CN111587107A

CN111587107A - 药物组合物

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Publication number: CN111587107A
Application number: CN201880053528.1A
Authority: CN
Inventors: G·马尔霍特拉; K·乔希; J·哥萨尔卡尔; A·达罗伊; S·阿格拉瓦尔
Original assignee: Cipla Ltd
Current assignee: Cipla Ltd
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: CN111587107B; ZA202000014B; WO2019003251A1; US12090163B2; EP3641733A1; US20200113919A1

Abstract

本发明涉及包含((((((R)‑1‑(6‑氨基‑9H‑嘌呤‑9‑基)丙烷‑2‑基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物的药物组合物，任选地具有另外的药剂；制备这些药物组合物的方法；以及这些药物组合物在医药中的用途。

Description

药物组合物

技术领域：

本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物。本发明还提供其制备方法以及所述组合物用于预防、治疗或防治由病毒引起的疾病(特别是获得性免疫缺陷综合症、HIV感染、乙型肝炎感染或丙型肝炎感染)的用途。

发明背景：

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染是一种具有重大公共卫生意义的威胁生命的严重疾病，全世界约有3,670万人感染(联合国艾滋病规划署(UNAIDS).《全球报告：UNAIDS关于全球艾滋病流行的报告》，2016年)。

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)导致身体免疫系统的逐渐崩溃以及中枢和外周神经系统的进行性衰退。自1980年代初首次被认识以来，AIDS迅速蔓延，并且现在已经在相对有限的部分人群中达到了流行病的比例。深入研究发现了责任因子，人类T淋巴细胞逆转录病毒111(HTLV-111)，通常称为人类免疫缺陷病毒或HIV。

人类免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原因子，AIDS不仅在印度而且在全球都造成了重大的保健问题。

HIV是称为逆转录病毒的病毒类别的一员。逆转录病毒基因组由RNA组成，RNA通过逆转录转化成DNA。然后，该逆转录病毒DNA稳定地整合到宿主细胞的染色体中，并且利用该宿主细胞的复制过程产生新的逆转录病毒颗粒并使感染发展到其它细胞。HIV似乎对在身体免疫系统中起至关重要的作用的人类T-4淋巴细胞有特定的亲和力。HIV感染的WBC导致WBC数量减少。最终，免疫系统对各种机会性疾病变得不起作用和无效。

替诺福韦是一种高效核苷酸类似物逆转录酶抑制剂，广泛用于治疗由逆转录病毒引起的疾病，特别是获得性免疫缺陷综合征或HIV感染。替诺福韦{9-R-[(2-膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤}(dAMP的无环核苷酸类似物)是人类免疫缺陷病毒1型(ΗIV-1)复制的有效体外和体内抑制剂。替诺福韦在细胞中由AMP激酶和核苷二磷酸激酶依次磷酸化为活性物质二磷酸替诺福韦，该二磷酸替诺福韦充当终止病毒DNA链生长的HIV-1逆转录酶的竞争性抑制剂。替诺福韦中不可水解的膦酸部分的存在避免了对HIV逆转录酶的核苷类似物抑制剂的激活可能是限速的初始磷酸化步骤。由于膦酸基团的存在，替诺福韦在中性PH下是带负电的，因此限制了其口服生物利用度。

富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF；

)(替诺福韦的第一代口服前药)已经在临床试验中得到广泛研究，并且已经在许多国家获得上市许可，作为与其它抗逆转录病毒药剂联合使用的每日一次的片剂(300mg)以治疗HIV-1感染。

美国专利第7,390,791号描述了可用于治疗的膦酸酯核苷酸类似物的某些前药。一种这样的前药是替诺福韦艾拉酚胺半富马酸盐(TAF；

)，它是替诺福韦的异丙基丙氨酸基苯基酯前药。

虽然TDF和TAF表现出期望的活性，但是随着所需药物量的增加，治疗成本和不良副作用的可能性都会增加。因此，需要可用于用减少的剂量实现可接受的抗病毒效果的方法和组合物。

美国专利第9,227,990号(其内容整体援引加入本文)描述了可用于治疗的膦酸酯核苷酸类似物的某些前药。一种这样的前药是((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯。

发明目的：

本发明的一个目的是提供一种药物组合物，该药物组合物包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物；以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

本发明的另一个目的是提供一种制备药物组合物的方法，该药物组合物包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

本发明的又一个目的是提供一种药物组合物，该药物组合物包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物以及至少一种另外的治疗药剂；以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

本发明的又一个目的是提供((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物用于预防性或治疗性治疗人类病毒感染的用途，其中病毒感染是人类免疫缺陷病毒(HIV)或乙型肝炎感染(HBV)或丙型肝炎感染(HCV)。

本发明的又一个目的是提供一种预防、治疗或防治由病毒引起的疾病(特别是获得性免疫缺陷综合征或HIV感染或乙型肝炎感染或丙型肝炎感染)的方法，该方法包括给药包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物的药物组合物。

本发明的又一个目的是提供一种预防、治疗或防治由病毒引起的疾病(特别是获得性免疫缺陷综合征或HIV感染或乙型肝炎感染或丙型肝炎感染)的方法，该方法包括给药药物组合物，该药物组合物包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物以及至少一种另外的治疗药剂。

发明概述：

根据本发明的一个方面，提供一种药物组合物，该药物组合物包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物；以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

根据本发明的另一个方面，提供一种制备药物组合物的方法，该药物组合物包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物；以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

根据本发明的又一个方面，提供一种药物组合物，该药物组合物包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物以及至少一种另外的治疗药剂；以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

根据本发明的又一个方面，提供((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物用于预防性或治疗性治疗人类病毒感染的用途，其中病毒感染是人类免疫缺陷病毒(HIV)或乙型肝炎感染(HBV)或丙型肝炎感染(HCV)。

根据本发明的又一个方面，提供一种预防、治疗或防治由病毒引起的疾病(特别是获得性免疫缺陷综合征或HIV感染或乙型肝炎感染或丙型肝炎感染)的方法，这样的方法包括向有此需要的患者给药治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物。

根据本发明的又一个方面，提供一种预防、治疗或防治由病毒引起的疾病(特别是获得性免疫缺陷综合征或HIV感染或乙型肝炎感染或丙型肝炎感染)的方法，这样的方法包括向有此需要的患者给药治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物以及至少一种另外的治疗药剂。

附图简述：

图1通过证明对PBMC中的HIV-1 JV1083复制的抑制，表示((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐对新鲜PBMC中的HIV-1的体外疗效。

图2通过证明对PBMC中的HIV-1 89BZ_167复制的抑制，表示((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐对新鲜PBMC中的HIV-1的体外疗效。

图3表示((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐对HepG2细胞中的HBV细胞的体外疗效，证明抗HBV活性。

图4使用HCV复制子试验表示((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐对HCV的体外疗效。

发明详述：

美国专利第9,227,990号(其内容整体援引加入本文)描述了可用于治疗的膦酸酯核苷酸类似物的某些前药。一种这样的前药是((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯(式1)。

本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物；以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。本发明还提供其制备方法以及所述组合物用于预防、治疗或防治由病毒引起的疾病(特别是获得性免疫缺陷综合症或HIV感染或乙型肝炎感染或丙型肝炎感染)的用途。

术语“((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯”在广义上不仅包括“((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯”本身，还包括其药学上可接受的衍生物。合适的药学上可接受的衍生物包括药学上可接受的盐、药学上可接受的溶剂化物、药学上可接受的水合物、药学上可接受的无水化合物、药学上可接受的对映异构体、药学上可接受的酯、药学上可接受的同分异构体、药学上可接受的多晶型物、药学上可接受的前药、药学上可接受的互变异构体、药学上可接受的络合物等。

优选地，((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯是其药学上可接受的酸加成盐的形式。((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯的药学上可接受的酸加成盐的实例包括但不限于：无机酸盐，诸如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐和磷酸盐；有机羧酸盐，诸如乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、戊二酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、苦杏仁酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐和苯二甲酸盐；以及有机磺酸盐，诸如甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和樟脑磺酸盐。优选地，酸是富马酸、酒石酸或磷酸。更优选使用富马酸，但是酸加成盐不限于此。优选地，((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯是富马酸盐的形式。

在一个实施方案中，提供一种药物组合物，该药物组合物包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物；以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

在另一个实施方案中，提供药物组合物，该药物组合物还包含另外的治疗药剂。在另一个实施方案中，附加治疗药剂选自核苷逆转录抑制剂(NRTI)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、整合酶抑制剂、CCR5抑制剂、融合抑制剂和成熟抑制剂(MI)及其任意组合。这些活性成分配制成同时、单独或顺序给药。当活性成分顺序给药时，可以首先给药((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或另外的治疗药剂。当同时给药时，活性成分可以以相同或不同的药物组合物给药。辅助治疗(即一种活性成分用作主要治疗，另一种或多种活性成分用于辅助该主要治疗)也是本发明的实施方案。

在又一个实施方案中，药物组合物是((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物和一种或多种另外的治疗药剂的组合，该一种或多种另外的治疗药剂选自，但不限于恩曲他滨、依非韦伦、奈韦拉平、地瑞那韦、阿扎那韦、齐多夫定、地达诺新、司他夫定、拉米夫定、扎西他滨、硫酸阿巴卡韦、地拉韦定、沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、奈非那韦、安普那韦、科比司他、洛匹那韦、恩夫韦地、度鲁特韦、埃替拉韦、雷特格韦、利匹韦林。

在又一个实施方案中，药物组合物是((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物和恩曲他滨的组合。

在又一个实施方案中，药物组合物是((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物和拉米夫定的组合。

在又一个实施方案中，药物组合物是((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物、拉米夫定和依非韦伦的组合。

在又一个实施方案中，药物组合物是((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物、恩曲他滨和依非韦伦的组合。

在又一个实施方案中，药物组合物是((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物、恩曲他滨和利匹韦林的组合。

在又一个实施方案中，药物组合物是((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物、埃替拉韦、科比司他和恩曲他滨的组合。

在又一个实施方案中，药物组合物是((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物和恩替卡韦的组合。

在又一个实施方案中，药物组合物是((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物和一种或多种另外的治疗药剂的组合，该一种或多种另外的治疗药剂选自，但不限于重组人干扰素α(诸如聚乙二醇化干扰素α-2a或聚乙二醇化干扰素α-2b(统称为“聚乙二醇干扰素”或“PEG”))、核苷类似物(例如利巴韦林)、直接作用的抗病毒剂(例如达卡他韦、波普瑞韦和特拉匹韦)、NS3/4A蛋白酶抑制剂(PI)(例如西咪匹韦)、核苷酸NS5B聚合酶抑制剂(例如索非布韦)、NS5A抑制剂(例如达卡他韦)、非核苷NS5B聚合酶抑制剂(例如达萨布韦)。

在又一个实施方案中，药物组合物是((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物和一种或多种另外的治疗药剂的组合，该一种或多种另外的治疗药剂选自，但不限于聚乙二醇干扰素、利巴韦林、索非布韦、达卡他韦、维帕他韦、伏西瑞韦(voxilapravir)、波普瑞韦、特拉匹韦、西咪匹韦、达萨布韦、雷迪帕韦、奥比他韦、帕利瑞韦、利托那韦、艾尔巴韦、格佐匹韦、阿孙普韦、贝卡布韦。

如本文使用的，术语“组合”定义了一种剂量单位形式的固定组合、非固定组合或包含用于联合给药的单独部分的药盒。

((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯可用于治疗和/或预防人类或动物的一种或多种病毒感染，包括由DNA病毒、RNA病毒、疱疹病毒(例如CMV、HSV 1、HSV 2、VZV)、逆转录病毒、嗜肝DNA病毒(例如HBV)、乳头瘤病毒、汉坦病毒、腺病毒和HIV引起的感染。美国专利第6,043,230号(其内容整体援引加入本文)及其它出版物描述了核苷酸类似物(诸如替诺福韦二吡呋酯)的抗病毒特异性。如替诺福韦二吡呋酯，((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯是替诺福韦的另一种前药形式，并且可以用于治疗和/或预防相同病症。

在一个实施方案中，提供一种用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的方法，该方法包括向有此需要的个体给药治疗有效量的包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物。

在另一个实施方案中，提供一种用于治疗HIV感染的方法，该方法包括向有此需要的个体给药治疗有效量的包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物的药物组合物。在另一个实施方案中，该方法包括向个体给药一种或多种另外的治疗药剂，该一种或多种另外的治疗药剂选自核苷逆转录抑制剂(NRTI)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、整合酶抑制剂、CCR5抑制剂、融合抑制剂和成熟抑制剂(MI)及其任意组合。

在又一个实施方案中，提供一种用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，该方法包括向有此需要的个体给药治疗有效量的((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物。

在另一个实施方案中，提供一种用于治疗HBV感染的方法，该方法包括向有此需要的个体给药治疗有效量的包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物的药物组合物。

在又一个实施方案中，提供一种用于治疗丙型肝炎病毒(HCV)感染的方法，该方法包括向有此需要的个体给药治疗有效量的((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物。

在另一个实施方案中，提供一种用于治疗HCV感染的方法，该方法包括向有此需要的个体给药治疗有效量的包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物的药物组合物。

在一个实施方案中，提供一种用于制备药物组合物的方法，该方法包括将((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物以及药学上可接受的赋形剂进行组合以提供药物组合物。

在一个实施方案中，提供((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物用于预防性或治疗性治疗HIV感染的用途。在另一个实施方案中，提供((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物用于制备或制造治疗HIV感染的药物的用途。

在一个实施方案中，提供((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物用于预防性或治疗性治疗HBV感染的用途。在另一个实施方案中，提供((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物用于制备或制造治疗HBV感染的药物的用途。

在一个实施方案中，提供((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物用于预防性或治疗性治疗HCV感染的用途。在另一个实施方案中，提供((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物用于制备或制造治疗HCV感染的药物的用途。

在本发明的一些实施方案中，预防性或治疗性治疗的方法包括给药多个日剂量。在其它实施方案中，预防性或治疗性治疗的方法包括给药单个日剂量。

((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯可以通过适合于待治疗病症的任何途径给药。合适的途径包括口服、直肠、鼻腔、局部(包括眼、含服和舌下)、阴道和肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)。通常，((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯是口服给药的，但是其可以通过本文提到的任何其它途径给药。制剂为单位剂型，并且通过药学领域中公知的任何方法制备。

对于口服治疗给药，((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯可以与一种或多种赋形剂组合，并且以可摄入片剂、分散片、口含片、锭剂(troche)、胶囊剂、酏剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)、自乳化药物递送系统(SEDDS)、自微乳化药物递送系统(SMEDDS)等。这样的药物组合物和制剂通常会含有至少0.1％的((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯。当然，该活性化合物在组合物和制剂中的百分比可以变化，并且可以方便地为给定单位剂型重量的约2％至约80％，优选约3％至约50％，更优选约5％至约25％。在这样的治疗上有用的药物组合物中，活性化合物的量优选使得在给药单个单位剂量(例如片剂)时会获得有效剂量水平。其它剂量制剂在重复给药亚临床有效量的((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯时可以提供其治疗有效量。优选的单位剂量制剂包括含有日剂量(例如单个日剂量)以及单位日亚临床剂量或其适当部分(例如多个日剂量)的((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯的制剂。

适用于口服给药的药物组合物可以呈现为：离散单位，诸如胶囊剂、扁囊剂或片剂，每个都含有预定量的((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯；散剂或颗粒剂；含水液体或非水液体中的溶液剂或混悬剂；或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯也可以呈现为大丸剂、药糖剂或糊剂。

((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯优选作为药物组合物或制剂的一部分给药。这样的药物组合物或制剂包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯和一种或多种药学上可接受的载体/赋形剂以及任选存在的的其它治疗成分。赋形剂/载体必须在与制剂的其它成分的相容性上是可接受的，并且对患者无害。赋形剂包括，但不限于可以用作((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯的载体或介质的物质(例如稀释剂载体)。它们可以封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，可以压制成片剂，或者可以直接包含在患者饮食的食物中。

合适的赋形剂可以用于配制根据本发明的剂型，诸如但不限于表面稳定剂或表面活性剂、粘度调节剂、包括延长释放聚合物的聚合物、稳定剂、崩解剂或超崩解剂、稀释剂、增塑剂、粘合剂、助流剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、防结块剂、乳浊剂、抗菌剂、消泡剂、乳化剂、缓冲剂、着色剂、载体、填充剂、抗粘附剂、溶剂、掩味剂、防腐剂、抗氧化剂、质地增强剂、孔道形成剂、包衣剂或其组合。

在一个实施方案中，药物组合物可以包含1-80％稀释剂、1-50％粘合剂、10-20％崩解剂、1-10％润滑剂、0.5-5％助流剂和1-10％包衣剂。

因此，片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等也可以包含但不限于以下物质：粘合剂，诸如羟丙基纤维素、聚维酮或羟丙基甲基纤维素；填充剂，诸如微晶纤维素、预胶化淀粉、淀粉、甘露醇或乳糖一水合物；崩解剂，诸如交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮或羧甲基淀粉钠；润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸或其它金属硬脂酸盐；甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜；和/或调味剂，诸如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊剂时，除了上述类型的物质之外，它还可以包含液体载体，诸如植物油或聚乙二醇。各种其它物质可以作为包衣存在，或者用来改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可以包衣明胶、聚合物、蜡、紫胶或糖等。此外，((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯可以包含在缓释制剂和装置中。

对于眼睛或其它外部组织(如口和皮肤)的感染，药物组合物优选作为局部软膏剂或乳膏剂或凝胶剂施用，该局部软膏剂或乳膏剂或凝胶剂含有例如0.01-10％w/w、优选0.2-5％w/w和最优选0.5-2％w/w的量的((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯。当配制成软膏剂时，活性成分可以与石蜡基质或水溶性软膏基质一起使用。或者，活性成分可以用水包油乳膏基质配制成乳膏剂。

适用于口中局部给药的药物组合物包括：锭剂(lozenge)，该锭剂包含在调味基(例如蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中的((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯；锭剂，该锭剂包含在惰性基诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶中的活性成分；以及漱口剂，该漱口剂包含合适液体载体中的活性成分。

用于直肠给药的制剂可以呈现为栓剂，该栓剂具有合适的基质，包括例如可可脂或水杨酸盐。

用于阴道给药的制剂可以呈现为阴道环、植入剂、凝胶剂、乳膏喷雾泡沫或栓剂。

适用于肠胃外给药的药物制剂是无菌的，并且包括：含水的和非水的注射液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期受体的血液等渗的溶质；和含水的和非水的无菌混悬剂，其可以包括助悬剂和增稠剂。制剂可以存在于单剂量或多剂量容器中，例如，密封安瓿瓶和带有弹性塞子的小瓶中，并且可以在使用前仅需要添加无菌液体载体(如注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件下储存。注射液和混悬剂可以由前述类型的无菌散剂、颗粒剂和片剂制备。

除了上面特别提到的成分之外，药物组合物/制剂可以包括本领域常规的其它成分，这与讨论中的制剂类型相关。

在另一个实施方案中，提供兽药组合物，该兽药组合物包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯及其兽药载体。兽药载体是可用于将组合物给药于猫、狗、马、兔和其它动物的物质，并且可以是在兽医领域中呈惰性或可接受的并与活性成分相容的固体、液体或气体物质。这些兽药组合物可以口服给药、肠胃外给药或通过其它期望途径给药。

((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯可以用于提供含有基质或吸收物质以及本发明的活性成分的控释药物制剂，其中活性成分的释放可以控制并调节以使得更低的给药频率或改善化合物的药代动力学或毒性特征。适于口服给药的控释制剂(其中离散单位包含本发明的化合物)可以根据常规方法制备。

在一个实施方案中，((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯可以以纳米粒的形式存在，该纳米粒的平均粒径小于2,000nm、小于1,500nm、小于1,000nm、小于750nm、小于500nm或小于250nm。

((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯的有用剂量可以通过比较体外活性和动物模型中的体内活性来确定。将小鼠和其它动物的有效量/剂量外推至人类的治疗有效量/剂量的方法是本领域已知的。

用于治疗所需的((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯的量会随几个因素而变化，包括但不限于给药途径、所治疗病症的性质以及患者的年龄和病症；最终，给药量会由巡诊医生或临床医生自行决定。((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯的治疗有效量/剂量至少取决于所治疗病症的性质、任何毒性或药物相互作用问题、是否该化合物是预防性使用(例如有时需要较低剂量)或是针对活动性疾病或病症、递送方法和药物制剂，并且会由临床医生使用常规剂量递增研究来确定。

在一个实施方案中，((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯的口服剂量可以为每天约0.0001至约100mg/kg体重，例如，每天约0.01至约10mg/kg体重、每天约0.01至约5mg/kg体重、每天约0.5至约50mg/kg体重、每天约1至约30mg/kg体重、每天约1.5至约10mg/kg体重或每天约0.05至约0.5mg/kg体重。作为一个非限制性实例，约70kg体重的成年人的每日候选剂量是约0.1mg至约500mg、或约1mg至约500mg、或约5mg至约300mg、或约10mg至约150mg、或约25mg至约150mg、或约5mg至约100mg，并且可以采取单剂量或多剂量的形式。

在实施方案中，((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物在T细胞、活化的外周血单核淋巴细胞(PBMC)和巨噬细胞中抗HIV-1表现出相对于替诺福韦500-1000倍增强的抗HIV-1活性。

在某些实施方案中，((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物单独给药或与一种或多种另外的治疗药剂联合给药可以降低患者体内的可检测病毒RNA/DNA水平。例如，本文公开的方法可以使病毒RNA/DNA水平相对于开始治疗之前的病毒RNA/DNA水平降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在某些情况下，((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物可以给药于患者，使得在疗程完成后患者体内检测不到病毒RNA/DNA水平。病毒RNA/DNA水平可以通过定量的多循环逆转录酶PCR来确定。这样的技术是已知的，例如，在美国第6,172,046号中第4栏第50行至第6栏第5行，其援引加入本文。如本文使用的，检测不到病毒RNA/DNA水平描述了每毫升患者血清中拷贝数小于100的情况。

治疗方法包括向需要其作为治疗性或预防性治疗的个体/患者给药((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯。因此，可以向患有医学疾病的个体/患者或可能得该疾病的个体给药((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯。普通技术人员会理解，给予这样的治疗是为了改善、预防、延缓、治愈和/或减轻疾病(包括复发性疾病)的症状或症状集合的严重程度。也可以给予治疗以延长个体的存活时间，例如，超过在没有这样的治疗的情况下的预期存活时间。可以用((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯治疗的医学疾病包括本文论述的那些疾病，包括但不限于HIV感染、HBV感染和HCV感染。

为了更全面地理解本发明，阐述了以下实施例。这些实施例仅用于说明目的，不应解释为以任何方式限制本发明的范围。以下组合物通过药学领域中公知的任何工艺/方法制备。

实施例1-((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐片剂

实施例2-((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐片剂

实施例3-((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐片剂

实施例4-((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐分散片

实施例5-((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐口服混悬散剂

实施例6-((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐口服颗粒剂

实施例7-恩曲他滨+((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐片剂

实施例8-依非韦伦+((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐片剂

实施例9-奈韦拉平+((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐片剂

实施例10-埃替拉韦+((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐片剂

实施例11-雷特格韦+((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐片剂

实施例12-度鲁特韦+((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐片剂

实施例13-阿扎那韦+((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐片剂

实施例14-地瑞那韦+((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐片剂

实施例15-科比司他+((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐片剂

实施例16-阴道环

为了更全面地理解本发明，阐述了以下制备与测试方法。这些方法仅用于说明目的，不应解释为以任何方式限制本发明的范围。

1.((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐对新鲜PBMC中的HIV-1的体外疗效：

从筛选出的供体中分离对HIV和HBV呈血清阴性的新鲜人PBMC(BiologicalSpecialty Corporation,Colmar,PA)。通过低速离心将细胞沉淀/洗涤2-3次，并且在PBS中再悬浮以去除受污染的血小板。然后，用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)将Leukophoresed血液稀释1:1，并且在50mL离心管中15mL Ficoll(GE Healthcare#17-1440-02)上进行分层，然后以600X g离心30分钟。从所产生的界面轻轻吸出带状PBMC，随后通过低速离心用PBS洗涤2X。最后一次洗涤后，通过台盼蓝排除法计数细胞，并以1 x 10⁶个细胞/毫升再悬浮在RPMI1640中，补充15％胎牛血清(FBS)和2mM L-谷氨酰胺、4μg/mLPhytohemagglutinin(PHA，Sigma)。使细胞在37℃孵育48-72小时。在孵育后，将PBMC离心并在添加15％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和约100-150U/mL重组人IL 2(R&D Systems,Inc)的PRMI 1640中进行再悬浮。将IL 2包含在培养基中，以维持由PHA促分裂刺激引发的细胞分裂。以1-2 x 10⁶细胞/mL的浓度将PBMC保持在该培养基中，每两周更换一次培养基，直到用于试验方案。细胞在认为太老而不能用于试验之前最多培养两周，并丢弃。由于附着在组织培养瓶上，MDM从培养物中消耗掉。对于标准PBMC试验，将来自至少两个正常供体的PHA刺激细胞合并(混合在一起)，在新鲜培养基中稀释到最终浓度为1 x 10⁶细胞/mL，并且以标准形式以50μL/孔(5 x 10⁴细胞/孔)铺板在96孔圆底微孔板的内部孔中。来自超过一个供体的单核细胞的合并(混合)用于最小化单个供体之间观察到的变异性，这种变异性是由HIV感染的定量和定性差异以及原代淋巴细胞群体对PHA和IL 2的总体反应造成的。每个板含有病毒/细胞对照孔(细胞加病毒)、实验孔(药物加细胞加病毒)和化合物对照孔(药物加无细胞培养基，细胞毒性的MTS检测所必需的)。在该体外试验中，在整个孵育期的持续时间中，PBMC生存力保持较高。因此，感染孔用于评估抗病毒活性和细胞毒性。在微量滴定管中以2X浓度配制测试药物稀释液，并且将100μL每种浓度(共9种浓度)放入使用标准形式的合适孔中。在每个测试孔中放置50μL病毒储备液的预定稀释液(最终MOI约为0.1)。感染后，PBMC培养物在37℃、5％CO₂下保持6-7天。在该阶段后，收集无细胞上清液样品，用于分析逆转录酶活性和/或p24抗原含量。

在去除上清液样品后，通过向板中添加MTS以确定细胞生存力来测定化合物细胞毒性。还用显微镜检查孔，并且记录任何异常情况。

利用基于微量滴定板的逆转录酶(RT)反应(Buckheit等人，AIDS研究和人类逆转录病毒7:295-302，1991)。将氚标记胸苷三磷酸(³H-TTP，80Ci/mmol，NEN)以1mCi/mL接收在1:1dH₂O:乙醇中。通过将150μL聚rA(20mg/mL)与0.5mL寡聚dT(20单位/mL)和5.35mL无菌dH₂O组合然后进行等分(1.0mL)将聚rA:寡聚dT模板:引物(GE Healthcare)制备成储备液并在-20℃下储存。RT反应缓冲液每日新鲜制备，并且由125μL 1.0M EGTA、125μL dH₂O、125μL 20％Triton X100、50μL 1.0M Tris(pH 7.4)、50μL 1.0M DTT和40μL 1.0M MgCl₂组成。通过将1份³H-TTP、4份dH₂O、2.5份聚rA:寡聚dT储备液和2.5份反应缓冲液组合来制备最终的反应混合物。将10微升该反应混合物放入圆底微量滴定板中，并且加入15μL含病毒的上清液并进行混合。将板在37℃下孵育60分钟。孵育后，将反应体积点在DE81过滤垫(Wallac)上，用5％磷酸钠缓冲液或2X SSC(Life Technologies)洗涤5次，每次5分钟。接下来，用蒸馏水洗涤2次，每次1分钟；用70％乙醇洗涤2次，每次1分钟；然后干燥。使用标准液体闪烁技术定量结合放射性(每分钟计数，CPM)。

试验结束时，用可溶性四唑基染料MTS(CellTiter 96Reagent，Promega)对试验板进行染色，以确定细胞生存力并量化化合物毒性。代谢活性细胞的线粒体酶代谢MTS产生可溶性甲

产物。这实现了细胞生存力和化合物细胞毒性的快速定量分析。MTS是稳定溶液，无需在使用前制备。在试验结束时，每个孔添加20μL MTS试剂。然后，将微量滴定板在37℃下孵育4-6小时。孵育间隔是根据经验确定的最佳染料还原时间来选择的。使用粘合板密封器代替盖子，将密封板倒置若干次以混合可溶性甲

产品，并且用Molecular DevicesSpectraMaxPlus i3读取器在490/650nm下用分光光度法读取板。

结论：发现测试物对两株HIV-1分离株具有强效活性，具有高选择性指数，表明了高抗病毒活性和低毒性。

2.((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐对HepG2细胞中HBV细胞的体外疗效

使用实时qPCR(TaqMan)进行最初抗HBV试验，以测定与从HepG2 2.2.15细胞释放的病毒颗粒相关联的细胞外HBV DNA拷贝数。HepG2 2.2.15细胞系是一种稳定的人肝母细胞瘤细胞系，包含两个HBV野生型菌株ayw1基因组的拷贝并且组成性地产生高水平的HBV。使用该细胞系可以鉴定和表征阻断病毒复制的任何后期步骤(诸如转录、翻译、前基因组包封、逆转录、颗粒组装和释放)的抗病毒化合物。简而言之，将HepG2 2.2.15细胞以1.5x10⁴细胞/孔接种在96孔微量滴定板中在补充有2％FBS、380μg/mL G418、2.0mM L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和0.1mM非必需氨基酸的杜式改良伊格尔氏培养基中。只有内部孔用于减少细胞培养期间观察到的“边缘效应”；外部孔填充有完全培养基，有助于最小化样品蒸发。16-24小时后，洗涤HepG2 2.2.15细胞的汇合单层，并且用含有各种浓度测试化合物(一式三份)的完全培养基替换该培养基。拉米夫定(3TC)用作阳性对照，而单独培养基添加到细胞作为阴性对照(病毒对照，VC)。三天后，用含有适当稀释的测试化合物的新鲜培养基替换培养基。测试化合物初次给药后6天，收集细胞培养上清液，用链霉蛋白酶处理，然后用于实时定量TaqMan qPCR试验。通过监测荧光信号的增加来实时检测PCR扩增的HBV DNA，荧光信号的增加是由与扩增的HBV DNA杂交的淬灭荧光探针分子的核酸外切性降解引起的。对于每次PCR扩增，同时使用纯化HBV DNA的稀释液产生标准曲线。抗病毒活性是根据HBV DNA水平的降低(测定EC₅₀值)来计算的。然后，采用四唑染料(MTS；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑；

96试剂，Promega)摄入试验，使用相同试验板来测定细胞生存力，并且使用生存力数据来计算化合物细胞毒性(CC₅₀)。选择性指数计算为CC₅₀/EC₅₀。

结论：发现测试物对HBV具有强效活性，具有高选择性指数，表明了高抗病毒活性和低毒性。

3.使用HCV复制子试验测定((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐对HCV的体外疗效

使用基因型1a(H77菌株)、1b(Con1菌株)和2a(JFH-1菌株)(其为包含HCV复制子的Huh7人肝癌细胞系)的亚基因组HCV复制子。

HCV复制子抗病毒评估试验检测化合物在六个系列稀释下的效果。人干扰素α-2b(rIFNα-2b)和/或索非布韦包含在每轮试验中作为阳性对照化合物。

简而言之，复制子细胞以5,000个细胞/孔接种到96孔板中，这些孔板专用于分析细胞数量(细胞毒性)或抗病毒活性。第二天，用试验培养基稀释样品，并且添加到合适的孔中。在72小时后细胞仍然是近汇合时处理细胞。对于荧光素酶端点试验，评估HCV复制子水平作为复制子得出的Luc活性。通过荧光CytoTox-1细胞增殖试验(Promega)来评估减少细胞生存力的药物浓度(以细胞数表示)。对于qRT-PCR/TaqMan试验，根据制造商的方案使用RNeasy 96试剂盒(Qiagen)从复制子细胞中提取总RNA。进行实时RTPCR/TaqMan试验以测量复制子RNA和细胞核糖体RNA的拷贝数。在适用的情况下，得出EC₅₀(抑制HCV 50％的浓度)、CC₅₀(使细胞生存力降低50％的浓度)和SI(选择性指数：CC₅₀/EC₅₀)值。

结论：发现测试物对HCV具有强效活性，具有高选择性指数，表明了高抗病毒活性和低毒性。

4.((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐与11种FDA批准的药物组合对HIV-1的体外疗效

评估了((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐与替诺福韦、替诺福韦艾拉酚胺、恩曲他滨、依非韦伦、奈韦拉平、阿扎那韦、地瑞那韦、科比司他、雷特格韦、度鲁特韦和埃替拉韦的双药物组合研究的抗HIV-1活性和细胞毒性。

该双药物组合分析研究使用Prichard和Shipman MacSynergy II三维模型进行以统计评估组合抗HIV试验。使用标准化微量滴定板形式，在急性感染HIV-1NL4-3的MT4细胞中进行每个组合试验。

MT4细胞(从NIH AIDS研究与参考试剂项目获得)在用于抗病毒试验之前在T-75烧瓶中进行传代。在试验的前一天，细胞以1:2分裂，以确保它们在感染时处于指数生长阶段。使用血细胞计数器和台盼蓝排除法进行总细胞和生存力定量。在试验中使用了大于95％细胞生存力的细胞。将细胞再悬浮在组织培养基中，并且以110μL的体积和5.0x10³个细胞/孔的接种密度添加到含药物的微量滴定板中。

使用方格板形式测试五种浓度的药物A(即替诺福韦、替诺福韦艾拉酚胺、恩曲他滨、依非韦伦、奈韦拉平、阿扎那韦、地瑞那韦、科比司他、雷特格韦、度鲁特韦和埃替拉韦)与八种浓度的药物B(((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐)的所有可能组合。在包括细胞对照孔(只有细胞)和病毒对照孔(细胞加病毒)的三个相同试验板(即一式三份测量)上评估组合抗病毒疗效。在包括细胞对照孔的两个相同试验板(即重复测量)上平行评估组合细胞毒性。

下面是((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯富马酸盐与替诺福韦、替诺福韦艾拉酚胺、恩曲他滨、依非韦伦、奈韦拉平、阿扎那韦、地瑞那韦、科比司他、雷特格韦、度鲁特韦和埃替拉韦的双药物组合试验中对感染的(抗病毒)MT4细胞中的HIV-1NL4-3的抗病毒测试以及未感染的(细胞毒性)MT4细胞中的细胞毒性测试的结果。

下面是“阳性拮抗作用对照”(司他夫定/利巴韦林)对MT4细胞中HIV-1NL4-3的抗病毒和细胞毒性测试的结果。

Claims

1.药物组合物，其包含((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯是富马酸盐的形式。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物的存在量为所述组合物的约2％至约80％。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述一种或多种药学上可接受的赋形剂选自载体、稀释剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、膨胀剂、调味剂或其任意组合。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物通过口服途径、局部途径、直肠途径、肠胃外途径或阴道途径给药。

6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物是可摄入片剂、分散片、口含片、锭剂(troche)、胶囊剂、酏剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂、自乳化药物递送系统(SEDDS)、自微乳化药物递送系统(SMEDDS)、局部软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、锭剂(lozenge)、软膏剂、栓剂、阴道环、植入剂、喷雾泡沫、注射剂的形式，或者是药盒的形式。

7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物的平均粒径小于2000nm。

8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物的平均粒径小于250nm。

9.根据权利要求1所述的药物组合物，其还包含另外的治疗药剂，所述另外的治疗药剂选自核苷逆转录抑制剂(NRTI)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、整合酶抑制剂、CCR5抑制剂、融合抑制剂和成熟抑制剂(MI)或其任意组合。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述另外的治疗药剂选自恩曲他滨、依非韦伦、奈韦拉平、地瑞那韦、阿扎那韦、齐多夫定、地达诺新、司他夫定、拉米夫定、扎西他滨、硫酸阿巴卡韦、地拉韦定、沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、奈非那韦、安普那韦、科比司他、洛匹那韦、恩夫韦地、度鲁特韦、埃替拉韦、雷特格韦、利匹韦林或其任意组合。

11.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述另外的治疗药剂选自重组人干扰素α诸如聚乙二醇化干扰素α-2a或聚乙二醇化干扰素α-2b(统称为“聚乙二醇干扰素”或“PEG”)、核苷类似物例如利巴韦林、直接作用的抗病毒剂(例如达卡他韦、波普瑞韦和特拉匹韦)、NS3/4A蛋白酶抑制剂(PI)(例如西咪匹韦)、核苷酸NS5B聚合酶抑制剂(例如索非布韦)、NS5A抑制剂(例如达卡他韦)、非核苷NS5B聚合酶抑制剂(例如达萨布韦)或其任意组合。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述另外的治疗药剂选自聚乙二醇干扰素、利巴韦林、索非布韦、达卡他韦、维帕他韦、伏西瑞韦、波普瑞韦、特拉匹韦、西咪匹韦、达萨布韦、雷迪帕韦、奥比他韦、帕利瑞韦、利托那韦、艾尔巴韦、格佐匹韦、阿孙普韦、贝卡布韦或其任意组合。

13.治疗需要这样的治疗的患者中的由逆转录病毒或乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒引起的疾病的方法，所述方法包括给药包含治疗有效量的((((((R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基)氧基)甲基)(苯氧基)磷酰基)氧基)甲基新戊酸酯或其药学上可接受的衍生物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。