CN111587128B - 定义明确的聚富马酸丙二醇酯和聚乙二醇嵌段共聚物的合成与表征 - Google Patents
定义明确的聚富马酸丙二醇酯和聚乙二醇嵌段共聚物的合成与表征 Download PDFInfo
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Abstract
在一个或多个实施方式中，本发明提供一种低分子量、无毒、可再吸收的聚乙二醇(PEG)‑嵌段‑聚富马酸丙二醇酯(PPF)二嵌段共聚物和聚富马酸丙二醇酯(PPF)‑嵌段‑聚乙二醇(PEG)‑嵌段‑聚富马酸丙二醇酯(PPF)三嵌段共聚物(及其相关的制备方法和使用方法)，其可以水合以形成诸如水凝胶的物质并且具有适合3D打印和药物递送应用的受约束且可预测的材料特性。与传统的基于富马酸二乙酯(DEF)的打印相比，使用连续数字光处理(cDLP)水凝胶能够将二嵌段和三嵌段共聚物从水溶液中光化学打印成断裂伸长率增加10倍的结构。此外，还发现PPF‑PEG‑PPF三嵌段水凝胶在许多工程化MC3T3、NIH3T3和原发Schwann细胞中具有体外生物相容性。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年8月7日提交的题为“定义明确的聚富马酸丙二醇酯和聚乙二醇嵌段共聚物的合成和表征”的序列号为62/541,889的美国临时专利申请的权益，该申请通过引用以其整体并入本文中。
关于联邦资助研究或开发支持的声明
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的合同号为P41EB001046下通过政府支持作出的。政府拥有本发明的某些权利。
合作研究协议的各方名称
本申请源于根据俄亥俄阿克伦的阿克伦大学和俄亥俄Pepper Pike的3DBioActives LLC之间的合作研究协议而完成的工作。
技术领域
一个或多个实施方式中，本发明涉及聚乙二醇(PEG)和聚富马酸丙二醇酯(PPF)的嵌段共聚物。在某些实施方式中，本发明涉及聚富马酸丙二醇酯PPF/聚乙二醇(PEG)二嵌段共聚物和聚富马酸丙二醇酯(PPF)-嵌段-聚乙二醇(PEG)-嵌段-聚富马酸丙二醇酯(PPF)三嵌段共聚物，其可用于各种水凝胶、药物递送和再生医学应用。
背景技术
用于组织工程应用的材料必须满足多个标准以变得与临床相关。除了细胞存活率，还需要合适的机械性能和足够的加工灵活性的组合以产生形态复杂的支架。已经充分证明，机械性能以及支架拓扑结构都可以极大地影响细胞行为和分化。因此，功能材料应随之具有与目标组织相似的机械性能，同时提供加工处理以产生复杂的高分辨率结构。
水凝胶是亲水性聚合物的网状物，由于其可调节的机械性能和固有的网状物形态，其可以被容易地调整以匹配这些设计参数。例如，已知可以使用动力学控制的交联反应来调节聚乙二醇(PEG)肟水凝胶的模量，而与化学、浓度和化学计量无关。可以通过改变水凝胶的重量百分比来调节其他水凝胶体系的模量。此外，水凝胶的简便功能化已提供了关于外源性生物标志物对细胞行为的作用的研究。但是，绝大多数水凝胶体系限于模塑制造技术，极大地限制了可以生产的支架架构的多样性以及分辨率控制。
近来，增材制造为形态复杂结构的生产提供了途径，这是其他加工方法无法实现的。该技术在组织工程支架的开发中提供了关键的优势，因为已知诸如孔隙率和增加的表面积的特征用于促进合成植入物的宿主浸润。一些增材制造技术，例如熔融沉积建模(FDM)，已应用于水凝胶体系，例如透明质酸和海藻酸钠系凝胶。此外，最近的报告证明了使用连续数字光处理(cDLP)技术将PEG-二丙烯酸酯(PEG-DA)水凝胶打印到高分辨率结构中。然而，由于交联的数量和位置都受到限制，可用于两种技术的水凝胶材料受到限制。
cDLP增材制造使用UV固化层的逐步产生来从光反应性液态树脂构建结构。该技术可以产生非常精细(例如<120μm)的特征，并且可以通过使用计算机辅助建模(CAM)来定制以创建针对患者特定缺陷的支架。然而，聚合物树脂的粘度必须足够低以使其易于流动(即η*＜1-3Pa.s)，这需要对许多聚合物使用稀释剂。
一种对cDLP表现出巨大效用的聚合物是聚富马酸丙二醇酯(PPF)。聚富马酸丙二醇酯(PPF)是基于富马酸的线性不饱和聚酯，它是一种可以通过Krebs循环除去的小分子。它是无毒的，可生物降解的，具有可调的机械性能，并且可以进行3D打印成多种构型，使其对许多生物医学和药物递送应用非常有用。由Mikos和同事首次报道并且专门为骨骼组织再生而开发的这种可紫外线交联的聚合物提供了坚固的机械强度，同时可降解为Krebs循环成分(富马酸)和普遍存在的食品添加剂(丙二醇)。
虽然首次描述的合成利用逐步增长式聚合，但Coates等人证明了在钴催化剂的存在下，环氧丙烷(PO)和马来酸酐(MA)的开环共聚(ROCOP)，产生良好控制的PPM，其可在异构化时被转化为PPF。(参见，Diciccio,A.M.；Coates,G.W.Ring-Opening Copolymerizationof Maleic Anhydride with Epoxides.J.Am.Chem.Soc.2011,133,10724–10727，其公开内容通过引用以其整体并入本文。)产生窄分子质量分布的聚合物在组织工程应用中至关重要，因为链分布会影响降解、机械性能和支架组合物的保真度。此后，乙醇镁已被用作ROCOP催化剂来生产PPF，尽管控制较低，但避免了钴的毒性。通过使用富马酸二乙酯(DEF)作为粘度调节剂和反应性稀释剂，使用cDLP将PPF制成了细胞可存活的支架。(参见，Luo,Y.；Dolder,C.K.；Walker,J.M.；Mishra,R.；Dean,D.；Becker,M.L.Synthesis and BiologicalEvaluation of Well-Defined Poly(Propylene Fumarate)Oligomers and Their Use in3D Printed Scaffolds.Biomacromolecules 2016,17(2),690–697，其公开内容通过引用以其整体并入本文。)
最近，已经证明了使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂实现了PPF的良好控制的ROCOP，使得分子质量分布(
)与Coates等人报道的分子质量分布相似，但不存在有毒的钴。(参见，Wilson,J.A.；Luong,D.；Kleinfehn,A.P.；Sallam,S.；Wesdemiotis,C.；Becker,M.L.Magnesium Catalyzed Polymerization of End Functionalized Poly(PropyleneMaleate)and Poly(Propylene Fumarate)for 3D Printing of BioactiveScaffolds.J.Am.Chem.Soc.2018,140,277–284，其公开内容通过引用以其整体并入本文。)此外，在该系统中使用官能醇引发剂实现了链端官能化，同时引入用于后聚合和打印后官能化的反应性处理。然而，不幸的是，由于PPF是疏水性玻璃态固体，因此PPF尚未用于需要水合的应用(例如水凝胶)中。
为了避免该限制，已经尝试从PEG-二醇链的末端聚合PPF以生产坚固的，可3D打印的水凝胶。已经报道了具有宽分子质量分布的多嵌段聚(富马酸丙二醇酯-共-乙二醇)聚合物，其采用逐步增长式酯交换反应机理将乙二醇亚基掺入PPF中。但是，尚未发现或开发出适用于3D打印的良序的PEG和PPF嵌段共聚物。
因此，本领域中需要适合3D打印的良序的PEG和PPF的嵌段共聚物，其具有合适的溶胀、降解和拉伸机械性能，以用作组织工程、药物递送和其他生物医学应用中的水凝胶。
发明内容
在一个或多个实施方式中，本发明提供一种低分子量、无毒、可再吸收的聚乙二醇(PEG)-嵌段-聚富马酸丙二醇酯(PPF)二嵌段共聚物(PEGnPPFm聚合物)和聚富马酸丙二醇酯(PPF)-嵌段-聚乙二醇(PEG)-嵌段-聚富马酸丙二醇酯(PPF)三嵌段共聚物(PPFmPEGnPPFm聚合物)(及其相关的制备方法和使用方法)，其可以水合以形成诸如水凝胶的物质并且具有适合3D打印和药物递送应用的受约束且可预测的材料特性。与传统的基于富马酸二乙酯(DEF)的打印相比，使用连续数字光处理(cDLP)水凝胶可将二嵌段和三嵌段共聚物从水溶液中光化学打印成断裂伸长率增加10倍的结构。此外，还发现PPF-PEG-PPF三嵌段水凝胶在许多工程化MC3T3、NIH3T3和原发Schwann细胞中具有体外生物相容性。
在第一方面，本发明涉及聚乙二醇(PEG)和聚富马酸丙二醇酯(PPF)的嵌段共聚物，其包含约5重量％至约95重量％的PEG。在这些实施方式中的一些中，嵌段共聚物的数均分子量(Mn)为约500Da至约100,000Da。在一个或多个实施方式中，本发明的嵌段共聚物包括本发明的第一方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中PEG和PPF的嵌段共聚物是PEG/PPF二嵌段共聚物。
在一个或多个实施方式中，本发明的嵌段共聚物包括本发明第一方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中PEG和PPF的嵌段共聚物是具有下式的PEG/PPF二嵌段共聚物：
其中a是约4至约100的整数；b是约2至约100的整数；R是选自由甲基、苄基、炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苯并环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤素基、聚乙二醇基团及其组合组成的组中的官能团。
在一个或多个实施方式中，本发明的嵌段共聚物包括本发明第一方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中PEG和PPF的嵌段共聚物是具有下式的PEG/PPF二嵌段共聚物：
其中a是约4至约100的整数，b是约2至约100的整数。
在一个或多个实施方式中，本发明的嵌段共聚物包括本发明第一方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中PEG和PPF的嵌段共聚物是PPF/PEG/PPF三嵌段共聚物。在一个或多个实施方式中，本发明的嵌段共聚物包括本发明第一方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中PEG和PPF的嵌段共聚物是具有下式的PPF/PEG/PPF三嵌段共聚物：
其中a是约2至约100的整数，每个b是约2至约100的整数。
在第二方面，本发明涉及用于制备本发明第一方面的嵌段共聚物的方法，所述方法包括：将环氧丙烷、马来酸酐、PEG引发剂和镁催化剂溶解在合适的溶剂中；将溶液加热至约40℃至约80℃的温度保持约1小时至约24小时，以生产聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)或聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-马来酸丙二醇酯)中间体；将聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)或聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)中间体溶解在合适的溶剂中并加入二乙胺；将溶液加热至回流持续约1至约24小时，以产生根据本发明第一方面的嵌段共聚物。
在一个或多个实施方式中，本发明的方法包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中PEG引发剂的数均分子量(Mn)为约100至约10,000Da。在一个或多个实施方式中，本发明的方法包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中PEG引发剂具有约2至约50个乙二醇单元。在一个或多个实施方式中，本发明的方法包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中PEG引发剂是单官能的。在一个或多个实施方式中，本发明的方法包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中PEG引发剂是数均分子量(Mn)为约100至约10,000的甲醚PEG。
在一个或多个实施方式中，本发明的方法包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中PEG引发剂是双官能的。在一个或多个实施方式中，本发明的方法包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中PEG引发剂是数均分子量(Mn)为约100Da至约10,000Da的PEG二醇。
在一个或多个实施方式中，本发明的方法包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中镁催化剂是Mg(BHT)2(THF)2。在一个或多个实施方式中，本发明的方法包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中合适的溶剂选自由甲苯、己烷、庚烷、辛烷及其组合所组成的组。在一个或多个实施方式中，本发明的方法包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中合适的溶剂是甲苯。
在一个或多个实施方式中，本发明的方法包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中合适的溶剂选自由氯仿、二氯甲烷及其组合所组成的组。在一个或多个实施方式中，本发明的方法包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中合适的溶剂是氯仿。在一个或多个实施方式中，本发明的方法包括本发明第二方面的上述参考实施方式中的任一个或多个，其中聚合度为约2至约100。
在另一方面，本发明涉及一种胶束，其包含本发明第一方面的嵌段共聚物。
在另一方面，本发明涉及一种3-D打印聚合物结构，其包含本发明第一方面的嵌段共聚物。
在另一方面，本发明涉及一种水凝胶，其包含本发明第一方面的嵌段共聚物。
附图说明
为了更全面地理解本发明的特征和优点，现在参考本发明的详细描述以及附图，其中：
图1A-图1B是根据本发明的PEGPPF二嵌段共聚物的合成反应机理，其由甲醚PEG引发以产生聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)(图1A)和由PEG-二醇引发以产生聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)(图1B)。
图2是1H NMR光谱，其显示了使用二乙胺作为催化剂进行异构化以得到本发明的聚(乙二醇-嵌-富马酸丙二醇酯)(图2A)和聚(富马酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-富马酸丙二醇酯)(图2B)共聚物的结果。
图3是聚(富马酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-富马酸丙二醇酯)的MALDI-TOF光谱。
图4A-图4B是本发明的PPFmPEGnPPFm三嵌段共聚物的定量13C NMR光谱图，通过与PEG亚基相邻的PPF中的羰基二重共振(图4A)和与PPF亚基相邻的PEG共振(图4B)的低积分表明清晰的嵌段界面。
图5A-图5B是PEGnPPFm二嵌段共聚物的定量13C NMR光谱图，通过与PEG亚基相邻的PPF中的羰基二重共振(图5A)和与PPF亚基相邻的PEG共振(图5B)的低积分表明清晰的嵌段界面。
图6图示出具有0重量％、25重量％和50重量％DEF的PPFmPEGnPPFm的粘度测定实验的结果。DEF用作极粘均聚物树脂的粘度调节剂，发现50重量％对于3D打印最佳。图6还示出了在50％DEF下具有不同PPF嵌段的PEGnPPFm二嵌段共聚物的结果，以相对于其他树脂制剂基准化粘度。
图7示出了螺旋形支架的CAD模型(图7A)和从50重量％的PPF3PEG23PPF3的DEF溶液成功打印的螺旋形支架的拍摄图像(图7B)。
图8图示出某些水溶性PPFmPEGnPPFm共聚物的粘度。发现PEG含量>2000Da的PPFmPEGnPPFm共聚物对于约25重量％的聚合物产生适合cDLP的粘度。
图9图示出对PPFmPEG45PPFm和PPFmPEG91PPFm水凝胶进行的溶胀试验的结果。
图10图示出水打印的PPF3PEG45PPF3和DEF打印的PPF3PEG23PPF3水凝胶的拉伸应力-应变曲线。
图11图示出PPF7PEG45PPF7 25重量％水溶液的应变扫描结果。
图12图示出PPF3PEG23PPF350重量％DEF溶液的应变扫描结果。
图13图示出相对于PPFmPEGnPPFm水凝胶上的载玻片对照标准化的NIH3T3、MC3T3和Schwann细胞的存活率。存活率几乎是定量的。
图14是接种在PPF6PEG45PPF6、PPF15PEG45PPF15、PPF25PEG45PPF25、PPF6PEG91PPF6、PPF15PEG91PPF15、PPF25PEG91PPF25水凝胶上的NIH3T3细胞的荧光显微镜显微照片的集合。
图15是接种在PPF6PEG45PPF6、PPF15PEG45PPF15、PPF25PEG45PPF25、PPF6PEG91PPF6、PPF15PEG91PPF15、PPF25PEG91PPF25水凝胶上的MC3T3细胞的显微镜显微照片的集合。
图16是使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂(DP 20)(300MHz，303K，CDCl 3)，由甲醚PEG MW 750引发的聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)的1H NMR光谱。
图17是PEG17PPF20的13C NMR光谱。
图18是使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂的由甲醚PEG MW 750引发的聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)的1H NMR光谱(DP 50)(300MHz，303K，CDCl3)。
图19是使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂的由PEG-二醇MW 1000引发的聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)的1H NMR光谱(300MHz，303K，CDCl3)。
图20是使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂由PEG-二醇MW 1000引发的聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)的1H NMR光谱(300MHz，303K，CDCl3)。
图21是使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂由甲醚PEG MW 750引发的聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)的1H NMR光谱(DP 50)(300MHz，303K，CDCl3)。
图22是聚(乙二醇-嵌-富马酸丙二醇酯)(上)与前体聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)(下)的1H NMR光谱比较(300MHz，303K，CDCl3)。
图23是使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂由甲醚PEG 750MW引发的聚(乙二醇-嵌-富马酸丙二醇酯)的13C NMR光谱(125MHz，303K，CDCl3)。
图24是由MW 750甲醚聚乙二醇引发的聚富马酸丙二醇酯的MALDI-ToF MS图。
图25A-图25B是示出用于确认二嵌段共聚物的合成的MALDI-TOF质谱法(图25A)和尺寸排阻色谱法(图25B)的结果的光谱。
图26A-图26B是示出用于确认三嵌段共聚物的合成的MALDI-TOF质谱法(图26A)和尺寸排阻色谱法(图26B)的结果的光谱。
图27是使用Mg(BHT)2(THF)2作为催化剂(300MHz，303K，CDCl3)由PEG-二醇MW 1000引发的聚(富马酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-富马酸丙二醇酯)的1H NMR光谱。
图28是PPF10PEG23PPF10的13C NMR。
图29是由PEG-二醇MW 1000引发的聚(乙二醇-嵌-富马酸丙二醇酯)的定量13C NMR光谱，通过涉及与PPF重复单元相邻的PEG重复单元的峰的低积分表明嵌段样特性。
图30是LAP光引发剂的1H NMR光谱。
具体实施方式
在一个或多个实施方式中，本发明提供了低分子量、无毒、可再吸收的聚乙二醇(PEG)-嵌段-聚富马酸丙二醇酯(PPF)二嵌段共聚物和聚富马酸丙二醇酯(PPF)-嵌段-聚乙二醇(PEG)-嵌段-聚富马酸丙二醇酯(PPF)三嵌段共聚物(及其制造和使用的相关方法)，其可以水合形成诸如水凝胶的物质，并具有适用于3D打印和药物递送应用的受约束且可预测的材料特性。与传统的基于富马酸二乙酯(DEF)的打印相比，使用连续数字光处理(cDLP)水凝胶可将二嵌段和三嵌段共聚物从水溶液中光化学打印成断裂伸长率增加10倍的结构。此外，还发现PPF-PEG-PPF三嵌段水凝胶在许多工程化MC3T3、NIH3T3和原发Schwann细胞中具有体外生物相容性。
在第一方面，本发明涉及聚乙二醇(PEG)和聚富马酸丙二醇酯(PPF)的嵌段共聚物。在一个或多个实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物的数均分子量(Mn)为约500Da至约100,000Da。在一些实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物的数均分子量(Mn)为5,000Da或更高，在其他实施方式中为10,000Da或更高，在其他实施方式中为20,000Da或更高，在其他实施方式中为30,000Da或更高，在其他实施方式中为40,000Da或更高，在其他实施方式中为50,000Da或更高。在一些实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物的数均分子量(Mn)为90,000Da或更低，在其他实施方式中为80,000Da或更小，在其他实施方式中为70,000Da或更低，在其他实施方式中为60,000Da或更低，在其他实施方式中为50,000Da或更低，等于或小于50,000Da，在其他实施方式中为40,000Da或更低。
在一个或多个实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物的重均分子量(Mw)将为约500Da至约200,000Da。在一些实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物的重均分子量(Mw)将为约5000Da至约200,000Da，在其他实施方式中为约20,000Da至约200,000Da，在其他实施方式中为约50,000Da至约200,000Da，在其他实施方式中为约100,000Da至约200,000Da，在其他实施方式中为约150,000Da至约200,000Da，在其他实施方式中为约500Da至约150,000Da，在其他实施方式中为约500Da至约100,000Da，在其他实施方式中为约500Da至约75,000Da，在其他实施方式中为约500Da至约50,000Da。
在一个或多个实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物的质量分布(
)将为2.0或更小，并且优选1.5或更小，其中
在一些实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物的质量分布(
)将为约1.0至约2.0，在其他实施方式中为约1.2至约2.0，在其他实施方式中为约1.4至约2.0，在其他实施方式中为约1.6至约2.0，在其他实施方式中为约1.8至约2.0，在其他实施方式中为约1.0至约1.9，在其他实施方式中为约1.0至约1.7，在其他实施方式中为约1.0至约1.7，在其他实施方式中为约1.0至约1.5，在其他实施方式中为约1.0至约1.3。
在一个或多个实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物将包含按重量计约5％至约95％的PEG。在一些实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物将包含按重量计20％或更多，在其他实施方式中30％或更多，在其他实施方式中40％或更多，在其他实施方式中50％或更多，在其他实施方式中60％或更多，并且在其他实施方式中70％或更多的PEG聚合物。在一些实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物将包含按重量计90％或更少，在其他实施方式中80％或更少，在其他实施方式中70％或更少，在其他实施方式中60％或更少，并且在其他实施方式中50％或更少的PEG聚合物。
在一个或多个实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物将包含按重量计约5％至约95％的PPF。在一些实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物将包含按重量计10％或更多，在其他实施方式中20％或更多，在其他实施方式中30％或更多，在其他实施方式中40％或更多，在其他实施方式中50％或更多，在其他实施方式中60％或更多，并且在其他实施方式中70％或更多的PPF聚合物。在一些实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物将包含按重量计90％或更少，在其他实施方式中80％或更少，在其他实施方式中70％或更少，在其他实施方式中60％或更少，在其他实施方式中50％或更少，在其他实施方式中40％或更少，并且在其他实施方式中为30％或更少的PPF聚合物。
在各种实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物的每个PPF嵌段的数均分子量(Mn)将为约500g/mol至约20,000g/mol。在一些实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物的每个PPF嵌段的数均分子量(Mn)将为约1,000g/mol至约20,000g/mol，在其他实施方式中为约3,000g/mol至约20,000g/mol，在其他实施方式中为约7,000g/mol至约20,000g/mol，在其他实施方式中为约10,000g/mol至约20,000g/mol，在其他实施方式中为约15,000g/mol至约20,000g/mol，在其他实施方式中为约500g/mol至约15,000g/mol，在其他实施方式中为约500g/mol至约10,000g/mol，在其他实施方式中为约500g/mol至约5000g/mol。
在各种实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物的PEG嵌段的数均分子量(Mn)将为约500g/mol至约20,000g/mol。在一些实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物的PEG嵌段的数均分子量(Mn)将为约1,000g/mol至约20,000g/mol，在其他实施方式中为约3,000g/mol至约20,000g/mol，在其他实施方式中为约7,000g/mol至约20,000g/mol，在其他实施方式中为约10,000g/mol至约20,000g/mol，在其他实施方式中为约15,000g/mol至约20,000g/mol，在其他实施方式中为约500g/mol至约15,000g/mol，在其他实施方式中为约500g/mol至约10,000g/mol，并且在其他实施方式中为约500g/mol至约5000g/mol。
在一个或多个实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物是水溶性的。PEG是水溶性聚合物，并且在一些实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物中的PEG嵌段将使这些聚合物是水溶性的。如本领域技术人员将理解的，这些聚合物中的PEG嵌段将使它们具有水溶性的点将取决于多种因素，包括但不限于，PEG嵌段的长度、聚合物中PEG与PPF的总摩尔比、温度和压力。在所有其他条件相同的情况下，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物中的PEG与PPF的比例越高，则该聚合物的水溶性越高。本领域普通技术人员将能够制备水溶性的本发明的PEG/PPF嵌段共聚物，而无需过度实验。
在一个或多个实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物是PEG/PPF二嵌段共聚物。在一个或多个实施方式中，这些PEG/PPF二嵌段共聚物将具有如上所述的数均分子量(Mn)和质量分布
在一个或多个实施方式中，这些PEG/PPF二嵌段共聚物的PPF和PEG嵌段将具有如上所述的数均分子量(Mn)。
在这些实施方式中的一些中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物是具有下式的PEG/PPF二嵌段共聚物：
其中a是约4至约100的整数，b是约2至约100的整数。在一些实施方式中，a将是10或更大的整数，在其他实施方式中为20或更大，在其他实施方式中为30或更大，在其他实施方式中为40或更大，在其他实施方式中为50或更大，在其他实施方式中为60或更大。在一些实施方式中，a将是90或更小的整数，在其他实施方式中为80或更小，在其他实施方式中为70或更小，在其他实施方式中为60或更小，并且在其他实施方式中为50或更小。在一些实施方式中，b将是5或更大的整数，在其他实施方式中为10或更大，在其他实施方式中为20或更大，在其他实施方式中为30或更大，在其他实施方式中为40或更大，并且在其他实施方式中为50或更大。在一些实施方式中，b将是90或更小的整数，在其他实施方式中为80或更小，在其他实施方式中为70或更小，在其他实施方式中为60或更小，并且在其他实施方式中为50或更小。
在这些实施方式中的一些中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物是具有下式的PEG/PPF二嵌段共聚物：
其中a是约4至约100的整数；b是约4至约100的整数；并且R选自由甲基、苄基、炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苯并环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤素基团、聚乙二醇基团及其组合所组成的组。
在一些实施方式中，a将是10或更大的整数，在其他实施方式中为20或更大，在其他实施方式中为30或更大，在其他实施方式中为40或更大，在其他实施方式中为50或更大，并且在其他实施方式中为60或更大。在一些实施方式中，a将是90或更小的整数，在其他实施方式中为80或更小，在其他实施方式中为70或更小，在其他实施方式中为60或更小，并且在其他实施方式中为50或更小。在一些实施方式中，b将是5或更大的整数，在其他实施方式中为10或更大，在其他实施方式中为20或更大，在其他实施方式中为30或更大，在其他实施方式中为40或更大，并且在其他实施方式中为50或更大。在一些实施方式中，b将是90或更小的整数，在其他实施方式中为80或更小，在其他实施方式中为70或更小，在其他实施方式中为60或更小，并且在其他实施方式中为50或更小。
在一个或多个实施方式中，本发明的PEG/PPF嵌段共聚物是PPF/PEG/PPF三嵌段共聚物。在一个或多个实施方式中，这些PPF/PEG/PPF三嵌段共聚物将具有如上所述的数均分子量(Mn)和质量分布
在一个或多个实施方式中，这些PPF/PEG/PPF三嵌段共聚物的PPF和PEG嵌段将具有如上所述的数均分子量(Mn)。应当理解，在这些实施方式中，存在两个具有约相同大小的单独的PPF嵌段，因此这些聚合物中PPF的总Mn可以为约1000g/mol至40,000g/mol。
在这些实施方式中的一些中，PEG/PPF嵌段共聚物是具有下式的PPF/PEG/PPF三嵌段共聚物：
其中a是约4至约100的整数，每个b是约2至约100的整数。在一些实施方式中，a将是10或更大的整数，在其他实施方式中为20或更大，在其他实施方式中为30或更大，在其他实施方式中为40或更大，在其他实施方式中为50或更大，并且在其他实施方式中为60或更大。在一些实施方式中，a将是90或更小的整数，在其他实施方式中为80或更小，在其他实施方式中为70或更小，在其他实施方式中为60或更小，并且在其他实施方式中为50或更小。在一些实施方式中，每个b将是5或更大的整数，在其他实施方式中为10或更大，在其他实施方式中为20或更大，在其他实施方式中为30或更大，在其他实施方式中为40或更大，并且在其他实施方式中为50或更大。在一些实施方式中，每个b将为90或更小的整数，在其他实施方式中为80或更小，在其他实施方式中为70或更小，在其他实施方式中为60或更小，并且在其他实施方式中为50或更小。
在另一方面，本发明涉及用于制备上述PEG/PPF嵌段共聚物的方法。在各种实施方式中，该方法开始于将环氧丙烷、马来酸酐、PEG引发剂和镁催化剂溶解在合适的溶剂中。本领域普通技术人员将能够为环氧丙烷、马来酸酐、PEG引发剂和镁催化剂选择合适的溶剂，而无需过度实验。在各种实施方式中，用于环氧丙烷、马来酸酐、PEG引发剂和镁催化剂的合适溶剂可包括但不限于甲苯、氯仿、二噁烷或四氢呋喃(THF)。在一些实施方式中，将环氧丙烷、马来酸酐、PEG引发剂和镁催化剂溶解在甲苯中。在一些实施方式中，镁催化剂可以是Mg(BHT)2(THF)2、MgEt2或它们的组合，但是优选是Mg(BHT)2(THF)2。
在这些实施方式中的一些中，PEG引发剂的数均分子量(Mn)为约100Da至约40,000Da。在一些实施方式中，PEG引发剂的数均分子量(Mn)为1000Da或更高，在其他实施方式中为2000Da或更高，在其他实施方式中为3000Da或更高，在其他实施方式中为4000Da或更高，在其他实施方式中为5000Da或更高，在其他实施方式中为6000Da或更高，并且在其他实施方式中为7000Da或更高。在一些实施方式中，PEG引发剂的数均分子量(Mn)为9000Da或更小，在其他实施方式中为80,000Da或更小，在其他实施方式中为7000Da或更小，在其他实施方式中为6000Da或更小，在其他实施方式中为5000Da或更小，在其他实施方式中为4000Da或更小，并且在其他实施方式中为3000Da或更小。
在这些实施方式中的一些中，PEG引发剂具有约2至约50个乙二醇单元。在一些实施方式中，PEG引发剂将具有5个或更多，在其他实施方式中10个或更多，在其他实施方式中15个或更多，在其他实施方式中20个或更多，在其他实施方式中25个或更多，并且在其他实施方式中30个或更多的乙二醇单元。在一些实施方式中，PEG引发剂将具有45个或更少，在其他实施方式中40个或更少，在其他实施方式中35个或更少，在其他实施方式中30个或更少，在其他实施方式中25个或更少，并且在其他实施方式中20个或更少的乙二醇单元。
在这些实施方式中的一些中，PEG引发剂是单官能的，具有单个官能羟基。显而易见的是，在其中PEG引发剂是单官能的实施方式中，将产生PEG/PPF二嵌段共聚物。在这些实施方式中的一些中，PEG引发剂是数均分子量(Mn)为约100至约10,000的甲醚PEG。在一些实施方式中，PEG引发剂将是数均分子量(Mn)为1000Da或更大，在其他实施方式中为2000Da或更大，在其他实施方式中为3000Da或更大，在其他实施方式中为4000Da或更大，在其他实施方式中为5000Da或更大，在其他实施方式中为6000Da或更大，并且在其他实施方式中为7,000Da或更大的甲醚PEG。在一些实施方式中，PEG引发剂将是数均分子量(Mn)为9000Da或更小，在其他实施方式中为8000Da或更小，在其他实施方式中为7000Da或更小，在其他实施方式中为6000Da或更小在其他实施方式中为5000Da或更小，在其他实施方式中为4000Da或更小，在其他实施方式中为3000或更小的甲醚PEG。
在一个或多个实施方式中，PEG引发剂是具有下式的单官能PEG：
其中a是约4至约100的整数；R选自由甲基、苄基、炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苯并环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤素基、聚乙二醇基团及其组合所组成的组。在一些实施方式中，a将是10或更大的整数，在其他实施方式中为20或更大，在其他实施方式中为30或更大，在其他实施方式中为40或更大，在其他实施方式中为50或更大，并且在其他实施方式中为60或更大。在一些实施方式中，a将是90或更小的整数，在其他实施方式中为80或更小，在其他实施方式中为70或更小，在其他实施方式中为60或更小，并且在其他实施方式中为50或更小。
在其他实施方式中的一些中，PEG引发剂是二醇。将显而易见的是，在PEG引发剂是二醇的实施方式中，本发明的方法将产生PPF/PEG/PPF三嵌段共聚物。在一个或多个实施方式中，PEG二醇可具有下式：
其中a是约4至约100的整数。在一些实施方式中，a将是10或更大的整数，在其他实施方式中为20或更大，在其他实施方式中为30或更大，在其他实施方式中为40或更大，在其他实施方式中为50或更大，且在其他实施方式中为60或更大。在一些实施方式中，a将是90或更小的整数，在其他实施方式中为80或更小，在其他实施方式中为70或更小，在其他实施方式中为60或更小，且在其他实施方式中为50或更小。
在这些实施方式中的一些中，PEG引发剂是具有数均分子量(Mn)为约100Da至约40,000Da的PEG二醇。在一些实施方式中，PEG引发剂将是具有数均分子量(Mn)为1000Da或更大，在其他实施方式中为2000Da或更大，在其他实施方式中为3000Da或更大，在其他实施方式中为4000Da或更大，在其他实施方式中为5000Da或更大，在其他实施方式中为6000Da或更大，且在其他实施方式中为7,000Da或更大的PEG二醇。在一些实施方式中，PEG引发剂将是具有数均分子量(Mn)为9000Da或更小，在其他实施方式中为8000Da或更小，在其他实施方式中为7000Da或更小，在其他实施方式中为6000Da或更小，在其他实施方式中为5000Da或更小，在其他实施方式中为4000Da或更小，且在其他实施方式中为3000或更小的PEG二醇。
在各个实施方式中，溶液中环氧丙烷和马来酸酐单体的浓度为约0.5M至约8M。在一些实施方式中，环氧丙烷和马来酸酐单体的浓度为约1M至约8M，在其他实施方式中为约2M至约8M，在其他实施方式中为约4M至约8M，在其他实施方式中为约0.5M至约6M，在其他实施方式中为约0.5M至约4M，且在其他实施方式中为约1M至约3M。在一些实施方式中，环氧丙烷和马来酸酐单体的浓度为2M。在一些实施方式中，镁催化剂是Mg(BHT)2(THF)2。
接下来，将溶液加热至约40℃至约80℃的温度持续约1小时至约48小时，以产生聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)或聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)中间体。在一些实施方式中，将溶液加热到约50℃至约80℃的温度，在其他实施方式中为约60℃至约80℃，在其他实施方式中为约70℃至约80℃，在其他实施方式中为约40℃至约70℃，在其他实施方式中为约40℃至约60℃，且在其他实施方式中为约40℃至约50℃的温度。在一些实施方式中，将溶液加热持续约1h至约40h，在其他实施方式中为约1h至约30h，在其他实施方式中为约1h至约20h，在其他实施方式中为约10h至约48h，在其他实施方式中为约20h至约48h。在一些实施方式中，将溶液加热至100℃的温度持续72小时。
在一些实施方式中，聚合度为约2至约100，在其他实施方式中为约2至约75，在其他实施方式中为约2至约50，在其他实施方式中为约2至约50，在其他实施方式中为约2至约25，在其他实施方式中为约25至约100，在其他实施方式中为约50至约100，且在其他实施方式中为约75至约100。
可以通过用于该目的的本领域已知的任何方法收集和纯化聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)或聚(马来酸-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)中间体。本领域普通技术人员将能够收集和纯化聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)或聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)中间体，而无需进行过度的实验。在一个或多个实施方式中，聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)或聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-b-马来酸丙二醇酯)中间体被收集并通过在过量的二乙醚中沉淀来纯化。在一些实施方式中，再次收集中间体，并通过在磷酸盐缓冲溶液中洗涤以除去任何未反应的PEG来纯化。
接下来，通过如下来将在聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)或聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)中间体中的马来酸酯基团的顺式双键异构化为它们的富马酸酯对应物：将聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)或聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)中间体溶解在合适的溶剂中，加入二乙胺并将步骤C的溶液加热回流约1至约24小时以生产根据本发明的一种或多种实施方式的嵌段共聚物。
本领域普通技术人员将能够为聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)或聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)中间体选择合适的溶剂，而无需过度实验。合适的溶剂可以包括但不限于氯仿、二氯甲烷及其组合。在这些实施方式中的一些中，将聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)或聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-马来酸丙二醇酯)中间体溶解在氯仿中。
在一些实施方式中，可以将聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)或聚(马来酸-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)中间体/二乙胺溶液加热至回流持续约1小时至约20小时，在其他实施方式中为约1小时至约15小时，约1小时至约10小时，约5小时至约24小时，约10小时至约24小时，约15小时至约24小时以产生根据本发明的一种或多种实施方式的嵌段共聚物。
本发明的嵌段共聚物可以通过本领域已知的用于该目的的任何方法来进行收集和纯化。本领域普通技术人员将能够收集和纯化本发明的嵌段共聚物而无需过度的实验。在一个或多个实施方式中，可以收集本发明的嵌段共聚物并通过在过量己烷中沉淀来纯化。
在一些实施方式中，本发明的嵌段共聚物可以是如以下方案1所示合成的二嵌段共聚物：
方案1
其中a是约4至约100的整数；b是约2至约100的整数；R选自由甲基、苄基、炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苯并环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤素基、聚乙二醇基团及其组合所组成的组。在各种实施方式中，R为甲基。在一些实施方式中，a将是10或更大的整数，在其他实施方式中为20或更大，在其他实施方式中为30或更大，在其他实施方式中为40或更大，在其他实施方式中为50或更大，并且在其他实施方式中为60或更大。在一些实施方式中，a将是90或更小的整数，在其他实施方式中为80或更小，在其他实施方式中为70或更小，在其他实施方式中为60或更小，且在其他实施方式中为50或更小。在一些实施方式中，b将是5或更大的整数，在其他实施方式中为10或更大，在其他实施方式中为20或更大，在其他实施方式中为30或更大，在其他实施方式中为40或更大，并且在其他实施方式中，为50或更大。在一些实施方式中，b将是90或更小的整数，在其他实施方式中为80或更小，在其他实施方式中为70或更小，在其他实施方式中为60或更小，且在其他实施方式中为50或更小。
在一些实施方式中，本发明的嵌段共聚物可以是如以下方案2所示合成的三嵌段共聚物：
方案2
其中a是约4至约100的整数；并且每个b是约2至约100的整数。在一些实施方式中，a将是10或更大的整数，在其他实施方式中为20或更大，在其他实施方式中为30或更大，在其他实施方式中为40或更大，在其他实施方式中为50或更大，且在其他实施方式中为60或更大。在一些实施方式中，a将是90或更小的整数，在其他实施方式中为80或更小，在其他实施方式中为70或更小，在其他实施方式中为60或更小，且在其他实施方式中为50或更小。在一些实施方式中，b将是5或更大的整数，在其他实施方式中为10或更大，在其他实施方式中为20或更大，在其他实施方式中为30或更大，在其他实施方式中为40或更大，且在其他实施方式中，为50或更大。在一些实施方式中，b将是90或更小的整数，在其他实施方式中为80或更小，在其他实施方式中为70或更小，在其他实施方式中为60或更小，且在其他实施方式中为50或更小。
在另一方面，本发明涉及包含上述PEG/PPF嵌段共聚物的水凝胶。本领域普通技术人员将能够使用本发明的嵌段共聚物来形成水凝胶而无需过度的实验。在这些实施方式中的一个或多个中，将如上所述的PEG/PPF嵌段共聚物的水混溶性和/或水溶性物质与水和水溶性光引发剂水合，然后用对于所选择的光引发剂适合波长的紫外光照射，以固化聚合物并形成水凝胶。合适的水溶性光引发剂可以包括但不限于酰基次膦酸锂(LAP)。
在各种实施方式中，PEG/PPF嵌段共聚物将占这些水凝胶的约2重量％至约50重量％。在一些实施方式中，PEG/PPF嵌段共聚物将占占这些水凝胶的约5重量％至约50重量％，在其他实施方式中为约10重量％至约50重量％，在其他实施方式中为约15重量％至约50重量％，在其他实施方式中为约20重量％至约50重量％，在其他实施方式中为约25重量％至约50重量％，在其他实施方式中为约2重量％至约40重量％，在其他实施方式中为约2重量％至约30重量％，在其他实施方式中为约2重量％至约20重量％。在一些实施方式中，PEG/PPF嵌段共聚物将占这些水凝胶的约20重量％至约25重量％。
在另一方面，本发明涉及包含上述PEG/PPF二嵌段共聚物的胶束。在这些实施方式中，将本发明的二嵌段共聚物溶解在用于PEG和PPF的合适溶剂(例如氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃(THF)、1,4-二噁烷、N,N-二甲基甲酰胺)中，然后将水或缓冲水溶液缓慢地添加到包含PEG/PPF二嵌段共聚物的溶液中以形成胶束。本领域普通技术人员将能够使用本发明的嵌段共聚物形成胶束，而无需过度实验。
在另一方面，本发明涉及一种3D打印的聚合物结构的方法，该聚合物结构包括包含上述PEG/PPF嵌段共聚物的嵌段共聚物。在各种实施方式中，可以使用常规的增材制造(3D打印)技术，例如连续数字光处理(cDLP)技术将本发明的PEG/PPF嵌段共聚物形成具有几乎任何形状的3D聚合物结构。在这些实施方式中，首先选择PEG/PPF嵌段共聚物并将其用于形成具有适合所用装置的粘度(通常为约0.001cP至约10.0cP)并且优选包含至少一种光引发剂的可3D打印树脂。在一个或多个实施方式中，将树脂用DEF或另一种合适的溶剂如二噁烷、四氢呋喃(THF)或二甲基甲酰胺(DMF)稀释至适合打印的粘度。对光引发剂没有特别限制，但是必须能够在所使用的3D打印装置所使用的光的波长处产生自由基，并且应该可溶于所使用的树脂中。在各种实施方式中，合适的光引发剂可包括但不限于双酰基氧化膦(BAPO)和IRGACURETM 2959、IRGACURETM784。在一些实施方式中，可以如在Dean,D.；Jonathan,W.；Siblani,A.；Wang,M.O.；Kim,K.；Mikos,A.G.；Fisher,J.P.ContinuousDigital Light Processing(CDLP):Highly Accurate Additive Manufacturing ofTissue Engineered Bone Scaffolds.Virtual Phys.Prototyp.2012,7(1),13–24(其公开内容通过引用以其整体并入本文)中所述来制备包含本发明的PEG/PPF嵌段共聚物的可3D打印树脂。
一旦形成，就可以使用常规连续数字光处理(cDLP)技术将这些可3D打印树脂打印成3D聚合物结构。
实验
为了评价和进一步简化本发明的实践，在Mg(BHT)2(THF)2催化剂存在下由MA和PO的交替ROCOP形成聚(马来酸丙二醇酯)(PPM)，由甲醚PEG和PEG-二醇的醇链末端引发形成二嵌段(PEGnPPMm)和三嵌段(PPMmPEGnPPMm)共聚物(见图1A，图1B；表1)。使用1：5的摩尔比(催化剂：引发剂)，在除条目2和6外的所有情况下，聚合反应都超过了90％的转化率，如通过1H NMR光谱中马来酸酐峰的积分所确定。较低的转化率可归因于反应容器中较大的顶部空间：PO在34℃沸腾，且必须被冷凝回溶液中。实验确定，通过最小化该顶部空间，可以将反应驱动至高转化率。然后通过用二乙胺处理将聚合物异构化成PEGnPPFm和PPFmPEGnPPFm物质(见图2A-图2B)。通过MALDI-TOF质谱法对最终的聚合物产物进行表征，以显示出156Da的PPF重复单元和44Da的PEG重复单元(见图3)。
表1
PEGPPF二嵌段和三嵌段共聚物的合成
a其中m＝甲醚PEG，d＝PEG-二醇，并且值表示分子质量(Da)。b基于引发剂与单体的比率。c基于针对聚(苯乙烯)标准的SEC。d基于使用1H NMR光谱进行的端基分析。
为了证明已经合成了定义明确的嵌段共聚物，采用扩散排序NMR光谱法(DOSY-NMR)和定量13C NMR光谱实验。(图4A-图4B，图5A-图5B)此外，在13C NMR光谱中，PPF重复单元(δ＝164.4和164.0ppm)的羰基二重共振被与其相邻的PEG碳分开。由于与PEG相邻的羰基PPF峰的积分值低于与PPF相邻的羰基PPF峰的积分值，因此显然在两个嵌段之间存在明显的界面。这也可以从由PPF嵌段界面分开的PEG峰(δ＝70.55ppm)中观察到。
小角度振荡剪切流变学
cDLP增材制造涉及使用紫外线将光反应性聚合物树脂交联成固体。该技术需要足够低的树脂粘度(即＜3Pa.s)，以使聚合物在打印产品从树脂中立起时流入空隙空间。通过小角度振荡剪切(SAOS)流变学测量，纯PPF3PEG23PPF3嵌段共聚物的树脂形式具有约35-50Pa.s的复数粘度。这些值对于该制造方法而言极其粘稠，因此必须稀释。DEF已表现出非常适合此目的，因为聚合物：DEF的比例为1：1的溶液容易产生均聚物PPF的可用粘度(<1Pa.s)。类似地，对于PPFmPEG23PPFm以及PEG23PPFm的所有变体，DEF：PPFmPEGnPPFm的3：1和1：1的比率产生的粘度＜3Pa.s。(见图6)。
使用DEF-树脂进行cDLP打印
使用聚合物：DEF的1：1质量比成功地打印了PPFmPEG23PPFm(即1kDa PEG)三嵌段共聚物。向Dean等人先前配制的三种光引发剂的混合物加入：3重量％的BAPO、酰基膦光引发剂、0.4％的IRGACURETM 784、钛茂化合物类引发剂/光散射剂和0.7％的氧苯酮、自由基清除剂。(参见，Dean,D.；Jonathan,W.；Siblani,A.；Wang,M.O.；Kim,K.；Mikos,A.G.；Fisher,J.P.Continuous Digital Light Processing(CDLP):Highly Accurate AdditiveManufacturing of Tissue Engineered Bone Scaffolds.Virtual Phys.Prototyp.2012,7(1),13–24，其公开内容通过引用以其整体并入本文。)为了证明PPF3PEG23PPF3聚合物的打印分辨率，根据计算机生成的模型打印具有直径为约100μm的支杆尺寸的螺旋支架。打印结构的光学图像证明了cDLP打印带来了PPF3PEG23PPF3的高分辨率。
水溶液中的cDLP打印
对于具有>1000Da的PEG嵌段的测试的PPFmPEGnPPFm物质，聚合物不溶于DEF，限制了其用作粘度调节剂。幸运的是，高于2000Da的PEG嵌段质量(即PEG45和PEG91)，聚合物变成水溶性的，并且当溶解时产生η*＜3Pa.s的可用于cDLP打印的粘度(图8)。与以前使用的PPF：DEF混合物相比，这提供了双重优势，因为它同时实现了可用的粘度并消除了对DEF(DEF作为反应性稀释剂被掺入了打印的支架中，因此改变了材料特性)的需求。
cDLP的一个挑战是为选择针对打印制剂的光引发剂。为了交联用于这些实验的水溶性聚合物，使用了光引发剂酰基次膦酸锂(LAP)。与水溶性相比，与广泛使用的IRGACURETM2959(在340-420nm范围内)相比，LAP还具有高得多的摩尔吸收系数。此外，它还具有细胞相容性，使其成为用于交联水溶性PEGPPF的理想光引发剂。34当打印机在405nm处发射光时，这些特性的组合使LAP成为用于尝试从水溶液中进行cDLP打印的理想选择，其证明在成功打印PPF3PEG45PPF3中富有成效。
模制的PEGPPF水凝胶。
将PPFmPEGnPPFm的水溶性物质(即PEG45和PEG91嵌段)光交联成水凝胶，以检查其溶胀性质和细胞存活率。将每种凝胶以25重量％浇铸在水中(其中反应中心(双键)：LAP的摩尔比为5∶1)，以确保均匀的交联。对于短的PPF嵌段长度，PPFmPEG91PPFm(即4kDa PEG)物质的溶胀远高于PPFmPEG45PPFm，但是随着PPF嵌段长度的增加而迅速收敛(图9)。这是交联位点的量增加的结果，交联位点的量增加减小了交联之间的距离并抑制了支架的溶胀。此外，PPF嵌段长度伴随着疏水性增加，与较短的链相比，这促进了反应中心的聚集，并潜在地增加了所形成的交联数。
3D打印的PPFmPEGnPPFm水凝胶的拉伸性能
与从基于DEF的树脂溶液进行打印相比，从水溶液进行3D打印产生明显不同的机械性能。与DEF打印的PPF3PEG23PPF3相比，水打印的PPF3PEG45PPF3材料的拉伸性能证明断裂应变增加了10倍(图10-图12)。这种扩增可以归因于没有DEF，从而产生了在交联之间具有更大距离的网状物。在PPF3PEG23PPF3的情况下，DEF被掺入最终的网状物中，并产生高度交联且有些脆的材料。相反，水打印水凝胶中较低的交联密度使PEG链的构象松弛模式显著增加，从而使它们在发生材料破坏之前可以延伸得更远。令人惊讶地，两种条件的模量相似(PPF3PEG45PPF3：9.1±0.1kPa；PPF3PEG23PPF3：8.9±0.1kPa)，表明断裂伸长率可以独立于模量进行调节。
细胞存活率
在三种不同细胞类型下使用存活率测定法评价了PPFmPEGnPPFm(n＝45，91)水凝胶在软组织应用(例如周围神经再生)中使用的潜力。小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞经常用于阐明骨科材料的基线细胞反应，Schwann细胞是在周围神经系统中支持神经元的主要神经胶质细胞，而NIH 3T3是常用的成纤维细胞系。不出所料，在细胞培养24小时后，来自活细胞的显性绿色荧光表明，当将细胞类型各自在交联样品的无菌盘上培养时，PPFmPEGnPPFm水凝胶具有高的存活率(见图13-图15)。这些结果表明该材料是无毒的，并且与三种细胞类型均具有相容性。这是理想的，因为它提高了PPFmPEGnPPFm作为生物材料在许多不同应用中与转译相关的潜力。
结论
可打印且可再吸收材料的可用性和多样性对于在再生医学中使用增材制造将至关重要。使用镁催化剂，通过ROCOP从甲醚PEG和PEG-二醇的链端成功地合成了PPF，分别产生了一系列PEGnPPFm二嵌段和PPFmPEGnPPFm三嵌段共聚物。与DEF打印的变型相比，在水溶液中打印的水凝胶显示出断裂伸长率的显著增加。另外，证明了独立于模量的断裂应变控制能力。最后，发现PPFmPEGnPPFm(n＝45、91)水凝胶与MC3T3、NIH3T3和Schwann细胞系兼容，证明了这些材料在组织工程应用中的潜力。
实施例
提供以下实施例以更全面地说明本发明，但不应解释为限制其范围。此外，尽管一些实施例可能包括关于本发明可以起作用的方式的结论，但是发明人不意在被那些结论所束缚，而仅将它们提出作为为可能的解释。而且，除非通过使用过去式来指出，否则实施例的呈现并不意味着已经进行或没有进行实验或过程，或实际上获得或未实际上获得结果。已经做出努力以确保所使用的数值(例如量，温度)的准确性，但是可能存在一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
材料
甲醚聚乙二醇购自TCI(Portland,OR)。除非另有说明，所有其他商业试剂和溶剂均购自Sigma-Aldrich或Fisher Scientific，按原样使用。除非另有说明，所有反应均在氮气下进行。
仪器
使用Harian NMRS 500MHz光谱仪获得1H和13C NMR光谱。所有化学位移均以ppm(δ)表示，并参考残留溶剂共振的化学位移(1H-NMR,CDCl3δ＝7.26ppm,DMSO-d6δ＝2.49ppm；13C-NMRδ＝77.16ppm)。多重性的缩写如下：s＝单重态，d＝双重态，t＝三重态，br＝宽单重态，m＝多重态。使用Varian NMRS500MHz光谱仪获得扩散排序的NMR光谱，并在MestRe Nova软件上使用贝叶斯变换对其进行处理。分子质量和分子质量分布
通过尺寸排阻色谱法(SEC)使用TSKgel GMHHR-M色谱柱上的Tosoh EcoSEC HLC-8320GPC与折射率(RI)检测串联进行测定。采用聚苯乙烯标准品的校准曲线在四氢呋喃(THF)溶剂以1.0mL min-1流动且样品浓度为10.0mg mL-1下确定分子质量。
使用配备有在355nm发射的Nd：YAG激光的Bruker UltraFlex III MALDI串联飞行时间(TOF/TOF)质谱仪(Bruker Daltonics，Billerica，MA，USA)进行质谱分析。基质和阳离子化盐分别是DCTB(2-[((2E)-3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙-2-亚烯基]丙二腈)和三氟乙酸钠。在CHCl3中制备基质(20mg/mL)和阳离子盐(10mg·mL-1)的溶液，以及聚合物样品(10mg·mL-1)。将基质和阳离子化剂溶液以10：1(v/v)的比例混合并应用于目标。干燥后，施加少量样品，然后再滴加基质/阳离子化剂(夹层法)。使用配备有间隙尺寸为2mm的25mm平行板几何结构的ARES G2流变仪(TA Instruments，New Castle，DE)确定3D打印溶液的粘度。
实施例1
合成Mg(BHT)2(THF)2催化剂
在充氮、经烘箱干燥的防凸块Schlenk烧瓶中，将13.22g(0.06mol)的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)在高真空下干燥40min。向烧瓶中回充入氮气，然后注入20mL无水THF(0.31mol)。BHT溶解后，在1小时内滴加30mL 1.0M二丁基镁的庚烷溶液(0.03mol)，并将烧瓶在冰上冷却。将反应在冰上搅拌另外2小时，然后形成白色沉淀。通过真空转移除去溶剂，并将催化剂干燥过夜，然后将其储存在手套箱中。(17.5g，96％产率)
实施例2
干燥聚乙二醇原料
聚乙二醇二醇和甲醚聚乙二醇原料购自Sigma(2kDa和4kDa PEG-二醇和甲醚PEG)和TCI(1kDa PEG-二醇和甲醚PEG)，根据以前的文献干燥。(参见，Kinard,L.；Kasper,K.；Mikos,A.Drying Poly(Ethylene Glycol).Protoc.Exch.2012，其公开内容通过引用以其整体并入本文。)简而言之，将10.00g每种PEG衍生物溶于无水甲苯中，并用Dean-Stark装置回流过夜。然后将溶液通过套管转移到带有
分子筛的干燥圆底烧瓶中过夜，然后将其转移到另一个带有真空干燥的分子筛的干燥圆底烧瓶中过夜。然后在真空下除去甲苯，并将PEG转移到手套箱中。对于按比例放大的聚合，省去了筛干燥步骤，因为发现在共沸蒸馏后反应已充分干燥。
实施例3
使用甲醚PEG(MW 750)合成聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)，DP 20
由甲醚PEG(MW 750)引发并由Mg(BHT)2(THF)2催化，通过马来酸酐和环氧丙烷的共聚反应成20聚合度(DP)来合成聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)。如以下方案3中所示。
方案3
使用标准Schlenk line技术，向安瓿瓶中装入Mg(BHT)2(THF)2(57.8mg，0.095mmol)、甲醚聚乙二醇MW 750(0.3573g，0.4764mmol)、环氧丙烷(0.683mL，9.76mmol)和马来酸酐(0.9571g，9.76mmol)。将溶液溶解于甲苯中，使总单体浓度为2M。将安瓿瓶密封并在100℃加热72小时。通过在过量的二乙醚中沉淀来回收所得聚合物，并通过如下进行表征：1H NMR((300MHz,303K,CDCl3):δ＝6.28-6.24(t,OC(＝O)CH＝CHC(＝O)O),5.30-5.20(m,CH2CH(CH3)O),4.29-4.22(m,CH2CH(CH3)O),3.64(m,OCH2CH2O),3.38(m,CH3OCH2CH2O),和1.33-1.31(m,CH2CH(CH3)O ppm)(见图16)；13C NMR((125MHz,303K,CDCl3):δ＝164.35和164.03(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),133.90和133.40(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),70.54(OCH2CH2O),69.26(MAn*-PO,CH2CH(CH3)O),66.60(MAn*-PO,CH2CH(CH3)O)和16.36(PO,CH2CH(CH3)O)ppm(见图17)；以及SEC((THF):Mn＝2.2kDa,Mw＝3.4kDa,
)。
实施例4
使用甲醚PEG(MW 750)合成聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)，DP 50
由甲醚PEG(MW 750)引发并由Mg(BHT)2(THF)2催化，通过马来酸酐和环氧丙烷的共聚反应成50聚合度(DP)来合成聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)。如以下方案4中所示。
方案4
使用标准Schlenk line技术，将Mg(BHT)2(THF)2(23.8mg，0.039mmol)、甲醚聚乙二醇MW 750(0.1471g，0.1961mmol)、环氧丙烷(0.693mL，9.90mmol)和马来酸酐(0.9709g，9.90mmol)充入安瓿瓶中。通过在过量的二乙醚中沉淀回收得到的聚合物，并通过如下进行表征：1H NMR((300MHz,303K,CDCl3):δ＝6.28-6.24(t,OC(＝O)CH＝CHC(＝O)O),5.30-5.20(m,CH2CH(CH3)O),4.29-4.22(m,CH2CH(CH3)O),3.64(m,OCH2CH2O),3.38(m,CH3OCH2CH2O),和1.33-1.31(m,CH2CH(CH3)O ppm(见图18)；13C NMR((125MHz,303K,CDCl3):δ＝164.35和164.03(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),133.90和133.40(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),70.54(OCH2CH2O),69.26(MAn*-PO,CH2CH(CH3)O),66.60(MAn*-PO,CH2CH(CH3)O)和16.36(PO,CH2CH(CH3)O)ppm；以及SEC((THF):Mn＝1.7kDa,Mw＝2.5kDa,
)
实施例5
使用PEG二醇(MW 1000)的聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)的合成，DP 20
由PEG二醇(MW 1000)引发并由Mg(BHT)2(THF)2催化，通过马来酸酐和环氧丙烷的共聚反应成20聚合度(DP)来合成聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)。如以下方案5所示。
方案5
使用标准Schlenk line技术，将Mg(BHT)2(THF)2(0.95g，1.57mmol)、聚乙二醇MW1000(7.86g，7.86mmol)、环氧丙烷(3.39mL，48.5mmol)和马来酸酐(4.76g，48.5mmol)充入安瓿瓶中。通过在过量的二乙醚中沉淀来回收所得聚合物，并通过如下进行表征：1H NMR(1HNMR(300MHz,303K,CDCl3):δ＝6.28-6.24(t,OC(＝O)CH＝CHC(＝O)O),5.30-5.20(m,CH2CH(CH3)O),4.29-4.21(m,CH2CH(CH3)O),3.64(m,OCH2CH2O),和1.33-1.31(m,CH2CH(CH3)Oppm)(见图19)；13C NMR((125MHz,303K,CDCl3):δ＝164.34和164.03(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),133.90和133.40(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),70.59(OCH2CH2OC(＝O)CH＝CH),70.54(OCH2CH2O),69.26(MAn*-PO,CH2CH(CH3)O),66.59(MAn*-PO,CH2CH(CH3)O)和16.35(PO,CH2CH(CH3)O)ppm)；以及SEC(THF):Mn＝4.8kDa,Mw＝11.1kDa,
实施例6
使用PEG二醇(MW 1000)合成聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)，DP 50
由PEG二醇(MW 1000)引发并由Mg(BHT)2(THF)2催化，通过马来酸酐和环氧丙烷的共聚反应成50聚合度(DP)来合成聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)聚合物(PPFmPEGnPPFm)。如以下方案6所示。
方案6
使用标准Schlenk line技术，将Mg(BHT)2(THF)2(23.8mg，0.039mmol)、聚乙二醇MW1000(0.1471g，0.1961mmol)、环氧丙烷(0.693mL，9.90mmol)和马来酸酐(0.9709g，9.90mmol)充入安瓿瓶中。通过在过量的二乙醚中沉淀来回收所得聚合物，并通过如下进行表征：1H NMR(1H NMR(300MHz,303K,CDCl3):δ＝6.28-6.24(t,OC(＝O)CH＝CHC(＝O)O),5.30-5.20(m,CH2CH(CH3)O),4.29-4.21(m,CH2CH(CH3)O),3.64(m,OCH2CH2O),和1.33-1.31(m,CH2CH(CH3)O ppm)(见图20)；13C NMR((125MHz,303K,CDCl3):δ＝164.34和164.03(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),133.90和133.40(MAn*-PO,O(O)C*CH＝CH),70.59(OCH2CH2OC(＝O)CH＝CH),70.54(OCH2CH2O),69.26(MAn*-PO,CH2CH(CH3)O),66.59(MAn*-PO,CH2CH(CH3)O)和16.35(PO,CH2CH(CH3)O)ppm)；以及SEC((THF):Mn＝4.0kDa,Mw＝6.4kDa,
)。
实施例7
合成聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)(PEGnPPFm)
通过开环共聚合成聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)。在经烘箱干燥的安瓿瓶中将甲醚PEG(MW 750)(0.357g，0.476mmol)、环氧丙烷(0.683mL，9.76mmol)，马来酸酐(0.957g，9.76mmol)和Mg(BHT)2(THF)2(57.8mg，0.095mmol)溶于10mL甲苯中。将安瓿瓶密封并在100℃加热72小时。将得到的聚合物立即淬灭，并通过在40℃在过量己烷中沉淀来回收。(95％转化率)1H NMR(500MHz,303K,CDCl3):δ＝6.28-6.24(t,OC(＝O)CH＝CHC(＝O)O),5.30-5.20(m,CH2CH(CH3)O),4.29-4.22(m,CH2CH(CH3)O),3.64(m,OCH2CH2O),3.38(m,CH3OCH2CH2O),和1.33-1.31(m,CH2CH(CH3)O)ppm。
实施例8
合成聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)(PPMmPEGnPPMm)
在经烘箱干燥的安瓿瓶中将PEG-二醇(MW 1000)(0.911g，0.091mmol)、环氧丙烷(0.668mL，9.54mmol)、马来酸酐(0.935g，9.54mmol)和Mg(BHT)2(THF)2(110.6mg，0.182mmol)溶解于10mL甲苯中。将安瓿瓶密封并在100℃加热72小时。通过在40℃在过量己烷中沉淀来回收所得聚合物，并用磷酸盐缓冲溶液洗涤以除去过量的原料，然后在高真空下干燥。(97％转化率)1H NMR(500MHz,303K,CDCl3):δ＝6.28-6.24(t,OC(＝O)CH＝CHC(＝O)O),5.30-5.20(m,CH2CH(CH3)O),4.29-4.21(m,CH2CH(CH3)O),3.64(m,OCH2CH2O),和1.33-1.31(m,CH2CH(CH3)O)ppm。
实施例9
甲醚聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)的异构化
DP 50
使用二乙胺使实施例4的甲醚聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)(DP 50)异构化以形成聚(乙二醇-嵌-富马酸丙二醇酯)，如以下方案7所示。
方案7
将甲醚聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)(1.00g，10摩尔当量的烯烃)溶于氯仿(50mL)中。将二乙胺(0.151mL，0.15mol当量的烯烃)加入溶液中，并在氮气气氛下回流24h。冷却至室温后，将有机溶液用磷酸盐缓冲溶液(150mL，pH＝6)洗涤，并通过从己烷中沉淀回收聚合物，并使用如下进行表征：1H NMR((300MHz,303K,CDCl3):δ＝6.88-6.82(m,OC(＝O)CH＝CH(＝O)O),5.35-5.25(m,CH2CH(CH3)O),4.43-4.18(m,CH2CH(CH3)O),3.64(m,OCH2CH2O),3.38(s,H3COCH2CH2O)和1.36-1.34(m,CH2CH(CH3)O)ppm)(见图21,图22),13C NMR(见图23)和MALDI-ToF MS(见图24)。
实施例10
聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)的异构化
将聚(乙二醇-嵌-富马酸丙二醇酯)(1g，10摩尔当量的烯烃)溶解在氯仿(50mL)中。将二乙胺(0.151mL，0.15摩尔当量的烯烃)加入溶液中，并在氮气气氛下回流24h。冷却至室温后，将有机溶液用磷酸盐缓冲溶液(150mL，pH＝6)洗涤，并通过从己烷中沉淀回收聚合物。1H NMR(500MHz,303K,CDCl3):δ＝6.88-6.82(m,OC(＝O)CH＝CH(＝O)O),5.35-5.25(m,CH2CH(CH3)O),4.43-4.18(m,CH2CH(CH3)O),3.64(m,OCH2CH2O),3.38(s,H3COCH2CH2O)和1.36-1.34(m,CH2CH(CH3)O)ppm。MALDI-TOF质谱法(图25A)和尺寸排阻色谱法(图25B)用于确认三嵌段共聚物的合成。
实施例11
聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)的异构化
将聚(聚马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)(1.00g，10摩尔当量的烯烃)溶解在氯仿(50mL)中。将二乙胺(0.151mL，0.15摩尔当量的烯烃)加入溶液中，并在氮气气氛下回流24h。冷却至室温后，将有机溶液用磷酸盐缓冲溶液(150mL，pH＝6)洗涤，并通过从己烷中沉淀回收聚合物。1H NMR(500MHz,303K,CDCl3):δ＝6.88-6.82(m,OC(＝O)CH＝CH(＝O)O),5.30-5.20(m,CH2CH(CH3)O),4.29-4.21(m,CH2CH(CH3)O),3.64(m,OCH2CH2O),和1.33-.31(m,CH2CH(CH3)O)ppm。MALDI-TOF质谱法(图26A)和尺寸排阻色谱法(图26B)用于确认三嵌段共聚物的合成。
实施例12
聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)的异构化
使用上述实施例11中所述的方法，将上述实施例5中形成的聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)聚合物(上述PPF10PEG23PPF10)异构化。所得PPF10PEG23PPF10聚合物的1H NMR，13C NMR和定量13C NMR光谱在图27-图29中。
实施例13
苯基2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)的合成
在充有氮气的两颈500mL圆底烧瓶中，将10.69g的2,4,6-三甲基苯甲酰氯(0.06mol，1当量)添加到10g的二甲基苯基次膦酸酯(0.06mol，1当量)中。将反应在室温搅拌18小时，然后加入在125mL的2-丁酮中的20.13g的LiBr(0.23mol，4当量)。然后将反应加热至50℃，保持10分钟，在此期间形成白色沉淀物。然后将反应冷却3小时，直到达到室温。将白色产物在布氏漏斗中用300mL的2-丁酮洗涤，然后真空干燥过夜。(13.22g,77％产率)。1HNMR(500MHz,303K,D2O):δ＝7.82-7.78(tot,2H),7.67-7.64(tot,1H),7.57-7.54(m,2H),6.98(s,2H),2.33(s,3H),和2.11(s,6H)ppm。(见图30)。
实施例14
水凝胶制造
根据其各自的粘度以20-25重量％制备水凝胶，其中引发剂(LAP)与聚合物主链中的双键的摩尔比为1：5。将溶液溶解后，将其置于UV烘箱(EnvisionTec，Dearborn，MI，70W，55Hz，λ最大＝400nm)中10分钟以固化。
实施例15
粘度测定
在配备有25mm铝平行板的ARES G2流变仪(TA Instruments，New Castle，DE)上对聚合物溶液在水和DEF中的复数粘度进行测量。使用根据0.01-100％应变的扫描确定线性粘弹性(LVE)方案，并在合适的应变下进行频繁扫描以测量粘度。报告的值是每种聚合物的重复三次进行的扫频的平均值。(见图11、图12)
实施例16
PPFmPEGnPPFm的3D打印
使用405nm紫外光投影仪在EnvisionTec Micro+Advantage 3D打印机上打印PPFmPEG23PPFm。如下制备树脂制剂：为了用富马酸二乙酯(DEF)进行打印，将聚合物以50重量％溶解在DEF中，其中具有另外3重量％的BAPO、0.7重量％的IRGACURETM 784和0.4重量％的氧苯酮。为了从水溶液中进行打印，将PPFmPEGnPPFm(n＝45，91)聚合物根据其复数粘度以20-25重量％溶解在水中，其中LAP光引发剂与聚合物中的双键的摩尔比为1：5(通过1H NMR通过Mn确定)。
实施例17
凝胶溶胀
将水凝胶在去离子水中溶胀48小时，称重，然后冷冻干燥72小时以去除所有多余的水。溶胀比Q由
定义，其中Ms是平衡溶胀的水凝胶的质量，Md是完全干燥的水凝胶的质量。见图9。
实施例18
灭菌
在超声下将水凝胶样品(8mm)用乙醇溶液(21％丙酮、49％乙醇和30％v/v蒸馏水)洗涤两次，每次25分钟，并用PBS浸泡以冲洗掉残留的溶剂。然后通过液体循环用PBS进行高压蒸汽处理以进行灭菌。将样品小心转移到24孔板中，并向每个孔中加入1mL培养基。
实施例19
细胞培养
将MC3T3-E1前成骨细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen,GrandIsland,NY)、100单位·mL-1的盘尼西林(Invitrogen,Grand Island,NY)和100单位·mL-1的链霉素(Invitrogen,Grand Island,NY)的α-MEM培养基(GIBCO,Life Technologies,Grand Island,NY)中扩增和培养。将NIH 3T3小鼠成纤维细胞在补充有10％FBS和青霉素和链霉素各100单位·mL-1的DMEM的培养基中培养。如先前在Fairbanks,B.D.；Schwartz,M.P.；Bowman,C.N.；Anseth,K.S.Biomaterials Photoinitiated Polymerization ofPEG-Diacrylate with Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate:Polymerization Rate and Cytocompatibility.Biomaterials 2009,30(35),6702–6707SC(其公开内容通过引用以其整体并入本文)中所述，将从成年大鼠坐骨神经中分离的原代Schwann细胞(SC)系用于研究，将其在补充有10％FBS、青霉素和链霉素各100单位·mL-1、福司可林(5μM，Sigma Aldrich)、N2补充剂(1％vol/vol，Sigma Aldrich)和牛垂体提取物(20μg·mL-1，Sigma Aldrich)的DMEM的培养基中扩增和培养。将细胞在37℃保持在5％CO2湿润气氛中。对于细胞接种，在5％CO2湿润的气氛中将细胞用DPBS冲洗，并使用0.05％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸四钠盐(EDTA)溶液从烧瓶中分离5分钟。将分离的细胞收集到含有等份培养基的锥形管中。将细胞在400g下离心以沉淀6min，然后抽吸出培养基/胰蛋白酶溶液。将细胞重悬于新鲜培养基中，使用血细胞计数器计数，并以5×105个细胞/样品的密度接种在水凝胶上。
实施例20
存活率测定
使用哺乳动物细胞的活/死存活率/细胞毒性试剂盒(Life Technologies)，在细胞培养1天后评价存活率。通过在暗处将钙黄绿素-AM(4mM，5μL)和乙啡啶均二聚体(5μL)溶解在10mL DPBS中制备染色溶液。将样品用DPBS冲洗一次，并于37℃，5％CO2下在1mL染色溶液中温育10分钟。以20倍放大倍数在具有用于德克萨斯红和GFP的滤光片的Keyence BZ-X700显微镜上拍摄显微照片。使用带有细胞计数器插件的ImageJ(NIH)软件分析显微照片以进行活/死计数。染成绿色的细胞被作为活细胞计数，染成红色的细胞被作为死细胞计数。合计所有显微照片的活细胞和死细胞计数，以计算每个研究组与载玻片对照相比的存活率百分比。见图13-图15。
鉴于前述内容，应理解，本发明通过提供以多种方式在结构和功能上改进的PEG/PPF二嵌段共聚物和PPG/PEG/PPF三嵌段共聚物(以及相关的制备和使用方法)而大大地改进了现有技术。尽管本文已经详细公开了本发明的特定实施方式，但是应当理解，本发明不限于此，或者因此，本领域普通技术人员将容易理解本文中本发明的变型。本发明的范围将从所附的权利要求书中理解。
Claims (20)
1.一种聚乙二醇(PEG)和聚富马酸丙二醇酯(PPF)的嵌段共聚物，其包含5重量％至95重量％的PEG，其中所述PEG和PPF的嵌段共聚物是具有下式的PEG/PPF二嵌段共聚物：
其中a是4至100的整数；b是2至100的整数；且R是选自由甲基、苄基、炔基、炔丙基、烯丙基、烯基、4-二苯并环辛炔基、环辛炔基、酮基、醛基、叔卤素基、聚乙二醇基团及其组合组成的组中的官能团。
2.一种聚乙二醇(PEG)和聚富马酸丙二醇酯(PPF)的嵌段共聚物，其包含5重量％至95重量％的PEG，其中所述PEG和PPF的嵌段共聚物是具有下式的PEG/PPF二嵌段共聚物：
其中a是4至100的整数，且b是2至100的整数。
3.一种聚乙二醇(PEG)和聚富马酸丙二醇酯(PPF)的嵌段共聚物，其包含5重量％至95重量％的PEG，其中所述PEG和PPF的嵌段共聚物是具有下式的PPF/PEG/PPF三嵌段共聚物：
其中a是2至100的整数，且每个b是2至100的整数。
4.根据权利要求1至3任一项所述的嵌段共聚物，所述嵌段共聚物的数均分子量(Mn)为500Da至100,000Da。
5.一种用于制备根据权利要求1至4任一项所述的嵌段共聚物的方法，所述方法包括：
A)将环氧丙烷、马来酸酐、PEG引发剂和镁催化剂溶解在合适的溶剂中；
B)将步骤A的溶液加热至40℃至80℃的温度保持1小时至24小时，以产生聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)或聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)中间体；
C)将所述聚(乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)或聚(马来酸丙二醇酯-嵌-乙二醇-嵌-马来酸丙二醇酯)中间体溶解在合适的溶剂中并加入二乙胺；和
D)将步骤C的溶液加热至回流持续1小时至24小时以产生根据权利要求1至3任一项所述的嵌段共聚物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述PEG引发剂的数均分子量(Mn)为100Da至10,000Da。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述PEG引发剂具有2至50个乙二醇单元。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述PEG引发剂是单官能的。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述PEG引发剂是数均分子量(Mn)为100Da至10,000Da的甲醚PEG。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述PEG引发剂是双官能的。
11.根据权利要求5所述的方法，其中所述PEG引发剂是数均分子量(Mn)为100Da至10,000Da的PEG二醇。
12.根据权利要求5所述的方法，其中所述镁催化剂是Mg(BHT)2(THF)2。
13.根据权利要求5所述的方法，其中步骤A的所述合适溶剂选自由甲苯、己烷、庚烷、辛烷及其组合所组成的组。
14.根据权利要求5所述的方法，其中步骤A的所述合适的溶剂是甲苯。
15.根据权利要求5所述的方法，其中步骤C的所述合适的溶剂选自由氯仿、二氯甲烷及其组合所组成的组。
16.根据权利要求5所述的方法，其中步骤C的所述合适的溶剂是氯仿。
17.根据权利要求5所述的方法，其中聚合度为2至100。
18.一种胶束，其包含根据权利要求1至4任一项所述的嵌段共聚物。
19.一种3-D打印的聚合物结构，其包含根据权利要求1至4任一项所述的嵌段共聚物。
20.一种水凝胶，其包含根据权利要求1至4任一项所述的嵌段共聚物。
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