑制剂ABT-494(AbbVie)和非洛替尼(GLPG0634，Galapagos和Gilead)(Sandborn，Gastroenterology&Hepatology12(7)(2016))。
在一些实施方案中，本公开内容涵盖用于治疗、改善或预防溃疡性结肠炎的方法，包括将本技术的一种或多种化合物与下述的至少一种或多种联合施用：5-氨基水杨酸酯，美沙拉敏，常规皮质类固醇或多基质布地奈德(Uceris，Salix)(其可将药物递送至结肠)，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，抗TNF药物(例如英夫利昔单抗，阿达木单抗和戈利木单抗(Simponi，Janssen))，维多珠单抗，Janus激酶(JAK)抑制剂(例如托法替尼(Xeljanz，Pfizer)ABT-494(AbbVie)和非洛替尼(GLPG0634，Galapagos和Gilead))(Sandborn，2016)。
VI.施用方式
可以采用本领域技术人员已知的使细胞、器官或组织与本技术的化合物接触的任何方法。合适的方法包括体外、离体或体内方法。
体外方法通常包括培养样品。例如，可将细胞置于储器(例如组织培养板)中，并在适合于获得所需结果的适当条件下与化合物一起孵育。合适的孵育条件可以由本领域技术人员容易地确定。
离体方法通常包括从哺乳动物例如人取出的细胞、器官或组织。细胞、器官或组织可以例如在适当条件下与化合物一起温育。接触的细胞、器官或组织通常返回给供体，放置在接受者中，或存储以备将来使用。因此，该化合物通常在药学上可接受的载体中。
体内方法通常包括向哺乳动物例如人施用本技术的化合物。当在体内用于治疗时，将本技术的化合物以有效获得例如治疗哺乳动物的期望结果的量施用于哺乳动物。有效量是在临床前试验和临床试验中通过医师和临床医生所熟悉的方法确定的。剂量和给药方案将取决于受试者的疾病或状况的程度，所用本技术的特定化合物的特征，例如其治疗指数，受试者和受试者的病史。
可通过用于施用药物组合物或药物的许多已知方法中的任何一种将有效量的可用于本方法的本技术化合物，例如在药物组合物或药物中，施用于需要其的哺乳动物。本技术的化合物可以全身或局部给药。
可将本文所述的本技术的化合物掺入药物组合物中，以将其单独或组合施用给受试者，以治疗或预防本文所述的病症。这样的组合物通常包括活性剂和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的盐水，溶剂，分散介质，包衣，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等。也可以将补充性的活性化合物掺入组合物中。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物包含药学上可接受的适合于使所述化合物或混合物以片剂、胶囊剂或丸剂的形式口服给药或者经肠胃外、静脉内、皮内、肌内或皮下或透皮给药的载体和/或赋形剂。
通常将药物组合物配制成与预期的给药途径相容。可以通过本领域技术人员已知的任何方式来完成本发明的药物组合物的施用。施用途径包括但不限于肠胃外、静脉内、肌内、皮内、腹膜内、气管内、皮下、口服、鼻内/呼吸(例如吸入)、透皮(局部)、舌下、眼、阴道、直肠和经粘膜给药。系统性途径包括口服和肠胃外。几种类型的设备经常用于通过吸入给药。这些类型的设备包括定量吸入器(MDI)，呼吸致动的MDI，干粉吸入器(DPI)，与MDI结合的垫片/固定腔和雾化器。
对于口服给药，可以通过将所述活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体混合来容易地配制化合物。这样的载体使得本公开的化合物能够被配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，以供待治疗的受试者口服摄取。可以以固体赋形剂的形式获得用于口服的药物制剂，任选地研磨所得混合物，并且如果需要，可以在加入合适的助剂之后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂尤其是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。任选地，口服制剂也可以在盐水或缓冲液中配制以中和内部酸性条件，或者可以在没有任何载体的情况下给药。
可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推合式(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的密封的软胶囊。推合式胶囊可以包含与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁以及任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可以将活性化合物溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油，液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。也可以使用配制用于口服的微球。这样的微球在本领域中已经被很好地定义。所有用于口服给药的制剂都处于适合于这种给药的剂量。
对于口腔给药，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂形式。
对于通过吸入给药，可以使用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他合适的气体，从加压包装或喷雾器中以气雾剂形式方便地递送根据本发明使用的化合物。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。可以配制用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊和药筒，其中含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
当需要全身递送时，可以将这些化合物配制成通过注射，例如通过推注或连续输注进行肠胃外给药。注射用制剂可以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中，并添加防腐剂。该组合物可以采取诸如在油性或水性运载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以包含配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
肠胃外给药的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，可以将活性化合物的悬浮液制备为合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油，或合成脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酸酯，或脂质体。水性注射混悬剂可包含增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可包含合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度的溶液。
或者，活性化合物可以是粉末形式，以便在使用前用合适的载体例如无菌的无热原水一起配制。
化合物也可以配制成直肠或阴道组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规的栓剂基质如可可脂或其他甘油酯。
在一些实施方案中，施用是局部的和/或在要治疗的组织的腔表面处。组合物的“局部”施用是指使组合物与皮肤接触。“腔表面”是指管状器官的内部开放空间或腔，例如血液流经的动脉或静脉的内部中央空间；胃肠道内部；肺中支气管的通路；肾小管和导尿管的内部；女性生殖道的通道，从阴道的单个通道开始，分裂成子宫中的两个腔，这两个腔都继续通过输卵管。
在一些实施方案中，本技术的化合物被局部和/或在靶组织的腔表面施用。这有利于减少所述化合物的潜在全身毒性副作用。
其他传递系统可以包括定时释放，延迟释放或持续释放传递系统。这样的系统可以避免化合物的重复施用，增加了对受试者和医师的便利。许多类型的释放递送系统是可用的，并且是本领域普通技术人员已知的。它们包括聚合物基础体系，例如聚(丙交酯乙交酯)，共聚草酸酯，聚己内酯，聚酯酰胺，聚原酸酯，聚羟基丁酸和聚酸酐。前述含药物的聚合物的微胶囊描述于例如美国专利No.5,075,109。递送系统还包括非聚合物系统，其为：脂质，包括固醇，例如胆固醇，胆固醇酯和脂肪酸，或中性脂肪，例如甘油单酯，甘油二酯和甘油三酸酯；水凝胶释放系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡涂层；使用常规粘合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入物；等等。具体实例包括但不限于：(a)侵蚀系统，其中本公开的试剂以诸如美国专利No.5,235,641中所述的基质形式存在于基质中。美国专利号4,452,775、4,675,189和5,736,152，以及(b)扩散系统，其中活性组分以受控的速率从聚合物中渗透，例如美国专利No.4,235,641所述。3,854,480、5,133,974和5,407,686。另外，可以使用基于泵的硬件输送系统，其中一些适于植入。
VII.向细胞递送核酸的方法
在一些实施方案中，抑制性寡核苷酸(例如，干扰RNA)和/或蛋白质可通过经工程改造以表达该抑制剂寡核苷酸和/或蛋白质的表达载体递送至细胞。表达载体是可以例如通过限制性消化和连接将所需序列插入其中、从而使其可操作地连接至调节序列并且可以表达为RNA转录物的载体。表达载体通常包含插入物，该插入物是蛋白质或抑制性寡核苷酸(例如，shRNA，miRNA或miRNA)的编码序列。载体可进一步包含适用于鉴定已被或尚未被载体转化或转染的细胞的一种或多种标记序列。标记包括例如编码增加或降低对抗生素或其他化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因，编码其活性可通过标准测定检测的酶或荧光蛋白质的基因等。
如本文所用，当编码序列(例如，蛋白质编码序列，miRNA序列，shRNA序列)和调节序列以使得编码序列的表达或转录处于调节序列的影响或控制下的方式共价连接时，它们被称为“可操作地”连接。如果希望将编码序列翻译成功能性蛋白质，则如果诱导在5'调节序列中的启动子导致编码序列的转录并且如果两个DNA序列之间的连接的性质不会(1)导致移码突变的引入；(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应的RNA转录物被翻译成蛋白质，则认为两个DNA序列可操作地连接。因此，如果启动子区能够实现该DNA序列的转录，使得所得的转录本可以翻译成所需的蛋白质或多肽，则该启动子区将可操作地连接编码序列。应当理解，编码序列可以编码miRNA，shRNA或miRNA。
基因表达所需的调控序列的确切性质可能因物种或细胞类型而异，但通常应视需要包括分别涉及转录和翻译起始的5'非转录序列和5'非翻译序列，例如TATA框，加帽序列，CAAT序列等。这样的5'非转录调控序列将包括启动子区域，该启动子区域包括用于可操作地连接的基因的转录控制的启动子序列。调节序列还可根据需要包括增强子序列或上游激活子序列。本公开的载体可以任选地包括5′前导序列或信号序列。
在一些实施方案中，用于递送核酸分子的病毒载体选自腺病毒，腺伴随病毒，包括痘苗病毒和减毒痘病毒的痘病毒，塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)，委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)，逆转录病毒，辛德比斯病毒(Sindbis virus)和Ty病毒样颗粒。已用于递送外源核酸的病毒和病毒样颗粒的例子包括：复制缺陷型腺病毒，修饰的逆转录病毒，非复制性逆转录病毒，复制缺陷的塞姆利基森林病毒，金丝雀痘病毒和高度减毒的痘苗病毒衍生物，非复制型痘苗病毒，复制型痘苗病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，辛德比斯病毒，慢病毒载体和Ty病毒样颗粒。
对于某些应用有用的另一种病毒是腺相关病毒。腺相关病毒能够感染多种细胞类型和物种，并可以被工程化为复制缺陷型。它还具有诸如热和脂质溶剂稳定性，在包括血细胞在内的多种谱系的细胞中高的转导频率以及没有超感染抑制从而允许进行多个系列的转导的优点。腺相关病毒可以以位点特异性方式整合到人类细胞DNA中，从而使插入诱变的可能性和插入基因表达的变异性最小。另外，在没有选择压力的情况下，在组织培养中对野生型腺相关病毒感染进行了100次以上传代，这表明腺相关病毒基因组整合是一个相对稳定的事件。腺相关病毒也可以染色体外的方式起作用。
通常，其他有用的病毒载体是基于非细胞致病性的真核病毒，其中非必需基因已被目的基因取代。非细胞致病性的病毒包括某些逆转录病毒，其生命周期包括将基因组病毒RNA逆转录成DNA，然后将原病毒整合到宿主细胞DNA中。通常，逆转录病毒是复制缺陷的(例如，能够指导所需转录物的合成，但是不能产生感染性颗粒)。这样的遗传改变的逆转录病毒表达载体对于体内基因的高效转导具有广泛用途。Kriegler,M.,“Gene Transfer andExpression,A Laboratory Manual,”W.H.Freeman Co.,New York(1990)和Murry,E.J.Ed.“Methods in Molecular Biology,”vol.7,Humana Press,Inc.,Clifton,New Jersey(1991)中提供了产生复制缺陷型逆转录病毒的标准方案(包括将外源遗传物质掺入质粒，用质粒转染包装细胞系，通过包装细胞系生产重组逆转录病毒，从组织培养基中收集病毒颗粒和用病毒颗粒感染靶细胞)。在一些实施方案中，DUX4的表观遗传调节剂(例如，干扰RNA或基因编辑复合体)通过慢病毒载体被递送至细胞(例如，受试者的细胞)。
取决于核酸分子是在体外还是体内引入宿主，可以采用各种技术将本发明的核酸分子引入细胞。这样的技术包括核酸分子-磷酸钙沉淀的转染，与DEAE缔合的核酸分子的转染，前述病毒(包括感兴趣的核酸分子)的转染或感染，脂质体介导的转染等。其他示例包括：Sigma-Aldrich的N-TERTM纳米转染系统，Polyplus Transfection的用于昆虫细胞的FectoFlyTM，Polysciences，Inc.的聚乙烯亚胺”Max”，Cosmo Bio Co.，Ltd.的独特的非病毒转染工具，Invitrogen的Lipofectamine LTX转染试剂，Stratagene的SatisFectionTM转染试剂，Invitrogen的LipofectamineTM转染试剂，Roche Applied Science的
Figure BDA0002392142680000531
HD转染试剂，Polyplus Transfection的符合GMP要求的in vivo-jetPEITM转染试剂和Novagen的Insect
Figure BDA0002392142680000532
转染试剂。
实验例
通过以下实施例进一步说明本技术，其不应以任何方式解释为限制性的。
实施例1：材料和方法
以下是在随后的实施例中使用的示例性材料和方法的简要描述。
人类细胞系。将第50-79代的T84肠上皮细胞(American Type CultureCollection,Rockville,Maryland)在补充有14mM NaHCO3、15mM Hepes缓冲液(pH 7.5)，40毫克/升青霉素，8毫克/升氨苄青霉素，90毫克/升链霉素和5％热灭活的胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagles培养基和Ham’s的F12营养混合物的混合物中生长。使HCT-8结肠癌细胞(ATCC)和H292肺上皮癌细胞(ATCC CRL 18-48)在具有10％热灭活FBS的RPMI-1640中生长。
沙门氏菌感染HCT-8上皮细胞。HCT-8细胞单层细胞生长并维持在倒置的0.33cm2环支撑的、胶原蛋白涂层的5μm孔聚碳酸酯滤膜上(Costar Corp.，Cambridge，MA)。在含有Ca2+和Mg2+(HBSS+/+)的Hanks缓冲盐溶液中，以100μM丙磺舒缀合物对细胞进行顶端和基底外侧处理，并于37℃孵育1小时。洗涤后，将细胞以375的MOI用肠沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌血清型SL1344菌株顶端感染1小时。充分洗涤后，将嗜中性粒细胞(1x 106)添加到基底外侧表面，并使其迁移穿过单层2小时，并按如下所述进行定量。
生产富集的羟基环氧素A3。将铜绿假单胞菌菌株PA01在LB肉汤中需氧条件下于37℃过夜生长。将培养物在HBSS+/+中洗涤一次，并以6x107个细菌/mL的浓度重新悬浮。将162cm2烧瓶中的H292单层感染1小时，用HBSS洗涤，然后在HBSS+/+中孵育5小时。通过在十八烷基硅烷(C18)柱(Supelco)上的反相色谱法捕获收集的上清液，用水洗涤，并用甲醇洗脱。将样品储存在-20℃，干燥各个实验所需的体积，并根据需要将其重新悬浮在HBSS+/+中。每一批新的富集的HXA3在用于实验之前都经过质量测试，通常以1：4至1：8的浓度使用。
P-gp敲低T84细胞系的生成。从UMass RNAi Core获得了在pLK0.1质粒背景中含有靶向mdr1a基因的shRNA构建体的纯化DNA。构建体如下：B4(克隆ID：TRCN0000059683)，B5(克隆ID：TRCN0000059684)，B6(克隆ID：TRCN0000059685)，B7(克隆ID：TRCN0000059686)，B8(克隆ID：TRCN0000059687)。通过使用Trans-IT-LT1脂质(Mirus Bio)用psPAX2，pMD.2G和pLK0.1质粒构建体转染包装细胞(293T)来生产慢病毒。48小时后，收集慢病毒上清液，与8μg/mL聚凝胺(polybrene)(Sigma-Aldrich)合并，施加到20％铺满单层的T84细胞上。24小时后重复此过程，第二次转染后48小时，用5μg/mL嘌呤霉素选择抗性细胞。一旦获得稳定的转染细胞系，使用抗P-gp单克隆抗体C219(EMD Millipore)通过Western印迹证实P-gp表达的降低。
生产富集的AMEND。T84细胞在162cm2烧瓶中生长为汇合单层，并在37℃，5％CO2的含Mg2+/Ca2+(HBSS+/+)的Hanks缓冲盐溶液中平衡。对于维拉帕米处理细胞，整个孵育过程中均包含40μM盐酸维拉帕米(Sigma)。从30个烧瓶中收集在五个小时的过程中收集的细胞上清液，冻干，重悬于水中，并在N2正压下通过Amicon 1,000-Da截止膜(Millipore)进行超滤。样品在C18
Figure BDA0002392142680000551
SepPak色谱柱上捕获，用水和己烷洗涤，用甲醇洗脱，在N2气中干燥，并保存在-80℃。在用于迁移实验之前，根据需要将样品重悬于HBSS+/+中。为了在DiscoveRx GPCRβ-arrestin活性测定(Fremont,CA)中进行筛选，将样品重悬于PBS中，以提供用于筛选的1000X溶液。
96孔嗜中性粒细胞迁移。所有研究均根据University of MassachusettsMedical School Human Subjects IRB批准进行。如先前所述(Hurley，B.P.等，J.Immunol.173：5712–5720(2004))，通过2％明胶沉淀从酸性柠檬酸葡萄糖抗凝的外周血中纯化外周血嗜中性粒细胞。通过在冷NH4Cl缓冲液中裂解除去红细胞，并用HBSS-/-(不含Ca2+或Mg2+)洗涤嗜中性粒细胞，并将其重悬至终体积5x107/mL。将孔径为3μm的96孔HTSTranswell滤板(Corning)用0.1mg/mL大鼠尾胶原包被，并干燥过夜。将富集的HXA3(见上文)以及1:10稀释的媒介物对照、富集的AMEND(见下文)或纯化的内源性大麻素化合物以指示浓度一起添加到下部孔中。将5x105个嗜中性粒细胞与1:10媒介物或纯化的内源性大麻素一起添加到顶部孔中，将其置于含5％CO2的37℃培养箱中，并使之迁移2小时。除去顶部孔，并用1％Triton-X100裂解反向迁移的嗜中性粒细胞。将柠檬酸钠缓冲液(pH4.2)添加到0.1M，然后将等体积的在0.1M柠檬酸钠中的2,2'-叠氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)添加到样品中。测量了髓过氧化物酶(mpo)活性。通过与标准曲线比较来计算嗜中性粒细胞的当量，并将来自各个实验的数据标准化为100％HXA3迁移。数据是至少三个独立实验的平均值+/-SEM。按照适合实验条件的方式，使用GraphPad Prism进行统计分析；通过单因素方差分析或Mann-Whitney非参数U检验分析数据。
用于迁移分析的纯化化合物。所有化合物均购自Cayman Chemical(Ann Arbor,MI)，并根据制造商的说明书和经验观察，以可溶于PBS的最高浓度重悬，然后按1:10稀释至最终浓度：
花生四烯酰基乙醇酰胺(AEA)，CAS No.94421-68-8，以0.01mg/mL使用。
α-亚麻酰基乙醇酰胺(α-LEA)，CAS编号57086-93-8，以0.005mg/mL使用。
亚油酰基乙醇酰胺(LEA)，CAS编号68171-52-8，以0.0001mg/mL使用。
γ-亚麻酰基乙醇酰胺(γ-LEA)，CAS编号150314-37-7，以0.0001mg/mL使用。
2-花生四烯酰基甘油(2-AG)，CAS编号53847-30-6，以0.01mg/mL使用。
2-亚油酰基甘油(2-LG)，CAS编号3443-82-1，以0.01mg/mL使用。
2-(14,15-环氧二十碳三烯酰基)甘油，CAS编号848667-56-1，以0.005mg/mL使用。
N-花生四烯酰基乙醇酰胺(NAE)，CAS编号94421-69-9，以0.005mg/mL使用。
O-花生四烯酰基乙醇胺(O-AEA)，CAS编号443129-35-9，以0.001mg/mL使用。
Noladin醚(NE)，CAS编号222723-55-9，以0.001mg/mL使用。
12-羟基花生四烯酸(12-HETE)，CAS编号71030-37-0，以0.005mg/mL使用。
20-HETE乙醇酰胺(20-HETE Eth)，CAS编号942069-11-6，以0.005mg/mL使用。
油酰基乙醇酰胺(OEA)，CAS编号111-58-0，以0.01mg/mL使用。
2-棕榈酰甘油(2-PG)，CAS编号23470-00-0，以0.05mg/mL使用。
2-油酰基甘油(2-OG)，CAS编号3443-84-3，以0.002mg/mL使用。
棕榈酰乙醇酰胺(PEA)，CAS编号544-31-0，以0.0000005mg/mL使用。
花生四烯酸，无过氧化物制剂(pfAA)，CAS编号506-32-1，以0.125mg/mL使用。
AMEND的LC/MS分析。将上述用MeOH洗脱的制备物在N2(g)气流中干燥，重新悬浮在MeOH/缓冲液中，并使用Vydac(Hesperia，CA)C18(10um；
Figure BDA0002392142680000571
)半制备柱(10x 250厘米)通过HPLC进行分离。活性AMEND级分通过已用5mM三乙胺乙酸(pH 7.2)平衡的HPLC/质谱法(Genesis C18(4um，
Figure BDA0002392142680000572
)分析性HPLC柱(4.6X 150mm))鉴定，流出液通过FinniganLCQDeca电喷雾质谱仪进行分析。
分析选定的样品以进行高质量准确性测定，并将其溶于含0.2％甲酸的50:50乙腈：H2O中。使用了MAXIS-HD超高分辨率四极杆飞行时间(UHR-ESI-QTOF)质谱仪(BrukerDaltonik GmbH,Bremen,Germany)；将其与注射器驱动器(Hamilton，Bonaduz，瑞士)偶联，并以3μL/min的速度注入样品溶液。
将氮气作为雾化气体，在2bar的压力下施加。干燥气体也是氮气，以8L/min的流速和200℃的温度供应。使用正离子模式，相应的毛细管电压为-4500V。仅获取完整的扫描数据。对于每一批样品，还分析了5mM甲酸钠簇的溶液。它在质量范围75-1000m/z上用作外部数据文件校准剂。在FindFormula工具中使用重新校准的检测质量和同位素模式，以在检测质量的2mDa之内生成潜在理论式子的列表。使用检测到的同位素模式对该列表进行排序。
数据获取和自动处理通过Compass OpenAccess 1.7软件(Bruker DaltonikGmbH,Bremen,Germany)进行控制，数据处理使用DataAnalysis 3.4(Bruker DaltonikGmbH,Bremen,Germany)进行。在每个步骤中，都应通过将样品尽可能保持在冰上和氮气下而尽量避免样品的降解和氧化。通过对质子化和钠化离子的强度求和以补偿由于生物钠水平变化而引起的加合物形成的可能变化，由此进行离子强度的相对定量。
小鼠实验。C57BL/6和cnr2-/-小鼠购自Jackson实验室；FVB wt和mdr1a-/-购自Taconic。在6-12周龄使用雌性小鼠，并且在实验之前将基因型混合2-4周，以平衡微生物群。将小鼠在饮用水中用3％DSS(分子量36,000-50,000，MP Biomedicals)处理7天，然后放回普通水并在第9天处死，这代表疾病高峰。将中段和远端结肠的样品固定在10％福尔马林中，石蜡包埋，切片，并用苏木精和曙红染色以进行组织病理学分析。每个样本从0到3进行半定量分级，符合四个标准：(1)上皮增生的程度和杯状细胞的耗竭程度；(2)固有层中白细胞的浸润；(3)受影响的组织区域；(4)严重炎症标志物例如隐窝脓肿、粘膜下炎症和溃疡的存在。由对样品身份不知情的训练有素的研究人员对样品进行评分，并对中值和远端值取平均值以得出结肠组织病理学评分。
固有层白细胞的分离和流式细胞术。如先前所述(Buonocore等人，2010)制备固有层的细胞悬液。将肠组织切成小块，用含10％FBS和5mM EDTA的RPMI处理以去除上皮细胞，然后与100U/mL VIII型胶原蛋白酶(Sigma-Aldrich)一起孵育两个1小时。然后将细胞施加到不连续的30/40/75％Percoll梯度(GE Healthsciences)，并从40/70％界面收获细胞。用PBS/0.1％BSA洗涤细胞，与抗Fc受体(αCD16/32，eBioscience)孵育，并用Zombie Live/Dead红外染色剂(eBioscience)染色，然后用针对CD45、CD11b、Ly6G、Ly6C或Gr1的抗体进行表面染色。样品在MACSquant Analyzer 10(Miltenyi Bioscience)上运行，并使用Flowjo软件第10版(Treestar)进行分析。
小鼠样品中髓过氧化物酶含量的分析。如所述测定样品的髓过氧化物酶活性(参见例如Pulli，B.等人，PLoS One 8，e67976(2013))。将结肠的组织切片在液氮中冷冻，并保存在-80℃直至使用。将切片置于具有裂解基质D(MP Biomedicals)的十六烷基三甲基溴化铵(HTAB，Sigma)缓冲液中，并用FastPrep-24匀浆器在6级匀浆40s。将样品与ABTS合并，并经8分钟读取荧光。使用Graphpad Prism通过线性回归计算斜率，并将其归一化为单个样品的蛋白质含量，如通过双辛可宁酸测定法(BioRad)所测。为了分析粪便样品，称量粪便含量，并以10μL/mg的比例添加HTAB缓冲液，并直接使用计算出的斜率。
结肠粘膜中HXA3的质谱分析。在其饮用水中给小鼠施用5％DSS，并在第7天处死。收获未处理或DSS处理的小鼠(9只小鼠/组)的近端结肠，并收集三个肠段。用橡皮擦在PBS中刮擦肠道表面来收集粘膜刮擦物，并如先前所述分析HXA3含量(Mumy，K.L.等人，Infect.Immun.76：3614–27(2008))。
实施例2：丙磺舒缀合物的合成
方案1中显示了葡聚糖-丙磺舒缀合物的一般合成的说明性实例。
方案1
Figure BDA0002392142680000601
葡聚糖-丙磺舒缀合物合成的一般说明。葡聚糖1.1是多糖。其平均分子量通常为约1000道尔顿至约1,000,000道尔顿。葡聚糖二醇官能度的氧化产生葡聚糖-二醛1.2。用于氧化的氧化剂包括高碘酸钠和高碘酸钾。水或醇水混合物用作氧化反应的溶剂。葡聚糖-二醛1.2的文献制备方法包括Hicks&Molday,Invest.Opthalmol.26：1002-1013(1985)。
葡聚糖醛1.2易于发生烷基二胺1.3的还原性胺化，产生葡聚糖-烷基二胺1.4。通过在合适的溶剂中在还原剂的存在下使1.2与过量的烷基二胺1.3接触来进行该反应。烷基二胺的实例是己二胺。进行还原性胺化的试剂包括硼氢化钠和氰基硼氢化钠。通常使用的溶剂是水和醇-水的混合物，pH值保持在5.5至8.5之间。取决于反应条件，所得的葡聚糖-烷基胺1.4胺取代水平为约5％至约70％。对于本文所述的方法，采用Hicks&Molday(1985)的方法从葡聚糖制备1.4。
如方案1所示，将葡聚糖-烷基二胺1.4与丙磺舒1.5偶联以产生葡聚糖-丙磺舒缀合物1.6，其中n可以是1至10的任何整数。偶联反应是在葡聚糖-烷基二胺1.4的末端伯胺和丙磺舒的羧酸基1.5之间发生的酰胺键形成反应。。羧酸基团首先被多种试剂活化。活化试剂包括但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)，二异丙基碳二亚胺(DIC)，乙基-(N'，N'-二甲基氨基)丙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)
Figure BDA0002392142680000602
六氟磷酸盐(BOP)，(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基
Figure BDA0002392142680000603
六氟磷酸盐(PyBOP)，(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基
Figure BDA0002392142680000604
六氟磷酸盐(PyAOP)，双(2-氧代-3-氧杂
Figure BDA0002392142680000605
唑烷基)次膦酰氯(BOP-氯化物)，O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲
Figure BDA0002392142680000612
六氟磷酸盐(HBTU)，O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲
Figure BDA0002392142680000613
四氟硼酸盐(TBTU)，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基
Figure BDA0002392142680000614
六氟磷酸盐(HATU)和羰基二咪唑(CDI)。用于进行偶联反应的溶剂包括但不限于二氯甲烷，乙醚，乙酸乙酯，甲苯和四氢呋喃。典型的反应时间为约15分钟至约12小时。反应进程可以通过质子NMR监测。酰胺偶联可导致聚合物胺衍生约5％至约95％。分析表征包括直接测量剩余的游离胺(偶联反应的程度)和通过质子NMR、质谱法或其他合适的分析技术测量丙磺舒偶联产物。
葡聚糖-丙磺舒缀合物的合成：
方案2
Figure BDA0002392142680000611
葡聚糖-丙磺舒缀合物1.3A的制备。将40kDa的葡聚糖-己胺(0.5g，0.263mmolesNH2)溶解在20mL的MES缓冲液中，并添加丙磺舒(112mg，1.5倍摩尔过量)。将pH为6.25的反应混合物在室温下剧烈搅拌以产生澄清溶液。加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC；200mg)，并将反应混合物搅拌15分钟。将反应混合物转移至透析管(15kDa膜)。透析后，通过冻干分离Dx-丙磺舒1.3A，为干燥粉末。丙磺舒缀合物1.3B通过相同的方法使用10-kDa葡聚糖-己胺1.1B制备。
葡聚糖-丙磺舒缀合物的替代合成：
方案3
步骤A
Figure BDA0002392142680000621
步骤B
Figure BDA0002392142680000622
Figure BDA0002392142680000623
葡聚糖-丙磺舒缀合物2.5的制备。将单-Boc己烷二胺2.1(CAS#51857-17-1；1克)和丙磺舒1.2(1.5摩尔当量)溶解在二氯甲烷(15mL)中。加入二环己基碳二亚胺(1.5摩尔当量)，并将反应混合物搅拌3小时。将溶液过滤以除去二环己基脲，并在旋转蒸发仪上除去溶剂。残余物通过硅胶色谱法纯化，得到750mg Boc-酰胺2.2。该化合物通过NMR和质谱分析来表征。
将三氟乙酸(1mL)加入到Boc-酰胺2.2(500mg)的二氯甲烷(10mL)溶液中。将反应混合物搅拌2小时，并在旋转蒸发仪上除去溶剂。将残余物溶解在乙酸乙酯中，并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。有机溶剂经固体硫酸钠干燥，过滤，并使用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯溶剂，得到胺2.3。化合物2.3以定量收率获得，不需要任何进一步纯化。该化合物通过NMR和质谱分析来表征。
将葡聚糖醛2.4(500mg)溶于硼酸钠水溶液(5mL的400mM溶液，pH 8.5)中。加入丙磺舒氨基己基酰胺2.3(5摩尔当量，先前溶解在2mL甲醇中)，然后加入新鲜制备的氰基硼氢化钠水溶液(3M水溶液的10摩尔当量)。将反应混合物在25℃下搅拌4小时。将反应混合物转移至透析袋中，并用水透析24小时(2次换水，每次1L)。将透析袋的内容物转移至玻璃小瓶中，并将溶液冻干以获得聚合物缀合物2.5。该化合物通过NMR和质谱分析来表征。
缩水甘油基葡聚糖-丙磺舒缀合物的合成：
方案4
Figure BDA0002392142680000631
葡聚糖-丙磺舒缀合物的制备3.2。将葡聚糖醛聚合物3.1(500mg)溶解在硼酸钠水溶液(5mL的400mM溶液，pH 8.5)中。加入丙磺舒氨基己基酰胺2.3(5摩尔当量，先前溶解在2mL甲醇中)，然后加入新鲜制备的氰基硼氢化钠水溶液(10摩尔当量的3摩尔水溶液)。将反应混合物在25℃下搅拌4小时。将反应混合物转移至透析袋中，并用水透析24小时(2次换水，每次1L)。将透析袋的内容物转移至玻璃小瓶中，并将溶液冻干以获得聚合物缀合物3.2。该化合物通过NMR和质谱分析来表征。
PEG-丙磺舒缀合物的合成：
方案5
Figure BDA0002392142680000632
葡聚糖-丙磺舒缀合物的制备4.2。在装有搅拌棒的25mL圆底烧瓶中装入0.1M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES缓冲液，pH 6.0)(10mL)和PEG胺4.1(40,000MW 2-臂分支PEG胺；NOFCorporation目录号
Figure BDA0002392142680000633
GL2-400PA；500mg)。加入丙磺舒1.2(3摩尔当量)，并将反应混合物剧烈搅拌直至获得澄清溶液。加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(3摩尔当量)，并将反应混合物搅拌30分钟。将反应混合物转移至透析袋中，并用水透析24小时(2次换水，每次1L)。将透析袋的内容物转移至玻璃小瓶中，并将溶液冻干以获得聚合物缀合物4.2。该化合物通过NMR和质谱分析来表征。
合成其他PEG-丙磺舒缀合物。类似于方案5和方案3，可以使用酰胺偶联或还原性胺化利用PEG的各种衍生物来制备丙磺舒的多种PEG缀合物。这些在以下方案6-19中进行了描述。
方案6
Figure BDA0002392142680000641
分子量：5,000
化学名称：α-氨基丙基-ω-甲氧基，聚氧乙烯
CAS#：116164-53-5
NOF目录编号：SUNBRIGHT MEPA-20H
方案7
Figure BDA0002392142680000642
分子量40,000
化学名称：α-氨基丙基-ω-甲氧基，聚氧乙烯
CAS#：116164-53-5
NOF目录编号：SUNBRIGHT MEPA-40T
方案8
Figure BDA0002392142680000643
分子量5,000
化学名称：α-甲氧基-ω-(3-氧代丙氧基)，聚氧乙烯
CAS#：125061-88-3
NOF目录编号：SUNBRIGHT ME-050AL
方案9
Figure BDA0002392142680000651
分子量40,000
化学名称：α-甲氧基-ω-(3-氧代丙氧基)，聚氧乙烯
CAS#：125061-88-3
NOF目录编号：SUNBRIGHT ME-400AL2
方案10
Figure BDA0002392142680000652
分子量5,000
化学名称：α-氨基丙氧基-ω-(氨基丙氧基)，聚氧乙烯
CAS#：25322-68-3
NANOCS目录编号：PG2-AM-5K
方案11
Figure BDA0002392142680000653
分子量30,000
化学名称：二-(α-氨基丙氧基)-ω-(3-氧代丙氧基)，聚氧乙烯
CAS#：25322-68-3
NOF目录编号：SUNBRIGHT DE-300PA
方案12
Figure BDA0002392142680000661
分子量5000
化学名称：α-氧代proxy-ω-(3-氧代丙氧基)，聚氧乙烯
NANOCS目录编号：PG2-AL-5k
方案13
Figure BDA0002392142680000662
4臂PEG，-((CH2)3-NH2)
分子量：10,000
化学名称：季戊四醇四(氨基丙基)聚氧乙烯
CAS#：804514-67-8
NOF目录编号：SUNBRIGHT HGEO-100PA
方案14
Figure BDA0002392142680000671
8臂PEG，-((CH2)3-NH2)8
分子量：15,000
化学名称：六甘油八(氨基丙基)聚氧乙烯
NOF目录编号：SUNBRIGHT HGEO-150PA
方案15
Figure BDA0002392142680000672
2臂支链PEG，-(CH2)3-NH2
分子量：40,000
化学名称：2,3-双(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-(氨基丙氧基)丙烷
NOF目录编号：SUNBRIGHT GL2-400PA
方案16
Figure BDA0002392142680000681
三臂支链PEG，-(CH2)3-NH2
分子量：50,000
化学名称：2,3-双(甲基聚氧乙烯-氧基)-1[(3-氨基丙基)聚氧乙烯-氧丙基氨基羰基-氧基]丙烷
NOF目录编号：SUNBRIGHT GL3-400PA100U
方案17
Figure BDA0002392142680000682
4臂支链PEG，-(CH2)3-NH2
分子量：40,000
化学名称：2,3-Bis-[2'，3'-二(甲基聚氧乙烯-氧基)-1'-丙基]聚氧乙烯-氧-1-(氨基丙氧基)丙烷
NOF目录编号：SUNBRIGHT GL4-400PA
方案18
Figure BDA0002392142680000691
2臂PEG，-((CH2)2-NH2)2
分子量：40,000
化学名称：1,3-双(2-氨基乙氧基)2,2-双(甲基-聚氧乙烯-氧甲基)丙烷
(氨基丙氧基)丙烷
NOF目录编号：SUNBRIGHT PTE2-400EA
方案19
Figure BDA0002392142680000692
2臂PEG，-((CH2)2-NH2)2
分子量：20,000
化学名称：1,3-双(2-氨基乙氧基)2,2-双(甲基-聚氧乙烯-氧甲基)丙烷
(氨基丙氧基)丙烷
NOF目录编号：SUNBRIGHT PTE2-200EA
制备PEG胺缀合物5.2、6.2、9.2、10.2、12.2、13.2、14.2、15.2、16.2、17.2和18.2的通用程序。在装有搅拌棒的25mL圆底烧瓶中装入0.1M 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES缓冲液，pH6.0)(10mL)和胺聚合物胺(500mg)的水溶液。加入丙磺舒1.2(3摩尔当量)，并将反应混合物剧烈搅拌直至获得澄清溶液。加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(3摩尔当量)，并将反应混合物搅拌30分钟。将反应混合物转移至透析袋中，并用水透析24小时(2次换水，每次1L)。将透析袋的内容物转移到玻璃小瓶中，并将溶液冻干以获得聚合物缀合物。该化合物通过NMR和质谱分析来表征。
制备PEG醛缀合物7.2、8.2和11.2的通用程序。在反应容器中装入聚合物醛(500mg)和硼酸钠水溶液(5mL的400mM溶液，pH8.5)。加入丙磺舒氨基己基酰胺2.3(5摩尔当量，先前溶解在2mL甲醇中)，然后加入新鲜制备的氰基硼氢化钠水溶液(10摩尔当量的3M水溶液)。将反应混合物在25℃下搅拌4小时。将反应混合物转移至透析袋中，并用水透析24小时(2次换水，每次1L)。将透析袋的内容物转移到玻璃小瓶中，并将溶液冻干以获得聚合物结合物。该化合物通过NMR和质谱分析来表征。
实施例3：丙磺舒缀合物减少嗜中性粒细胞向结肠腔的浸润
已显示在肺和肠上皮中多种病原体感染期间MRP/HXA3途径是保守的(Boll，EJ等人，Cell.Microbiol.14：120–32(2012)；Mumy，KL等人，Infect Immun.76：3614–27(2008)；Hurley，BP等人，J.Immunol.173：5712–5720(2004))中，分析了在没有感染的情况下它是否也会引起炎症。
用葡聚糖硫酸钠(DSS)处理小鼠会诱发急性结肠炎症，其特征在于上皮损害和嗜中性粒细胞大量涌流入(Okayasu，I.等人，Gastroenterology 98：694-702(1990))。结肠粘膜刮擦的半定量LC/MS/MS分析表明，DSS处理强烈诱导了HXA3在上皮表面的分泌(图1A)。为了证实这种增加的HXA3会导致疾病，HXA3的分泌通过丙磺舒抑制MRP2来阻断(Pazos，M.等人，J.Immunol.181：8044-52(2008))。丙磺舒通过还原性酰胺化反应化学缀合至高碘酸盐氧化的40kDa葡聚糖。由于附着的葡聚糖的大小，该化合物向肠内的直肠内递送预计将靶向腔内MRP2，而不会达到全身循环。该缀合物在体外沙门氏菌感染测定中具有功能(图5)。通过直肠内施用丙磺舒-葡聚糖缀合物对MRP2/HXA3途径的体内抑制显著降低了由DSS诱导的肠病理学和结肠缩短(图1B-1D)。结肠组织病理学分析显示，用丙磺舒-葡聚糖缀合物处理的小鼠减少了嗜中性粒细胞向结肠腔的浸润(图1D)，这通过粪便样品中髓过氧化物酶的显著减少而证实(图1E)。相反，固有层中嗜中性粒细胞的定量显示与丙磺舒治疗无显著差异(图1F-1I)，表明该治疗主要阻止了跨上皮向腔内的迁移。这些发现与对MRP2/HXA3途径的其他研究一致，表明嗜中性粒细胞的跨上皮迁移可能在加剧炎症病理中起作用。
因此，这些结果表明，本技术的丙磺舒缀合物可用于减少组织中嗜中性粒细胞浸润和治疗炎性疾病如结肠炎症的方法。
实施例4：P-糖蛋白分泌AMEND
收集来自静息T84结肠上皮细胞的上清液，并进行超滤以收集小于1kDa的化合物，然后通过反相液相色谱富集脂质。这些富含脂质的上清液能够在无细胞体外测定中抑制由HXA3刺激的原代人嗜中性粒细胞迁移(图2A)。表现出这种活性的未知化合物被称为”AMEND”，代表调节上皮嗜中性粒细胞话语的活性(Activity Modulating EpithelialNeutrophil Discourse)。为了确认AMEND是由P-糖蛋白(P-gp)特异性分泌的，产生了表达靶向mdr1a的shRNA的稳定的敲低T84细胞系，并通过Western印迹证实了P-gp表达的降低(图6)。来自P-gp缺陷细胞的富集的上清液缺乏AMEND活性，并且不能抑制嗜中性粒细胞迁移(图2B)。用维拉帕米(P-gp抑制剂)处理野生型细胞后，获得了相似的结果。
实施例5：负责嗜中性粒细胞迁移抑制的AMEND组分
为了鉴定负责抑制嗜中性粒细胞迁移的AMEND组分，采用了一种针对靶标的方法来探测受体的活化。在独立于G蛋白亚型的β-arrestin活性的测定中，针对GPCR小组的激动剂和拮抗剂活性筛选了富集的AMEND。与其作为迁移抑制剂的作用一致，AMEND在GPCR上主要表现出拮抗剂活性，包括趋化因子受体(表1)。但是，观察到的最强信号是外周大麻素受体CB2的激动剂活性，支持将AMEND鉴定为一种或多种内源性大麻素。
表1.采用富集的AMEND进行GPCR活性筛选的结果
Figure BDA0002392142680000721
Figure BDA0002392142680000731
关于表1，制备了来自T84细胞的大规模AMEND制剂，并在激动剂和拮抗剂模式下在DiscoveRx GPCRβ-arrestin激活测定中进行了筛选。针对两种模式均显示了活性百分比(％活性)。对于拮抗剂活性，显示了所列激动剂对GPCR活化的抑制百分比。第1-2行和第3-4行显示了GPCR，AMEND对其显示的激动剂活性超过任意阈值10％。第5-7行和第8-17行的GPCR具有负抑制百分比，但在激动剂测定中没有相应的活性。第18-21行包含AMEND对其既显示激动剂又显示拮抗剂活性的GPCR，这可能反映了该混合物的独立成分。第22-46行包含AMEND针对其显示超过10％的任意临界值的拮抗剂活性的GPCR。
为了确认内源性大麻素提供AMEND活性，检查了其对这些酶的敏感性。用FAAH处理富集的AMEND完全消除了AMEND的抑制活性，而用MAGL处理未能降低AMEND抑制HXA3诱导的迁移的能力(图2C)，表明AMEND属于NAE类别。为了证实酶处理的特异性，对迁移抑制的非内源性大麻素脂质脂氧素A4进行了类似的实验，该实验对FAAH或MAGL的失活不敏感(图8)。
示例6：AMEND的表征
通过质谱法进一步缩小AMEND的鉴定范围。从用或不用维拉帕米处理的上皮细胞制备的富集的AMEND制剂进行反相HPLC，显示在不存在维拉帕米的情况下有一个特定峰，其含有潜在的AMEND化合物(图2D)。对照小鼠和P-gp缺陷小鼠的富集的AMEND制剂在正离子模式(LC/MS)下进行电喷雾质谱分析，发现在不存在P-gp的情况下，NAE和MAG类的几种内源性大麻素的含量均降低了(表2)。相对丰度的定性分析显示，与大麻素(AEA)一致的H+和N+加合物质量的峰分布存在显著差异(图2E)。为了确定这些P-gp转运的EC中哪一个表现出实际的AMEND抑制活性，在无细胞迁移测定中测试了纯化的化合物。只有AEA，油酰基乙醇酰胺(OEA)和α-亚麻酸乙醇酰胺(α-LEA)表现出显著的抑制活性，从而将这些NAEs鉴定为推定的AMEND组分(图2F)。
Figure BDA0002392142680000741
Figure BDA0002392142680000751
关于表2，进行了半定量MS分析，以比较来自对照T84细胞的富集的AMEND制剂与具有shRNA介导的P-gp敲低的制剂(B4-mdr1a和B5-mdr1a)。通过与测得的大麻素-d8标准品强度比较，计算出每种化合物的相对丰度；尽管这仅仅对大麻素本身是准确定量的，但它允许比较样品之间其余化合物的相对单位。
实施例7：内源性大麻素途径
尽管人们认为膜蛋白可以跨上皮运输大麻素和2-AG，但对大麻素向细胞内外转运的机制了解甚少。现在已经确定了该转运蛋白的身份为P-gp，然后检查该途径在肠中是否有活性。WT和P-gp缺陷(mdr1a-/-)小鼠结肠的粘膜刮屑富含AMEND，评估它们抑制嗜中性粒细胞迁移的能力。来自WT小鼠的这些离体刮擦物类似于体外AMEND抑制迁移，而来自mdr1a-/-小鼠的刮擦物缺乏抑制活性(图3A)。当用FAAH预处理来自WT小鼠的刮擦物时，它们失去了抑制活性，证实这些样品中含有N-酰基乙醇胺内源性大麻素(NAE EC)(图3B)。
已经证明了P-gp会在体内发生EC的分泌，因此研究了它是否调节肠道中的HXA3功能。与先前的报道一致，除了发生自发性结肠炎之外，缺少P-gp依赖性EC分泌的mdr1a-/-小鼠更容易患DSS结肠炎(图9)。不能响应AMEND的CB2缺陷小鼠(cnr2-/-)类似地表现出对DSS诱导的结肠炎的敏感性增加(图4A-4C)。特别地，它们显示出嗜中性粒细胞迁移到肠腔中的急剧增加(图4C，4D)，而组织中的嗜中性粒细胞积累在很大程度上不受影响(图4E-4H)。这些平行实验证实，在缺乏功能性P-gp/AMEND途径的情况下，肠内稳态受到干扰，小鼠更容易迅速启动炎性疾病。正如在DSS结肠炎中使用丙磺舒阻止了正常的嗜中性粒细胞的反向迁移(transmigration)一样(图1)，跨上皮的迁移特别引起明显的组织损伤，从而导致了疾病病理。
实施例8：肺炎链球菌感染期间MRP表达模式的调查
为了研究肺炎链球菌感染期间的炎症反应，使用人类粘液表皮样肺癌细胞株NCI-H292(本文标识为“H292”)(II型肺泡上皮细胞类型)的极化单层建立了PMN迁移的体外模型。考虑到外排转运蛋白在宿主防御中的作用日益受到重视，该模型用于进一步检查MRP的表达谱，目的是分析肺炎链球菌感染过程中mRNA或蛋白质表达不同的基因。提取mRNA，通过RT-PCR定量MRPs 1、2、3、5和MDR1(编码P-糖蛋白P-gp的基因)的表达水平，发现在感染肺炎链球菌期间MRP1适度降低，而MRP2和MRP5的表达均略有增加。然而，这些变化均无统计学意义(图21B)。另外，在基线或肺炎球菌感染期间没有可检测到的MDR1表达。另外，经由蛋白质印迹分析细胞裂解物的蛋白表达显示在肺炎球菌感染期间MRP1类似的降低(图21A)。MRP2的总细胞含量略有下降，而MRP4和MRP5的总细胞含量略有增加，尽管这些变化没有统计学显著性。像RT-PCR数据一样，也无法通过Western blot检测MRP3和P-gp。因此，据推测，这些蛋白质在所检查的条件下不会在H292细胞中表达或是无法测量的，这与先前在基础状态下测量这些转运蛋白的研究相一致。
实施例9：MRP1和MRP2在肺炎链球菌感染期间显示不同的表达模式
尽管在全细胞mRNA和蛋白质中观察到了一些显著变化，但是有充分的证据证明MRP经历了翻译后修饰，可能影响整体细胞定位。外排蛋白的亚细胞定位至关重要，因为MRP的主要活性是将有效载荷从细胞内空间外排到细胞外环境。除非蛋白质本身已定向使其配体外排到细胞外空间，否则这种泵的活性可能是无用的。因此，检查了肺炎球菌感染是否可以引起翻译后修饰或亚细胞定位。为了检验这种可能性，在感染肺炎链球菌或用汉克斯平衡盐溶液进行的未感染处理后，选择性极化生物素化极化细胞单层的顶表面。由于该方法可以识别蛋白表达的变化，特别是响应肺炎球菌感染的顶部表面的蛋白表达变化，因此，调查在不存在和存在肺炎球菌感染的情况下顶部表达的MRP。将顶表面选择性地标记为一种手段，以专注于可能将免疫调节剂外排到感染的腔空间中的那些转运蛋白。
考虑到在肺炎球菌感染期间，MRP1、-2和-5的表达被修饰(图21A-B)，检查了这些转运蛋白。如图16所示，在肺炎球菌感染后，检测到顶表面MRP1显著降低，而MRP2的顶表面表达显著增加。这样的结果与mRNA表达数据(以及蛋白表达数据与MRP1；图21A-B)一致。然而，表面表达的MRP4和MRP5仅有名义上的变化，并且与对于MRP1和MRP2观察到的变化相比，这些变化是微不足道的(图16)。还通过免疫细胞化学证实了肺炎球菌感染导致MRP1表达减少和MRP2表达交互性增加(图17B)。通过免疫荧光未观察到MRP4表面表达发生变化，MRP5表面表达极低，这似乎证实了大部分肺MRP5保留在细胞内的发现。根据生物素化和免疫荧光数据，努力集中在检查MRP 1和2，它们在肺炎链球菌感染期间可检测，定位于细胞表面并调节。
为了检查此类体外观察结果是否与体内MRP定位变化相关，将C57BL/6小鼠感染了2.5x105CFU的肺炎链球菌或用PBS模拟处理。感染后第二天，在首先注意到症状后，处死小鼠。然后，切除肺并切片，并对MRP1和MRP2进行免疫组织化学。与体外发现相似，肺炎球菌感染降低了MRP1蛋白的表达，并交互性地提高了MRP2的表达(图18)。
实施例10：MRP1和MRP2对嗜中性粒细胞反向迁移的影响
根据这些观察结果，推测由于MRP1的表达在基础状态下较高，而在感染过程中较低，因此该转运蛋白可能在稳态期间建立免疫抑制基调中起作用，而在感染过程中增加的MRP2可能在促炎能力方面起作用。为了检验该假设，分析了感染情况下转运蛋白动力学的功能后果。在上皮发炎的状态中，ABC外排转运蛋白MRP2的表达上调，并且与12/15-LOX途径相关，其被认为是最大程度地诱导这种MRP2上调所需要的。以前有人观察到在肺炎球菌感染期间PMN迁移到肺气道中需要产生脂质趋化因子羟基环氧素A3，这是一种通过12-脂氧合酶(LOX)在肺上皮细胞中的作用而衍生自花生四烯酸的类花生酸。由于还显示出MRP2是HXA3的外排转运蛋白，因此分析了MRP2的药理学抑制作用在肺炎球菌感染过程中也阻止PMN跨上皮迁移的程度。
肺炎链球菌可诱导PMN跨模型肺上皮细胞的跨上皮迁移，其中利用了完善的体外模型系统。简而言之，将H292细胞接种在可渗透的载体上以形成屏障，从而模拟体内结构。然后将新鲜分离的人嗜中性粒细胞施加到转运孔的基底外侧腔中，使嗜中性粒细胞响应于上皮释放的化学引诱剂而横穿上皮层。为了检查MRP如何影响PMN迁移，在感染前将H292极化的单层膜暴露于MRP2抑制剂丙磺舒(请参阅“方法”)，并测试了这种处理是否抑制PMN而迁移。不出所料，经丙磺舒处理的样品中迁移的嗜中性粒细胞数明显少于模拟处理的对照样品，这表明在这种公认的嗜中性粒细胞反向迁移模型中，通过MRP2活性介导的某些促迁移作用。
检查了丙磺舒阻碍MRP2功能的条件下的肺炎链球菌感染。C57BL/6小鼠通过气管感染了1x105至3x105个细菌，导致大叶性肺炎并发展为菌血症和败血症，此后小鼠屈服于感染。丙磺舒在感染前3小时作为引发剂递送，并且在感染后3小时再次递送。
在感染后第1天，来自经丙磺舒治疗的小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF)的嗜中性粒细胞比PBS治疗的小鼠少35％(图19B)。丙磺舒治疗导致在D1上发生菌血症的病例减少，而那些确实发生菌血症的病例与PBS治疗的小鼠相比在血液中的CFU降低了约10倍(图19C)。尽管BALF中PMN减少，但未观察到小鼠肺中其他粒细胞减少(图19D)，从而得出结论，丙磺舒作用似乎是嗜中性粒细胞特异性的。感染后48，这种趋势继续在经丙磺舒处理的小鼠中导致菌血症减少10倍(图19C)，尽管这些不再具有统计学显著性。尽管侵入循环的细菌数量有所减少，但感染后48小时肺中的细菌数量是相同的。因此，MRP2抑制有效地限制了感染后24小时嗜中性粒细胞对肺的浸润，这对应于感染后48小时持续的菌血症减少。
为了更深入地阐明MRP1或MRP2活性如何影响炎症，生成了组成型表达的shRNAH292细胞系，该细胞系可敲低MRP1或MRP2的表达(MRP敲低)。与MRP1参与抗炎级联反应的假设相一致，发现感染了肺炎链球菌的MRP1缺陷型细胞与感染了肺炎链球菌的混杂对照细胞相比诱导了更多的PMN跨上皮迁移。另外，类似于丙磺舒的结果(图19A)，与对照细胞相比，MRP2敲低细胞也不能支持PMN经上皮迁移。这表明上皮来源的MRP1活性抑制了PMN跨上皮的迁移，而MRP2的表达和活性对于肺炎球菌感染期间嗜中性粒细胞跨上皮的反向迁移是必需的。
由于这些结果表明MRP1排出具有免疫抑制作用的底物，而MRP2分泌具有促炎作用的底物，因此尝试通过从感染的极化H292细胞单层的顶端上清液中分离生物活性脂质来概括这一结果(图20A)。先前的研究表明，在肠道细菌感染过程中MRP2外排HXA3，PMN跨上皮迁移绝对依赖于HXA3的产生。对于这些研究，收集上清液中的脂质提取物，并使用装有1,000Da截止膜的Am icon仪器(Millipore)进行超滤。使用C18Backerbond萃取柱可去除盐分并富集脂质。从混杂对照或MRP2敲低的细胞中分离出脂质提取物，并将其应用于幼稚的H292细胞的顶腔。如图20B所示，与混杂对照相比，来自MRP2敲低细胞(MRP2KD)的富集的脂质显示出减少的PMN迁移，这暗示MRP2外排促炎性刺激，最有可能是HXA3。
使用类似的策略，将Hank’s缓冲液应用于混杂对照细胞或MRP1敲低细胞的顶端表面，以产生条件培养基。然后将促炎性脂质如图20C所示重悬于未条件化培养基，来自含有MRP1的混杂对照的条件培养基或来自MRP1缺陷细胞的条件培养基。将脂质提取物暴露于未条件化培养基可促进最大量的PMN迁移。但是，以来自具有完整MRP1的细胞的培养基条件化的混杂对照细胞显示PMN迁移显著减少(包含免疫抑制剂)，而以MRP1基因敲除细胞(缺少免疫抑制剂)条件化的培养基未能减少PMN迁移，并显示了PMN迁移水平与未条件化上清液一致。因此，通过抑制该抑制剂在MRP1缺陷细胞中的分泌，消除了抑制作用，并导致嗜中性粒细胞迁移增加。我们将此免疫抑制剂称为L-AMEND(肺活性调节上皮-嗜中性粒细胞话语，Lung-Activity Modulating Epithelial-Neutrophil Discourse)。总的来说，这些结果为MRP1/L-AMEND途径提供了证据，该途径起到抑制(负平衡)MRP2/HXA3途径激发肺炎链球菌触发的PMN反向迁移的能力。
使用嗜中性粒细胞(PMN)迁移的体外模型，我们检查了MRP2抑制的结果。将NIH-H292细胞与100μM的MRP2抑制剂丙磺舒(水平条纹)孵育，或在感染前用PBS(黑色)模拟处理。然后洗涤对照和经丙磺舒处理的细胞，并用10MOI的肺炎链球菌感染。将嗜中性粒细胞置于膜构建体的基底外侧腔中，并使其在感染后迁移。用改良的髓过氧化物酶测定法针对标准数量的嗜中性粒细胞对已经到达顶端腔的嗜中性粒细胞进行定量。图20D中所示的是代表性数据集，该数据集已经重复了至少3次。与模拟处理的细胞相比，丙磺舒预处理有效地减少了从基底外侧到顶腔穿过上皮细胞层和生长膜转移的嗜中性粒细胞的数量。未感染的细胞以白色表示，标记为“缓冲液”。使用未配对的T检验执行统计学分析。这些结果表明，丙磺舒对MRP2的抑制作用降低了嗜中性粒细胞的迁移。
实施例11：本技术化合物对嗜中性粒细胞迁移的抑制
该实施例将证明本技术的化合物在体外抑制嗜中性粒细胞迁移的功效。
如先前所述，通过2％明胶沉淀从酸性柠檬酸葡萄糖抗凝外周血中纯化外周血嗜中性粒细胞(Hurley，B.P.等人，J。Immunol.173：5712–5720(2004))。通过在冷NH4Cl缓冲液中裂解除去红细胞，并用HBSS-/-(不含Ca2+或Mg2+)洗涤嗜中性粒细胞，并重悬至终体积5x107/mL。将孔径为3μm的96孔HTS Transwell滤板(Corning)用0.1mg/mL大鼠尾胶原包被，并干燥过夜。将富集的HXA3(参见上文)与媒介物对照液或本技术化合物的1:10稀释液以预定浓度一起添加到下部孔中。将5x105个嗜中性粒细胞与1:10媒介物或纯化的内源性大麻素一起添加到顶部孔中，将其置于37℃的5％CO2培养箱中，并使其迁移2小时。取下顶部孔，并用1％Triton-X100裂解反向迁移的嗜中性粒细胞。将柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2)添加到0.1M，并将0.1M柠檬酸钠的2,2'-叠氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)等体积添加到样品中。测量髓过氧化物酶(mpo)活性。通过与标准曲线比较来计算嗜中性粒细胞的当量值，并将来自各个实验的数据标准化为100％HXA3迁移。数据是至少三个独立实验的平均值+/-SEM。使用GraphPad Prism进行统计分析；根据实验条件，通过单向方差分析或曼惠特尼非参数U检验分析数据。
预期本技术的化合物在体外抑制嗜中性粒细胞迁移方面将显示出高度的效力，例如实施例3，图1D-1E所示。这些结果将证明，当前技术的化合物可用于抑制嗜中性粒细胞迁移的方法，例如用于预防或治疗由嗜中性粒细胞迁移引起或其他方面与之相关的疾病或病症。
实施例12：本技术化合物用于预防和治疗结肠炎
该实施例证明了本技术化合物在动物模型和人类受试者中预防和治疗结肠炎的用途。
动物模型
适用于该实施例的动物模型包括但不限于患有结肠炎的动物，例如本文所述的那些。本领域技术人员将理解，以下描述是说明性的，并且可以适当地应用于其他动物模型。
总述。C57BL/6和cnr2-/-小鼠将从杰克逊实验室购买；FVB wt和mdr1a-/-将从Taconic购买。在6-12周龄使用雌性小鼠，并且在实验之前将各基因型混合2-4周，以平衡微生物群。将小鼠在饮用水中用3％DSS(分子量36,000-50,000，MP Biomedicals)处理7天，然后放回普通水并在第9天处死，这代表疾病高峰。将中段和远端结肠的样品固定在10％福尔马林中，石蜡包埋，切片并染色，以用苏木精和曙红进行组织病理学分析。根据四个标准，每个样本从0到3进行半定量分级：(1)上皮增生的程度和杯状细胞的耗竭程度；(2)固有层中白细胞浸润；(3)受影响的组织区域；(4)严重炎症标志物的存在，例如隐窝脓肿，粘膜下炎症和溃疡。由对样品身份不知情的训练有素的研究人员对样品进行评分，对中值和远端值取平均值以给出结肠组织病理学评分。
根据本文所述的方法，例如通过直肠内施用，向受试者施用本技术的化合物。在一些实施方案中，化合物每天一次、每周一次或每月一次给药。在一些实施方案中，化合物每天多次、每周多次或每月多次给药。对照受试者单独施用媒介物。
固有层白细胞的分离和流式细胞术。如先前所述(Buonocore等人，2010)制备固有层的细胞悬液。将肠组织切成小块，用含10％FBS和5mM EDTA的RPMI处理以去除上皮细胞，然后与100U/mL VIII型胶原酶(Sigma-Aldrich)一起孵育两个1小时。然后将细胞应用于不连续的30/40/75％Percoll梯度(GE Healthsciences)，并从40/70％界面收获细胞。用PBS/0.1％BSA洗涤细胞，与抗Fc受体(αCD16/32，eBioscience)孵育，并用Zombie Live/Dead红外染色剂(eBioscience)染色，然后用针对CD45、CD11b、Ly6G和Ly6C或Gr1的抗体染色表面。样品在MACSquant Analyzer 10(Miltenyi Bioscience)上运行，并使用Flowjo软件第10版(Treestar)进行分析。
小鼠样品中髓过氧化物酶含量的分析。如所述测定样品的髓过氧化物酶活性。结肠的组织切片在N2液体中冷冻并保存在-80℃直至使用。将切片置于具有裂解基质D(MPBiomedicals)的十六烷基三甲基溴化铵(HTAB，Sigma)缓冲液中，并用FastPrep-24匀浆器在6级匀浆40s。将样品与ABTS合并，并经8分钟读取荧光。使用Graphpad Prism通过线性回归计算得出斜率，并标准化为单个样品的蛋白质含量(通过双辛可宁酸测定法(BioRad)进行测量)。为了分析粪便样品，称量粪便含量，并以10μL/mg的比例添加HTAB缓冲液，并直接使用计算出的斜率。
结肠粘膜中HXA3的质谱分析。在其饮用水中向小鼠施用5％DSS，并在第7天处死。收获来自未治疗或DSS治疗的小鼠(9只小鼠/组)的近端结肠，并收集三个肠段。用橡皮擦(policeman)在PBS中刮擦肠道表面来收集粘膜刮擦物，并如先前所述分析HXA3的含量(Mumy，K.L.等，Infect.Immun.76：3614-3627(2008)。
结果。预计与对照动物相比，直肠内施用本技术的化合物将显著减少由DSS诱导的肠道病理和结肠缩短。结肠组织病理学分析将显示，用该化合物处理的小鼠的嗜中性粒细胞向结肠腔中的浸润减少，这可通过粪便样本中的髓过氧化物酶显著减少来证实。
因此，这些结果表明，本技术的化合物可用于减少体内嗜中性粒细胞浸润的方法中，例如用于预防和治疗与嗜中性粒细胞迁移相关的炎性病症，例如结肠炎。
人类受试者
使用本领域已知和接受的选择标准招募被诊断为患有或怀疑患有结肠炎或相关疾病并且当前表现出结肠炎或相关疾病的一种或多种症状和/或病理的人类受试者。
预防和治疗方法：以与疾病的阶段和严重程度相称的剂量和频率向受试者施用本技术的化合物。在一些实施方案中，化合物每天一次，每周一次或每月一次给药。在一些实施方案中，化合物每天，每周或每月多次给药。
为了证明人类中的预防和治疗方法，在结肠炎或相关病症的症状和/或病理发展之前或之后向受试者施用本技术的化合物，并使用本领域已知方法评估其症状/病理学的逆转或预期症状/症状的减轻。
结果：预期本技术的化合物将诱导人类受试者中结肠炎和相关病症的症状和/或病理学的逆转。这些结果将表明，本技术的化合物对于预防和治疗此类疾病是有用和有效的。
实施例13：本技术的化合物用于预防和治疗囊性纤维化
该实施例证明了本技术化合物在动物模型和人类受试者中预防和治疗囊性纤维化的用途。
动物模型
适用于本实施例的动物模型包括本领域已知的囊性纤维化动物模型，包括但不限于具有囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)突变的鼠，猪和雪貂模型。本领域技术人员将理解，以下描述是说明性的，并且可以适当地应用于其他动物模型。
在129/FVB远交背景中ΔF508突变纯合的年轻成年雌性CF小鼠及其野生型同窝仔被关在静态隔离笼中。为了预防肠梗阻，将CF小鼠断奶至流食(
Figure BDA0002392142680000841
NestléClinical Nutrition,France)。每天更换Peptamen。非CF小鼠接受标准饮食喂养(PavanService-Carfil，Oud-Tournhout,Belgium)，每周更换一次，对笼子进行消毒并配备新鲜的窝具。随意提供软化和酸化的水。使用尾夹DNA的Taqman定量PCR多重分析(Taqman，ABI
Figure BDA0002392142680000842
7700Sequence Detection System，Applied Biosystems，Foster，CA，USA)，在21天大时检查每只动物的基因型。使用Primer Express软件(Applied Biosystems,FosterCity,CA,USA)为等位基因特异性PCR设计的引物和小沟结合剂(MGB)探针如下：
正向引物＝5'-TTTCTTGGATTATGCCGGGTA-3'；
反向引物＝5'-GTTGGCAAGCTTTGACAACACT-3'；
野生型特异性探针＝5'-FAM-AAACACCAAAGATGATATT-MGB-3'；
突变体特异性探针＝5'-VIC-AACACCAATAATATTTTC-MGB-3'。
诱发肺部炎症。作为预防方法，将性别和体重匹配的CF和正常纯合野生型小鼠(10至14周龄)通过每天一次吸入气雾剂4周，用本技术化合物进行预处理。对照受试者单独施用媒介物。急性肺部炎症是通过使用喉镜和细移液管吸头经口向气管内滴入10μg/20g体重的LPS(Sigma Chemical,St.Louis,MO,USA)的50μl盐水诱导的。当施用LPS时，停止施用本技术的化合物。
对于治疗方法，如上所述，在不进行预处理的情况下，将LPS给予性别和体重匹配的CF和正常纯合野生型小鼠。确认肺部炎症后，根据本文所述的方法向受试者施用本技术的化合物。对照受试者单独施用媒介物。使用本文所述或本领域已知的方法在治疗方案完成时评估肺部炎症的参数。
支气管肺泡灌洗(BAL)。在LPS滴注后的选定时间点，通过腹膜内注射20mg戊巴比妥钠(Abbott，Chicago，IL，USA)处死小鼠。如上所述，通过向气管插管并用1ml无菌盐水灌洗来进行BAL。将BAL液(BALF)离心(250×g，10分钟，4℃)，将上清液等分并保存在-20℃进行进一步的生化测量。使用DiffQuick染色(Dade，布鲁塞尔，比利时)对细胞离心制备物进行差异细胞计数。
髓过氧化物酶(MPO)活性。进行BAL后，通过右心室对肺灌注盐水并切除肺。如前所述，在10分钟内于490nm处评估肺匀浆物中的MPO活性。
乳酸脱氢酶(LDH)。使用本领域已知的方法通过分光光度法评估BALF样品中的LDH活性。
细胞因子测定。在BALF中使用标准夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)按照相应制造商的规程测量小鼠巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-2(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)，肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-10(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA)的浓度进行。
组织病理学。切除未灌洗的全肺，并通过气管在4％缓冲的多聚甲醛中固定充气，并以5μm的厚度处理以进行光学显微镜检查。载玻片用苏木精和曙红或Masson三色染料染色。
细菌学。将BALF样品接种到含有5％羊血(一种多价非选择性培养基)的哥伦比亚琼脂培养基上。Sabouraud琼脂(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)和MacConkey培养基分别用于选择酵母和真菌以及革兰氏阴性细菌。将板置于35℃的传统培养箱中至少24小时。所有测试均重复进行。
统计。结果表示为平均值±SEM。使用SAS-JMP软件(SAS Institute,Cary,NC,USA)分析统计数据。组间比较使用单向方差分析进行评估。适当时，事后比较是根据Student’st检验或Tukey-Kramer HSD检验进行的。零假设在p<0.05时被拒绝。在确定了正态分布变量的均值没有不同(t检验)并且总体方差是同质的(Snedecor's F检验)之后，根据Benferroni校正，对来自不同实验的合并数据进行调整，从而调整alpha水平。
结果。预计施用本技术的化合物将对肺炎囊性纤维化动物模型的治疗和预防有效。这些结果将表明，本技术的化合物可用于治疗囊性纤维化和治疗/预防与该疾病相关的肺部炎症的方法。
人类受试者
使用本领域已知和接受的选择标准招募被诊断为患有或怀疑患有囊性纤维化并且目前显示出囊性纤维化的一种或多种症状和/或病理学的人类受试者。
预防和治疗方法。以与疾病的阶段和严重性相称的剂量和频率向受试者施用本技术的化合物。在一些实施方案中，化合物每天一次、每周一次或每月一次给药。在一些实施方案中，化合物每天、每周或每月多次给药。
为了证明在人类中的预防和治疗方法，在出现囊性纤维化的症状和/或病理学之前或之后向受试者施用本技术的化合物，并使用本领域已知的方法评估症状/病理学的逆转或预期症状/病理学的减轻。例如，在发生与囊性纤维化相关的肺部炎症之前或之后，向受试者施用本技术的化合物。然后使用本领域已知的方法对受试者进行肺部炎症预防、逆转或减轻的评估。
结果。预期本技术的化合物将诱导人类受试者中囊性纤维化例如肺部炎症的症状和/或病理学的逆转。这些结果将表明，本技术的化合物对于预防和治疗囊性纤维化和与囊性纤维化相关的肺部炎症是有用和有效的。
实施例14：本技术的化合物用于预防和治疗嗜中性粒细胞介导的皮肤病
该实施例证明本技术化合物在动物模型和人类受试者中预防和治疗嗜中性粒细胞介导的皮肤疾病例如皮炎(湿疹)、酒渣鼻、脂溢性皮炎和牛皮癣的用途。本领域技术人员将理解，以下与牛皮癣有关的实施例举例说明了嗜中性粒细胞介导的皮肤疾病，其方法通常适用于任何嗜中性粒细胞介导的皮肤疾病。
动物模型
适用于该实例的动物模型包括任何公认的牛皮癣模型，包括但不限于具有自发突变的模型，基因工程动物，免疫学模型和药理学模型。自发突变模型包括但不限于：asebia(Scd1ab/Scd1ab)，慢性增生性皮炎(Sharpincpdm/Sharpincpdm)，片状皮肤(Ttc7fsn/Ttc7fsn)突变的纯合小鼠。基因工程模型包括异位表达关键调控分子或缺乏关键调控分子的动物，如本领域已知的。免疫模型包括经受过继转移或本领域已知的相关方法的动物受试者。药理模型包括向受试者施用诱导牛皮癣或牛皮癣相关病症的药剂。例如，受试者局部施用咪喹莫特(IMQ)，toll样受体(TLR)-7和TLR-8激动剂。
本领域技术人员将理解，以下描述是说明性的，并且可以适当地应用于其他动物模型。
材料。咪喹莫特(IMQ，5％乳膏，
Figure BDA0002392142680000871
)购自Mochida Pharmaceutical(日本东京)。丙酸倍他米松丁酸丙酸酯(0.05％软膏，
Figure BDA0002392142680000881
)购自Torii Phar maceutical(日本东京)。实时PCR探针和相关试剂购自Applied Biosystems(美国马萨诸塞州)。
动物。将7-12周大的雌性BALB/c小鼠和雄性CB-17scid小鼠置于无病原体的特定条件下，室温为23±3℃，空气湿度为55±15％，光照时间为12小时亮/暗周期环境，并随意提供食物和水。
诱发皮肤发炎。每天一次将IMQ 5％乳霜涂在左耳皮肤的内侧和/或外侧。IMQ的剂量为耳朵外侧250ug，外侧500ug，或者在耳朵内侧和外侧均为250ug。倍他米松软膏或相关软膏基质每天两次涂在左耳上，内侧和/或外侧的用量均为5uL。每天使用IMQ之前，使用测厚仪(IDA-112M,Mitutoyo,Kawasaki,Japan)测量左耳的厚度，作为皮肤炎症的定量指标。对照受试者单独施用媒介物。
对于预防方法，在IMQ暴露之前，通过局部应用本技术的化合物对受试者进行预处理预定时间。
对于治疗方法，在使用本领域已知的方法确认IMQ诱导的炎症后，向受试者局部施用本技术的化合物进行预定时期。
用二氧化碳气体使受试者安乐死，并在检查红斑和鳞屑的总体形态后收获左耳。将一部分收获的组织切片，用缓冲的10％福尔马林溶液固定，并进行处理以制备组织学石蜡切片。切片用苏木精和曙红染色，并进行光学显微镜检查。其余组织储存在-80℃下用于通过实时PCR进行mRNA分析。
实时PCR分析。按照制造商的说明，使用
Figure BDA0002392142680000882
脂质组织迷你试剂盒(QIAGEN，Venlo,the Netherlands)获得耳组织中的总RNA样品。使用RNA-to-CtTM1-Step试剂盒通过TaqMan基因表达测定法测量本研究中编码目标细胞因子的转录本的水平。
示例性靶标包括但不限于IFN-γ，IL-13，IL-17，IL-22，IL-23，TNF-α和IL-1β。将靶转录物水平标准化为GAPDH转录物水平。
统计分析。耳朵厚度的值显示为与第1天测得的预处理值相比的增加，并表示为平均值±标准差(S.D.)。统计显著性通过F检验，然后进行Aspin-Welch t检验和Bartlett检验，再进行Dunnett检验或Steel检验分析耳厚度的统计学显著性，然后通过Bartlett检验、再进行Tukey检验或Steel-Dwass检验分析mRNA转录水平的统计学显著性。小于0.05的p值被认为具有统计学意义。
结果。据预测，如通过组织厚度，炎性基因表达和皮肤嗜中性粒细胞浸润所测量的，施用本技术的化合物将预防或减少IMQ诱导的炎症。这些结果将表明，本技术的化合物可用于预防和治疗与炎症和皮肤嗜中性粒细胞浸润有关的病症，包括但不限于皮炎(湿疹)、酒渣鼻、脂溢性皮炎和牛皮癣。
人类受试者
通过利用本领域已知和接受的标准选择招募被诊断患有或怀疑患有嗜中性粒细胞介导的皮肤病例如皮炎(湿疹)、酒渣鼻、脂溢性皮炎或牛皮癣并且目前表现出该病症的一种或多种症状和/或病理学的人类受试者。
预防和治疗方法。以与疾病的阶段和严重性相称的剂量和频率向受试者施用本技术的化合物。在一些实施方案中，化合物每天一次、每周一次或每月一次给药。在一些实施方案中，化合物每天、每周或每月多次给药。
为了证明人类中的预防和治疗方法，在嗜中性粒细胞介导的皮肤病的症状和/或病理学发展之前或之后向受试者施用本技术的化合物，并使用本领域已知的方法评估其症状/病理学的逆转或者预期症状的减轻。例如，在嗜中性粒细胞介导的皮肤疾病或其症状发生之前或之后，向受试者施用本技术的化合物。然后使用本领域已知的方法评估受试者中该疾病或症状的预防、逆转或减轻。
结果。预期本技术的化合物将诱导嗜中性粒细胞介导的皮肤疾病，例如皮炎(湿疹)，酒渣鼻，脂溢性皮炎和牛皮癣的症状和/或病理学的逆转。这些结果将表明，本技术的化合物对于预防和治疗人类受试者中嗜中性粒细胞介导的皮肤疾病是有用和有效的。
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出于所有目的，以上说明书中提到的每个出版物和专利均通过引用整体并入本文。在不脱离本技术的范围和精神的情况下，本技术的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定实施例描述了本技术，但是所要求保护的本技术不应不适当地限制于这样的特定实施例。实际上，对于本领域技术人员及其相关领域的技术人员来说显而易见的是，用于实施本技术的所描述的模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。
等价物
本技术不受本申请中描述的特定实施例的限制，这些特定实施例旨在作为本技术的各个方面的单个说明。如本领域技术人员将显而易见的，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本技术进行许多修改和变化。除了本文列举的方法和装置之外，根据前述说明，本领域技术人员可以想到功能上等效的方法和装置。这样的修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。本技术仅由所附权利要求书以及这些权利要求书所赋予的等效物的全部范围来限制。应当理解，本技术不限于特定的方法、试剂、组合物或生物系统，它们当然可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而无意于进行限制。

Claims (51)

1.一种用于在有此需要的哺乳动物受试者的靶组织中治疗嗜中性粒细胞介导的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和羟基环氧素A3(HXA3)合酶中一种或多种的一种或多种第一化合物，其中治疗量的第一化合物可减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的能增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的一种或多种第二化合物，其中所述治疗量的所述第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的增加多药抗性蛋白1(MRP1)的一种或多种第三化合物，其中所述治疗量的第三化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的增加多药抗性蛋白1(MRP1)的一种或多种第二化合物，其中所述治疗量的第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用步骤选自局部施用和在所述靶组织的腔表面处施用。
6.根据权利要求1所述的方法，其中减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移的第一化合物被缀合至聚合物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述炎症是非感染性炎症。
8.一种用于在有此需要的哺乳动物受试者的靶组织中治疗嗜中性粒细胞介导的炎症的方法，其中包括向所述受试者施用治疗有效量的增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的一种或多种第一化合物，其中所述治疗量的第一化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用治疗有效量的抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和HXA3合酶中一种或多种的一种或多种第二化合物，其中所述治疗量的第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的增加多药抗性蛋白1(MRP1)的一种或多种第三化合物，其中所述治疗量的第三化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
11.根据权利要求8所述的方法，其中增加一种或多种NAE的所述一种或多种第一化合物是大麻素受体2型(CB2)激动剂。
12.根据权利要求8所述的方法，其中减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移的第一化合物与聚合物缀合。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的增加多药抗性蛋白1(MRP1)的一种或多种第二化合物，其中所述治疗量的第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
14.一种用于在有此需要的哺乳动物受试者的靶组织中治疗嗜中性粒细胞介导的炎症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的增加多药耐药蛋白1(MRP1)的一种或多种第一化合物，其中所述治疗有效量的第一化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法进一步包括施用抑制多药抗性蛋白2(MRP2)和羟基环氧素A3(HXA3)合酶中一种或多种的一种或多种第二化合物，其中所述治疗量的第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAE)的一种或多种第三化合物，其中所述治疗量的第三化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的增加一种或多种N-酰基乙醇胺(NAEs)的一种或多种第二化合物，其中所述治疗量的第二化合物减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述施用是局部或在所述靶组织的腔表面处的一种或多种。
19.根据权利要求14所述的方法，其中减少嗜中性粒细胞向靶组织的迁移的第一化合物与聚合物缀合。
20.根据权利要求1、8或14中任一项所述的方法，其中所述炎症是非感染性炎症。
21.根据权利要求1、8或14中任一项所述的方法，其中所述炎症是感染性炎症。
22.根据权利要求1、9或15中任一项所述的方法，其中所述抑制MRP2的化合物包括具有下式的丙磺舒-聚合物缀合物：
Figure FDA0002392142670000031
其中X是包含一个或多个原子的连接基，而POLY是聚合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中X是选自取代或未取代的C1-CX亚烷基、亚杂烷基、亚烯基或亚杂烯基的连接基，其中x可以是1至12的任何整数。
24.根据权利要求22所述的方法，其中POLY是选自以下的聚合物：葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、高碘酸盐氧化的葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、透明质酸(HA)、糊精、羟乙基淀粉(HES)、聚(2-乙基2-
Figure FDA0002392142670000032
唑啉)(PEOZ)、聚谷氨酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLA/PLGA)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚甘油、25聚酰胺基胺(PAMAM)、聚乙烯亚胺(PEI)、多肽及其任意组合。
25.根据权利要求22所述的方法，其中POLY是40kDa的葡聚糖。
26.根据权利要求22所述的方法，其中，POLY是10kDa的葡聚糖。
27.根据权利要求22所述的方法，其中X是己胺，而POLY是高碘酸盐氧化的40kDa葡聚糖。
28.根据权利要求22所述的方法，其中POLY是40kDa的2-臂分枝PEG胺。
29.具有下式的化合物：
Figure FDA0002392142670000041
其中X是连接基，并且POLY是聚合物。
30.根据权利要求29所述的化合物，其中X是选自取代或未取代的C1-CX亚烷基、亚环烷基、亚环烷基烷基、亚杂烷基、亚烯基或亚杂烯基的连接基，其中x可以是1至12的任何整数。
31.根据权利要求29所述的化合物，其中POLY是选自以下的聚合物：葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、高碘酸盐氧化的葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、透明质酸(HA)、糊精、羟乙基淀粉(HES)、聚(2-乙基2-
Figure FDA0002392142670000042
唑啉)(PEOZ)、聚谷氨酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLA/PLGA)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚甘油、25聚酰胺基胺(PAMAM)、聚乙烯亚胺(PEI)、多肽及其任意组合。
32.根据权利要求29所述的化合物，其中POLY是40kDa的葡聚糖。
33.根据权利要求29所述的化合物，其中X是己胺，POLY是高碘酸盐氧化的40kDa葡聚糖。
34.根据权利要求29所述的化合物，其中POLY是10kDa的葡聚糖。
35.根据权利要求29所述的化合物，其中X是选自取代或未取代的C1-CX亚烷基，亚环烷基，亚环烷基烷基，亚杂烷基，亚烯基或亚杂烯基的连接基，其中x可以是1至12的任何整数，并且POLY是高碘酸盐-氧化的10kDa葡聚糖。
36.根据权利要求29所述的化合物，其中POLY是PEG。
37.根据权利要求36所述的化合物，其中POLY是40kDa的2-臂分枝PEG胺。
38.根据权利要求29所述的化合物，其中相对于未经治疗的对照，所述化合物能够减轻有需要的受试者中嗜中性粒细胞介导的炎症。
39.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求29所述的化合物和药学上可接受的载体。
40.一种用于在有此需要的受试者中治疗或预防炎症的方法，包括向该受试者施用治疗有效量的权利要求29所述的化合物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述炎症是由选自以下的炎性疾病引起的：肠道疾病，包括直肠炎，orchitis，克罗恩病，结肠炎，例如溃疡性结肠炎，也称为溃疡性结肠炎，传染性/非传染性-传染性小肠结肠炎和炎症性肠病(IBD)；炎症性肺部疾病，包括肺炎球菌感染，哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺纤维化；炎性皮肤疾病，包括皮炎(湿疹)，酒渣鼻，脂溢性皮炎和牛皮癣；眼病，例如葡萄膜炎，视网膜炎，角膜炎和黄斑变性；泌尿生殖系统疾病，包括尿路感染；性传播疾病，包括盆腔炎，淋病，衣原体感染和疱疹；和尿道炎。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述炎症包括嗜中性粒细胞介导的炎症。
43.根据权利要求40所述的方法，其中所述施用包括使上皮细胞与有效量的所述化合物接触。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述治疗减少了沿基底外侧至顶端方向迁移的嗜中性粒细胞的数量。
45.根据权利要求40所述的方法，其中所述炎症与炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩氏病(CD)或感染性和/或非感染性小肠结肠炎有关。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述炎症与克罗恩氏病有关，并且所述治疗或预防还包括施用下述中的一种或多种：美沙拉敏产品，皮质类固醇制剂，回肠释放布地奈德，糖皮质激素/EEN免疫调节剂，包括硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤和甲氨蝶呤，抗肿瘤坏死因子(TNF)药物，包括英夫利昔单抗、阿达木单抗和赛妥珠单抗，pegol，抗α-4β-7整联蛋白抗体维多珠单抗，ABT-494和非洛替尼。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述炎症与溃疡性结肠炎有关，并且所述治疗或预防还包括施用下述中的一种或多种：5-氨基水杨酸酯，美沙拉明，皮质类固醇，多基质布地奈德，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，抗TNF药物，包括英夫利昔单抗、阿达木单抗和戈利木单抗，维多珠单抗，托法替尼，ABT-494和非戈替尼。
48.根据权利要求40所述的方法，其中所述炎症与感染性和/或非感染性炎性肺病有关，所述肺病选自：肺炎球菌感染，哮喘，慢性阻塞性肺病(COPD)和肺纤维化。
49.根据权利要求40所述的方法，其中所述炎症与选自以下的炎症性皮肤病相关：皮炎(湿疹)，酒渣鼻，脂溢性皮炎和牛皮癣。
50.根据权利要求40所述的方法，其进一步包括施用一种或多种选自以下的抗生素和/或抗炎剂：达巴万星(Dalbavancin)，奥利万星(Oritavancin)，克必信(Cubicin)，特地唑胺(Tedizolid)，头孢比洛(Ceftobiprole)，头孢比洛(Ceftobiprole)，头孢唑烷-他唑巴坦(Ceftolozane-tazobactam)，莫匹罗星(mupirocin)，硫酸新霉素，杆菌肽，多粘菌素B，1-氧氟沙星(1-ofloxacin)，克林霉素磷酸酯(clindamycin phosphate)，硫酸庆大霉素，甲硝唑(metronidazole)，己基间苯二酚(hexylresorcinol)，氯化苄乙氧铵(methylbenzethoniumchloride)，苯酚，季铵盐化合物，茶树油，甾类药物例如皮质类固醇如氢化可的松，羟基三安西松(hydroxyltriamcinolone)，α甲基地塞米松(alphamethyl dexamethasone)，地塞米松磷酸酯(dexamethasonephosphate)，倍氯米松二丙酸酯(beclomethasonedipropionate)，氯倍他索戊酸酯(clobetasol valerate)，地索奈德(desonide)，去氧甲米松(desoxymethasone)，去氧皮质酮乙酸酯(desoxycorticosterone acetate)，地塞米松(dexamethasone)，二氯松(dichlorisone)，醋酸双氟拉松(diflorasone diacetate)，戊酸双氟可龙(diflucortolone valerate)，氟氢缩松(fluadrenolone)，氟氯缩松丙酮化物(fluclarolone acetonide)，氟轻松(fluocinonide)，氟可丁酯(flucortinebutylester)，氟可龙(fluocortolone)，氟泼尼定(fluprednidene)，醋酸氟泼尼定(fluprednylidene acetate)，氟氢缩松(flurandrenolone)，哈西奈德(halcinonide)，醋酸氢化可的松，丁酸氢化可的松，甲基强的松龙(methylprednisolone)，曲安奈德(triamcinolone acetonide)，可的松(cortisone)，可托多松(cortodoxone)，flucetonide，氟氢可的松(fludrocortisone)，difluorosone diacetate，fluradrenaloneacetonide，甲羟松(medrysone)，amciafel，安西非特(amcinafide)，倍他米松(betamethasone)，氯泼尼松(chlorprednisone)，醋酸氯泼尼松(chlorprednisoneacetate)，氯考特酮(clocortelone)，clescinolone，二氯松酮(dichlorisone)，二氟泼尼酯(difluprednate)，氟氯奈德(flucloronide)，氟尼缩松(flunisolide)，氟米龙(fluoromethalone)，氟培龙(fluperolone)，氟泼尼松龙(fluprednisolone)，氢化可的松戊酸酯(hydrocortisone valerate)，氢化可的松环戊基丙酸酯(hydrocortisonecyclopentylproprionate)，氢可他酯(hydrocortamate)，甲泼尼松(meprednisone)，对氟米松(paramethasone)，泼尼松龙(prednisolone)，泼尼松(prednisone)，倍氯米松二丙酸酯(beclomethasone dipropionate)，倍他米松二丙酸酯(betamethasone dipropionate)，曲安西龙(triamcinolone)，非甾类药剂例如COX抑制剂，LOX抑制剂，p38激酶抑制剂，免疫抑制剂如环孢菌素和细胞因子合成抑制剂，四环素，米诺环素(minocycline)和强力霉素(doxycycline)，或其任何组合。
51.根据权利要求40所述的方法，其进一步包括施用一种或多种选自以下的抗体：针对艰难梭菌毒素的抗体，针对肿瘤坏死因子(TNF)的抗体，针对白介素的抗体和针对金属蛋白酶-9的抗体。
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