CN111534558A - 一种脂肪酶催化合成维生素a二十二碳六烯酸酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶催化合成技术领域，公开了一种脂肪酶催化合成维生素A二十二碳六烯酸酯的方法。本发明所述方法利用固定化脂肪酶Novozyme435催化乙酯型鱼油与维生素A醋酸酯发生酯交换反应，合成维生素A二十二碳六烯酸酯，所述酯交换反应是将维生素A醋酸酯和乙酯型鱼油溶解于有机溶剂中，加入固定化脂肪酶Novozyme435，于无氧条件下进行反应后分离纯化得到维生素A二十二碳六烯酸酯。该方法利用脂肪酶Novozyme435催化乙酯型鱼油与维生素A醋酸酯发生酯交换反应，首次合成了维生素A二十二碳六烯酸酯，制备的维生素A二十二碳六烯酸酯稳定性很好，杂质含量低，且反应温度低，能够在较短时间实现反应底物的转化，较好地避免了原料的变质。

Description

一种脂肪酶催化合成维生素A二十二碳六烯酸酯的方法
技术领域
本发明涉及酶催化合成技术领域，具体是涉及一种脂肪酶催化合成维生素A二十二碳六烯酸酯的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(DHA，docosahexaenoic acid)是广泛存在于海洋鱼油中的多不饱和脂肪酸，具有防治心血管疾病、治疗糖尿病、抑制肿瘤细胞等多种功效。另外，DHA还是视网膜的重要组成部分，对视力的发育起着非常重要的作用。目前，能稳定存在于总脂肪酸中含量较高的DHA主要以乙酯形式为主，该形式不利于人体吸收，生物利用率较低。现有一些研究尝试利用脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)的特异催化活性，对其进行改性，合成了DHA含量较高的甘油酯、磷脂脂质形式，既保留了DHA在总脂肪酸中的高含量，还将其转化成了更容易吸收的形式。
维生素A是人体必需的维生素之一，是儿童生长过程中必不可少的、也是最早被发现的维生素，对于维持正常的视觉反应，治疗夜盲症、眼干燥症等具有重要作用。但是维生素A极其不稳定，很容易在光、空气、高温下氧化分解，且对皮肤有刺激性。为了降低它的不稳定性和刺激性，已采用多种方法将维生素A转化成维生素A酯，市场上广泛应用的维生素A酯主要有维生素A棕榈酸酯、维生素A乙酸酯、维生素A油酸酯和维生素A琥珀酸酯等。
发明内容
本发明的目的是结合DHA所具有的促进视力发育、保护视力的作用，利用维生素A对DHA进行酯化修饰，期望获得更有利于视力发育、保持视力健康的化合物。
为达到本发明的目的，本发明利用固定化脂肪酶Novozyme435催化乙酯型鱼油与维生素A醋酸酯发生酯交换反应，合成结构如下所示的维生素A二十二碳六烯酸酯：
Figure BDA0002519815770000021
进一步地，所述酯交换反应是将维生素A醋酸酯和乙酯型鱼油溶解于有机溶剂中，加入固定化脂肪酶Novozyme435，于无氧条件下进行反应后分离纯化得到维生素A二十二碳六烯酸酯。
进一步地，所述有机溶剂与乙酯型鱼油的体积比为80～120：1。
进一步地，所述每μL鱼油中加入0.0025～0.0075mM维生素A醋酸酯。
进一步地，所述每mM维生素A醋酸酯中加入固定化脂肪酶200～300mg。
进一步地，所述有机溶剂为亲油性有机溶剂。
优选地，所述有机溶剂为石油醚、正己烷、环己烷和异辛烷中的一种或多种。
更优选地，所述有机溶剂为石油醚。
进一步地，所述反应温度为25～40℃，反应时间为1～24h。
进一步地，所述分离纯化方法为：先离心除去酶，再除去上清液中的有机溶剂，最后用C18柱层析进行纯化。
本发明利用脂肪酶Novozyme435催化乙酯型鱼油与维生素A醋酸酯发生酯交换反应，首次合成了维生素A二十二碳六烯酸酯，为该化合物生理活性相关研究的开展打好了基础，为本研究领域提供了更多的参考，也为工业应用提供了更多的选择性。此外，制备的维生素A二十二碳六烯酸酯稳定性很好，杂质含量低，且反应温度低，能够在较短时间实现反应底物的转化，较好地避免了原料的变质。
附图说明
图1是本发明实施例1目的产物的检测鉴定结果；
图2是本发明实施例3采用不同有机溶剂所得产物产量检测结果；
图3是本发明实施例4中维生素A醋酸酯添加量对所得产物产量的影响示意图；
图4是本发明实施例5中不同反应温度下所得产物产量检测结果；
图5是本发明实施例6中酶添加量对所得产物产量的影响示意图；
图6是本发明实施例7中酯交换反应效率随时间的变化示意图；
图7是本发明实施例8中酶使用批次对催化产物生成效率的影响示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
实施例1
维生素A二十二碳六烯酸酯的有机相制备：称取0.1mmol维生素A醋酸酯(纯度≥95.5％)于棕色瓶中，加入2mL石油醚溶解，再加入20μL鱼油(DHA≥90％)和20mg固定化酶Novozyme435。反应体系充氮后进行密封，于37℃反应24h后离心除去固定化脂肪酶。
实施例2
维生素A二十二碳六烯酸酯的分析鉴定方法：实施例1中除去酶后所得反应上清液经适当稀释后过膜，用高效液相色谱法进行产物的分离和定量检测。具体检测条件为：液相色谱柱为Agilent C18，紫外检测波长为327nm，流动相为1mL/min纯甲醇，柱温箱维持在35℃。液相检测结果如图1a所示，按照出峰顺序，3.07min为脂肪酶水解副产物维生素A，3.835min为底物维生素A醋酸酯，14.603min为目的产物维生素A二十二碳六烯酸酯。
采用高分辨液相-质谱联用技术进一步对产物进行鉴定，选用正离子模式，扫描范围为100～1000eV。图1b展示了产物的质谱鉴定结果，其中，619.4496就是目的产物[M+Na]+的分子量。
实施例3
酯交换反应有机溶剂体系的优化：选取不同有机溶剂，包括石油醚、正己烷、环己烷、异辛烷、乙腈、异丙醇和二甲基亚砜来作为反应体系中的有机溶剂，反应时间缩短至6h以使优化结果更容易观察，其它条件与实施例1中所述一致。按照实施例2中所述检测产物含量，结果表明，基本上转化效率随着有机溶剂的Log P增大而增大，石油醚作为反应溶剂时更有利于产物的生成(图2)。固定化脂肪酶在正己烷、环己烷和异辛烷这类非极性溶剂中也能发挥较好的催化作用，而在异丙醇中则主要对底物表现出水解活性，主要生成游离维生素A，生成的目的产物极少。在二甲基亚砜中固定化酶完全被抑制，既不能表现出酯交换活性，也不能表现出水解活性。
实施例4
酯交换反应维生素A醋酸酯添加量的优化：在实施例3的基础上，进行酰基受体维生素A醋酸酯添加量的优化。在鱼油添加量为20μL的前提下，维生素A醋酸酯的添加量分别设定为0.05mmol，0.075mmol，0.1mmol，0.125mmol和0.15mmol，反应6h后同样测定不同添加量下维生素A二十二碳六烯酸酯的产量(图3)。结果表明，维生素A醋酸酯添加量由0.05mmol增加至0.1mmol时，产物含量提高比较明显；当维生素A醋酸酯添加量继续增加时，产物含量提高幅度较小，总体呈现为一个先明显增加，再趋于稳定的趋势。考虑到成本问题，选用0.1mmol维生素A醋酸酯为最适添加量。
实施例5
酯交换反应温度的优化：在实施例4的基础上，进行反应温度的优化，选取了25℃，30℃，35℃，37℃，40℃，45℃，50℃，55℃和60℃分别进行酯交换反应(图4)。结果表明，从25℃到40℃，随着温度升高，目的产物的产量有也所提高，可能是温度的升高加快了分子运动，从而更有利于酶分子与底物分子的接触；从40℃继续升温，高温不利于脂肪酶保持分子结构，加速了酶的失活，因此产量出现明显下降。最终选用40℃作为最佳反应温度。另外，从图中也能观察到，在25℃到40℃产量只是缓慢增加，因此，在室温条件下也可获得与最适温度条件下几乎相同的产量，在大规模生产中可以大大地节约能源。
实施例6
酯交换反应酶添加量的优化：在实施例5的基础上，进行固定化脂肪酶添加量的优化，选取了10mg、15mg、20mg、25mg和30mg酶添加量分别进行酯交换反应(图5)。测定了不同酶添加量条件下反应体系中目的产物的含量，结果表明，从10mg到25mg，目的产物的产量有所提高；当加酶量继续增加时，产量反而有所下降，因此选用25mg作为最适加酶量。出现这种现象可能是因为酶量较少时，在有机体系中主要催化酯交换反应，而当酶量达到某个标准，甚至过量时，在短时间内就可以比较完全地催化酯交换反应，继续反应则会以目的产物为底物，催化维生素A二十二碳六烯酸酯发生水解反应，从而导致了产量的降低。
实施例7
酯交换反应效率随时间的变化：在实施例6的基础上，于最适条件下进行反应，分别测定在反应了1h，3h，6h，9h，12h和24h后反应体系中目的产物的含量(图6)。结果表明，在前6h，由于底物含量较高，有利于反应的快速进行，目的产物的产量随着时间延长而出现明显的提高；当反应时间继续延长时(6h至24h)，由于反应本身已经进行得比较充分，底物含量也明显降低，因此目的产物产量的提高幅度明显变小，渐渐趋于稳定。在工业生产中，时间的延长就意味着更多的成本，同时也容易使底物和产物变质，造成损失，因此选用6h作为最适反应时间。
实施例8
最优反应条件下固定化酶的重复使用：依照实施例3-7，最优反应条件为：维生素A醋酸0.1mmol，鱼油20μL，加酶量25mg，石油醚2mL，充氮密封后于40℃反应6h。固定化酶经分离后，用石油醚洗涤两次，在通风橱充分晾干，以备进行下一轮反应。以第一轮反应产物的产量为100％，第二轮到第五轮的转化效率分别保留了87.9％，75.8％，62.4％和52.6％(图7)。总体来说，Novo435催化产物生成的效率随着使用批次的增加，出现了大幅度的下降，平均每重复利用一次，转化效率下降12％。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种脂肪酶催化合成维生素A二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于，所述方法利用固定化脂肪酶Novozyme435催化乙酯型鱼油与维生素A醋酸酯发生酯交换反应，合成结构如下所示的维生素A二十二碳六烯酸酯：
Figure FDA0002519815760000011
2.根据权利要求1所述的脂肪酶催化合成维生素A二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于，所述酯交换反应是将维生素A醋酸酯和乙酯型鱼油溶解于有机溶剂中，加入固定化脂肪酶Novozyme435，于无氧条件下进行反应后分离纯化得到维生素A二十二碳六烯酸酯。
3.根据权利要求1所述的脂肪酶催化合成维生素A二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于，所述有机溶剂与乙酯型鱼油的体积比为80～120：1。
4.根据权利要求1所述的脂肪酶催化合成维生素A二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于，所述每μL鱼油中加入0.0025～0.0075mM维生素A醋酸酯。
5.根据权利要求1所述的脂肪酶催化合成维生素A二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于，所述每mM维生素A醋酸酯中加入固定化脂肪酶200～300mg。
6.根据权利要求1所述的脂肪酶催化合成维生素A二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于，所述有机溶剂为亲油性有机溶剂。
7.根据权利要求6所述的脂肪酶催化合成维生素A二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于，所述有机溶剂为石油醚、正己烷、环己烷和异辛烷中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的脂肪酶催化合成维生素A二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于，所述有机溶剂为石油醚。
9.根据权利要求1所述的脂肪酶催化合成维生素A二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于，所述反应温度为25～40℃，反应时间为1～24h。
10.根据权利要求1所述的脂肪酶催化合成维生素A二十二碳六烯酸酯的方法，其特征在于，所述分离纯化方法为：先离心除去酶，再除去上清液中的有机溶剂，最后用C18柱层析进行纯化。
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