CN111567525A - 一种防治柑橘黄龙病的组合物及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种防治柑橘黄龙病的组合物及其方法，首次采用具有抑制革兰氏阴性菌的中药材提取物进行黄龙病菌抑菌试验，结果显示五倍子乙酸乙酯萃取物和大血藤正丁醇萃取物的抑菌效果明显，同时采用高效液相技术对化合物进行分离，再利用1H NMR、13C NMR及MS对化合物结构进行分析，结果显示：没食子酸和水杨酸具有良好抑菌效果，可用于农业生产。

Description

一种防治柑橘黄龙病的组合物及其方法
技术领域
本发明涉及柑橘病虫防治领域，具体涉及一种防治柑橘黄龙病的组合物及其方法。
背景技术
柑橘(Citrus L.)属芸香科柑橘亚科是热带、亚热带常绿果树，可以用于作为经济栽培的主要有三个属：积属、柑橘属和金柑属，其中又以柑橘属为主要栽培品种。中国是世界三大柑橘主要生产国家之一，已有四千多年的悠久栽培历史，种植资源也非常丰富。我国柑橘的经济栽培区主要分布在北纬20-30度之间，海拔700-1000米以下。全国栽培柑橘主要分布在包括台湾省在内有19个省，其中主产柑橘的有浙江、福建、湖南、四川、广西、湖北、广东、江西、重庆和台湾等10个省(市、区)。柑橘果实中营养丰富，色香味俱全，果实即可用于新鲜食用，又可用于果汁的加工，还可以从果皮和果肉中提取香精油等工业深层次加工。柑橘种子中富含有维生素E，可以用于榨取植物油和提取植物蛋白。我国柑橘的产量居各种水果之首，受到广大消费者的青睐。在我国柑橘产业已经成为农业产业结构调整、农民增收的主导和支柱项目。
我国的柑橘品种主要可以分为柑类、橘类、橙类、柠檬类和柏类五个方面。其中又以宽皮柑橘为主要生产和栽培品种。我国宽皮柑橘占柑橘总产量的71％，橙类占16％柚子类和其它占13％。而世界柑橘以橙类为主(锦橙、脐橙)，约占63％，宽皮柑橘(温州蜜柑、碰柑)占17％，葡萄柏、柠檬等占20％。温州蜜柑是我国柑橘栽培的主要种类，目前栽培较多的为早熟的宫川、兴津等早熟品种，成熟期一般在10月上中旬。但在10月以前成熟的品种不多，表现较好的更少。碰柑是我国宽皮橘的优势类型和主要出口类型。目前，栽培的品种的成熟期以中熟为主，早熟和晚熟品种栽培较少，一般可在10月下旬至11月中下旬采收。锦橙又名鹅蛋柑26号，原产中国重庆江津，系40年代从地方实生甜橙中选出的优良变异，是中国甜橙中发展最快的品种，一般在11月下旬成熟。
黄龙病是柑橘的一种致命性病菌灾害，染病后的植株分支变多，叶片变小且呈斑驳性黄化，果实着色不均匀且呈畸形，较正常果实小，严重影响柑橘产量和品质。并且一片柑橘园一旦发现病情，很快便会蔓延整块桔园。目前尚无有效的防治方法，植株染病后，只能挖除销毁，对柑橘产业具有毁灭性的后果。其病原菌是韧皮部限制的革兰氏阴性菌，分为亚洲种(Carndidatus Liberibacter asiaticus,Ca.Las)、美洲种(CarndidatusLiberibacter americanus,Ca.Lam)、非洲种(Candidates Liberibacter africanus,Ca.Laf)，其中亚洲种危害最严重。柑橘木虱(Diaphorina citri)(昆虫纲，同翅目，木虱科)主要危害柑橘等芸香科植物，也是黄龙病在自然界的主要传播媒介。
现有技术存在的问题：现有技术中还未见有效的防治黄龙病的方法，特别是未见利用中草药的有效成分及其修饰化合物防治黄龙病的方法。
发明内容
本发明要解决的关键技术问题在于提供一种防治柑橘黄龙病的组合物及其方法，通过从抑菌中药中提取有效部位和有效单体制成黄龙病菌的抑制剂。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
1、一种黄龙病病原菌分离和培养方法，包括：(1)样品的采集与处理；(2)黄龙病菌培养基配置；(3)黄龙病菌种培养与培养体系优化；(4)基于16S rDNA的菌种鉴定。
2、一种黄龙病菌抑菌剂的提取方法，包括如下步骤：(1)药材选择与组合物提取；(2)提取部位抑菌效果验证；(3)组合物黄龙病防治效果验证。
3、一种黄龙病菌抑菌化合物的提取方法，包括如下步骤：(1)高效液相色谱分离活性成分；(2)抑菌效果验证；(3)抑制剂化学结构解释；(4)化合物黄龙病防治效果验证。
4、五倍子乙酸乙酯萃取物和大血藤正丁醇萃取物在抑制黄龙病菌中的应用。
5、没食子酸和水杨酸在抑制黄龙病菌中的应用。
附图说明
图1为本发明抑菌圈测量图；
图中，d代表抑菌圈直径。
具体实施方法
本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供了黄龙病病原菌分离和培养方法，包括：
(1)样品的采集与处理
用于黄龙病病原菌培养的实验材料均取自有典型症状的感病柑橘植株。剪取样品材料的根、茎、叶，果实，冲洗除去表面杂物和灰尘，使用滤纸吸干样品材料表面的水分。其中根、茎可直接作为实验材料剪取需要的用量，叶片剪取中脉部分作为实验材料，果实取橘络作为实验材料。表面消毒工作需在超净工作台完成，操作时用镊子夹住材料基部将其浸没在95％乙醇溶液中，取出后甩去材料表面多余乙醇，酒精灯上点燃，按时间精准灼烧灭菌，灭菌后进行接种操作，样品材料放置于-20℃冰箱保存。
(2)黄龙病菌培养基配置
取新鲜无农药残留的脐橙成熟果实榨汁，用纱布过滤去除果肉等纤维组织，过滤灭菌，4℃保存。磷酸钠缓冲液：称取Na2HPO4·H2O 44.5g，Na2HPO4·2H2O 1.27g用去离子水定容到1L，121℃，20min。脐橙叶片汁液：称取5g 2年生新鲜叶片，去离子水洗净后晾干，液氮研磨，加磷酸钠缓冲液20mL常温解冻，121℃20min灭菌，4℃保存备用。
LB果汁培养基(LB培养基+脐橙果汁液200mL/L)；NB果汁培养基(NB培养基+脐橙果汁液200mL/L)；叶汁培养基(脐橙叶片汁液200mL/L+去离子水)；果汁培养基(脐橙果汁液200mL/L+去离子水)。叶汁琼脂培养基(脐橙叶片汁液200mL/L、琼脂20g/L)，NB果汁琼脂培养基(NB培养基、脐橙果汁液200mL/L，琼脂20g/L)。
(3)黄龙病菌种培养与培养体系优化
超净工作台随机选取实验样品的叶片、茎、根部和果实无菌水冲洗5-6次，收集最后一次冲洗的冲洗液。吸取100mL冲洗液，在叶汁琼脂培养基和NB果汁琼脂培养基上涂布均匀；置于28℃细菌恒温培养箱中培养2-3天。菌落长出后，挑选不同形状菌落分别加入到LB果汁培养基、NB果汁培养基、叶汁培养基、果汁培养基中培养。测定菌液浊度和菌斑大小确定每个菌种的最佳培养基。结果显示：亚洲种、美洲种的最佳固体培养基为叶汁琼脂培养基、非洲种的最佳固体培养基为NB果汁琼脂培养基；亚洲种的最佳液体培养基为叶汁培养基，美洲种和非洲种的最佳液体培养基为LB果汁培养基。
(4)菌种鉴定
采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)按试剂盒说明书操作提取菌液DNA，采用细菌通用16S rDNA扩增引物进行扩增。使用Taq Master Mix DNA聚合酶混合体系进行PCR扩增。PCR反应体系为：2XTaq Mater Mix 10μL；特异性上游引物(F)1μL；特异性下游引物(R)1μL；DNA 1μL；ddH2O 7μL。
PCR反应步骤为：预变性94℃2min；变性94℃30s；退火60℃30s；延伸72℃30s；终延伸72℃2min；取8μL反应液用琼脂糖凝胶电泳进行引物特异性的检测。有特异性片段的扩增产物由上海生工测序分析，测序序列经NCBI BLAST检测分别确定为亚洲种(CarndidatusLiberibacter asiaticus,Ca.Las)、美洲种(Carndidatus Liberibacter americanus,Ca.Lam)、非洲种(Candidates Liberibacter africanus,Ca.Laf)。
实施例2
本实施例提供了黄龙病菌抑菌剂的提取方法，包括如下步骤：
(1)药材选择与组合物提取
分别取具有革兰氏阴性菌抑制效果的药材五倍子、乌梅、金银花、五味子、地锦草和大血藤粉碎，过40目筛。取已粉碎药材5g于250mL锥形瓶中，置于KJ-11030AL型超声波清洗器，按液料比10:1加入70％(v:v)乙醇溶液，于600W、40kHz、60℃提取1h，过滤除去药渣，将药渣重复提取4次。提取液经减压浓缩，得棕褐色黏稠稠物，即醇提浸膏。浸膏浸入蒸馏水超声辅助溶解，依次用10倍蒸馏水体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取各5次。浓缩后得五倍子、乌梅、金银花、五味子、地锦草和大血藤的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物共18份，4℃避光保存备用。
(2)提取部位抑菌效果验证
将测试样品以20％DMSO溶解，配制成含量为500μg/mL的供试液，采用牛津杯法进行体外抗黄龙病菌活性考察，分别取亚洲种、美洲种、非洲种的最佳固体培养基，以1×105个/mL菌浓度接种，每一试验重复3次，测试组加1mL/牛津杯供试液，对照组加1mL/牛津杯20％DMSO溶液，培养24小时后，用游标卡尺测抑菌圈大小。实验结果如图1所示.
表1不同提取物抑菌圈大小
Figure BDA0002482807300000041
Figure BDA0002482807300000051
根据表1结果显示：黄龙病菌亚洲种的最佳抑制剂为：五倍子乙酸乙酯萃取物，黄龙病菌美洲种的最佳抑制剂为：五倍子乙酸乙酯萃取物，黄龙病菌非洲种的最佳抑制剂为：大血藤正丁醇萃取物。
(3)组合物黄龙病防治效果验证
取五倍子乙酸乙酯萃取物和大血藤正丁醇萃取物以20％DMSO溶解后溶于无菌水，配制成含量为500mg/L的供试液，对典型症状的感病柑橘植株叶片进行喷雾(对照组喷雾相同体积蒸馏水)，24h后以感染叶片的病害发展面积评价抑菌效果。结果显示：与对照组相比，感染叶片的病害发展面积下降了85.23％，抑菌效果明显。
实施例3
本实施例提供了黄龙病菌抑菌剂的提取方法，包括如下步骤：
(1)高效液相色谱分离活性成分
取五倍子乙酸乙酯萃取物和大血藤正丁醇萃取物1:1混合，乙腈为溶剂超声溶解，0.45μm针头过滤器过滤后，进行HPLC分析，其中产物的纯度按面积归一化法计算。采用ESI源，毛细管电压3500V，雾化气压力30psi，干燥气流速9L/min，干燥气温度350℃，毛细管电压3500V，质量数扫描范围100～1000。正离子模式下：液相色谱条件见表2.1，向流动相A中添加10mM甲酸-氨水缓冲液(调至偏酸性pH 4.5)。负离子模式下：液相色谱条件表2.1，向流动相A添加10mM甲酸-氨水缓冲液(调至偏碱性pH 7.5)。
采用色谱-质谱分析方法获得萃取物正离子模式离子流色谱图相关信息。正离子模式下质谱分子离子峰强度大于1*106的质谱信号共有11个，负离子模式下质谱分子离子峰强度大于1*106的质谱信号共有8个。分离含量最大的化合物个5个，共10个化合物。
(2)抑菌效果验证
将测试样品以20％DMSO溶解，配制成含量为50μg/mL(与组分相比浓度稀释10倍)的供试液，采用牛津杯法进行体外抗黄龙病菌活性考察，分别取亚洲种、美洲种、非洲种的最佳固体培养基，以1×105个/mL菌浓度接种，每一试验重复3次，测试组加1mL/牛津杯供试液，对照组加1mL/牛津杯20％DMSO溶液，培养24小时后，用游标卡尺测抑菌圈大小。实验结果如表2所示.
表2不同化合物的抑菌圈大小
化合物 亚洲种 美洲种 非洲种
化合物1 11.2 21.32 7.96
化合物2 12.3 22.25 3.26
化合物3 8.9 12.36 12.58
化合物4 6.3 3.69 8.36
化合物5 2.21 8.25 2.86
化合物6 7.82 6.35 6.25
化合物7 9.32 3.25 7.28
化合物8 10.25 7.25 9.32
化合物9 12.36 9.36 6.77
化合物10 13.65 7.69 7.58
结果显示：黄龙病菌亚洲种的最佳抑制剂为：化合物5，黄龙病菌美洲种的最佳抑制剂为：化合物4，黄龙病菌非洲种的最佳抑制剂为：化合物5。
(3)抑制剂化学结构解释
采用1H NMR、13C NMR及MS鉴定化合物4和化合物5结构。采用ESI-MS/MS两种模式：即正离子模式(Positive)和负离子模式(Negative)。负离子模式化合物分子量变化情况主要有两种情况：[M-H]-和[M+Cl]-。正离子模式如下：[M+H]+、[M+NH4]+、[M+Na]+、[2M+H+H]2+和[2M+H+Na]2+。结果如下：
化合物4：[M+H]+m/z 171.4，二级质谱未检出质谱碎片，其分子离子峰信号强度小于1*104，属微量成分，查阅质谱数据库可知，其元素组成可能为C7H6O5，对应分子量为170.0的五倍子酸，即没食子酸。
化合物5：[M+H]+质核比为139.5。查阅质谱数据库确定其元素组成为C7H6O3，分子量为138.3的有机酸类化合物或醌类化合物，对应化合物为：水杨酸。
(4)化合物黄龙病防治效果验证
购买没食子酸和水杨酸标准品，以20％DMSO溶解后溶于无菌水，配制成含量为50mg/L的供试液(相比于组合物稀释10倍)，对典型症状的感病柑橘植株叶片进行喷雾(对照组喷雾相同体积蒸馏水)，24h后以感染叶片的病害发展面积评价抑菌效果。结果显示：与对照组相比，感染叶片的病害发展面积下降了92.21％，抑菌效果明显。
有益效果：本发明首次采用具有抑制革兰氏阴性菌的中药材提取物进行黄龙病菌抑菌试验，结果显示五倍子乙酸乙酯萃取物和大血藤正丁醇萃取物的抑菌效果明显，同时采用高效液相技术对化合物进行分离，再利用1H NMR、13C NMR及MS对化合物结构进行分析，结果显示：没食子酸和水杨酸具有良好抑菌效果，可用于农业生产。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (7)

1.一种黄龙病病原菌分离和培养方法，其特征在于，包括：(1)样品的采集与处理；(2)黄龙病菌培养基配置；(3)黄龙病菌种培养与培养体系优化；(4)基于16S rDNA的菌种鉴定。
2.一种黄龙病菌抑菌剂的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)药材选择与组合物提取；(2)提取部位抑菌效果验证；(3)组合物黄龙病防治效果验证。
3.一种黄龙病菌抑菌化合物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)高效液相色谱分离活性成分；(2)抑菌效果验证；(3)抑制剂化学结构解释；(4)化合物黄龙病防治效果验证。
4.五倍子乙酸乙酯萃取物和大血藤正丁醇萃取物在抑制黄龙病菌中的应用。
5.根据权利要求4所述的五倍子乙酸乙酯萃取物和大血藤正丁醇萃取物在抑制黄龙病菌中的应用，其特征在于，取五倍子乙酸乙酯萃取物和大血藤正丁醇萃取物以20％DMSO溶解后溶于无菌水，配制成含量为500mg/L的供试液，对典型症状的感病柑橘植株叶片进行喷雾用于黄龙病的防治。
6.没食子酸和水杨酸在抑制黄龙病菌中的应用。
7.根据权利要求6所述的没食子酸和水杨酸在抑制黄龙病菌中的应用，其特征在于，没食子酸和水杨酸以20％DMSO溶解后溶于无菌水，配制成含量为50mg/L的供试液，对典型症状的感病柑橘植株叶片进行喷雾用于黄龙病的防治。
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