CN111544489A - 黄金莓萃取物用于制备提升基因表现量及线粒体活性的组合物的用途 - Google Patents
黄金莓萃取物用于制备提升基因表现量及线粒体活性的组合物的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及植物提取物领域，尤其是黄金莓萃取物用于制备提升基因表现量及线粒体活性的组合物的用途。本发明提供一种黄金莓萃取物，所述黄金莓萃取物是以一溶剂萃取一黄金莓所获得，所述溶剂为水、醇、或醇水混合物。本发明还提供所述黄金莓萃取物用于提升TGM基因及/或KRT基因表现量以及线粒体活性的用途。所述黄金莓萃取物能使皮肤形成更多保湿因子，并维持角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能，同时有效提升线粒体活性，以维持皮肤的正常代谢及抗老化活性。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取物领域，尤其是黄金莓萃取物用于制备提升基因表现量及线粒体活性的组合物的用途线粒体。
背景技术
表皮层为皮肤的最外层，由外往内依序为角质层、颗粒层、有棘层及基底层，表皮层主要由基底层中未分化的圆柱型角质细胞持续向上进行分化形成，此过程称为角质化。角质细胞内含水量高，随着细胞向上代谢分化，角质细胞形状会逐渐变成扁平状，且细胞核及胞器开始退化萎缩，并在角质层形成不具细胞核与细胞器的死细胞。表皮层的主要功能为使皮肤保水，并形成皮肤屏障以抵御各种外来伤害，其中表皮层最外层由一弱酸性的皮脂膜以及如砖墙结构的角质层所构成，此屏障能锁住皮肤的水分和油脂、抵抗皮肤表面病菌入侵，及对抗外界异物及紫外光等伤害，对人体有非常重要的保护作用。
表皮层中的角质层，其角质细胞虽然为死细胞，但其主要成分为角蛋白(keratin)，角蛋白能吸收水分使皮肤保持湿润，角质细胞也会分泌如玻尿酸等物质作为细胞间质，以维持表皮层皮肤屏障的结构完整，以防止皮肤水分散失及形成完整防护。当皮肤接触过冷或过热的环境以及照射紫外光等刺激，会导致角质细胞无法维持正常的代谢循环，且皮肤保水能力也会下降，并导致皮肤表皮层屏障受损，让皮肤变得粗糙、干燥脱屑、脆弱易受刺激、敏感泛红，因此角质层的健康与保水能力对于抵御外来伤害着实非常重要。
然而，随着年纪渐长皮肤会逐渐地老化(Ageing)，皮肤老化形成原因与过程非常复杂牵涉了无数的生理现象，其中紫外线伤害、自由基伤害、胶原蛋白减少、细胞更新减缓、异常细胞的出现、皮肤脂肪减少、细胞间质缺乏、细胞生长休止、荷尔蒙下降等是较常见的因素。但截至目前为止，市售的皮肤抗老化产品大多只能着手在增加抗氧化活性，并无法直接且有效地改善或推迟皮肤老化的发生。
综合上面所述，为了改善因角质细胞受损、保水能力下降、以及皮肤老化所导致皮肤变得脆弱、易敏等问题，开发一种能直接且有效地改善或推迟皮肤老化发生，同时又能有效使角质细胞分泌更多保湿因子，以维持角质细胞排列、维持角质层结构完整的组合物，着实有其必要性。
发明内容
因此，本发明的一目的在提供一种黄金莓萃取物用于制备提升转谷氨酰胺酶(Transglutaminase，TGM)基因、及角蛋白(Keratin，KRT)基因表现量的组合物的用途，其中该黄金莓萃取物是以一溶剂萃取一黄金莓所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物；且该组合物进一步包含一医药上可接受的载体。
本发明的另一目的在提供一种黄金莓萃取物用于制备提升线粒体活性的组合物的用途，其中该黄金莓萃取物是以一溶剂萃取一黄金莓所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物该组合物进一步包含一医药上可接受的载体。
在本发明的一实施例中，该溶剂与该黄金莓的重量比为10-20∶1-5；且该萃取的温度是50-100℃。
在本发明的又一实施例中，该转谷氨酰胺酶基因是转谷氨酰胺酶1(Transglutaminase 1，TGM1)基因；且该角蛋白基因是角蛋白10(Keratin10，KRT10)基因、角蛋白14(Keratin14，KRT14)基因或其组合。
在本发明的又一实施例中，该黄金莓萃取物是维持皮肤角质层结构完整、及/或提升皮肤保湿能力；且该黄金莓萃取物的浓度为至少0.05mg/mL。
在本发明的另一实施例中，该黄金莓萃取物是维持皮肤细胞的正常代谢、及/或提升皮肤细胞的抗老化活性；且该黄金莓萃取物的浓度为至少0.03125mg/mL。
本发明的黄金莓萃取物能有效在6-24小时内即有效提升皮肤角质细胞中与保湿相关的TGM1基因、KRT10基因、及KRT14基因的表现量，能有效维持皮肤角质细胞排列，使皮肤角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能、以及防止皮肤水分散失，使皮肤处于保水的状态、及维持皮肤年轻光滑有弹性；本发明的黄金莓萃取物亦能有效提升皮肤细胞的线粒体活性，以维持皮肤细胞的活力及正常代谢，以提升皮肤细胞抗老化的活性。因此，本发明的黄金莓萃取物具有提升皮肤抗老化活性及保湿能力的功效，可用于制备皮肤保健的组合物的用途，其中该组合物该组合物是一医药品、一食品或一保养品，可藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。
附图说明
图1是本发明的一实施例的黄金莓萃取物后提升角质细胞中TGM1基因、KRT10基因、及KRT14基因表现量的效果的柱形图；*p值＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；
图2是本发明的一实施例的黄金莓萃取物提升皮肤细胞线粒体活性的效果的柱形图；**p＜0.01。
具体实施方式
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，个此之间的差异以学生t检验(student′s t-test)分析。
黄金莓为灯笼草的果实，灯笼草(Physalis peruviana)为茄科(Solanaceae)灯笼草属(Physalis)一年生草本植物，原产于原产于美洲大陆，尤其是秘鲁与智利，引进中国台湾后，种植于低海拔的山野、田园及荒废地间，灯笼草又称秘鲁苦蘵、酸浆、炮仔草、登郎草、蝶仔草、挂金灯等名；果实为浆果，直径约1公分且呈球形，被膨大的宿存萼片所包覆，成熟时为黄绿色，因味甜而被广泛食用，果实被称为黄金莓、灯笼果、及金姑娘等名，其具有清热解毒及化痰的功效。
如本文中所使用的，用语「黄金莓萃取物」意为黄金莓果实与溶剂以1-5∶10-20(w/w)比例经一特定时间与温度萃取而得。
本文所述的「有效浓度」是表示能有效提升皮肤细胞线粒体活性、及/或有效提升皮肤细胞中TGM1基因、KRT10基因、及KRT14基因表现量所需本发明的黄金莓萃取物的浓度。有效浓度依所作用的对象而可能不同，但可藉由例如剂量递增试验(dose escalation)以实验决定其有效浓度。
依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。
依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、泡沫(foam)、以及悬浮液(suspension)等。
依据本发明，该外部制剂是藉由将本发明的医药品与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而被制备。
依据本发明，该基底可包含有一或多种选自于下列的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum，jelly)以及白凡士林(white petrolatum，)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，保养品可进一步包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含有一或多种选自于下列的试剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，这包括，但不限于：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body cleansingproducts)等。
依据本发明，保养品亦可与一或多种选自于下列的已知活性的外用剂(externaluse agents)一起合并使用：美白剂(whitening agents)、保湿剂、抗发炎剂(anti-inflammatory agents)、杀菌剂(bactericides)、及紫外线吸收剂(ultravioletabsorbers)等。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。
依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)等。
本发明提供一种黄金莓萃取物用于制备皮肤保健的组合物的用途，本发明的黄金莓萃取物是以一溶剂萃取一黄金莓所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物，其可用于维持角质细胞排列，使皮肤角质组织的结构完整，以及提升皮肤细胞的线粒体活性，以维持皮肤细胞的活力及正常代谢。
同时，本发明用于制备皮肤保健的组合物，亦可包含一有效量的黄金莓萃取物及一医药上可接受的载体，该组合物是一医药品、一食品或一保养品。
以下将详细说明本发明黄金莓萃取物的详细萃取方法；本发明黄金莓萃取物于短时间与较长作用下，提升皮肤角质细胞中TGM1基因、KRT10基因、及/或KRT14基因表现量的功效测试；以及本发明黄金莓萃取物提升皮肤细胞线粒体活性的功效测试。以证实本发明的黄金莓萃取物能有效的维持皮肤角质细胞排列，使皮肤角质层结构完整，以及提升皮肤细胞的线粒体活性，以维持皮肤细胞的活力及正常代谢。以使皮肤处于保水的状态、及维持皮肤年轻光滑有弹性，且同时能有效提升皮肤细胞抗老化的活性。
实施例1本发明的黄金莓萃取物的制备方法
在本发明的一实施例中，首先将黄金莓果实清洗干净后，将该黄金莓果实与水、醇、或醇水混合物的萃取溶剂，萃取溶剂较佳为水，以1-5∶10-20的重量比混合，均质后在溶剂中以50-100℃进行萃取0.5-2小时后，将粗萃取物冷却至室温，并将该粗萃取物以400mesh的滤网过滤以获得滤液。最后，将该滤液于45-70℃进行减压浓缩后，即得到本发明的黄金莓萃取物。
实施例2本发明的黄金莓萃取物提升角质细胞保湿基因表现量的功效
本发明的一实施例以人类初代皮肤角质细胞HPEK-50(Human primary epidermalkeratinocytes-50，HPEK-50)进行本发明的黄金莓萃取物在短时间作用下提升TGM1基因、KRT10基因、及KRT14基因表现量的功效的测试。该HPEK-50细胞是购自CELLnTEC公司(瑞士)，且培养于无血清的角质细胞培养液(keratinocyte-SFM)，该细胞培养液是购自Gibco公司(美国)，编号为#17005042，并于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。
首先，将1.5x105个HPEK-50细胞培养于每孔含有2mL上述培养液的6孔培养盘中，于37℃培养16-18小时，接着将细胞分成以下三组：(1)仅加入细胞培养液的控制组、(2)加入0.0625mg/mL本发明的黄金莓萃取物的实验组、及(3)加入0.03125mg/mL本发明的黄金莓萃取物的实验组，并将该三组分别作用24小时后，测试各组HPEK-50细胞中目标基因的表现量；其中该黄金莓萃取物是以水为溶剂进行萃取。首先，将该三组的HPEK-50细胞以细胞裂解液(RB buffer，购自Geanaid公司，中国台湾，Cat No.RBD300)回收细胞后，使用RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Cat No.RBD300)分别收集该三组细胞内的总RNA，接着利用
III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)以2000ng的萃取RNA为模板，并以表1的组合引物及反转录酶进行反转录作用，以产生该些基因的mRNA所相应的cDNA产物，接着利用ABI StepOnePlusTMReal-Time PCR system(ThermoFisher Scientific公司，美国)，以及KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)将该三组反转录后产物分别以表1的组合引物进行定量实时聚合酶连锁反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)试验，条件为95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个循环。用以定量该三组HPEK-50细胞中TGM1基因、KRT10基因、及KRT14基因的mRNA的表现量，其中定量数值是取由阈值循环数(Ct)，而目标基因的mRNA相对量是推导自方程式2-ΔΔCt，其中ΔCT＝CT比较组或实验组目标基因/控制组目标基因-CT TBP(TATA结合蛋白，TATA-binding protein)；ΔΔCT＝CT比较组或实验组目标基因-CT控制组目标基因；各组中各基因的foldchange则为2-ΔΔCt。接着，再利用Excel软件决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001)。
表1、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引物
先前研究指出TGM会使角质化细胞的细胞膜与结构蛋白间形成强力键结，并能增加表皮层的强度与稳定性；KRT会形成角蛋白微丝，为角质细胞的结构蛋白，可维持角质细胞结构的强度和弹性。因此，角质细胞的结构基因-TGM1基因、KRT10基因、及KRT14基因的表现量上升，能够维持角质细胞排列，使皮肤角质组织的结构完整，并防止皮肤水分散失。
本发明的黄金莓萃取物提升角质细胞内TGM1基因、KRT10基因、及KRT14表现量的结果如图1所示。人类初代角质细胞经0.0625mg/mL本发明的黄金莓萃取物处理后，TGM1基因的表现量为控制组的1.15倍、KRT10基因的表现量为控制组的1.72倍、KRT14基因的表现量则为控制组的2.17倍；经0.03125mg/mL本发明的黄金莓萃取物处理后，TGM1基因的表现量为控制组的1.20倍、KRT10基因的表现量为控制组的1.72倍、KRT14基因的表现量则为控制组的2.35倍。此些结果显示本发明的黄金莓萃取物能在24小时的作用下，有效提高TGM1基因、KRT10基因、及KRT14基因的表现量，能有效维持皮肤角质细胞排列，使皮肤角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能、防止皮肤水分散失，使皮肤处于保水的状态、及维持皮肤年轻光滑有弹性。
实施例3本发明的黄金莓萃取物提升皮肤细胞线粒体活性的功效
本发明的一实施例以人类皮肤纤维母细胞(Human skin fibroblast)CCD-966SK细胞、以及BDTMMitoScreen(JC-1)试剂套组(Flow cytometry Mitochondrial membranepotential detection kit)，以进行本发明的黄金莓萃取物提升皮肤细胞线粒体活性的功效的测试。其中，该CCD-966SK细胞是购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，美国)，编号BCRCNo.60153，且该细胞是培养于含有10％的胎牛血清(Fetal Bovine Serum)以及90％的Eagle’s Minimum Essential Medium(EMEM)的培养液(购自Gibco，美国)，其中含有0.1mM的非必需氨基酸(Non-essential amino acids)、1.5g/L的碳酸氢钠(Sodiumbicarbonate)、及1mM的丙酮酸钠(Sodium pyruvate)。
其中，在使用该BDTMMitoScreen(JC-1)试剂套组前，需先将10x JC-1染色测定缓冲溶液(JC-1 10x assay buffer)置于37℃下预热，并以无菌的1x磷酸盐缓冲溶液(1xPhosphate buffered saline，1xPBS)配置1x JC-1染色测定缓冲溶液，且维持温度为37℃，接着加入130μL的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)于该1x JC-1染色测定缓冲溶液中进行冷冻干燥，即为JC-1染色测定缓冲溶液的储存溶液，其能够在-20℃下保存6个月；待使用时，将JC-1染剂与该1x JC-1测定缓冲溶液以1∶100的比例均匀，即为JC-1作用染剂。
首先，将1.5x105个CCD-966SK细胞培养于每孔含有2mL上述培养液的6孔培养盘中，于37℃培养16-18小时，接着在不影响吸附盘底细胞的情状下，更换新的细胞培养液，并将细胞分成以下三组(n＝3)：(1)仅加入细胞培养液的控制组、(2)加入1mg/mL本发明的黄金莓萃取物的实验组、及(3)加入0.5mg/mL本发明的黄金莓萃取物的实验组，并将该三组分别作用24小时；其中该黄金莓萃取物是以水为溶剂进行萃取，接着在不影响吸附盘底细胞的情状下，移除培养液并以1xPBS冲洗细胞两次，再加入200μL的胰蛋白酶(Trypsin)反应5分钟，使细胞由培养盘上脱落，加入适当的培养液终止反应，并将细胞连同培养液收集至1.5mL离心管中，以400g离心5分钟后移除上清液，再以1mL的1xPBS冲洗细胞一次后，于400g离心5分钟后除上清液，再加入100μL的前述JC-1作用染剂，以vortex混合均匀后于黑暗中避光反应15分钟，接着于400g离心5分钟后除上清液，再以前述1x JC-1染色测定缓冲溶液冲洗细胞两次后，将细胞重新悬浮于含有2％胎牛血清的500μL的1xPBS中，以流式细胞仪(Beckman)侦测CCD-966SK细胞中线粒体的膜电位，其中线粒体膜电位越高表示线粒体活性越高。最后再利用Excel软件决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001)。
本发明的黄金莓萃取物提升皮肤细胞线粒体活性的结果如图2所示。人类纤维母细胞1mg/mL本发明的黄金莓萃取物处理后，相较于控制组，能显著提升36.5％的线粒体膜电位；经0.5mg/mL本发明的黄金莓萃取物处理后，相较于控制组，则能显著提升32.3％的线粒体膜电位。此结果显示本发明的黄金莓萃取物有效提升皮肤细胞的线粒体活性，以维持皮肤细胞的活力及正常代谢，并能有效提升皮肤细胞抗老化的活性。
综上所述，本发明的黄金莓萃取物能有效在6-24小时内即有效提升皮肤角质细胞中与保湿相关的TGM1基因、KRT10基因、及KRT14基因的表现量，能有效维持皮肤角质细胞排列，使皮肤角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能、以及防止皮肤水分散失，使皮肤处于保水的状态、及维持皮肤年轻光滑有弹性；本发明的黄金莓萃取物亦能有效提升皮肤细胞的线粒体活性，以维持皮肤细胞的活力及正常代谢，以提升皮肤细胞抗老化的活性。因此，本发明的黄金莓萃取物具有提升皮肤抗老化活性及保湿能力的功效，可用于制备皮肤保健的组合物的用途，其中该组合物该组合物是一医药品、一食品或一保养品，可藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。
Claims (12)
1.一种黄金莓萃取物用于制备提升转谷氨酰胺酶(Transglutaminase，TGM)基因、及/或角蛋白(Keratin，KRT)基因表现量的组合物的用途，其中所述黄金莓萃取物是以一溶剂萃取一黄金莓所获得，所述溶剂为水、醇、或醇水混合物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述转谷氨酰胺酶基因是转谷氨酰胺酶1(Transglutaminase 1，TGM1)基因。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述角蛋白基因是角蛋白10(Keratin10，KRT10)基因、角蛋白14(Keratin14，KRT14)基因或其组合。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述黄金莓萃取物是维持皮肤角质层结构完整、及/或提升皮肤保湿能力。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述黄金莓萃取物的浓度为至少0.05mg/mL。
6.一种黄金莓萃取物用于制备提升线粒体活性的组合物的用途，其中所述黄金莓萃取物是以一溶剂萃取一黄金莓所获得，所述溶剂为水、醇、或醇水混合物。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述黄金莓萃取物是维持皮肤细胞的正常代谢、及/或提升皮肤细胞的抗老化活性。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述黄金莓萃取物的浓度为至少0.03125mg/mL。
9.根据权利要求1或6所述的用途，其特征在于，所述溶剂与所述黄金莓的重量比为10-20∶1-5。
10.根据权利要求1或6所述的用途，其特征在于，所述萃取的温度是50-100℃。
11.根据权利要求1或6所述的用途，其特征在于，所述组合物进一步包含一医药上可接受的载体。
12.根据权利要求1或6所述的用途，其特征在于，所述组合物是一医药品、一食品或一保养品。
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- 2019-04-26 CN CN201910347064.1A patent/CN111544489A/zh active Pending
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Also Published As
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