CN111603455B - 一种纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种Pt+si‑GPX4@IONPs、FA/Pt+si‑GPX4@IONPs纳米颗粒及其制备方法和应用，本发明中组合顺铂、si‑GPX4和IONPs三种治疗性药物于一体，从细胞凋亡和铁死亡两个方面共同诱导胶质瘤细胞死亡，还使用FA修饰的脂质体包裹顺铂、si‑GPX4和IONPs三种药物，具有靶向性好，生物相容性高的优点，取得了对胶质瘤的很好的治疗效果，解决了传统单一化疗药物的缺点，提出了针对胶质瘤细胞的多靶点联合化疗方法。

Description

一种纳米颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒、FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
胶质瘤被认为是最致命和最难治疗的癌症之一。胶质瘤可根据恶性程度分为4级(WHO I，II，III和VI)，最常见的胶质瘤是IV型胶质瘤，又称为胶质母细胞瘤(GBM)。目前包括手术切除、化疗和放疗在内的综合治疗对GBM患者的治疗效果有限，患者的中位生存期不到15个月。越来越多的证据表明，GBM的遗传和表观遗传异质性可能是导致目前治疗受限的根本原因。由于血脑屏障(BBB)的存在、严重的副作用等多种因素，单一化疗药物治疗胶质瘤的策略不能达到很好的临床效果，甚至增加肿瘤的耐药性。因此，针对胶质瘤细胞内不同靶点的多种药物联合治疗成为研究人员探索的方向之一，数项临床研究已被证明联合化疗可以延长生存时间并降低复发率。
发明内容
正如背景技术中论述的，单一化疗药物治疗胶质瘤的策略不能达到很好的临床效果，甚至增加肿瘤的耐药性，因此，针对胶质瘤细胞内不同靶点的多种药物联合治疗成为研究人员探索的方向之一，数项临床研究已被证明联合化疗可以延长生存时间并降低复发率。
铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖型细胞程序性死亡，细胞内过量的铁离子会与细胞内过氧化氢(H2O2)反应产生羟基自由基(芬顿反应)，羟基自由基可以引起细胞内不饱和脂肪酸过氧化，导致的脂质过氧化物蓄积而引起细胞铁死亡，诱导肿瘤细胞铁死亡现已成为治疗恶性肿瘤的新靶点。
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒以及FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒及其制备方法和应用。本发明创造性地构建了搭载顺铂和si-GPX4的FA修饰氧化铁纳米药物，通过组合顺铂和si-GPX4来攻击肿瘤细胞的DNA和脂质而引起肿瘤细胞凋亡和铁死亡，实现纳米药物抗肿瘤效果的最大化，且能够靶向治疗胶质瘤。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，其包括：si-GPX4@IONPs和装载在si-GPX4@IONPs上的Pt，其中si-GPX4@IONPs由含羧基的多孔IONPs和si-GPX4装载而成；所述si-GPX4有义链5'末端经氨基修饰并标记5-羧荧光素(FAM)。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法制备，其包括：
避光条件下，将si-GPX4@IONPs纳米颗粒与Pt混合搅拌使两者充分静电吸附；离心除去游离的Pt，得到Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒；
其中，所述si-GPX4@IONPs纳米颗粒由以下方法制备：
在焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液中加入含羧基的多孔IONPs，然后加入EDC和NHS，并在室温下搅拌，加入具有不同I/S比的si-GPX4，得到si-GPX4@IONPs；其中，装载si-GPX4前，si-GPX4有义链5'末端经氨基修饰并标记5-羧荧光素(FAM)。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，其包括：本发明第一方面所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒和FA修饰脂质体，其中，Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒包被在FA修饰脂质体中。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其包括：
避光条件下，将FA修饰脂质体与Pt+si-GPX4@IONP纳米颗粒的焦碳酸二乙酯(DEPC)H2O2溶液混合，经水合作用得到FA/Pt+si-GPX4@IONPs；
其中，所述Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒如本发明的第一方面中所述；
所述FA修饰的脂质体由摩尔比为6:1的lipofectamine 2000和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)2000](DSPE-PEG2k-FA)组成。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种药物载体或递药系统或药物组合物或药物制剂，其包括本发明上文第一方面中所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，或本发明上文第三方面中所述的FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种本发明上文第一方面中所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，或本发明上文第三方面中所述的FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，或本发明上文第五方面中所述的药物载体或递药系统或药物组合物或药物制剂在制备治疗抗肿瘤药物中的应用；所述肿瘤为胶质瘤或无血脑屏障的其他组织器官的实体肿瘤；特别地，所述肿瘤为胶质瘤。
本发明的具体实施方式具有以下有益效果：
1.立足的机制新颖，铁死亡是2012年新发现的细胞死亡方式，具有铁离子依赖性，过量的铁会与细胞内过氧化氢(H2O2)发生芬顿反应，导致致命的脂质过氧化，是治疗恶性肿瘤的新靶点；
2.利用三种药物的协同作用提高疗效，创造性地将顺铂、si-GPX4和IONPs组合在一起，从细胞凋亡和铁死亡两个方面共同诱导GBM细胞死亡，弥补了传统单一化疗药物的不足，减少耐药性的产生；
3.FA/Pt+si-GPX4@IONPs靶向性好。通过将叶酸修饰到该纳米复合物表面，利用叶酸可以和肿瘤细胞表面高表达的FOLR1和FOLR2受体特异性结合的特点，实现了该纳米药物的靶向递送，有利于药物在肿瘤局部浓聚，具有高效、全身副作用小的优点；
4.对肿瘤的抑制效果确切，实验证明FA/Pt+si-GPX4@IONPs对体外培养的胶质瘤细胞具有杀伤作用，并且在动物实验中能够抑制胶质瘤在小鼠体内的生长，延长荷瘤小鼠的生存期，
5.生物安全性高、相容性好，IONPs是一种具有生物相容性和可生物降解性的药物载体，已经通过了FDA的临床测试和批准。脂质体与生物膜结构相似，经修饰后包裹纳米药物在体内可稳定存在。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例的FA/Pt+si-GPX4@IONPs的合成示意图；
图2为合成的纳米颗粒的电镜图，a1-c1为纳米颗粒的TEM图；a2-c2为纳米颗粒的SEM图；a1、a2：IONPs，b1、b2：si-GPX4@IONPs，c1、c2：Pt+si-GPX4@IONPs；
图3为FA/Pt+si-GPX4@IONPs的TEM图；
图4为IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs、FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的粒径分布图；
图5为IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs、FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的Zeta电位；
图6为不同IONP/si-GPX4比值(I/S重量比)结合物琼脂糖凝胶电泳结果图；
图7为不同IONP/si-GPX4比值(I/S重量比)结合效率直条图；
图8为FA/Pt+siGPX4@IONPs在不同pH条件下Pt释放曲线；
图9示出了Pt+siGPX4@IONPs和FA/Pt-si-GPX4@IONPs分别在NHA细胞内的浓度；
图10示出了Pt+siGPX4@IONPs和FA/Pt-si-GPX4@IONPs分别在U87MG细胞内的浓度；
图11示出了NHA细胞、U87MG细胞和P3#GBM细胞的共聚焦显微镜图像；
图12示出了U87MG细胞活力变化图；
图13示出了经不同浓度FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理后U87MG、P3#GBM和NHA三种细胞系的细胞活力变化图；
图14示出了FA/Pt+si-GPX4@IONPs对U87MG、P3#GBM和NHA三种细胞系的半数最大抑制浓度(IC50值)；
图15为NHA细胞的共聚焦激光扫描显微镜图像，示出了FA/Pt+si-GPX4@IONPs对NHA细胞的毒性，a1、b1、c1为对照组，a2、b2、c2为实验组，其中a1、a2显示活细胞图像，b1、b2显示死细胞图像，c1、c2显示活细胞和死细胞的混合图像；
图16为P3#GBM细胞的共聚焦激光扫描显微镜图像，示出了FA/Pt+si-GPX4@IONPs对P3#GBM细胞的毒性，a1、b1、c1为对照组，a2、b2、c2为实验组，其中a1、a2显示活细胞图像，b1、b2显示死细胞图像，c1、c2显示活细胞和死细胞的混合图像；
图17为U87MG细胞的共聚焦激光扫描显微镜图像，示出了FA/Pt+si-GPX4@IONPs对U87MG细胞的毒性，a1、b1、c1为对照组，a2、b2、c2为实验组，其中a1、a2显示活细胞图像，b1、b2显示死细胞图像，c1、c2显示活细胞和死细胞的混合图像；
图18为顺铂诱导细胞凋亡和参与铁死亡的细胞内机制；
图19为流式细胞仪分析显示(Pt、Pt@IONPs、Pt+siGPX4@IONPs和FA/Pt-si-GPX4@IONPs)不同处理组间U87MG细胞的凋亡率；
图20为U87MG细胞的共聚焦激光扫描显微镜图，a1-e1分别为对照组、经Pt、Pt@IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理48h后处在增殖状态的U87MG细胞；a2-e2分别为对照组、经Pt、Pt@IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理48h后总体的U87MG细胞；
图21为对照组、经Pt、Pt@IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理48h的U87MG细胞的增殖状态百分比图；
图22为P3#GMB细胞的共聚焦激光扫描显微镜图，a1-e1分别为对照组、经Pt、Pt@IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理48h后处在增殖状态的P3#GMB细胞；a2-e2分别为对照组、经Pt、Pt@IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理48h后总体的P3#GMB细胞；
图23示出了对照组、经Pt、Pt@IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理48h的P3#GMB细胞的增殖状态百分比图；
图24为细胞中GPX4蛋白表达的免疫荧光检测图；
图25为细胞中GPX4蛋白表达量的柱状图；
图26示出了GPX4减少导致脂质过氧化和铁死亡的细胞内机制；
图27示出了经FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理后肿瘤细胞内GSH水平；
图28示出了对照组和经处理组肿瘤细胞内Fe2+水平；
图29示出了对照组和经处理后肿瘤细胞内H2O2水平；
图30为对照组和经处理后的肿瘤细胞的免疫荧光图；
图31示出了对照组和经处理后的肿瘤细胞内的脂质过氧化丙二醛(MDA)水平；
图32示出了小鼠体内治疗过程时间表；
图33示出了实验组对肿瘤的抑制作用；
图34为各处理组生物荧光值的变化曲线；
图35为各处理组的小鼠生存时间分析图；
图36为各处理组小鼠体重变化曲线图；
图37为各处理组小鼠脑肿瘤样品的Ki-67免疫组织化学染色图；
图38为各处理组小鼠脑肿瘤样品的H&E免疫组织化学染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
术语解释：
FA：Folic acid，中文名叶酸，也称为维生素B9、维生素M、维生素Bc，属于维生素B。FA可以与其受体(叶酸受体)靶向特异性结合，叶酸受体主要是FOLR1和FOLR2，与正常脑组织相比胶质瘤细胞表面高表达FOLR1和FOLR2。
顺铂：英文名cisplatin，简写为Pt。顺铂可破坏细胞内核DNA和线粒体mtDNA，诱导细胞凋亡，具有抗癌谱广、乏氧细胞有效、作用性强等优点，已普遍用于治疗卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、肺癌、脑癌等，疗效显著。研究表明顺铂可以激活NADPH氧化酶(NOX)，NOX将NADPH转化为NADP+，释放电子，生成O2 -，并参与形成过氧化氢(H2O2)。
si-GPX4：具有敲减细胞内GPX4表达的作用，siRNA称为小干扰RNA(Smallinterfering RNA)，是长20到25个核苷酸的双链RNA，可特异性敲减基因的表达。GPX4，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)的一种亚型，GPX是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶,保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。si-GPX4可通过抑制细胞内GPX4的表达，导致细胞内脂质过氧化物堆积，引起细胞铁死亡。
IONPs：Iron oxide nanoparticles(IONPs)，中文名氧化铁纳米颗粒，本发明中使用的IONPs为Fe3O4。IONPs是将铁递送至细胞的最有效、最容易的方法，而且经化学修饰后的IONPs可通过静电吸引或共价键的作用结合抗肿瘤药物，实现联合化疗的目标。
统计分析
对于配对数据，使用Student-t检验比较平均值。方差分析用于分析多组比较的潜在差异。通过使用对数秩检验比较Kaplan-Meier生存曲线，以评估各组之间的生存差异。使用GraphPad Prism 7.00软件(GraphPad；美国加利福尼亚州拉荷亚)进行统计分析。除非另有说明，所有实验重复至少三遍。每个治疗组的数据结果表示为平均值±SEM。所有测试均为双盲测试，P值<0.05被认为具有统计学意义。
正如背景技术中论述的，传统单一化疗药物的使用是GBM耐药性产生的主要原因，本发明发现针对GBM细胞的多靶点联合化疗是降低耐药性的有力方法。
本发明的一种实施方式中，提供了一种Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，其包括：si-GPX4@IONPs和装载在si-GPX4@IONPs上的Pt，其中si-GPX4@IONPs由含羧基的多孔IONPs和si-GPX4装载而成；
在一种优选的实施方式中，所述si-GPX4有义链5'末端经氨基修饰并标记5-羧荧光素(FAM)。
本发明的一种实施方式中，提供了一种Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法：
避光条件下，将si-GPX4@IONPs纳米颗粒与Pt混合搅拌使两者充分静电吸附；离心除去游离的Pt，得到Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒；
在一种优选的实施方式中，所述si-GPX4@IONPs的浓度为10mg/mL；
在一种优选的实施方式中，所述Pt的浓度为3mg/mL；
在一种优选的实施方式中，所述混合搅拌的时间为8小时。
本发明的一种实施方式中，提供了一种si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法：
在焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液中加入含羧基的多孔IONPs，然后加入EDC和NHS，并在室温下搅拌，加入具有不同I/S比的si-GPX4，得到si-GPX4@IONPs；其中，装载si-GPX4前，si-GPX4有义链5'末端经氨基修饰并标记5-羧荧光素(FAM)；
在一种优选的实施方式中，所述焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液的PH＝6；
在一种优选的实施方式中，所述含羧基的多孔IONPs的加入量为1mL；
在一种优选的实施方式中，所述含羧基的多孔IONPs的浓度为10mg/mL；
在一种优选的实施方式中，所述室温下搅拌时间为1h。
本发明的实施方式组合顺铂、si-GPX4和IONPs三种治疗性药物于一体，从细胞凋亡和铁死亡两个方面共同诱导GBM细胞死亡：一方面，顺铂在破坏DNA诱导细胞凋亡的同时，激活NADPH氧化酶(NOX)，NOX将NADPH转化为NADP+，释放电子，生成O2 -，并参与形成过氧化氢(H2O2)；另一方面，si-GPX4通过敲减GPX4基因的表达减少谷胱甘肽过氧化物酶的产生，导致细胞H2O2分解能力降低。顺铂和si-GPX4共同使细胞内H2O2积累。IONPs能提高细胞内铁离子浓度，铁离子和H2O2发生芬顿反应，产生具有强氧化性的羟自由基，破坏细胞膜结构及功能，最终导致细胞铁死亡。实验证明，集顺铂、si-GPX4和IONPs于一体的纳米药物在细胞实验和动物实验中对GBM均有很好的治疗效果。
本发明的一种实施方式中，提供了一种FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，其包括：权利要求1所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒和FA修饰脂质体，其中，Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒包被在FA修饰脂质体中；
在一种优选的实施方式中，所述FA修饰的脂质体由摩尔比为6:1的lipofectamine2000和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)2000](DSPE-PEG2k-FA)组成。
本发明的一种实施方式中，提供了一种FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法：
避光条件下，将FA修饰脂质体与Pt+si-GPX4@IONP纳米颗粒的焦碳酸二乙酯(DEPC)H2O2溶液混合，经水合作用得到FA/Pt+si-GPX4@IONPs；
其中，所述Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒如本发明的第一方面中所述；
在一种优选的实施方式中，所述FA修饰的脂质体由摩尔比为6:1的lipofectamine2000和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)2000](DSPE-PEG2k-FA)组成。
本发明的实施方式使用FA修饰的脂质体包裹顺铂、si-GPX4和IONPs三种药物，具有靶向性好，生物相容性高的优点。首先，脂质体具有与生物膜相似的结构，脂质体转染试剂被广泛接受为将外源DNA或RNA输送到细胞中“金标准”；其次，实验证明人GBM细胞与正常星形胶质细胞相比FA受体表达增加，胶质瘤细胞能够选择性摄取FA修饰后的IONPs；最后，IONPs是一种具有生物相容性和可生物降解性的药物载体，已经通过了FDA的临床测试和批准，而且IONPs具有超顺磁性，可通过外部磁场实现体内定向输送。
本发明的一种实施方式中，提供了一种药物载体或递药系统或药物组合物或药物制剂，其包括上述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，或上述的FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒；
进一步地，说书药物制剂中还可以包含至少一种药学上可接受的辅料，辅料的选择可根据药物制剂的剂型进行选择。
本发明的一种实施方式中，提供了一种上述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，或上述的FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，或上述的药物载体或递药系统或药物组合物或药物制剂在制备治疗抗肿瘤药物中的应用；
所述肿瘤为胶质瘤或无血脑屏障的其他组织器官的实体肿瘤；
特别地，所述肿瘤为胶质瘤。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。
实施例1 si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备
第一步，在PH＝6的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液中加入1mL含羧基的多孔IONPs(10mg/mL)，然后加入9.6mg EDC和5.8mg NHS，并在室温下搅拌1h。第二步，装载si-GPX4前，si-GPX4有义链5'末端经氨基修饰并标记5-羧荧光素(FAM)。向第一步获得的溶液中加入具有不同I/S比的si-GPX4 30分钟，得到si-GPX4@IONPs，用琼脂糖凝胶电泳评估结合力。
实施例2 Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备
避光条件下操作，将10mg/mL si-GPX4@IONPs与3mg/mL Pt混合并搅拌8小时，使两者充分静电吸附。用超滤离心管(MWCO：10kD)将混合物以1000rpm离心，以除去游离的Pt，得到Pt+si-GPX4@IONPs。通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)检测包封率和载药量。
实施例3 FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备
避光条件下操作，脂质体与1mg/mL Pt+si-GPX4@IONP的DEPC H2O2溶液混合，经水合作用得到FA/Pt+si-GPX4@IONPs。最终溶液经200nm聚碳酸酯膜过滤和sephadex G-100柱纯化后冷凝并储存在4℃以便进一步使用；
其中，脂质体由lipofectamine 2000和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)2000](DSPE-PEG2k-FA)组成(摩尔比6:1)。
其中，si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs、FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备过程如图1所示；IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的SEM和TEM图如图2所示；FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的TEM图如图3所示；IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs、FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的粒径分布如图4所示；IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs、FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的Zeta电位如图5所示；不同IONP/si-GPX4比值(I/S重量比)结合物琼脂糖凝胶电泳结果图如图6所示；不同IONP/si-GPX4比值(I/S重量比)结合效率直条图如图7所示；FA/Pt+siGPX4@IONPs在不同pH条件下Pt释放曲线如图8所示。
实验例
细胞实验：
1.细胞培养：将U87MG和NHA细胞在加有5％CO2的10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中于37℃的潮湿培养箱中培养。在NeurobasalTM培养基中培养P3#GBM细胞，并补充2％B27 Neuro Mix，20ng/mL表皮生长因子和10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。将培养的U87MG细胞分为Pt组、IONPs组、Pt@IONPs组、si-GPX4@IONPs、Pt-si-GPX4@IONPs组和FA/Pt-si-GPX4@IONPs组，，并使用相应药物处理，其中药物浓度采用0.125ug/mL、0.25ug/mL、0.5ug/mL、1ug/mL、2ug/mLh和4ug/mL不同浓度梯度。同时，将培养的U87MG、P3#GBM和NHA三种细胞用不同浓度FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理，其中药物的浓度采用0ug/mL、0.78125ug/mL、1.5625ug/mL、3.125ug/mL、6.25ug/mL、12.5ug/mL和25ug/mL不同浓度梯度。
2.细胞活力和增殖测定：使用Cell Counting Kit-8分析法评估细胞活力。将细胞以2×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在37℃的含5％CO2的恒温箱中孵育24小时。将CCK-8溶液(10μL)添加到每个孔中，并将板在培养箱中于37℃孵育1h。使用酶标仪在450nm(OD450)处读取每个孔的吸光度。
3.铁死亡相关测定：使用铁比色测定试剂盒(Abcam；美国加利福尼亚州)分析亚铁(Fe2+)的浓度。通过丙二醛(MDA)测定试剂盒(Beyotime)检测脂质过氧化水平。使用二氢乙啶(DHE，Beyotime)检测超氧阴离子水平。详细操作根据试剂盒说明进行。
4.细胞活/死染色：根据使用说明，用活/死活力/细胞毒性试剂盒(美国密苏里州西格玛奥德里奇)评估活细胞和死细胞的数量。简而言之，用钙黄绿素-AM和乙二胺-二聚体-1的工作溶液在PBS中以适当的稀释度制备。将染色溶液与培养基以1：2(v/v)的比例混合到工作溶液中，并在37℃下孵育15分钟。使用Leica SP8共聚焦显微镜(LeicaMicrosystems)捕获活细胞和死细胞的图像。
实验结果分别如图9-31所示。
图9-11显示了胶质瘤细胞中IONPs的生物相容性和选择性摄取
从图9和图10可以看出：IONPs(黑色颗粒)在U87MG细胞内的浓度比在NHA细胞内高，并且与未包被叶酸的Pt+siGPX4@IONPs相比，FA/Pt-si-GPX4@IONPs在细胞内的浓度更高。
图11的共聚焦显微镜图像显示了IONPs(红色荧光)和si-GPX4(绿色荧光)在U87MG、NHA和P3#GBM细胞内的定位，与NHA细胞相比，U87MG和P3#GBM细胞呈现出更高的红色和绿色荧光强度。
图12-17显示了纳米颗粒药物抑制胶质瘤细胞生长的情况：
图12的细胞活力检测显示，Pt、IONPs、Pt@IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt-si-GPX4@IONPs和FA/Pt-si-GPX4@IONPs均能影响U87MG的细胞活力，其中FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理的U87MG的细胞活力最低。
图13显示了经不同浓度FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理后U87MG、P3#GBM和NHA三种细胞系的细胞活力，可见三种细胞系的细胞活力均降低，且在一定FA/Pt+si-GPX4@IONPs浓度范围内(0.78125μg/ml-25μg/ml)，随着浓度升高对细胞活力的影响逐渐加大。
图14显示了FA/Pt+si-GPX4@IONPs对U87MG、P3#GBM和NHA三种细胞系的半数最大抑制浓度(IC50)：可以看出FA/Pt+si-GPX4@IONPs对U87MG细胞系的IC50值最小，抑制效果最好，其次是P3#GBM细胞系，最后是NHA细胞系。
图15-17共聚焦激光扫描显微镜显示了FA/Pt+si-GPX4@IONPs对U87MG、P3#GBM和NHA三种细胞系的毒性大小：与对照组相比，实验组存活细胞减少，死亡细胞增加；且结果显示FA/Pt+si-GPX4@IONPs对U87MG和P3#GBM细胞的毒性高于对NHA细胞的毒性。
图18-23展示了装载在IONPs中的顺铂诱导细胞凋亡的情况：
图18展示了顺铂诱导细胞凋亡和参与铁死亡的细胞内机制。
图19：流式细胞仪分析显示不同处理组(Pt、Pt@IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt-si-GPX4@IONPs和FA/Pt-si-GPX4@IONPs)间U87MG细胞的凋亡率分别为6％、24％、26.6％和33.3％。
图20和21：共聚焦激光扫描显微镜显示，与对照组相比，经Pt、Pt@IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理的U87MG细胞的增殖速率被显着抑制(红色荧光表示细胞增殖水平)。处理48小时后Pt+si-GPX4@IONPs组和FA/Pt+si-GPX4@IONPs组之间的增殖抑制差异有统计学意义。
图22和23：共聚焦激光扫描显微镜显示，与对照组相比，经Pt、Pt@IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理的P3#GMB细胞的增殖速率被显着抑制(红色荧光表示细胞增殖水平)。处理48小时后Pt+si-GPX4@IONPs组和FA/Pt+si-GPX4@IONPs组之间的增殖抑制差异有统计学意义。与U87MG细胞结果相似。
图24-31展示了组合的IONPs诱发铁死亡的情况：
图24和25：在用4μg/mL FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理48小时后，通过免疫荧光检测GPX4蛋白(绿色荧光)表达，与对照组(PBS)相比，NHA、U87MG和P3#GBM三个细胞系GPX4的表达均明显降低。统计模型显示，在U87MG和P3#GBM细胞中，GPX4分别降至其原始水平的30.9％和36.4％。
图26：GPX4减少导致脂质过氧化和铁死亡的细胞内机制。
图27显示了对照组以及经4μg/mL FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理24h和48h后的NHA、U87MG和P3#GBM三个细胞系肿瘤细胞内的GSH水平，从图中可以看出U87MG和P3#GBM细胞系肿瘤细胞内的GSH水平受FA/Pt+si-GPX4@IONPs的影响较大，48h后细胞内的GSH水平显著下降。
图28显示了经4μg/mL的Pt、si-GPX4、IONPs、Pt@IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理后U87MG细胞系肿瘤细胞内Fe2+水平，FA/Pt+si-GPX4@IONPs可显著提高细胞内Fe2+浓度。
图29显示了经4μg/mL的IONPs、Pt@IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理后P3#GBM细胞系肿瘤细胞内H2O2水平，FA/Pt+si-GPX4@IONPs可显著提高细胞内H2O2水平。
图30的红色免疫荧光显示了经4μg/mL的IONPs、Pt@IONPs、si-GPX4@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理后肿瘤细胞内超氧阴离子水平，从图中可以看出5组药物组均能使肿瘤细胞内超氧阴离子水平升高，但是Pt+si-GPX4@IONPs组和FA/Pt+si-GPX4@IONPs组的效果更好，尤其FA/Pt+si-GPX4@IONPs组肿瘤细胞内超氧阴离子水平最高。
图31的柱状图显示了经处理后肿瘤细胞内的脂质过氧化丙二醛(MDA)水平，与对照组相比，5组药物组均能使肿肿瘤细胞内的脂质过氧化丙二醛(MDA)水平升高，但是FA/Pt+si-GPX4@IONPs组的效果最好，与Pt+si-GPX4@IONPs组相比，FA/Pt+si-GPX4@IONPs组的脂质过氧化丙二醛(MDA)水平高1.38倍。
动物实验Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒对动物模型的疗效及安全性评估
1.将4周龄的雌性裸鼠(Foxn1nu mut/mut；SLAC实验动物中心；中国上海)随机分为5组(每组10只小鼠)：盐水组、Pt组、Pt@IONPs组、Pt+si-GPX4@IONPs组和FA/Pt+si-GPX4@IONPs组。将1x106个经荧光素酶标记的U87MG胶质瘤细胞在10μL PBS溶液中稀释，然后注入每组所有小鼠右额叶(深度2mm)，7天后形成携带U87MG胶质瘤的小鼠模型。
在第0，2，4，6，8，10天通过小鼠尾静脉按分组分别注射浓度为4μg/mL的生理盐水、游离Pt、Pt@IONPs、Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs，共六次，于第12天检测肿瘤抑制效果。使用体内成像系统(IVIS)光谱仪(Perkin-Elmer；马萨诸塞州沃尔瑟姆)通过生物发光成像监测肿瘤的生长。
实验结果分别如图33-36所示。
其中，图33和34：生物发光成像(BLI)显示FA/Pt+si-GPX4@IONPs在5个实验组中具有最佳的肿瘤抑制作用，其次是Pt+si-GPX4@IONPs。图35的生存分析显示，盐水组、Pt组、Pt@IONPs组、Pt+si-GPX4@IONPs组和FA/Pt+si-GPX4@IONPs组的总生存时间分别为16.9天、18.5天、20.7天、27.4天和38.3天以上，可见Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs能够有效延长携带U87MG胶质瘤的小鼠的生存时间。
图36显示了5组小鼠的体重变化曲线，在12天的治疗期间，Pt@IONPs，Pt+si-GPX4@IONPs和FA/Pt+si-GPX4@IONPs组之间没有观察到明显的体重差异。然而，生理盐水和Pt组的小鼠体重出现下降，表明肿瘤生长影响小鼠的休息和进食。
2.小鼠表现出症状(例如严重的驼背姿势，活动减少，腿拖拉，或体重急剧下降)后经颈椎脱臼处死。然后用生理盐水和4％多聚甲醛(PFA)灌注小鼠。收集大脑和主要器官，并进一步固定在4％PFA中，然后再嵌入石蜡中。通过H&E和IHC染色进一步检查肿瘤组织。
实验结果分别如图37和38所示。
图37显示了小鼠脑肿瘤样品的Ki-67免疫组织化学染色情况，从图中可以看出FA/Pt+si-GPX4@IONPs组具有最低数量的Ki-67阳性细胞，其次是Pt+si-GPX4@IONPs组，Ki-67阳性细胞数量低意味着肿瘤细胞增殖在小鼠体内被显著抑制。图38显示了H&E染色情况，从图中可以看出，用FA/Pt+si-GPX4@IONPs处理的小鼠肿瘤样品中存在最广泛的细胞死亡区域，其次是Pt+si-GPX4@IONPs。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (21)

1.一种Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，其包括：si-GPX4@IONPs和装载在si-GPX4@IONPs上的Pt，其中si-GPX4@IONPs由含羧基的多孔IONPs和si-GPX4装载而成。
2.如权利要求1所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，其特征在于，所述si-GPX4有义链5'末端经氨基修饰并标记5-羧荧光素(FAM)。
3.一种Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其特征在于，
其包括：避光条件下，将si-GPX4@IONPs纳米颗粒与Pt混合搅拌使两者充分静电吸附；离心除去游离的Pt，得到Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒。
4.如权利要求3所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述si-GPX4@IONPs的浓度为10mg/mL。
5.如权利要求3所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述Pt的浓度为3mg/mL。
6.如权利要求3所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述混合搅拌的时间为8小时。
7.如权利要求3所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其特征在于，
所述si-GPX4@IONPs纳米颗粒由以下方法制备：
在焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液中加入含羧基的多孔IONPs，然后加入EDC和NHS，并在室温下搅拌，加入具有不同I/S比的si-GPX4，得到si-GPX4@IONPs；其中，装载si-GPX4前，si-GPX4有义链5'末端经氨基修饰并标记5-羧荧光素(FAM)。
8.如权利要求7所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液的PH＝6。
9.如权利要求7所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述含羧基的多孔IONPs的加入量为1mL。
10.如权利要求7所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述含羧基的多孔IONPs的浓度为10mg/mL。
11.如权利要求7所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述室温下搅拌时间为1h。
12.一种FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，其包括：权利要求1所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒和FA修饰脂质体，其中，Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒包被在FA修饰脂质体中。
13.如权利要求12所述的FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，其特征在于，所述FA修饰的脂质体由摩尔比为6:1的lipofectamine 2000和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)2000](DSPE-PEG2k-FA)组成。
14.一种FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其包括：
避光条件下，将FA修饰脂质体与Pt+si-GPX4@IONP纳米颗粒的焦碳酸二乙酯(DEPC)H2O2溶液混合，经水合作用得到FA/Pt+si-GPX4@IONPs；
其中，所述Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒如权利要求1中所述。
15.如权利要求14所述的FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其特征在于：
所述FA修饰的脂质体由摩尔比为6:1的lipofectamine 2000和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)2000](DSPE-PEG2k-FA)组成。
16.如权利要求14所述的FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其特征在于：
所述Pt+si-GPX4@IONP的DEPC H2O2溶液的浓度为1mg/mL。
17.如权利要求14所述的FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括过滤、纯化、冷凝和在4℃下储存的步骤。
18.如权利要求17所述的FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述过滤采用200nm聚碳酸酯膜进行过滤；所述纯化采用sephadex G-100柱进行纯化。
19.一种药物载体或递药系统或药物组合物或药物制剂，其包含：权利要求1所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，或权利要求12所述的FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒。
20.如权利要求19所述的药物载体或递药系统或药物组合物或药物制剂，其特征在于：包含至少一种药学上可接受的辅料。
21.权利要求1所述的Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，或权利要求12所述的FA/Pt+si-GPX4@IONPs纳米颗粒，或权利要求19所述的药物载体或递药系统在制备治疗抗胶质瘤药物中的应用。
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