CN111574525A - 一种金属卟啉配合物及制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金属卟啉配合物及制备方法及应用，通过光动力机制对金黄色葡萄球菌生物活性抑制的应用，该金属配合物以卟啉小分子为配体与Ga配位形成四配位金属配合物，形成镓卟啉配合物对金黄色葡萄球菌有良好的抑菌作用，并且可以有效干扰细菌生物膜的形成和溶血霉素的分泌，本发明的镓卟啉配合物在光动力作用下能够有效抑制细菌生长和促进小鼠伤口修复，减低细菌的耐药性和毒性，因此，该镓卟啉配合物有良好的应用前景。

Description

一种金属卟啉配合物及制备方法及应用

技术领域

本发明涉及抗菌生物活性领域，尤其是涉及配合物对金黄色葡萄球菌抑菌效果研究，具体涉及一种金属卟啉配合物的合成方法及应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)，是一种常见的临床致病菌，具有广泛的分布。人体被感染后将会导致一系列的病变，例如呼吸系统、泌尿系统以及血液系统等方面的疾病。随着抗菌药物在临床上的广泛使用，使得菌株对药物出现不同程度的耐药率，导致许多种类的抗菌药物已经不能满足临床治疗要求，给治疗方面带来很大困扰。传统的抗菌药物对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度相对比较高，而且具体的抑菌机制缺乏系统性研究，给后续药物的进一步研发带来一定的局限性。因此，研究新型的抗菌药物迫在眉睫。

目前，临床用于治疗金黄色葡萄球菌的药物种类比较多，但是细菌对很多药物容易产生耐药性。然而，最近研究表明通过抑制金黄色葡萄球菌的溶血酶素的分泌(Hemolysin)以及生物膜的形成(Biofilm formation)等途径可以减少细菌对药物耐药性的产生。而且这几种因素是细菌入侵宿主和产生耐药性的重要途径。因此，我们可以通过以上几种因素的理论模型来指导药物的筛选，一方面可以减少易产生耐药性抗菌药物的使用，用新型的抗菌药物取代，另一方面通过这种新策略筛选的抗菌药物给临床治疗带来便捷，而且尽可能的减少药物对人体的副作用。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种金属卟啉配合物及制备方法及应用。

为实现上述目的，本发明提供一种金属卟啉配合物，所述金属卟啉配合物分子式为C₄₈H₃₆N₄O₄，其结构式为：

所述活性中心M为Ga。

本发明还提供上述活性中心M为Ga的金属卟啉配合物的制备方法，具体包括如下步骤：

将四对甲氧苯基卟啉和氯化镓加入无水吡啶溶剂中，通入氮气保护加热条件下反应，反应结束后冷却至室温得到深红色溶液，除去溶剂，收集沉淀物；洗涤液洗涤后，干燥；所述卟啉小分子配体和氯化镓摩尔比为1∶2-10；卟啉小分子配体和氯化镓混合物加入无水吡啶溶剂，形成终浓度0.05-0.5mol/L。

作为进一步改进，所述洗涤液为冷却后的乙醇或氯仿或两者组合物。

本发明还提供上述金属卟啉配合物的应用，金属卟啉配合物用于制备金黄色葡萄球菌抑制剂的用途。

作为本发明的一种应用方式，所述金黄色葡萄球菌抑制剂为金黄色葡萄球菌溶血酶素分泌抑制剂。

作为本发明的一种应用方式，所述金黄色葡萄球菌抑制剂为金黄色葡萄球菌生物膜成型抑制剂。

作为本发明的一种应用方式，所述金黄色葡萄球菌抑制剂为光敏金黄色葡萄球菌抑制剂。

进一步的，在所述活性中心M为Ga时，所述光敏金黄色葡萄球菌抑制剂在自然光条件使用，金黄色葡萄球菌抑制的有效浓度为128μg/mL。

进一步的，在所述活性中心M为Ga时，所述光敏金黄色葡萄球菌抑制剂在光照强度为2000-10000LUX下使用，金黄色葡萄球菌抑制的有效浓度为3.9-100μg/mL。

进一步的，在所述活性中心M为Ga时，所述光敏金黄色葡萄球菌抑制剂在光照强度为20000LUX下使用，金黄色葡萄球菌抑制的有效浓度为0.5μg/mL。

本发明具有如下优点：本发明通过金属卟啉配合物对金黄色葡萄球菌生物活性的研究，以光敏剂卟啉分子为配体，金属离子Ga为配位中心，合成了一种具有生物活性的镓卟啉配合物，具有很好的抗菌活性，发现该类配合物对大肠杆菌和铜绿假单胞菌没有明显的抑制效果，对金黄色葡萄球菌具有很好的抑制效果，通过光动力产生活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)进行杀菌，其MIC为0.5μg/mL，接着从溶血和生物膜实验进一步表明镓卟啉配合物以明显抑制细菌生物膜的形成和降低细菌的溶血效果，减低细菌耐药性的产生，本发明的镓卟啉配合物对金黄色葡萄球菌抑制效果比硝酸镓要明显。

附图说明

图1为实施例1中镓卟啉配合物的合成路线；

图2为实施例2中镓卟啉配合物抗菌活性筛选；

图3为实施例3中镓卟啉配合物抗菌活性优化，(A)光照条件优化，(B)药物浓度与抗菌活性关系，(C)金属离子、配体以及配合物光动力抗菌活性；

图4为实施例4中不同金属的卟啉配合物抗菌活性测试；

图5为实施例5中镓卟啉配合物抑制金黄色葡萄球菌溶血酶素的分泌；

图6为实施例6中镓卟啉配合物抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成；

图7为实施例1制备的镓卟啉配合物的核磁氢谱图

具体实施方式

下面将结合实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明的范围。

实施例1镓卟啉配合物的合成路线

配合物的合成，称取一定量的四对甲氧苯基卟啉(1.0mmol)和氯化镓(0.5mmol)置于100mL圆底烧瓶中加入无水吡啶溶剂30mL，通入氮气保护加热回流反应8h。反应结束后冷却至室温，得到深红色溶液，旋干收集沉淀，并用少量预冷的乙醇清洗，粗产品再用氯仿洗涤，过滤置于真空干燥器中干燥过夜，得到深紫色粉末。镓卟啉配合物合成路线如图1所示。核磁数据如下：

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ9.07(s，4H)，8.41(m，3H)，7.63(d，J＝0.8Hz，1H)，8.14(d，J＝4.0Hz，4H)，7.90(t，7H)，7.43(d，J＝4.0Hz，4H)，4.07(s，7H)。

实施例2镓卟啉配合物抗菌活性筛选

镓卟啉配合物对细菌工C₅₀值测定，将过夜培养的大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌稀释培养至对数期，再将细菌稀释至OD为0.05备用，取6块无菌的96孔板，每种菌各2块板，光照与黑暗条件下各一块。镓卟啉配合物用培养基稀释，再用二倍法等梯度稀释不同的药物浓度(512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL)。每个孔中加入50μL镓卟啉配合物再加入50μL稀释后的菌液，放入37℃培养箱中培养20h，培养基作为负对照，菌液(不含药物)作为正对照。用酶标仪测OD600的吸收，采用Log₁₀OD计数。如图2结果所示，IC₅₀结果发现镓卟啉配合物在黑暗条件下基本无抑菌效果；在光照条件下，浓度为0.25μg/mL时对大肠杆菌的抑菌效果不明显，对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果，而0.5μg/mL时对金葡菌有显著的抑菌效果。因此，可认为该镓卟啉配合物对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌性能。

实施例3镓卟啉配合物抗菌活性条件优化

将过夜培养的金黄色葡萄球菌稀释培养至对数期，将菌稀释至OD为0.05备用。取5块无菌的96孔板，镓卟啉配合物用培养基稀释，再用二倍法等梯度稀释不同的药物浓度(512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL)。每个孔中加入50μL镓卟啉配合物再加入50μL稀释后的菌液。黑暗条件下1块，其余4块分别使用光照强度为2513、6573、9894、20000LUX的光照射，放入37℃培养箱中培养20h，培养基作为负对照，菌液(不含镓卟啉配合物)作为正对照。用酶标仪测OD600的吸收，记录各光照强度下的MIC值。图3A所示，当光照强度为20000LUX时，MIC值最低抑菌浓度最低为0.5μg/mL，极低浓度下即可显著抑制金葡菌的生长。

同样将过夜培养菌稀释培养至对数期，将菌稀释至0D为0.05备用。取无菌的96孔板，镓卟啉配合物用培养基稀释至16.0μg/mL，再用二倍法等梯度稀释不同的药物浓度(512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL)。每个孔中加入50μL镓卟啉配合物再加入50μL稀释后的菌液，则此时镓卟啉配合物最大浓度为8.0μg/mL。光照与黑暗条件下各1块板，放入37℃培养箱中培养20h，培养基作为对照。用酶标仪测OD600的吸收，与对照组相比得出细菌存活率。当药物浓度从0到1.0μg/mL增长过程中，如图3B所示，光照条件下，细菌存活率快速下降，至8.0μg/mL时，细菌存活率几乎为0；而在黑暗条件下，细菌存活率只降低了不到20％。

同样将过夜培养菌稀释培养至对数期，将菌稀释至OD为0.05备用。取无菌的96孔板，取硝酸镓溶液、卟啉配体、镓卟啉配合物用培养基稀释至相同浓度，再用二倍法等梯度稀释不同的药物浓度(512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL)。每个孔中加入50μL药物再加入50μL稀释后的菌液。黑暗与光照条件下各培养20h，培养基作为对照。用酶标仪测OD600的吸收，与对照组相比得出细菌存活率。如图3C示，光照条件下，相比对照组，只有镓卟啉配合物有明显的抑菌效果(p＜0.0001)。

实施例4不同金属卟啉配合物抗菌活性对比

利用卟啉小分子作为配体，以金属镓、铁、铋、钼、钴、镍、铜作为活性中心，制备不同的金属卟啉配合物。将过夜培养的金黄色葡萄球菌稀释培养至对数期，将菌稀释至0D为0.05备用。取无菌的96孔板，药物用培养基稀释，再用二倍法等梯度稀释不同的药物浓度(512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL)。每个孔中加入50μL药物再加入50μL稀释后的菌液。每种药物2块板，光照与黑暗条件下各1块。放入37℃培养箱中培养20h，培养基作为负对照，菌液(不含药物)作为正对照。用酶标仪测OD600的吸收。如图4所示，金属镓、铋、钼、钴、镍、铜作为活性中心，制备不同的金属卟啉配合物均对金葡萄球菌有明显的抑制效果，其中当金属镓为活性中心时，光照与黑暗条件下的MIC值有明显的统计学差异(p＜0.0001)，且光照时的MIC值在各金属配合物中最低，对金葡萄球菌有最明显的抗菌效果。

实施例5镓卟啉配合物抑制金黄色葡萄球菌溶血酶素的分泌

将各金黄色葡萄球菌标准菌株接种于TSB液体培养基中(37℃，200r/min)培养至对数生长初期(D＝0.3)，分装，分别加入0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0μg/mL的镓卟啉配合物共培养至对数生长后期(D＝2.5)。然后将细菌培养物离心(5500×g，4℃，1min)，收集菌上清。取1.5mL离心管，加入875μL PBS，100μL菌上清以及25μL脱纤维兔红细胞，混匀，于37℃孵育15min后离心(5500×g，室温，1min)使未破裂的红细胞沉积于管底。然后取上清在543nm处测光密度。如图5所示，当镓卟啉配合物浓度为0.2μg/mL时，溶血率已较低，与对照组PBS有显著的统计学差异(p＜0.001)，说明镓卟啉配合物可以明显降低金葡菌的溶血效果。

实施例6镓卟啉配合物抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成

以6孔板为载体，每孔中加入1mL TSB稀释过的菌液，再加入不同浓度的镓卟啉配合物，3个重复孔，实验组为0.2μg/mL、0.5μg/mL、2.0μg/mL，以空TSB培养基作为对照，37℃培养72h定量测定生物膜。首先缓慢移除每孔中的培养物，然后用PBS缓冲液清洗2～3次，洗去未黏附的菌体，自然干燥后加入3mL 0.1mg/mL的结晶紫染液进行染色20min，再用PBS进行缓慢冲洗，直至流出无色为止，室温静置干燥，除去多余水分，随后加入3mL体积分数33％乙酸进行脱色15min，最后用酶标仪测定OD570的值衡量生物膜的多少。结果如图6所示，对照组染色最深，生物膜完整，而随着药物浓度的增大，结晶紫颜色越来越淡，生物膜破碎程度越来越大，表明镓卟啉配合物可以明显抑制细菌生物膜的形成。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种金属卟啉配合物，其特征在于：所述金属卟啉配合物分子式为C₄₈H₃₆N₄O₄，其结构式为：

所述活性中心M为Ga。

2.一种金属卟啉配合物的制备方法，其特征在于，根据权利要求1所述的金属卟啉配合物，所述活性中心M为Ga，具体包括如下步骤：

将四对甲氧苯基卟啉和氯化镓加入无水吡啶溶剂中，通入氮气保护加热条件下反应，反应结束后冷却至室温得到深红色溶液，除去溶剂，收集沉淀物；洗涤液洗涤后，干燥；所述卟啉小分子配体和氯化镓摩尔比为1∶2-10；卟啉小分子配体和氯化镓混合物加入无水吡啶溶剂，形成终浓度0.05-0.5mol/L。

3.权利要求2所述的一种金属卟啉配合物的制备方法，其特征在于，所述洗涤液为冷却后的乙醇或氯仿或两者组合物。

4.一种金属卟啉配合物的应用，其特征在于，根据权利要求1任一所述的金属卟啉配合物用于制备金黄色葡萄球菌抑制剂的用途。

5.根据权利要求4所述的一种金属卟啉配合物的应用，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌抑制剂为金黄色葡萄球菌溶血酶素分泌抑制剂。

6.根据权利要求4所述的一种金属卟啉配合物的应用，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌抑制剂为金黄色葡萄球菌生物膜成型抑制剂。

7.根据权利要求4或5或6一种金属卟啉配合物的应用，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌抑制剂为光敏金黄色葡萄球菌抑制剂。

8.根据权利要求7一种金属卟啉配合物的应用，其特征在于，在所述活性中心M为Ga时，所述光敏金黄色葡萄球菌抑制剂在自然光条件使用，金黄色葡萄球菌抑制的有效浓度为128μg/mL。

9.根据权利要求7一种金属卟啉配合物的应用，其特征在于，在所述活性中心M为Ga时，所述光敏金黄色葡萄球菌抑制剂在光照强度为2000-10000LUX下使用，金黄色葡萄球菌抑制的有效浓度为3.9-100μg/mL。

10.根据权利要求7一种金属卟啉配合物的应用，其特征在于，在所述活性中心M为Ga时，所述光敏金黄色葡萄球菌抑制剂在光照强度为20000LUX下使用，金黄色葡萄球菌抑制的有效浓度为0.5μg/mL。

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