CN111560243B - 一种近红外光控制的UCNPs载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种近红外控制的多功能UCNPs载体、UCNPs纳米复合体及其制备方法和应用，首先通过高温分解法合成掺杂钇、镱、铒、铥的稀土UCNPs内核，并在其表面包覆介孔二氧化硅及在介孔二氧化硅内修饰偶氮苯得到UCNP@mSiO2‑azo，再在UCNP@mSiO2‑azo表面修饰RGD多肽及MMP13酶切多肽，得到可以近红外光控制MSCs定向分化及检测分化的UCNPs载体。本发明UCNPs纳米复合体在满足了可控制诱导MSCs成骨分化临床应用的基础上，还可以实现对细胞成骨分化进行检测，具有良好的生物医学应用前景。

Description

一种近红外光控制的UCNPs载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料及生物医学领域，特别涉及一种近红外控制的UCNPs载体、UCNPs纳米复合体，及其制备方法和应用。
背景技术
间充质干细胞(MSCs)是一种成体干细胞，具有多向分化潜能，在一定条件下可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞及神经细胞等多种组织细胞，是基础医学和临床医学组织器官损伤修复及再生医学的热点。目前MSCs临床应用存在的主要问题是分化效率低或非定向分化形成异质细胞，而在骨组织工程中定向诱导MSCs分化为成骨细胞是关键。
目前常用小分子化合物淫羊藿苷(ICA)诱导MSCs成骨分化，可以提高MSCs分化期间Runx2成骨基因的表达，诱导MSCs成骨分化。ICA获得简单，容易储存，使用便捷；但水溶性差、无细胞组织靶向性，且具有一定副作用，极大的限制了其临床应用。因此，建立一种安全、高效的载体运载ICA诱导MSCs成骨分化，是骨组织工程的关键。
此外，如何检测细胞的分化状态也是MSCs应用于临床研究和治疗的关键问题。特别是在体内，医生往往希望知道移植到体内的MSCs分化状态，以此为治疗效果提供科学依据。目前传统检测细胞分化方法如Western blot，步骤繁琐、耗时长、价格昂贵，还需要提取移植部位的细胞组织，给病人带来一定的痛苦。开发一种简单、有效且便捷的方法检测细胞分化也是MSCs临床应用的迫切需求。
稀土上转换纳米材料(UCNPs)具有光稳定性优异、激发光的组织穿透能力强、细胞毒性低等优点，已经在生物医学领域中受到广泛的关注。特别是作为药物控释载体和纳米荧光探针，已经在生物医学各个领域体现出巨大的潜在应用价值。MSCs的控制分化和检测分化是其临床应用的关键，但目前还没有一种方法能够同时控制分化和检测分化。
发明内容
基于此，本发明提供了一种同时控制诱导MSCs成骨分化和检测分化的近红外控制UCNPs载体、UCNPs纳米复合体及其制备方法和应用，UCNPs载体能高效、安全、精准的将ICA运载到细胞内，携载ICA的UCNPs纳米复合体能在近红外的控制下诱导间充质干细胞成骨分化和检测分化。
本发明提出了一种UCNPs载体，包括稀土UCNPs内核，包裹在所述稀土UCNPs内核表面的介孔二氧化硅，修饰在所述介孔二氧化硅内的偶氮苯，及修饰在所述介孔二氧化硅表面的RGD多肽和MMP13酶切多肽。
与现有技术相比，本发明首次以荧光性能良好的稀土元素合成了稀土UCNPs内核，用于近红外光控制诱导MSCs成骨分化和检测分化。稀土UCNPs内核表面包覆的介孔二氧化硅(mSiO2)用以修饰偶氮苯(azo)、RGD多肽和MMP13酶切多肽；近红外光照可驱动偶氮苯(azo)释放运载的ICA以诱导MSCs成骨分化，RGD多肽能实现细胞靶向功能，MSCs成骨分化时产生MMP13酶(MMP13 enzyme)，然后通过650nm荧光检测细胞成骨分化。得到的UCNPs载体，能高效、安全、精准的将ICA运载到靶细胞内。
进一步，所述稀土UCNPs内核中钇、镱、铒、铥的摩尔质量比为78:20:2:1～78:20:2:0.1。本发明以荧光性能良好的稀土元素钇(Y)、镱(Yb)、铒(Er)、铥(Tm)为原料，合成了含NaYF4:Yb:Tm/Er纳米颗粒的稀土UCNPs内核。
进一步，所述UCNPs载体的粒径为50～60nm。
进一步，所述UCNPs载体的荧光峰位为650nm。
本发明还提出了一种UCNPs载体的制备方法，包括以下步骤：
S1：将15mL油酸和30mL 1-十八烯的混合溶液中，分别加入482.3mg的六水合氯化钇、155mg六水合氯化镱、2.75mg六水合氯化铥、7.62mg六水合氯化铒，然后在150℃下搅拌2时，接下来加入含有200mg氢氧化钠和296mg氟化铵的10mL甲醇溶液，室温下搅拌2小时，最后在300℃高温下搅拌1.5小时，离心收集得到UCNPs内核；
S2：分别制备0.1～0.5mM的CTAB水溶液和20％的TEOS乙醇溶液，再将含8mg稀土UCNPs内核的环己烷溶液，加入2～5mL 0.2mM的CTAB溶液中，超声60分钟，得到混合溶液A；然后将所述混合溶液A在70℃下搅拌30分钟，冷却至室温后，加入5mL蒸馏水，搅拌1～2小时，再加入150μL 0.1M的氢氧化钠溶液，搅拌1小时后，加入50～150μL上述TEOS乙醇溶液，搅拌12～24小时，最后加入1～10μL APTES溶液，搅拌6～12小时后，离心收集得到UCNP@mSiO2；
S3：将UCNP@mSiO2和偶氮苯以质量比为1:5～10，分别加入10mL三乙胺和10mL DMF的混合溶液中，搅拌8～12小时，离心收集，得到UCNP@mSiO2-azo；
S4：将10mg UCNP@mSiO2-azo和5mg NHS-PEG4-MAL加入10mL DMF的溶液中，搅拌8～12小时，离心收集，乙醇清洗，10mL DMF重悬，然后加入2mg RGD多肽和2mg MMP13酶切多肽，搅拌8～12小时后离心收集，乙醇清洗、干燥，得到UCNPs载体。
进一步，在步骤S2中，CTAB的浓度为0.2mM，加入的量为5mL，处理方式为剧烈震荡和超声。
进一步，在步骤S2中，加入TEOS的量为100μL，加入APTES的量为2μL。
进一步，所述UCNP@mSiO2和偶氮苯的加入量分别为10mg和100mg。
本发明还提出了一种UCNPs纳米复合体的制备方法，将UCNPs载体和ICA加入到乙醇中，经搅拌、搅拌6～12小时，然后离心纯化，乙醇洗涤，干燥，得到UCNPs纳米复合体。
与现有技术相比，本发明UCNPs纳米复合体能高效、安全、精准的到达靶细胞内，并诱导间充质干细胞成骨分化。所述UCNPs纳米复合体，可以利用近红外光控制诱导MSCs成骨分化，同时利用UCNPs荧光对细胞分化进行实时检测，具有良好的生物医学应用前景。
本发明还提出了一种近红外控制UCNPs纳米复合体释放ICA的控制方法，包括以下步骤：
步骤1：取1mg/mL UCNPs纳米复合体均匀分散在PBS中，再以功率为0.2～1W/cm2的近红外光照射，照射时间为10～110分钟，照射10分钟停10分钟，交替进行；
步骤2：待近红外光照射结束后，离心收集上清液，并测量上清液中ICA的含量，根据ICA浓度标准曲线，计算不同照射功率和时间条件下ICA的释放量和释放率。
本发明还提出了一种UCNPs载体检测MMP13酶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将1mg/mL UCNPs载体加入酶反应buffer中，再加入浓度为20～100nM的MMP13酶进行酶切反应，反应时间为1～8小时；
步骤2：待酶切反应结束后，采用近红外光照射溶液，测量UCNPs载体在650nm荧光下的恢复值，计算检测MMP13酶的效率。
本发明还提出了一种UCNPs纳米复合体近红外控制MSCs成骨分化的控制方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：取1mg/mL UCNPs纳米复合体与MSCs孵育1～4小时，PBS清洗去除没有被MSCs内吞的UCNPs纳米复合体，近红外光照射MSCs，照射功率为1W/cm2，照射时间为60分钟，照10分钟停10分钟，交替进行；
步骤2：待近红外照射结束后，继续培养7天，待MSCs成骨分化后提取RNA和蛋白，分别进行RT-PCR和Western blot实验，以观察成骨相关基因和蛋白的表达情况。
本发明还提出了一种UCNPs纳米复合体检测MSCs成骨分化的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：取1mg/mL UCNPs纳米复合体分别诱导MSCs成骨分化1、3、7天后，固定细胞，制片；
步骤2：在980nm近红外下，分别观察成骨分化1、3、7天的MSCs细胞内550nm和650nm荧光强度的变化。
与现有技术相比，本发明首次以荧光性能良好的稀土元素合成了稀土UCNPs内核，用于近红外光控制诱导MSCs成骨分化和检测分化。稀土UCNPs内核表面包覆的介孔二氧化硅(mSiO2)用以修饰偶氮苯(azo)和RGD多肽；近红外光照可驱动偶氮苯(azo)释放运载的ICA以诱导MSCs成骨分化，成骨分化相关蛋白BMP-2、Runx2和OPN呈现高表达，RGD多肽能实现细胞靶向功能。得到的UCNPs载体，能高效、安全、精准的将ICA运载到靶细胞内，并诱导间充质干细胞成骨分化。同时，本发明在所述介孔二氧化硅(mSiO2)表面修饰的金属蛋白酶13切多肽(MMP13酶切多肽，或MMP13peptide-BHQ)，在MSCs成骨分化时产生MMP13酶(MMP13enzyme)，然后通过650nm荧光检测细胞成骨分化。与现有发明专利相比，本发明首次将诱导细胞分化和检测细胞分化融为一体，达到诱导分化和检测分化一体化目的。因此，本发明UCNPs纳米复合体在满足了可控制诱导MSCs成骨分化临床应用的基础上，还可以实现对细胞成骨分化进行检测，具有良好的生物医学应用前景。
附图说明
图1为实施例1中UCNPs载体的透射电镜图；
图2为实施例1中UCNP@mSiO2-azo和UCNPs载体的荧光光谱图；
图3为实施例1中UCNP@mSiO2、UCNP@mSiO2-azo和UCNPs载体的紫外吸收图；
图4为实施例1中UCNP@mSiO2、UCNP@mSiO2-azo和UCNPs载体的红外吸收图；
图5为实施例1中负载了ICA的UCNPs纳米复合体的紫外吸收图；
图6为实施例1中所述UCNPs载体的制备和实施功能示意图；
图7为本发明中UCNPs纳米复合体近红外光照释放ICA的效率图；
图8为本发明UCNPs纳米复合体酶切buffer中检测MMP13荧光的恢复图；
图9为本发明UCNPs纳米复合体光控诱导MSCs成骨分化后的RT-PCR实验分析结果统计图；
图10为本发明UCNPs纳米复合体光控诱导MSCs成骨分化后的Western blot实验统计图；
图11为本发明UCNPs纳米复合体光控诱导MSCs成骨分化后的荧光检测成骨分化效果图。
具体实施方式
实施例1
本发明提供一种近红外光控制MSCs定向分化及检测分化的上转换纳米材料的制备及应用，包括以下步骤：
a)构建多功能UCNPs载体；
b)多功能UCNPs载体负载ICA后，用于近红外光控制MSCs成骨分化；
c)多功能UCNPs载体用于近红外光检测MSCs成骨分化。
其中，步骤a)构建多功能UCNPs载体；
所述多功能UCNPs制备方法为：
(1)制备上转换稀土UCNPs内核：
采用高温分解法制备钇、镱、铒、铥掺杂的NaYF4:Yb:Tm/Er纳米颗粒：在装有15mL油酸和30mL 1-十八烯的150mL锥形瓶中分别加入482.3mg的六水合氯化钇、155mg六水合氯化镱、2.75mg六水合氯化铥、7.62mg六水合氯化铒，然后在150℃下搅拌2小时，接下来加入含有200mg氢氧化钠和296mg氟化铵的10mL甲醇溶液，室温下搅拌2小时，最后在300℃高温下搅拌1.5小时，离心收集，乙醇洗涤、干燥得到稀土UCNPs内核。
作为优选，钇、镱、铒、铥的摩尔质量比为78:20:2:1-78:20:2:0.1
(2)制备UCNP@mSiO2：
分别制备0.1～0.5mM的CTAB水溶液和20％的TEOS乙醇溶液，取10mg上述稀土UCNPs内核溶于10mL环己烷，加入2～5mL 0.2mM的CTAB溶液，剧烈震荡30分钟，超声30分钟，重复3次，离心、乙醇洗涤去除CTAB；
作为优选，CTAB的浓度为0.2mM，加入的量为5mL，处理方式为剧烈震荡和超声。
10mL蒸馏水重悬，加入50～150μL 0.1M的氢氧化钠溶液，搅拌1～2小时后，加入100μL TEOS乙醇溶液，搅拌12～24小时后加入1～10μL APTES溶液，搅拌8～16小时后，离心收集得到UCNP@mSiO2。
作为优选，TEOS与APTES的体积比为100:1～5。加入TEOS的量为100μL，加入APTES的量为2μL。
(3)制备UCNP@mSiO2-azo：
将UCNP@mSiO2和偶氮苯(azo)以质量比为1:5～10，加入到有10mL DMF和100μL三乙胺的锥形瓶中，搅拌8～16小时，离心收集，得到UCNP@mSiO2-azo。
作为优选，UCNP@mSiO2与偶氮苯的质量比为1:10～20。所述UCNP@mSiO2和偶氮苯的加入量分别为10mg和100mg。
(4)制备UCNPs载体(UCNP@mSiO2-azo-peptide-BHQ)：
取10mg UCNP@mSiO2-azo及10mg NHS-PEG4-MAL加入到10mL DMF的锥形瓶中，搅拌8～16小时，离心收集，乙醇洗涤，10mL DMF重悬，然后加入2mg RGD多肽和2mg MMP13酶切多肽(CGPLGVRGK-BHQ)，搅拌8～16小时后离心收集，乙醇清洗、干燥，得到UCNPs载体(UCNP@mSiO2-azo-peptide-BHQ)。
作为优选，步骤(1)中钇、镱、铒、铥的摩尔质量比为78:20:2:1-78:20:2:0.1。步骤(2)中TEOS与APTES的体积比为100:1～5。
本发明UCNPs载体包括稀土UCNPs内核，包裹在所述稀土UCNPs内核表面的介孔二氧化硅，修饰在所述介孔二氧化硅内的偶氮苯，及修饰在所述介孔二氧化硅表面的RGD多肽和MMP13酶切多肽。
b)多功能UCNPs载体负载ICA后，用于近红外光控制MSCs成骨分化；
步骤b)中多功能UCNPs载体负载ICA得到UCNPs纳米复合体的步骤为：
取10mg UCNPs载体和1mg ICA，加入到10mL 50％乙醇中，搅拌6～12小时，乙醇洗涤，离心收集，真空干燥，得到负载ICA的UCNPs纳米复合体。
作为优选，所述UCNPs载体与ICA的摩尔比为1:5～10。
其中，UCNPs纳米复合体用于近红外光控制MSCs成骨分化的步骤为：
将1mg/mL UCNPs纳米复合体与MSCs共孵育2小时，孵育结束后PBS清洗没有被MSCs内吞的纳米复合体；近红外光照射MSCs，1W/cm2，照10分钟停10分钟，共照射60分钟，照射结束后MSCs成骨培养基中继续培养7天进行成骨分化；7天后提取RNA和蛋白进行RT-PCR和Western blot进行成骨分化鉴定。
进一步，步骤b)中UCNPs纳米复合体与MSCs共孵育时间为1～4小时。
进一步，步骤b)中近红外光照射功率为0.2～2W/cm2，照射时间为60～120分钟。
c)多功能UCNPs载体用于近红外光检测MSCs成骨分化。
UCNPs载体用于近红外光检测MSCs成骨分化的步骤为：
将1mg/mL UCNPs纳米复合体与MSCs共孵育2小时，孵育结束后PBS清洗没有被MSCs内吞的纳米复合体；近红外光照射MSCs诱导其成骨分化，照射结束后MSCs成骨培养基中继续培养1、3、7天进行成骨分化，分化结束后将细胞放置在近红外激光共聚焦显微镜下观测细胞内550nm和650nm的荧光强度。通过与空白对照组(没有成骨分化)比较，判断细胞成骨分化情况。
进一步，步骤c)中MSCs近红外光照射后继续培养1～7天进行成骨分化。
本发明首次合成了多功能UCNPs载体用于近红外光控制诱导MSCs成骨分化和检测分化：以荧光性能良好的稀土NaYF4:Yb:Tm/Er纳米颗粒制备内核，表面包覆多孔二氧化硅用以修饰azo和负载ICA，通过近红外光照驱动azo释放ICA诱导MSCs成骨分化；多功能UCNPs表面修饰的MMP13酶切多肽在MSCs成骨分化产生MMP13酶后，通过650nm荧光检测细胞成骨分化。与现有发明专利相比，本发明首次将诱导细胞分化和检测细胞分化融为一体，达到诱导分化和检测分化一体化目的。
请同时参阅图1～图5，图1为实施例1中UCNPs载体的透射电镜图，从图中可以看出UCNPs载体的由介孔二氧化硅(mSiO2)外包覆构成，呈球状，粒径大小约为50～60nm。
图2为实施例1中UCNP@mSiO2-azo和UCNPs载体的荧光光谱图，从图中可以看出UCNPs载体(UCNP@mSiO2-azo-peptide-BHQ)的荧光和UCNP@mSiO2-azo保持一致，区别在于UCNPs载体650nm处荧光强度比UCNP@mSiO2-azo低，因为MMP13酶切多肽上的荧光猝灭基团BHQ吸收了UCNPs 650nm荧光。
图3为实施例1中UCNP@mSiO2、UCNP@mSiO2-azo和UCNPs载体的紫外吸收图，通过对比观察可以看出UCNP@mSiO2-azo相对于UCNP@mSiO2多了340nm处azo紫外吸收峰，而UCNPs载体相对于UCNP@mSiO2-azo多了280nm处peptide和640nm处BHQ的紫外吸收峰。
图4为实施例1中UCNP@mSiO2、UCNP@mSiO2-azo和UCNPs载体的红外吸收图，通过对比观察可以看出UCNP@mSiO2-azo相对于UCNP@mSiO2多了900nm处azo红外伸缩震动峰，而UCNPs载体相对于UCNP@mSiO2-azo多了1500nm和1680nm peptide酰胺键的红外伸缩震动峰。
图5为实施例1中UCNPs纳米复合体的紫外吸收图，通过对比观察可以看出UCNPs载体相对于UCNPs纳米复合体多了260nm处ICA的紫外吸收峰。上述说明已经成功制备了UCNPs纳米复合体。
本实施例1所述UCNPs纳米复合体促进并检测间充质干细胞成骨分化的作用机理 如下：
请参照图6，图6为实施例1中负载了ICA的UCNPs纳米复合体的紫外吸收图。由图6可知，本发明通过构建功能性稀土UCNPs内核，再在其表面修饰一种连接荧光分子的MMP-13酶切多肽，用其作为诱导间充质干细胞成骨分化的检测显示物质。
所述UCNPs纳米复合体促进并检测间充质干细胞成骨分化，主要通过以下两个步骤实现：
a)促进成骨分化：将所述UCNPs纳米复合体与MSCs共孵育2小时，孵育结束后，用PBS清洗没有被MSCs内吞的UCNPs纳米复合体；再用近红外光照射MSCs，1W/cm2，照10分钟停10分钟，共照射60～120分钟，照射结束后MSCs成骨培养基中继续培养7天进行成骨分化；
b)检测：步骤a)获得的所述成骨细胞产生MMP13酶，所述MMP-13酶将所述UCNPs纳米复合体表面的MMP-13酶切多肽进行酶切，然后通过650nm荧光检测细胞成骨分化，以实现检测成骨分化情况。
该UCNPs纳米复合体可通过二氧化硅装载小分子淫羊藿苷(ICA)，并通过近红外光照促使二氧化硅内的偶氮苯(azo)发生构象变化释放ICA，特异性诱导MSCs成骨分化；MSCs成骨分化产生MMP13，和酶切多肽发生反应，切除多肽上荧光淬灭基团BHQ恢复UCNPs的荧光，从而可以通过荧光变化对细胞分化进行实时检测。本发明制备的UCNPs纳米复合体，可以利用近红外光控制诱导MSCs成骨分化，同时利用荧光对细胞分化进行实时检测，具有良好的生物医学应用前景。
实施例2
本发明进一步探索了在实施例1中UCNPs载体对MMP13酶的检测，近红外控制UCNPs纳米复合体释放ICA，及检测MSCs的成骨分化情况的控制和检测方法。
首先，提供了一种近红外控制UCNPs纳米复合体释放ICA的控制方法，包括以下步骤：
步骤1：取1mg/mL UCNPs纳米复合体均匀分散在PBS中，再以功率为0.2～1W/cm2的近红外光照射，照射时间为10～110分钟，照射10分钟停10分钟，交替进行；
步骤2：待近红外光照射结束后，离心收集上清液，并测量上清液中ICA的含量，根据ICA浓度标准曲线，计算不同照射功率和时间条件下ICA的释放量和释放率。
其次，还提供了一种UCNPs载体检测MMP13酶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将1mg/mL UCNPs载体加入酶反应buffer中，再加入浓度为20～100nM的MMP13酶进行酶切反应，反应时间为1～8小时；
步骤2：待酶切反应结束后，采用近红外光照射溶液，测量UCNPs载体在650nm荧光下的恢复值，计算检测MMP13酶的效率。
进一步，还提供了一种UCNPs纳米复合体近红外控制MSCs成骨分化的控制方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：取1mg/mL UCNPs纳米复合体与MSCs孵育1～4小时，PBS清洗去除没有被MSCs内吞的UCNPs纳米复合体，近红外光照射MSCs，照射功率为1W/cm2，照射时间为60分钟，照10分钟停10分钟，交替进行；
步骤2：待近红外照射结束后，继续培养7天，待MSCs成骨分化后提取RNA和蛋白，分别进行RT-PCR和Western blot实验，以观察成骨相关基因和蛋白的表达情况。
另外，还提供了一种UCNPs纳米复合体检测MSCs成骨分化的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：取1mg/mL UCNPs纳米复合体分别诱导MSCs成骨分化1、3、7天后，固定细胞，制片；
步骤2：在980nm近红外下，分别采用激光共聚焦显微镜观察成骨分化1、3、7天的MSCs细胞内550nm和650nm荧光强度的变化，650nm逐渐增强。。
作为优选，MSCs成骨分化的时间为1～7天。
因此，UCNPs纳米复合体在满足了可促进MSCs成骨分化临床应用的基础上，还可以实现UCNPs载体对MMP13酶的检测，近红外控制UCNPs纳米复合体释放ICA，及检测MSCs成骨分化情况的控制和检测。
以下通过具体实验，详细说明本发明中UCNPs载体、UCNPs纳米复合体、及二者制备方法和应用的技术方案。
近红外光控制诱导MSCs成骨分化及检测实验：
(1)UCNPs纳米复合体近红外光控制释放ICA
取10mg UCNPs纳米复合体溶于5mL PBS中，分别用0.4W/cm2、0.7W/cm2、1W/cm2980nm的近红外光照射UCNPs纳米复合体，照射10分钟停10分钟。照射结束后离心取上清液进行紫外光谱扫描，通过检测上清液中ICA紫外吸手值及ICA标准曲线计算出UCNPs纳米复合体在近红外光照射下ICA释放效率。
请参阅附图7，图7为本发明中UCNPs纳米复合体近红外光照释放ICA的效率图，从图中可以看出UCNPs纳米复合体在近红外光的照射下可以有效地释放ICA。
(2)UCNPs纳米复合体buffer中检测MMP13酶
取1mg UCNPs纳米复合体加入到1mL酶切buffer中(100mM Tris，5mMcalciumchloride，200mM NaCl and 0.1％of Brij，1mL)，分别加入0、10、20、50、100mM的MMP13酶，在37℃下水浴2小时，酶切反应结束后980nm近红外光照下检测多功能UCNPs荧光光谱，观察650nm荧光恢复情况判断MMP13酶检测效果。
请参阅附图8，图8为本发明UCNPs纳米复合体酶切buffer中检测MMP13荧光的恢复图，从图中可以看出UCNPs纳米复合体可以在酶切buffer中有效检测MMP13酶。
UCNPs纳米复合体诱导MSCs成骨分化后的RT-PCR和Western blot实验：
(1)UCNPs纳米复合体近红外光控制诱导MSCs成骨分化
取1mg/mL UCNPs纳米复合体与MSCs共孵育2小时，孵育结束后PBS清洗没有被MSCs内吞的UCNPs纳米复合体；近红外光照射MSCs，1W/cm2，照10分钟停10分钟，共照射60分钟，照射结束后MSCs成骨培养基中继续培养7天进行成骨分化；7天后提取RNA和蛋白进行RT-PCR和Western blot进行成骨分化鉴定。
为了更好地理解本发明UCNPs纳米复合体近红外光控制诱导MSCs成骨分化的效果，经过7天成骨分化诱导后，对MSCs进行了总RNA和蛋白提取以进行RT-PCR和Westernblot验证成骨相关基因和蛋白的表达。
请参阅附图9，图9为本发明UCNPs纳米复合体光控诱导MSCs成骨分化后的RT-PCR实验分析结果统计图。RT-PCR结果表明经过7天诱导分化后，和空白对照组(control)相比较，UCNPs纳米复合体+近红外光照组(UCNP/ICA+NIR)成骨分化相关基因BMP-2、Runx2和OPN呈现高表达。
请参阅附图10，图10为本发明UCNPs纳米复合体光控诱导MSCs成骨分化后的Western blot实验统计图，Western blot结果表明经过7天诱导分化后，和空白对照组(control)相比较，UCNPs纳米复合体+近红外光照组(UCNP/ICA+NIR)成骨分化相关蛋白BMP-2、Runx2和OPN呈现高表达。
上述结果说明UCNPs纳米复合体能够有效光控诱导MSCs成骨分化。
2)UCNPs纳米复合体光控诱导MSCs成骨分化后荧光检测细胞分化效果
取1mg/mL UCNPs纳米复合体与MSCs共孵育2小时，孵育结束后PBS清洗没有被MSCs内吞的UCNPs纳米复合体；近红外光照射MSCs诱导其成骨分化，照射结束后MSCs成骨培养基中继续培养1、3、7天进行成骨分化，分化结束后将细胞放置在近红外激光共聚焦显微镜下观测细胞内550nm和650nm的荧光强度。通过与空白对照组(没有成骨分化)比较，判断细胞成骨分化情况。
请参阅附图11，图11为本发明UCNPs纳米复合体光控诱导MSCs成骨分化后的荧光检测成骨分化效果图，与空白对照组(UCNPs)相比较，UCNPs纳米复合体近红外光诱导分化组(UCNP/ICA+NIR)在诱导成骨分化1、3、7天后，在980nm近红外光激光共聚焦显微镜下MSCs细胞内650nm荧光显著，说明成骨分化效果显著。
与现有技术相比，本发明首次以荧光性能良好的稀土元素合成了稀土UCNPs内核，用于近红外光控制诱导MSCs成骨分化和检测分化。稀土UCNPs内核表面包覆的介孔二氧化硅(mSiO2)用以修饰偶氮苯(azo)和RGD多肽；近红外光照可驱动偶氮苯(azo)释放运载的ICA以诱导MSCs成骨分化，成骨分化相关蛋白BMP-2、Runx2和OPN呈现高表达，RGD多肽能实现细胞靶向功能。得到的UCNPs载体，能高效、安全、精准的将ICA运载到靶细胞内，并诱导间充质干细胞成骨分化。同时，本发明在所述介孔二氧化硅(mSiO2)表面修饰的金属蛋白酶13切多肽(MMP13酶切多肽，或MMP13peptide-BHQ)，在MSCs成骨分化时产生MMP13酶(MMP13enzyme)，然后通过650nm荧光检测细胞成骨分化。与现有发明专利相比，本发明首次将诱导细胞分化和检测细胞分化融为一体，达到诱导分化和检测分化一体化目的。因此，本发明UCNPs纳米复合体在满足了可控制诱导MSCs成骨分化临床应用的基础上，还可以实现对细胞成骨分化进行检测，具有良好的生物医学应用前景。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (14)

1.一种UCNPs载体，其特征在于：包括稀土UCNPs内核，所述稀土UCNPs内核为NaYF4:Yb:Tm/Er纳米颗粒，包裹在所述稀土UCNPs内核表面的介孔二氧化硅，修饰在所述介孔二氧化硅内的偶氮苯，及修饰在所述介孔二氧化硅表面的RGD多肽和MMP13酶切多肽，所述MMP13酶切多肽的序列为CGPLGVRGK-BHQ-3。
2.根据权利要求1所述UCNPs载体，其特征在于：所述稀土UCNPs内核中钇、镱、铒、铥的摩尔质量比为78:20:2:1～78:20:2:0.1。
3.根据权利要求2所述UCNPs载体，其特征在于：所述UCNPs载体的粒径为50～60nm。
4.根据权利要求3所述UCNPs载体，其特征在于：所述UCNPs载体的荧光峰位为650nm。
5.一种根据权利要求1～4任意一项所述UCNPs载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将15mL油酸和30mL 1-十八烯的混合溶液中，分别加入482.3mg的六水合氯化钇、155mg六水合氯化镱、2.75mg六水合氯化铥、7.62mg六水合氯化铒，然后在150℃下搅拌2小时，接下来加入含有200mg氢氧化钠和296mg氟化铵的10mL甲醇溶液，室温下搅拌2小时，最后在300℃高温下搅拌1.5小时，离心收集得到稀土UCNPs内核；
S2：分别制备0.1～0.5mM的CTAB水溶液和20％的TEOS乙醇溶液，再将含8mg稀土UCNPs内核的环己烷溶液，加入2～5mL 0.2mM的CTAB溶液中，超声60分钟，得到混合溶液A；然后将所述混合溶液A在70℃下搅拌30分钟，冷却至室温后，加入5mL蒸馏水，搅拌1～2小时，再加入150μL 0.1M的氢氧化钠溶液，搅拌1小时后，加入50～150μL上述TEOS乙醇溶液，搅拌12～24小时，最后加入1～10μL APTES溶液，搅拌6～12小时后，离心收集得到UCNP@mSiO2；
S3：将UCNP@mSiO2和偶氮苯以质量比为1:5～10，分别加入10mL三乙胺和10mL DMF的混合溶液中，搅拌8～16小时，离心收集，得到UCNP@mSiO2-azo；
S4：将10mg UCNP@mSiO2-azo和5mg NHS-PEG4-MAL加入10mL DMF的溶液中，搅拌8～16小时，离心收集，乙醇清洗，10mL DMF重悬，然后加入2mg RGD多肽和2mg MMP13酶切多肽，搅拌8～16小时后离心收集，乙醇清洗、干燥，得到UCNPs载体。
6.根据权利要求5所述UCNPs载体的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，CTAB的浓度为0.2mM，加入的量为5mL，处理方式为剧烈震荡和超声。
7.根据权利要求5所述UCNPs载体的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，加入TEOS的量为100μL，加入APTES的量为2μL。
8.根据权利要求5所述UCNPs载体的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，所述UCNP@mSiO2和偶氮苯的加入量分别为10mg和100mg。
9.一种UCNPs纳米复合体的制备方法，其特征在于：将权利要求5～8任意一项所述制备方法得到的UCNPs载体和淫羊藿苷ICA加入到乙醇中，经搅拌、搅拌6～12小时，然后离心纯化，乙醇洗涤，干燥，得到UCNPs纳米复合体。
10.根据权利要求9所述UCNPs纳米复合体的制备方法，其特征在于：所述UCNPs载体与ICA的摩尔比为1:5～10。
11.一种近红外控制权利要求9或10所述制备方法得到的UCNPs纳米复合体释放ICA的控制方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：取1mg/mL UCNPs纳米复合体均匀分散在PBS中，再以功率为0.2～1W/cm2的近红外光照射，照射时间为10～110分钟，照射10分钟停10分钟，交替进行；
步骤2：待近红外光照射结束后，离心收集上清液，并测量上清液中ICA的含量，根据ICA浓度标准曲线，计算不同照射功率和时间条件下ICA的释放量和释放率。
12.一种根据权利要求5～8任意一项所述制备方法得到的UCNPs载体检测MMP13酶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将1mg/mL UCNPs载体加入酶反应buffer中，再加入浓度为20～100nM的MMP13酶进行酶切反应，反应时间为1～8小时；
步骤2：待酶切反应结束后，采用近红外光照射溶液，测量UCNPs载体在650nm荧光下的恢复值，计算检测MMP13酶的效率。
13.一种根据权利要求9所述制备方法得到的UCNPs纳米复合体近红外控制MSCs成骨分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：取1mg/mL UCNPs纳米复合体与MSCs孵育1～4小时，PBS清洗去除没有被MSCs内吞的UCNPs纳米复合体，近红外光照射MSCs，照射功率为1W/cm2，照射时间为60分钟，照10分钟停10分钟，交替进行；
步骤2：待近红外照射结束后，继续培养7天，待MSCs成骨分化后提取RNA和蛋白，分别进行RT-PCR和Western blot实验，以观察成骨相关基因和蛋白的表达情况。
14.一种根据权利要求9所述制备方法得到的UCNPs纳米复合体检测MSCs成骨分化的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：取1mg/mL UCNPs纳米复合体分别诱导MSCs成骨分化1、3、7天后，固定细胞，制片；
步骤2：在980nm近红外下，分别观察成骨分化1、3、7天的MSCs细胞内650nm荧光强度的变化。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112220777B (zh) * 2020-10-16 2022-04-12 北京大学口腔医学院 一种微环境响应型成骨细胞靶向载药纳米粒子及其制备方法和应用
CN113440620A (zh) * 2021-05-31 2021-09-28 华南师范大学 上转换纳米颗粒及其在光控诱导msc软骨分化和示踪成像中的应用
CN113785754B (zh) * 2021-09-07 2023-04-07 广东百林生态科技股份有限公司 一种轻质立体绿化保水基质的制备方法及应用
CN113785730B (zh) * 2021-09-07 2023-04-18 广东百林生态科技股份有限公司 一种天桥三角梅的管养方法
CN114984240A (zh) * 2022-04-19 2022-09-02 华南师范大学 功能化UCNPs载体、治疗骨质疏松症的UCNPs纳米复合物及其制备和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104017769A (zh) * 2014-05-23 2014-09-03 暨南大学 钌配合物修饰纳米硒在促进间充质干细胞成骨分化的应用
CN108192590A (zh) * 2017-12-10 2018-06-22 湖北工业大学 一种基于稀土上转换材料的聚偶氮苯多功能纳米粒子的制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104017769A (zh) * 2014-05-23 2014-09-03 暨南大学 钌配合物修饰纳米硒在促进间充质干细胞成骨分化的应用
CN108192590A (zh) * 2017-12-10 2018-06-22 湖北工业大学 一种基于稀土上转换材料的聚偶氮苯多功能纳米粒子的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Labeling and long-term tracking of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro using NaYF4:Yb3+,Er3+ upconversion nanoparticles";Yufei Ma et al.,;《Acta Biomaterialia》;20160717;第42卷;第199-208页 *
"Near-infrared light-triggered release of small molecules for controlled differentiation and long-term tracking of stem cells in vivo using upconversion nanoparticles";Jinming Li et al.,;《Biomaterials》;20160914;第110卷;第1-10页 *

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