CN111511197A - 甜菊属栽培品种“16228013” - Google Patents
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Abstract
公开了称为“16228013”的甜菊属栽培品种。另一些实施方案涉及甜菊属栽培品种“16228013”的植物部分、甜菊属植物“16228013”以及用于产生通过将所述栽培品种“16228013”与自身或其他甜菊属品种进行杂交而产生的甜菊属植物的方法，包括使用标记辅助育种的方法。另一些实施方案涉及通过将所述栽培品种“16228013”与其他甜菊属栽培品种进行杂交而产生的杂交体甜菊属种子和植物。还公开了用于鉴定植物品种“16228013”来源植物材料的六个高度多态性SNP基因座和相应的基因组序列。
Description
相关申请的交叉引用
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序列表的提交
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本公开内容涉及甜菊属(stevia)(甜菊(Stevia rebaudiana))种子、甜菊属植物、甜菊属栽培品种(cultivar)和甜菊属杂交体(hybrid)。本公开内容还涉及用于产生甜菊属种子和植物的方法。本申请中引用的所有出版物均通过引用并入本文。
甜菊属是用于生产甜味剂、糖替代品和其他可消费成分(consumableingredient)的重要且有价值的大田作物(field crop)。因此，甜菊属植物育种的持续目标是开发稳定、高产的农学上合理的甜菊属物种的甜菊属栽培品种。该目标的原因是为了使甜味剂、糖替代品和其他可消费成分的量和品质最大化。为了实现该目标，甜菊属育种者(breeder)必须选择和开发具有产生优良栽培品种之性状的植物。
新甜菊属栽培品种的开发需要评价和选择亲本以及使这些亲本进行杂交。由于给定杂交缺乏可预见的成功，因此需要育种者在任何给定年份中进行具有相同或不同育种目标的数次杂交。
相关领域的前述实例和与其相关的限制旨在是举例说明性的而非排他性的。在阅读说明书之后，相关领域的其他限制对本领域技术人员而言将变得明显。
发明概述
应当理解，一些实施方案包括多个不同的形式或实施方案，并且本发明概述不意在是限制性的或全部包含性的(all-inclusive)。本发明概述提供了一些实施方案的一些一般性描述，但是还可包括其他实施方案的一些更具体的描述。
以下实施方案及其方面结合系统、工具和方法进行描述，其旨在是示例性的和举例说明性的，而不是在范围上的限制。在多个实施方案中，上述问题中的一个或更多个已被减小或消除，而另一些实施方案针对另一些改进。
一个或更多个实施方案涉及甜菊属种子、甜菊属植物、甜菊属栽培品种以及用于产生甜菊属植物的方法。
一个或更多个实施方案还涉及通过将本发明的植物与其他甜菊属植物进行杂交来产生甜菊属种子和植物的方法。
一个实施方案涉及甜菊属品种(stevia variety)“16228013”的植物组织，例如芽(shoot)、微芽和种子。另一个方面还涉及通过种植(growing)甜菊属品种“16228013”的种子而产生的植物，以及这样的植物的衍生物。本文中使用的术语“植物”包括植物细胞，植物原生质体，可从其再生甜菊属植物的组织培养物的植物细胞，植物愈伤组织(calli)，植物团块(plant clump)，芽，微芽，以及在植物或植物的部分(例如花粉、花、种子、叶、茎等)中是完整的植物细胞。
另一个实施方案涉及甜菊属品种“16228013”的可再生细胞的组织培养物，以及从其再生的植物，其中再生的甜菊属植物表达由称为“16228013”的甜菊属种子或组织培养物种植的植物的所有生理和形态特征。
又一个实施方案是包含至少第一转基因的甜菊属品种“16228013”的甜菊属植物，其中以另外的方式使所述甜菊属植物能够表达甜菊属品种“16228013”的所有生理和形态特征。特别地，在本发明的一些实施方案中，提供了包含单一基因座转换的植物。单一基因座转换可包含转基因基因(transgenic gene)，该基因已通过遗传转化引入甜菊属品种“16228013”或其祖先中。如本领域公知的，转基因或非转基因单基因座转换也可通过进行回交来引入。在某些实施方案中，单基因座转换可包含显性或隐性等位基因。基因座转换可潜在地赋予如本文中所述植物以任何期望的性状。
又一个实施方案是关于使用另一些新植物育种技术(New Plant BreedingTechnique，NPBT)，例如寡核苷酸定向诱变(Oligo-Directed Mutagenesis，ODM)和CRISPR-Cas9或CRISPR-Cpf1，来修饰甜菊属品种“16228013”或其祖先。
又一个实施方案涉及通过将甜菊属品种“16228013”的植物与第二甜菊属植物进行杂交而产生的第一代(F1)杂交体甜菊属种子。本发明的一些实施方案中还包括通过将甜菊属品种“16228013”与第二甜菊属植物进行杂交而产生的杂交体种子生长的F1杂交体甜菊属植物。本发明的一些实施方案中还包括以甜菊属品种“16228013”作为一个亲本产生的F1杂交体植物的种子，从F1杂交体植物的种子生长的第二代(F2)杂交体甜菊属植物，以及F2杂交体植物的种子。
又一个实施方案是用于产生甜菊属种子的方法，其包括将甜菊属品种“16228013”的植物与任何第二甜菊属植物，包括品种“16228013”自身或其他植物进行杂交。特别地，在本发明的一些实施方案中，杂交方法包括以下步骤：(a)栽培(planting)甜菊属品种“16228013”的种子；(b)培养由所述种子产生的甜菊属植物直至所述植物开花(bearflower)；(c)使所述植物的花受精；以及(d)收获由所述植物产生的种子。
又一个实施方案是用于产生杂交体甜菊属种子的方法，其包括将甜菊属品种“16228013”与和甜菊属品种“16228013”非同基因的第二独特的甜菊属植物进行杂交。特别地，在杂交时包括以下步骤：(a)栽培甜菊属品种“16228013”和第二独特的甜菊属植物的种子；(b)培养从种子生长的甜菊属植物直至植物开花；(c)将两株植物之一上的花与其他植物的花粉进行交叉授粉(cross pollinate)；以及(d)收获由交叉授粉而产生的种子。
又一个实施方案是用于在甜菊属育种程序中开发甜菊属植物的方法，其包括：(a)获得品种“16228013”的甜菊属植物或其部分；以及(b)将所述植物或部分用作育种材料的来源，使用植物育种技术。在该方法中，植物育种技术可选自轮回选择、混合选择(massselection)、集团选择(bulk selection)、回交、谱系育种、标记辅助选择、遗传转化和基因组编辑。在某些实施方案中，品种“16228013”的甜菊属植物被用作雄性或雌性亲本。
又一个实施方案是用于产生来源于甜菊属品种“16228013”的甜菊属植物的方法，该方法包括以下步骤：(a)通过将甜菊属品种“16228013”的植物与第二甜菊属植物进行杂交来制备来源于甜菊属品种“16228013”的后代植物；以及(b)将后代植物与自身或第二植物进行杂交，以产生来源于甜菊属品种“16228013”的植物的后代的后代植物。在一个实施方案中，该方法还包括：(c)将后代的后代植物与其本身或第二植物进行杂交；以及(d)重复步骤(b)和(c)至少2至10另外的代数，以产生来源于甜菊属品种“16228013”的近交甜菊属植物。还提供了通过本发明实施方案的该方法和另一些方法产生的植物。
通过本文中所述的本发明实施方案的该方法和另一些方法产生的植物品种“16228013”来源的植物在某些实施方案中可进一步限定为包含表1中给出的植物品种“16228013”的性状。
在另一个实施方案中，使本申请的甜菊属植物无性繁殖的方法，其包括以下步骤：(a)从“16228013”的植物收集能够繁殖的组织或细胞；(b)培养(a)的所述组织或细胞以获得增殖的芽(proliferated shoot)；以及(c)使所述增殖的芽生根以获得生根的小植株(plantlet)；或者(d)培养所述组织或细胞以获得增殖的芽，或获得小植株。此外，提供了通过培养所述小植株或增殖的芽而产生的植物。
在另一个实施方案中，描述了使用单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)标志物来鉴定甜菊属品种的方法。使用六个高度多态性SNP基因座和相应的基因组序列来鉴定植物品种“16228013”来源的植物材料。带有经标记的六种SNP的基因组序列出于表4中。
在权利要求书和/或说明书中，当与术语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词可意指“一个/种”，但其也与“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。
从以下详细描述中，其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应当理解，虽然示出了具体实施方案，但是详细描述和具体实例仅通过举例说明的方式给出，由于从该详细描述中，对于本领域技术人员而言，本发明实施方案的精神和范围内的多个变化和修改将变的明显。
另一个实施方案提供了用于甜菊属植物“16228013”的组织培养中的可再生细胞。组织培养可能够使具有前述甜菊属植物的生理和形态特征的植物再生，并且能够使具有与前述甜菊属植物基本上相同的基因型的植物再生。在这样的组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、雌蕊、根、根尖、花、种子或茎。更进一步，另一个实施方案提供了从本发明的组织培养物中再生的甜菊属植物。
本发明的另一个实施方案包括用于在甜菊属植物育种程序中开发甜菊属植物的方法，其包括将植物育种技术应用于权利要求1所述的甜菊属植物或其部分，所述植物育种技术包括轮回选择、回交、谱系育种、标记增强选择、单倍体/双单倍体生产、或转化，其中所述技术的应用导致甜菊属植物的开发。
本发明的另一个实施方案包括通过将甜菊属栽培品种“16228013”的植物或植物部分或者其基因座转换体与其他植物进行杂交而产生的第二甜菊属种子、植物、植物部分或细胞，其中所述甜菊属栽培品种“16228013”的代表性植物组织已以CGMCC No.11706保藏，并且其中所述甜菊属栽培品种“16228013”种子、植物、植物部分或细胞与甜菊属栽培品种“16228013”的植物或植物部分具有相同的SNP ID NO：1、SNP ID NO：2、SNP ID NO：3、SNPID NO：4、SNP ID NO：5和SNP ID NO：6单核苷酸多态性的多态性。
又一个实施方案是用于鉴定所述甜菊属栽培品种“16228013”的六个单核苷酸多态性，包括基因座特异性基因组序列和序列内鉴定的单核苷酸多态性。
除上述示例性的方面和实施方案之外，通过对以下描述的研究，另一些方面和实施方案可变得明显。
本文中使用的“至少一个”、“一个或更多个”和“和/或”是在操作中为结合性和分离性的开放式表达。例如，表达“A、B和C中的至少一个”，“A、B或C中的至少一个”，“A、B和C中的一个或更多个”，“A、B或C中的一个或更多个”以及“A、B和/或C”中的每个意指单独的A，单独的B，单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，或A、B和C一起。
本文中使用的“某时”意指在某个不明确或不确定的时间点。因此，例如，本文中使用的“在……之后的某时”意指跟随，无论是紧随先前动作或是在先前动作之后的某个不明确或不确定的时间点。
多个实施方案阐述于本文中提供的并且由权利要求书记载的详细描述中。然而，应当理解，本发明概述不包含所有的方面和实施方案，这并不意指以任何方式进行限制或约束，并且本领域普通技术人员理解如本文中公开的实施方案涵盖其明显的改进和修改。
除上述示例性的方面和实施方案之外，通过对以下描述的研究，另一些方面和实施方案将变得明显。
序列表简述
SNP ID NO：1公开了单核苷酸多态性“stv_snp_568899”，其在受试甜菊属品系中是高度多态性的。
SNP ID NO：2公开了单核苷酸多态性“stv_snp_77072”，其在受试甜菊属品系中是高度多态性的。
SNP ID NO：3公开了单核苷酸多态性“stv_snp_11466”，其在受试甜菊属品系中是高度多态性的。
SNP ID NO：4公开了单核苷酸多态性“stv_snp_14413”，其在受试甜菊属品系中是高度多态性的。
SNP ID NO：5公开了单核苷酸多态性“stv_snp_6645712”，其在受试甜菊属品系中是高度多态性的。
SNP ID NO：6公开了单核苷酸多态性“sty_snp_682884”，其在受试甜菊属品系中是高度多态性的。
附图简述
并入本文并构成说明书一部分的附图示出了一些但不是唯一或排他的示例性实施方案和/或特征。本文中公开的实施方案和附图旨在被认为是举例说明性的而不是限制性的。
图1示出了SEQ ID No：1至6的SNP序列。
定义
在以下的描述和表格中，使用了许多术语。为了对说明书和权利要求书提供清楚和一致的理解(包括这样的术语给定的范围)，提供了以下定义：
基因型：是指细胞或生物体的遗传组成。
植物：本文中使用的术语“植物”包括提及未成熟或成熟的整个植物，包括已被加工用于甜菊醇糖苷的植物。会产生植物的种子或植物部分也被认为是植物。
植物部分：本文中使用的术语“植物部分”包括叶、茎、根、根尖、种子、胚、花粉、胚珠、花、根尖、芽、微芽、花药、组织、细胞等。
莱鲍迪苷A(Rebaudioside A)：本文中使用的是仅包含葡萄糖作为其单糖部分(moiety)的甜菊醇糖苷。其总共包含四个葡萄糖分子，其中三联体的中心葡萄糖与主要的甜菊醇结构在其羟基处连接，并且其余葡萄糖在其羧基处连接形成酯键。
莱鲍迪苷D：本文中使用的是从甜菊分离的对映-贝壳杉烷型二萜糖苷(ent-kaurane diterpene glycoside)。
莱鲍迪苷M：本文中使用的是从甜菊分离的对映-贝壳杉烷型二萜糖苷。
SNP：本文中使用的术语“SNP”应是指单核苷酸多态性。
甜菊苷含量：本文中使用的甜菊苷是来源于甜菊属植物的糖苷百分比。
传统育种技术：本文中涵盖如育种者已知的杂交、自交、选择、双单倍体生产、胚拯救(embryo rescue)、原生质体融合、标记辅助选择、突变育种等(即除遗传修饰/转化/转基因方法之外的方法)，例如，通过所述方法可将遗传可继承的性状从一种胡萝卜品系或品种转移到其他胡萝卜品系或品种。
无性繁殖(vegetative propagation)：“(vegetative reproduction)”或“克隆繁殖”在本文中可互换使用，并且意指获取植物部分并使该植物部分形成至少根的方法，其中植物部分例如被限定为或来源于(例如，通过切割)叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、细胞、结节、原生质体、分生组织细胞、根、根尖、雌蕊、花药、花、芽尖、芽、茎、叶柄等。当整个植物通过无性繁殖而再生时，其也称为无性繁殖。
发明详述
甜菊属栽培品种“16228013”是甜菊属植物品种，其显示出均匀性和稳定性，如以下品种描述信息中所述。在慎重注意植物类型均匀性的情况下，已经复制了足够的代数目。在持续观察到均匀性的情况下增多了栽培品种。
甜菊属栽培品种“16228013”是由2015年9月在中华人民共和国江西省赣州进行的专有雌性甜菊属品种“814011”(美国专利No.9,668,451)与专有雄性甜菊属品种“44004”(无专利的优良高级莱鲍迪苷M品系)之间的双亲杂交产生。
根据在中华人民共和国江西省赣州采集的数据，甜菊属栽培品种“16228013”具有以下形态和其他特征。
表1品种描述信息
繁殖类型：营养扦插(Vegetative cutting)、组织培养和种子
类型：多年生
产生生根的幼小植物的时间：从扦插起20至30天
根描述：存在初生根(包括直根和侧根)和次生根(包括肉质根和小根(rootlet))
生根习性：须根系，深度约20.0cm至30.0cm，宽30.0cm至40.0cm(在大田条件下)
植物和生长习性：分为3个阶段，植被生长阶段、植被生长和生殖生长共同阶段、生殖生长阶段
植物高度：105.0cm至115.0cm
植株直径：57.0cm至69.0cm
茎长度：82.0cm至100.0cm
茎节间长度：2.7cm至4.0cm
茎直径：0.9cm至1.0cm
茎颜色：RHS 144B
茎质地：在基部木质化
茎强度：强
茎花色苷：不存在
茎，主茎上的节数目：40至50
茎，每个植物的基础节数目：320至400
侧枝长度：10.0cm至35.0cm
侧枝直径：0.15cm至0.25em
侧枝节间长度：3.0cm至5.0cm
侧枝方向：向上；约20至30度角
侧枝强度：强
侧枝质地：在基部木质化
侧枝颜色：RHS 142B
叶序：对生
叶长：8.0cm至10.0cm
叶宽：1.5cm至2.8cm
叶形状：卵形
叶端：突然变细(Abruptly tapered)
叶基：渐狭(Attenuate)
叶缘：浅齿状
叶脉序模式：网状脉序
叶脉序颜色：RHS 144B
叶质地(上和下表面二者)：无毛
叶颜色，未成熟的上表面：RHS 137A
叶颜色，下表面：RHS 138B
叶颜色，成熟的上表面：RHS 141B
叶颜色，成熟的下表面：RHS 138B
芽长(bud length)：0.6cm至0.7cm
芽宽：0.2cm至0.3cm
芽形状：椭圆形(Ellipsoid)
芽颜色：轻微地RHS 142A(绿色)
花序、外观和布置：花头状花序，由五个椭圆形苞片，五个盘状小花(disk floret)组成
花序，开花时间：在移植之后约110天
花序，开花时间：在中华人民共和国江西省赣州，从八月至九月
盘状小花(disc floret)，长度：0.8cm至0.9cm
盘状小花，宽度：0.3至0.4cm
盘状小花，形状：管状
盘状小花，尖端(apex)：尖锐
盘状小花，边缘：光滑
盘状小花，基部：在基部的中部变成管状
盘状小花，颜色，上表面：白色
盘状小花，颜色，下表面：白色
盘状小花，脉序颜色，上表面：白色
盘状小花，脉序颜色，下表面：白色
盘状小花，苞片长度：0.7cm至0.8cm
盘状小花，苞片宽度：0.2cm至0.3cm
盘状小花，苞片形状：披针状(Lanceolate)
盘状小花，苞片尖端：突然变细
盘状小花，苞片边缘：光滑
盘状小花，苞片基部：渐狭
盘状小花，苞片颜色(上和下表面二者)：RHS 143C(绿色)
盘状小花，苞片脉序颜色(上和下表面二者)：RHS 143C(绿色)
盘状小花，苞片香味：不存在
雄蕊量：5
花丝长度：0.20cm至0.25cm
花丝颜色：RHS 145C
花药形状：柱样
花药长度：0.16cm至0.21cm
花药颜色：RHS 150D
花粉量：7000至8000
花粉颜色：RHS 150D
花柱长度：0.86cm至0.93cm
花柱颜色：RHS 144B
柱头形状：2分支
柱头颜色：RHS 145A
子房颜色：RHS 144C
果实和种子集合：种子是瘦果，长约0.2cm至0.4cm，以及宽0.05cm至0.08cm，同时顶部上有浅棕色的冠毛。
病害和昆虫/有害生物(pest)抗性：良好。
与商业品种的比较
“16228013”与其以“CGMCC No.9701”保藏的名称为“814011”的商业亲本品系最相似。两个品种之间的差异描述于表2中。
表2：与相似品种的比较
莱鲍迪苷含量
为了收集下表3的数据，将甜菊属叶样品风干/烘干，然后使用研杵和研钵将其研磨成细粉。对于每个样品，将叶粉末(100mg)用15ml的60℃蒸馏水提取18小时。将混合物离心，过滤上清液并收集，用于通过HPLC(Agilent，美国)进行SG组分分析。甜菊醇糖苷的分析使用配备有Poroshell 120SB-C182.7μm，4.6×150mm的Agilent Technologies 1200系列(美国)HPLC进行。设置在210nm的二极管阵列用作检测器。在列一中，Reb代表莱鲍迪苷，Stev代表甜菊苷，Dul代表杜克苷(Dulcoside)。
表3：“16228013”的莱鲍迪苷含量
用于鉴定甜菊属栽培品种“16228013”的单核苷酸多态性(SNP)
单核苷酸多态性(SNP)是发生在基因组中特定位置的特定单核苷酸中的变异，这是甜菊基因组中最常见的遗传变异类型。图1示出了表明6种SNP的测序结果是用于鉴定品种“16228013”的有力分子标志物。
甜菊属品种“16228013”中六种SNP(SNP ID NO：1、SNP ID NO：2、SNP ID NO：3、SNPID NO：4、SNP ID NO：5和SNP ID NO：6)的基因型列出如下。
表4：“16228013”的SNP基因型
另一个实施方案是来源于通过将将甜菊属品种“16228013”的植物或植物部分与其他植物进行杂交而产生的甜菊属品种“16228013”的甜菊属植物或植物部分，其中所述甜菊属品种“16228013”的代表性新鲜组织培养物已经保藏，并且其中来源于甜菊属品种“16228013”的所述甜菊属植物部分与甜菊属品种“16228013”的植物或植物部分具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的SNP ID NO：1、SNP ID NO：2、SNP ID NO：3、SNP ID NO：4、SNP ID NO：5和SNP ID NO：6的SNP的多态性。
来源于通过将甜菊属品种“16228013”的植物或植物部分与其他植物进行杂交而产生的甜菊属品种“16228013”的甜菊属种子，其中所述甜菊属品种“16228013”的代表性植物部分已经保藏，并且其中来源于甜菊属品种“16228013”的所述甜菊属种子在相同的环境条件下培养时，基本上具有与和甜菊属品种“16228013”相同的形态特征。相同的环境条件可以是但不限于并排(side-by-side)比较。特征可以是表1中列出的那些。该比较可使用许多专业认可的实验设计和统计分析来进行。
一个实施方案还涉及通过将第一亲本甜菊属植物与第二亲本甜菊属植物进行杂交而用于产生甜菊属植物的方法，其中第一或第二甜菊属植物是来自栽培品种“16228013”的甜菊属植物。此外，第一和第二亲本甜菊属植物二者可以是栽培品种“16228013”(例如，自花授粉)。因此，使用栽培品种“16228013”的任何方法都是本发明的实施方案的一部分：自交、回交、杂交体育种以及与种群杂交。使用栽培品种“16228013”作为亲本产生的任何植物都在本发明的实施方案的范围内。本文中使用的术语“植物”包括植物细胞，植物原生质体，可从其再生甜菊属植物的组织培养物的植物细胞，植物愈伤组织，植物团块，以及在植物或植物的部分，例如花粉、花、胚、胚珠、种子、叶、茎、根、花药、雌蕊、芽、微芽等中是完整的植物细胞。因此，另一个方面是提供在生长和分化时产生基本上具有“16228013”的所有的生理和形态特征的栽培品种的细胞。
另一个实施方案考虑了从本发明的本实施方案的栽培品种(例如，“16228013”)或杂交体植物的组织培养物中再生的甜菊属植物。如本领域中公知的，甜菊属的组织培养物可用于甜菊属植物的体外再生。甜菊属的多种组织的组织培养物和由此产生的植物的再生是公知的，并且已经广泛公布。
在任何期望的植物种质的开发中存在许多步骤。植物育种始于对当前种质问题和劣势的分析和定义、计划目标的制定以及对特定育种目标的定义。下一步是选择具有满足计划目标的性状的种质。目标是在单个栽培品种中组合来自亲本种质的期望性状的改进组合。在甜菊属中，重要性状为叶产率、早熟、改善的叶品质、莱鲍迪苷含量、甜菊苷含量，对病虫害的抗性，对旱热的抗性和改善的农学性状。
育种方法
育种或选择方法的选择取决于植物繁殖的模式、被改善性状的遗传力，以及商业上使用的栽培品种类型(例如，F1杂交栽培品种、纯系栽培品种等)。对于高度可遗传的性状，在单个位置处评价优质个体植物的选择将是有效的，而对于具有低遗传力的性状，选择应基于从相关植物家族的重复评价获得的平均值。流行的选择方法通常包括谱系选择、改进的谱系选择、重量选择(mass selection)和轮回选择。
遗传的复杂性影响育种方法的选择。回交育种用于将高度可遗传性状的一个或一些有利基因转移到期望的栽培品种中。该方法已广泛用于对于抗病性栽培品种进行育种。多种轮回选择技术用于改善由许多基因控制的定量遗传性状。在自花授粉作物中轮回选择的使用取决于授粉的容易程度、每次授粉成功杂交的频率、以及每个成功杂交的杂交后代的数目。
每个育种程序应包括对育种操作效率的定期、客观评价。评价标准根据目标和目的而不同，但应包括基于与适当标准的比较、先进育种品系的总体价值、以及每单位投入(例如，每年、每花费的美元数等)产生的成功栽培品种的数目的每年来自选择的收益。
有前途的先进育种品系经过全面测试，并与代表商业目标区域的环境中的流行栽培品种进行了三年或更多年的比较。比流行的栽培品种优良的品系是成为新的商业栽培品种的候选者。那些仍然缺乏一些性状的品系被丢弃或用作亲本以产生新的种群用于进一步选择。
导致营销和分销的最后步骤的这些过程通常需要从进行第一次杂交开始起7至12年。因此，开发新栽培品种是一个耗时的过程，需要精确的前瞻性规划、资源的高效利用以及方向的最小变化。
最困难的任务是鉴定遗传上优良的个体，因为对于大多数性状，真实的基因型值被其他混杂的植物性状或环境因素所掩盖。鉴定优良植物的一种方法是观察其相对于其他实验品系和广泛培养的标准栽培品种的性能。对于许多性状，单个观察结果是不确定的，并且需要在时间和空间上重复观察以提供对品系的遗传价值的良好估计。
商业甜菊属育种程序的目标是开发新的、独特的和优良的甜菊属栽培品种。育种者最初选择两个或更多个亲本品系并使其杂交，然后进行世代进化和选择，从而产生许多新的遗传组合。通过这种操作，育种者理论上可产生数十亿种不同的遗传组合。育种者无法直接控制在其培养的有限种群规模中将会出现哪种遗传组合。因此，两个育种者将永远不会开发出具有相同性状的相同品系。
每年，植物育种者选择种质以推进至下一代。该种质在独特且不同的地理、气候和土壤条件下生长，并随后在生长季节期间和结束时进行进一步选择。所开发的品系是不可预测的。这种不可预测性是因为育种者的选择发生在独特的环境中，在DNA水平上没有控制(使用常规育种操作)，并且产生了数百万种不同的可能的遗传组合。本领域普通技术育种人员不能预测他开发的最终所得品系，除了可能以非常粗略和一般的方式。通过使用完全相同的原始亲本和相同的选择技术，同一育种者不能以任何合理的可能性产生相同的栽培品种两次。这种不可预测性导致大量研究资金的开支用于开发优良的新的甜菊属栽培品种。
甜菊属的纯系栽培品种通常通过使两个或更多个亲本杂交然后进行选择来繁殖。遗传的复杂性、育种目标和可利用的资源均影响育种方法。谱系育种、轮回选择育种和回交育种是通常用于自花授粉作物(例如甜菊属)的育种方法。这些方法涉及其中制备育种池或种群以组合来自两个或更多个栽培品种或多种广泛来源的期望性状的方式。通常用于选择期望个体或个体种群的操作被称为重量选择、株行选择(plant-to-row selection)和单粒传法(single seed descent)或改进的单粒传法。这些选择方法中的一种或其组合可用于从育种种群开发栽培品种。
谱系育种主要用于将有利基因组合成全新栽培品种，其在许多性状上与用于原始杂交的任一亲本不同。其通常用于改良自花授粉作物。将具有有利的互补性状的两个亲本杂交以产生F1(子一代)。通过使F2植物自交产生F2群体。期望个体植物的选择可早在其中发生最大基因分离的F2代开始。个体植物选择可发生一代或更多代。接下来，来自每个所选植物的种子可栽培在被称为后代行(progeny row)或后代山(progeny hill)的单独的、识别的行或山中以评价该品系并提高种子数量，或进一步选择个体植物。一旦选择具有期望性状的后代行或后代山，其就变成所谓的育种品系，其可从源自相同原始种群的其他育种品系中特异性地鉴定。在高世代(advanced generation)(即F5或更高代)中，在重复测试中评价个体品系的种子。在高级阶段，测试来自相同原始杂交的最佳品系或表型相似品系的混合物作为新栽培品种的潜在释放。
严格意义上的单粒传法操作是指栽培分离种群，从每柱植物中收获一粒种子，并将这些种子组合成批(bulk)，其作为下一代栽培。当群体已经进展至期望的近交水平时，从其来源的品系的植物将分别追踪至不同的F2个体。单粒传法操作的主要优点是延迟选择，直至在单个植物中实现高水平的纯合性(例如，缺乏基因分离)，并且通常通过使用冬季小植株圃快速通过这些早期世代。
改进的单粒传法操作涉及从种群中的每个植物收获多个种子(即单个锁(singlelock)或简单铃(simple boll))并将它们组合以形成批。该批的一部分用于栽培下一代，且一部分用于储备。该操作已被用于在收获时节省劳动力并保持足够的种群种子数量。
期望性状的选择可在任何分离的世代(F2及更高代)发生。通过在最大程度地表达期望性状的环境中培养种群并且可鉴定具有该性状的个体或品系而对种群施加选择压力。例如，当植物或品系在天然或人工诱导的病害环境中培养时，可进行对抗病性的选择，并且育种者仅选择几乎没有或没有病害并因此被认为具有抗性的那些个体。
除表型观察之外，还可检测植物的基因型。存在许多基于实验室的技术可用于植物基因型的分析、比较和表征。其中包括同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RestrictionFragment Length Polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(Randomly AmplifiedPolymorphic DNA，RAPD)、任意引物聚合酶链反应(Arbitrarily Primed PolymeraseChain Reaction，AP-PCR)、DNA扩增指纹技术(DNA Amplification Fingerprinting，DAF)、序列特征扩增区(Sequence Characterized Amplified Region，SCAR)、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、简单重复序列(Simple SequenceRepeat，SSR-也被称为微卫星)和单核苷酸多态性(SNP)。
使用分子技术进行育种
同工酶电泳和RFLP已广泛用于确定遗传组成。Shoemaker and Olsen，(MolecularLinkage Map of Soybean(Glycine max L.Merr.)pp.6.131-6.138，S.J.O’Brien(Ed.)Genetic Maps：Locus Maps of Complex Genomes，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1993))开发了分子遗传连锁图谱，其由25个具有约365个RFLP、11个RAPD、3个经典标记和4个同工酶基因座的连锁群组成。还参见Shoemaker，R.C.，RFLP Map of Soybean，pp.299-309，in Phillips，R.L.and Vasil，I.K.(Eds.)，DNA-Based Markers in Plants，Kluwer Academic Press，Dordrecht，the Netherlands(1994)。
SSR技术是目前最高效且实用的标记技术；与RFLP相比，可常规使用更多的标记基因座，并且可使用SSR找到每个标记基因座的更多等位基因。例如，Diwan和Cregan描述了在大豆中具有多达26个等位基因的高度多态微卫星基因座。Diwan，N.and Cregan，P.B.，Theor.Appl.Genet.，95：22-225(1997。SNP也可用于鉴定本发明的独特遗传组成和保留该独特遗传组成的后代品种。可组合使用多种分子标记技术以增强总体分辨率。
包括通过使用例如同工酶电泳、RFLP、RAPD、AP-PCR、DAF、SCAR、AFLP、SSR和SNP的技术鉴定的标记的分子标记可用于植物育种。分子标记的一种用途是数量性状基因座(Quantitative Trait Loci，QTL)映射。QTL映射是使用已知与对于数量性状具有可测量的影响的等位基因密切相关的标记。育种过程中的选择基于与正效应等位基因相关的标记的积累和/或与来自植物基因组的负效应等位基因相关的标记的消除。
在育种过程期间也可使用分子标记来选择定性性状。例如，与包含实际感兴趣等位基因内的序列的等位基因或标记密切相关的标记可用于在回交育种程序期间选择包含感兴趣的等位基因的植物。例如，分子标记用于大豆育种以选择对大豆胞囊线虫(soybeancyst nematode)具有抗性的性状，参见美国专利No.6,162,967。标记也可用于选择轮回亲本的基因组和针对供体亲本的标记进行选择。使用该操作可使来自保留在所选植物中的供体亲本的基因组的量最小化。其还可用于降低回交程序中所需杂交回轮回亲本的次数。在选择过程中使用分子标记通常被称为遗传标记增强选择。通过提供通过杂交追踪遗传谱的手段，分子标记也可用于鉴定和排除作为植物的祖先或亲本品种的某些种质来源，如下文中更全面地讨论的。
突变育种
突变育种是将新性状引入甜菊属品种中的另一种方法。自发发生或人工诱导的突变可用于植物育种者的变异性来源。人工诱变的目标是提高期望特征的突变率。突变率可通过许多不同手段来提高，所述手段包括温度；长期种子储存；组织培养条件；辐射(例如X射线、γ射线、中子、β辐射或紫外辐射)；化学诱变剂(例如碱基类似物如5-溴尿嘧啶)；抗生素；烷化剂(例如硫芥、氮芥、环氧化物、乙胺、硫酸酯、磺酸酯、砜或内酯)、叠氮化物；羟胺；亚硝酸或者吖啶。一旦通过诱变观察到期望的性状，则然后可通过传统育种技术将性状并入现有种质中。突变育种的细节可见于Fehr，Macmillan Publishing Company的Principles of Cultivar Development(1993)中。
双单倍体生产
双单倍体生产也可以在育种程序中用于纯合品种的开发。双单倍体通过使来自杂合植物的染色体集合加倍以产生完全纯合的个体来产生。例如，参见Wan，et al.，Theor.Appl.Genet.，77：889-892(1989)。
对通常用于不同性状和作物的另一些育种方法的描述可见于数本参考书之一(例如，Allard(1960)；Simmonds(1979)；Sneep，et al.(1979)；Fehr(1987))中。
合适的测试应检测到任何重大缺陷，并确定相对于当前栽培品种的优越性或改进水平。除表现出优良的性能之外，还必须需要与工业标准相容或创造新市场的新栽培品种。新栽培品种的引入将为种子生产者、以及种植者、加工者和消费者带来另外的成本用于特殊的广告、市场营销和商业生产实践以及新产品利用。在发布新栽培品种之前进行的测试应考虑研究和开发成本以及最终栽培品种的技术优越性。对于经种子繁殖的栽培品种，容易且经济地产生种子必须是可行的。
甜菊属花是雌雄同株的，因为雄性和雌性结构在同一花中。杂交种子或杂交体种子通过选择的亲本之间的人工杂交来产生。通过人工去除雄性花药，在开花之前将待成为雌性的亲本的花芽去雄。在开花时，将来自称为雄性的亲本植物的花的花粉人工置于先前经去雄的花的柱头上。由杂交开发的种子称为第一代(F1)杂交体种子。栽培这种种子会产生F1杂交体植物，其遗传组分的一半来自雌性亲本，并且一半来自雄性亲本。基因的分离始于减数分裂，从而产生第二代(F2)种子。假设原始亲本之间存在多个遗传差异，则每个F2种子均具有独特的基因组合。
另一些实施方案
随着允许分离和表征编码特定蛋白质产物的基因的分子生物学技术的出现，植物生物学领域的科学家们对设计植物基因组以包含和表达外源基因或者另外的或经修饰形式的天然或内源基因(可能由不同的启动子驱动)以便以特定方式改变植物的性状产生了浓厚的兴趣。这样的外源的另外的和/或经修饰的基因在本文中被统称为“转基因”。在过去的十五至二十年中，已经开发了数种用于产生转基因植物的方法，在一些特定的实施方案中，还涉及要求保护的栽培品种的转化形式。
植物转化涉及构建将在植物细胞中发挥作用的表达载体。这样的载体包含含有受调节元件(例如，启动子)控制或与其可操作地连接的基因的DNA。表达载体可包含一个或更多个这样的可操作地连接的基因/调节元件组合。载体可以是质粒的形式，并且可单独使用或与其他质粒组合使用，以提供经转化的甜菊属植物，使用如下所述的转化方法将转基因并入到甜菊属植物的遗传物质中。
用于甜菊属转化的表达载体：标记基因
表达载体包含至少一个可操作地连接至调节元件(例如，启动子)的遗传标记，其允许通过阴性选择(即，抑制不包含选择标记基因的细胞的生长)或通过阳性选择(即，筛选由遗传标记编码的产物)来回收包含标记的转化细胞。用于植物转化的许多常用的选择标记基因在转化领域中是公知的，并且包括例如编码代谢解毒选择性化学试剂的酶的基因，所述选择性化学试剂可以是抗生素或除草剂，或者编码对抑制剂不敏感的经改变靶标的基因。一些阳性选择方法也是本领域中已知的。
用于植物转化的一种常用的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶II(neomycinphosphotransferase II，nptII)，其在植物调节信号的控制下赋予对卡那霉素的抗性。Fraley，et al.，PNAS，80：4803(1983)。另一种常用的选择标记基因是潮霉素磷酸转移酶基因，其赋予对抗生素潮霉素的抗性。Vanden Elzen，et al.，Plant Mol.Biol.，5：299(1985)。
赋予对抗生素之抗性的细菌来源的另外的选择标记基因包括庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶和氨基糖苷-3’-腺苷转移酶，即博来霉素抗性决定子。Hayford，etal.，Plant Physiol.，86：1216(1988)；Jones，et al.，Mol.Gen.Genet.，210：86(1987)；Svab，et al.，Plant Mol.Biol.，14：197(1990)；Hille，et al.，Plant Mol.Biol.，7：171(1986)。另一些选择标记基因赋予对除草剂(例如草甘膦、草铵膦或溴苯腈类)的抗性。Comai，et al.，Nature，317：741-744(1985)；Gordon-Kamm，et al.，Plant Cell，2：603-618(1990)；以及Stalker，et al.，Science，242：419-423(1988)。
用于非细菌来源的植物转化的其他选择标记基因包括例如小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶和植物乙酰乳酸合酶。Eichholtz，et al.，Somatic Cell Mol.Genet.，13：67(1987)；Shah，et al.，Science，233：478(1986)；Charest，et al.，Plant Cell Rep.，8：643(1990)。
用于植物转化的另一类标记基因需要筛选推定转化的植物细胞，而不是直接遗传选择经转化细胞对毒性物质(例如抗生素)的抗性。这些基因特别可用于对特定组织中基因表达的空间模式进行定量或使其可视化，并且通常被称为报道基因，因为其可与基因或基因调节序列融合以研究基因表达。用于筛选推定转化细胞的常用基因包括β-葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase，GUS)、β-半乳糖苷酶、萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶。Jefferson，R.A.，Plant Mol.Biol.Rep.，5：387(1987)；Teeri，et al.，EMBO J.，8：343(1989)；Koncz，etal.，PNAS，84：131(1987)；DeBlock，et al.，EMBO J.3：1681(1984)。
可获得用于不需要破坏植物组织的可视化GUS活性的体内方法。MolecularProbes Publication 2908，IMAGENE GREEN，pp.1-4(1993)和Naleway，et al.，J.CellBiol.，115：151a(1991)。然而，由于低灵敏度、高荧光背景和与使用萤光素酶基因作为选择标记相关的限制，这些用于可视化GUS活性的体内方法未被证明可用于回收经转化细胞。
最近，编码绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的基因在原核和真核细胞中已被用作用于基因表达的标记。Chalfie，et al.，Science，263：802(1994)。GFP和GFP突变体可用作可筛选标记。
用于甜菊属转化的表达载体：启动子
包含在表达载体中的基因必须由包含调节元件(例如，启动子)的核苷酸序列驱动。目前，数种类型的启动子在转化领域中是公知的，可单独使用或与启动子组合使用的其他调节元件也是如此。
本文中使用的，“启动子”包括提及来自转录起始上游的DNA区域，并参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录。“植物启动子”是能够在植物细胞中起始转录的启动子。发育控制下的启动子的一些实例包括在某些组织(例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞(tracheid)或厚壁组织(sclerenchyma))中优先启动转录的启动子。这样的启动子被称为“组织优选的”。仅在某些组织中起始转录的启动子被称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动一个或更多个器官中某些细胞类型，例如，根或叶中的维管细胞的表达。“诱导型”启动子是受环境控制的启动子。可能通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件或光的存在。组织特异性、组织优选的、细胞类型特异性和诱导型启动子构成“非组成型”启动子的类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下具有活性的启动子。
A.诱导型启动子：
诱导型启动子可操作地连接至用于在甜菊属中表达的基因。任选地，诱导型启动子可操作地连接至编码信号序列的核苷酸序列，所述信号序列可操作地连接至用于在甜菊属中表达的基因。对于诱导型启动子，转录速率响应于诱导剂而提高。
任何诱导型启动子均可用于本发明的实施方案中。参见Ward，et al.，PlantMol.Biol.，22：361-366(1993)。示例性诱导型启动子包括但不限于来自响应于铜的ACEI系统的启动子(Mett，et al.，PNAS，90：4567-4571(1993))；响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2基因(Hershey，et al.，Mol.Gen.Genet.，227：229-237(1991)和Gatz，etal.，Mol.Gen.Genet.，243：32-38(1994))；或来自Tn10的Tet阻遏物(Gatz，et al.，Mol.Gen.Genet.，227：229-237(1991))。诱导型启动子的一个实例是响应于植物通常不响应之诱导剂的启动子。示例性诱导型启动子是来自甾体激素基因的诱导型启动子，其转录活性由糖皮质激素诱导(Schena，et al.，PNAS，88：0421(1991))。
B.组成型启动子：
组成型启动子可操作地连接至用于在甜菊属中表达的基因，或者组成型启动子可操作地连接至编码信号序列的核苷酸序列，所述信号序列可操作地连接至用于在甜菊属中表达的基因。
许多不同的组成型启动子可用于本发明的实施方案中。示例性的组成型启动子包括但不限于来自植物病毒的启动子，例如来自CaMV的35S启动子(Odell，et al.，Nature，313：810-812(1985))和来自例如稻肌动蛋白(rice actin)的基因的启动子(McElroy，etal.，Plant Cell，2：163-171(1990))；泛素(Christensen，et al.，Plant Mol.Biol.，12：619-632(1989)和Christensen，et al.，Plant Mol.Biol.，18：675-689(1992))；pEMU(Last，et al.，Theor.Appl.Genet.，81：581-588(1991))；MAS(Velten，et al.，EMBO J.，3：2723-2730(1984))；以及玉米H3组蛋白(Lepetit，et al.，Mol.Gen.Genet.，231：276-285(1992)和Atanassova，et al.，Plant Journal，2(3)：291-300(1992))。
ALS启动子，即甘蓝型油菜(Brassica napus)ALS3结构基因5’的XbaI/NcoI片段(或与所述XbaI/NcoI片段相似的核苷酸序列)代表特别地可用的组成型启动子。参见PCT申请No.WO 96/30530。
C.组织特异性或组织优选的启动子：
组织特异性启动子可操作地连接至用于在甜菊属中表达的基因。任选地，组织特异性启动子可操作地连接至编码信号序列的核苷酸序列，所述信号序列可操作地连接至用于在甜菊属中表达的基因。用可操作地连接至组织特异性启动子的感兴趣基因转化的植物仅在或优先在特定组织中产生转基因的蛋白质产物。
任何组织特异性或组织优选的启动子均可用于本发明的实施方案中。示例性的组织特异性或组织优选的启动子包括但不限于：根优选的启动子，例如来自菜豆蛋白(phaseolin)基因的启动子(Murai，et al.，Science，23：476-482(1983)和Sengupta-Gopalan，et al.，PNAS，82：3320-3324(1985))；叶特异性和光诱导的启动子，例如来自cab或rubisco的启动子(Simpson，et al.，EMBO J.，4(11)：2723-2729(1985)和Timko，et al.，Nature，318：579-582(1985))；花药特异性启动子，例如来自LAT52的启动子(Twell，etal.，Mol.Gen.Genet.，217：240-245(1989))；花粉特异性启动子，例如来自Zm13的启动子(Guerrero，et al.，Mol.Gen.Genet.，244：161-168(1993))；或小孢子优选的启动子，例如来自apg的启动子(Twell，et al.，Sex.Plant Reprod.，6：217-224(1993))。
用于将蛋白质靶向到亚细胞区室的信号序列
通过将编码信号序列的核苷酸序列与编码感兴趣蛋白的基因的5’和/或3’区可操作地连接来实现将转基因产生的蛋白质转运至亚细胞区室，例如叶绿体、液泡、过氧化物酶体、乙醛酸循环体(glyoxysome)、细胞壁或线粒体，或用于分泌到质外体(apoplast)中。在蛋白质合成和加工期间，结构基因的5’和/或3’末端的靶向序列可确定所编码蛋白质最终被区室化的位置。
信号序列的存在将多肽引导至胞内细胞器或亚细胞区室或用于分泌至质外体。许多信号序列是本领域中已知的。参见例如，Becker，et al.，Plant Mol.Biol.，20：49(1992)；Close，P.S.，Master’s Thesis，Iowa State University(1993)；Knox，C.，et al.，Plant Mol.Biol.，9：3-17(1987)；Lerner，et al.，Plant Physiol.，91：124-129(1989)；Fontes，et al.，Plant Cell，3：483-496(1991)；Matsuoka，et al.，PNAS，88：834(1991)；Gould，et al.，J.Cell.Biol.，108：1657(1989)；Creissen，et al.，Plant J.，2：129(1991)；Kalderon，et al.，Cell，39：499-509(1984)；Steifel，et al.，Plant Cell，2：785-793(1990)。
外源蛋白质基因和农学基因
对于转基因植物，可以以商业数量生产外源蛋白质。因此，本领域中公知的用于选择和繁殖经转化植物的技术产生了以常规方式收获的许多转基因植物，并且然后可从目的组织或从总生物质中提取外源蛋白质。从植物生物质中提取蛋白质可通过例如由Heneyand Orr，Anal.Biochem.，114：92-6(1981)所讨论的已知方法来完成。
根据一个实施方案，提供用于商业生产外源蛋白质的转基因植物是甜菊属植物。在另一个实施方案中，目的生物质是种子。对于显示出较高表达水平的相对较少数目的转基因植物，可主要通过常规的RFLP、PCR和SSR分析生成遗传图谱，该图谱鉴定整合的DNA分子的大致染色体位置。对于这方面的示例性方法，参见Glick and Thompson，Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology，CRC Press，Boca Raton，269：284(1993)。关于染色体位置的图谱信息可用于主题转基因植物的专有保护。如果进行未经授权的繁殖并与其他种质进行杂交，则可将整合区的图谱与可疑植物的相似图谱进行比较，以确定后者是否与主题植物具有共同的系谱。图谱比较将涉及杂交、RFLP、PCR、SSR和测序，所有这些均是常规技术。
同样，农学基因可在经转化的植物中表达。更具体地，可对植物进行遗传改造以表达多个农学目的的表型。在这方面涉及的示例性基因包括但不限于以下分类的那些：
A.赋予对有害生物或病害的抗性并编码以下的基因：
1.植物抗病性基因。植物防御通常通过植物中抗病性基因(R)的产物与病原体中相应无毒力(avirulence，Avr)基因的产物之间的特异性相互作用来激活。可用克隆的抗性基因转化植物品种，以使对特定病原体株具有抗性的植物工程化。参见，例如，Jones，etal.，Science，266：789(1994)(对黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)具有抗性的番茄Cf-9基因的克隆)；Martin，et al.，Science，262：1432(1993)(对丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)具有抗性的番茄Pto基因编码蛋白激酶)；Mindrinos，et al.，Cell，78：1089(1994)(对丁香假单胞菌具有抗性的拟南芥(Arabidopsis)RSP2基因)。
2.赋予对有害生物例如线虫的抗性的基因。参见例如，PCT申请No.WO 96/30517；PCT申请No.WO 93/19181。
3.苏云金芽孢杆菌蛋白，其衍生物或在它们之上模仿的合成多肽。参见例如，Geiser，et al.，Gene，48：109(1986)，其公开了Bt δ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码.δ-内毒素基因的DNA分子可购自美国模式培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)，Manassas，Va.，例如，根据ATCC登录No.40098、67136、31995和31998。
4.凝集素。参见，例如，Van Damme，et al.，Plant Molec.Biol.，24：25(1994)的公开内容，其公开了数种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列。
5.维生素结合蛋白，例如抗生物素蛋白。参见PCT申请No.US 93/06487。该申请教导了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作为针对虫害的杀幼虫剂的用途。
6.酶抑制剂，例如蛋白酶(protease)或蛋白酶(proteinase)抑制剂或者淀粉酶抑制剂。参见，例如，Abe，et al.，J.Biol.Chem.，262：16793(1987)(稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂的核苷酸序列)；Huub，et al.，Plant Molec.Biol.，21：985(1993)(编码烟草蛋白酶抑制剂I的cDNA的核苷酸序列)；Sumitani，et al.，Biosci.Biotech.Biochem.，57：1243(1993)(硝孢链霉菌(Streptomyces nitrosporeus)α-淀粉酶抑制剂的核苷酸序列)和美国专利No.5,494,813(Hepher和Atkinson于1996年2月27日发布)。
7.昆虫特异性激素或信息素，例如蜕皮甾体和保幼激素，其变体，基于它们的模拟物，或它们的拮抗剂或激动剂。参见，例如，Hammock，et al.，Nature，344：458(1990)，杆状病毒表达克隆的保幼激素酯酶，即保幼激素灭活剂的公开内容。
8.在表达时破坏所感染有害生物的生理的昆虫特异性肽或神经肽。例如，参见Regan，J.Biol.Chem.，269：9(1994)(表达克隆产生编码昆虫利尿激激素受体的DNA)和Pratt，et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，163：1243(1989)(在太平洋折翅爐(Diploptera puntata)中鉴定出咽侧体抑制素(allostatin))的公开内容。还参见Tomalski，et al.的美国专利No.5,266,317，其公开了编码昆虫特异性麻痹性神经毒素的基因。
9.由蛇(snake)、蜂(wasp)等在自然界中产生的昆虫特异性毒液。例如，参见Pang，et al.，Gene，116：165(1992)，在植物中异源表达编码蝎昆虫毒性肽的基因的公开内容。
10.负责单萜、倍半萜、甾体、异羟肟酸、苯丙素衍生物或者具有杀虫活性的另外非蛋白质分子的过度积累的酶。
11.参与生物活性分子的修饰，包括翻译后修饰的酶。例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、壳多糖酶和葡聚糖水解酶，无论是天然的或是合成的。参见以Scott，et al.的名义的PCT申请No.WO 93/02197，其公开了胼胝质酶(callase)基因的核苷酸序列。包含编码壳多糖酶的序列的DNA分子可例如从ATCC以登录No.39637和67152获得。还参见Kramer，etal.，Insect Biochem.Molec.Biol.，23：691(1993)，其教导了编码烟草天蛾(tobaccohornworm)壳多糖酶的cDNA的核苷酸序列，以及Kawalleck，et al.，Plant Molec.Biol.，21：673(1993)，其提供了欧芹(parsley)ubi4-2聚泛素基因的核苷酸序列。
12.刺激信号转导的分子。例如，参见Botella，et al.，Plant Molec.Biol.，24：757(1994)，用于绿豆(mung bean)钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列的公开内容，以及Griess，et al.，Plant Physiol.，104：1467(1994)，其提供了玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列。
13.疏水矩肽(hydrophobic moment peptide)。参见PCT申请No.WO 95/16776(抑制真菌植物病原体的鲎抗菌肽(Tachyplesin)的肽衍生物的公开内容)和PCT申请No.WO95/18855(教导赋予抗病性的合成抗微生物肽)。
14.膜通透酶，通道形成剂或通道阻滞剂。例如，参见Jaynes，et al.，Plant Sci.，89：43(1993)，天蚕素-β-裂解肽类似物的异源表达使转基因烟草植物对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)具有抗性的公开内容。
15.病毒侵入性蛋白或由来源于此的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在经转化的植物细胞中的积累赋予对由外壳蛋白基因来源的病毒以及相关病毒影响的病毒感染和/或病害发展的抗性。参见Beachy，et al.，Ann.Rev.Phytopathol.，28：451(1990)。外壳蛋白介导的抗性已赋予针对以下的经转化植物：苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)、烟草线条病毒(tobacco streak virus)、马铃薯病毒X(potato virus X)、马铃薯病毒Y(potato virus Y)、烟草蚀纹病毒(tobacco etchvirus)、烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus)和烟草花叶病毒(tobacco mosaicvirus.Id)。
16.昆虫特异性抗体或来源于此的免疫毒素。因此，靶向昆虫肠中关键代谢功能的抗体将使受影响的酶失活，杀灭昆虫。参见Taylor，et al.，摘要#497，分子植物-微生物相互作用的第七次国际研讨会(Edinburgh，Scotland)(1994)(通过产生单链抗体片段在转基因烟草中的酶失活)。
17.病毒特异性抗体。参见，例如，Tavladoraki，et al.，Nature，366：469(1993)，其表明表达重组抗体基因的转基因植物受到保护免受病毒攻击。
18.由病原体或寄生物在自然界中产生的发育阻滞蛋白(developmental-arrestive protein)。因此，真菌内源α-1，4-D-多半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同源α-1，4-D-半乳糖醛酸酶来促进真菌定植和植物养分释放。参见Lamb，et al.，Bio/technology，10：1436(1992)。Toubart，et al.，Plant J.，2：367(1992)描述了编码豆内源多半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征。
19.由植物在自然界中产生的发育阻滞蛋白。例如，Logemann，et al.，Bio/technology，10：305(1992)已表明表达大麦核糖体失活基因的转基因植物对真菌性病害的抗性提高。
B.赋予对除草剂抗性的基因：
1.抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪唑啉酮类(imidazolinone)或磺酰脲类。该类别中的示例性基因编码突变的ALS和AHAS酶，如例如由Lee，et al.，EMBO J.，7：1241(1988)和Miki，et al.，Theor.Appl.Genet.，80：449(1990)分别所描述的。另一些除草剂(例如麦草畏(dicamba))提高植物生长。
2.草甘膦(glyphosate)(分别由突变的5-烯醇式丙酮基莽草酸酯-3-磷酸合酶(5-enolpyruvlshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)和aroA基因赋予抗性)和另一些膦酰基化合物，例如草铵膦(glufosinate)(膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase，PAT)和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)PAT bar基因)，以及吡啶氧基或苯氧基丙酸类和环己酮类(编码ACCase抑制剂的基因)。参见，例如，Shah，et al.的美国专利No.4,940,835，其公开了可赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变的aroA基因的DNA分子可以以ATCC登录No.39256获得，并且该突变基因的核苷酸序列公开于Comai的美国专利No.4,769,061中。Kumada，et al的欧洲专利申请No.0333033和Goodman，et al的美国专利No.4,975,374，公开了赋予对除草剂(例如L-膦丝菌素或环己二酮类)的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列提供于Leemans，et al的欧洲申请No.0 242 246中。DeGreef，et al.，Bio/technology，7：61(1989)描述了表达编码PAT活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。赋予对苯氧基丙酸类和环己酮类，例如烯禾啶(sethoxydim)和氟吡甲禾灵(haloxyfop)的抗性的示例性基因是由Marshall，et al.，Theor.Appl.Genet.，83：435(1992)描述的Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因。
3.抑制光合作用的除草剂，例如三嗪类(psbA和gs+基因)、溴苯腈类或苄腈类(腈水解酶基因)。Przibila，et al.，Plant Cell，3：169(1991)描述了用编码突变的psbA基因的质粒转化衣藻(Chlamydomonas)。用于腈水解酶基因的核苷酸序列公开于Stalker的美国专利No.4,810,648，并且包含这些基因的DNA分子可以以ATCC登录No.53435、67441和67442获得。编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达由Hayes，et al.，Biochem.J.，285：173(1992)描述。
C.赋予或有助于增值(Value-Add)性状的基因，例如：
1.改进的脂肪酸代谢，例如，通过用硬脂基-ACP脱饱和酶的反义基因转化植物以提高植物的硬脂酸含量。参见Knultzon，et al.，PNAS，89：2624(1992)。
2.降低的肌醇六磷酸含量：(a)肌醇六磷酸酶编码基因的引入将增强肌醇六磷酸的分解，向经转化的植物中添加更多的游离磷酸盐。参见例如Van Hartingsveldt，et al.，Gene，127：87(1993)，对于黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公开内容；以及(b)可引入降低肌醇六磷酸含量的基因。例如，在玉米中，这可通过克隆并且然后再引入与单个等位基因相关的DNA来完成，该等位基因负责以低植酸水平为特征的玉米突变体。参见，Raboy，et al.，Maydica，35：383(1990)。
3.改进的碳水化合物组成，其例如通过用编码改变淀粉的分支模式的酶的基因转化植物来实现。参见Shiroza，et al.，J.Bacteol.，170：810(1988)(链球菌(Streptococcus)突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列)；Steinmetz，et al.，Mol.Gen.Genet.，20：220(1985)(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)；Pen，et al.，Bio/technology，10：292(1992)(表达地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶的转基因植物的产生)；Elliot，et al.，Plant Molec.Biol.，21：515(1993)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)；Sorgaard，et al.，J.Biol.Chem.，268：22480(1993)(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)；以及Fisher，et al.，Plant Physiol.，102：1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。
4.改进的纤维特征，例如代表可在甜菊属品种中改进的性状的另一个实例的纤维品质。例如，美国专利No.6,472,588描述了用改变纤维特征，例如强度、长度、纤维细度、纤维成熟度比、未成熟纤维含量、纤维均匀度和马克隆值(micronaire)的蔗糖磷酸合酶核酸转化的转基因植物。包含用于改进纤维特征的编码选自内木葡聚糖转移酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的酶的一种或更多种基因的甜菊属植物还描述于美国专利No.6,563,022中。使用优先指导子房组织中基因表达的子房组织转录因子对甜菊属纤维进行改进，特别地在非常早的果实发育中，用于在甜菊属胚珠组织中表达编码异戊烯基转移酶的基因，以及改进植物中铃集合(boll set)的特征并改变纤维品质特征，包括纤维的尺寸和强度在美国专利No.6,329,570中讨论。控制植物中纤维形成机制的基因描述于美国专利No.6,169,174中。参与木质素生物合成的基因描述于美国专利No.5,451,514中。
用于甜菊属转化的方法
已开发了许多用于植物转化的方法，其包括生物和物理植物转化方案。参见例如Mild，et al.，“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”in Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson(Eds.)，CRC Press，Inc.，Boca Raton，pp.67-88(1993)。另外，可获得用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达载体和体外培养方法。参见例如Gruber，et al.，“Vectors for PlantTransformation”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson(Eds.)，CRC Press，Inc.，Boca Raton，pp.89-119(1993)。
A.农杆菌(Agrobacterium)介导的转化：
用于将表达载体引入到植物中的一种方法基于农杆菌的天然转化系统。参见例如Horsch，et al.，Science，227：1229(1985)。根癌农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)是植物病原性土壤细菌，其遗传地转化植物细胞。根癌农杆菌和发根农杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。参见例如Kado，C.I.，Crit.Rev.PlantSci.，10：1(1991)。农杆菌载体系统的描述和用于农杆菌介导的基因转移方法由Gruber等，同上，Miki，et al.，同上，和Moloney，et al.，Plant Cell Rep.，8：238(1989)提供。还参见1996年10月8日发布的美国专利No.5,563,055(Townsend和Thomas)。
B.直接基因转移：
已开发了被统称为直接基因转移的数种植物转化方法作为农杆菌介导的转化的替代方法。通常可应用的植物转化方法是微粒介导的转化，其中DNA被携带在1μm至4μm的微粒表面上。使用生物射弹装置将表达载体引入到植物组织中，所述生物射弹装置将微粒加速至300m/s至600m/s的速度，其足以穿透植物细胞壁和膜。Sanford，et al.，Part.Sci.Technol.，5：27(1987)；Sanford，J.C.，Trends Biotech.，6：299(1988)；Klein，et al.，Bio/technology，6：559-563(1988)；Sanford，J.C.，Physiol Plant，7：206(1990)；Klein，et al.，Bio/technology，10：268(1992)。还参见1991年5月14日发布的美国专利No.5,015,580(Christou，et al.)；1994年6月21日发布的美国专利No.5,322,783(Tomes，et al.)。
用于将DNA物理递送至植物的另一种方法是靶细胞的超声处理。Zhang，et al.，Bio/technology，9：996(1991)。或者，脂质体和原生质球融合已用于将表达载体引入到植物中。Deshayes，et al.，EMBO J.，4：2731(1985)；Christou，et al.，PNAS，84：3962(1987)。还报道了使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸直接将DNA吸收到原生质体中。Hain，etal.，Mol.Gen.Genet.，199：161(1985)和Draper，et al.，Plant Cell Physiol.23：451(1982)。还描述了原生质体和全细胞和组织的电穿孔。Donn，et al.，In Abstracts ofVIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC，A2-38，p.53(1990)；D’Halluin，et al.，Plant Cell，4：1495-1505(1992)；以及Spencer，et al.，Plant Mol.Biol.，24：51-61(1994)。
转化甜菊属靶组织之后，上述选择标记基因的表达允许使用本领域中目前公知的再生和选择方法优先选择转化的细胞、组织和/或植物。
用于转化的前述方法将通常用于产生转基因品种。然后可将转基因品种与另一种(未经转化的或经转化的)品种杂交，以产生新的转基因品种。或者，可使用在植物育种领域中公知的传统回交技术将使用前述转化技术已工程化到特定甜菊属栽培品种中的遗传性状转移到另一个栽培品种中。例如，回交方法可用于将工程化性状从公共、非优良品种转变为优良品种，或从其基因组中包含外源基因的品种转变为不含该基因的品种。本文中使用的“杂交”可指简单的X×Y杂交，或回交的过程，这取决于上下文。
C.单基因转换
当本文中使用术语“甜菊属植物”时，这也包括该品种的任何单基因转换。本文中使用的术语“单基因转换植物”是指通过被称为回交的植物育种技术开发的那些甜菊属植物，其中除了通过回交技术转移到品种中的单个基因之外，基本上恢复了品种的所有所期望形态和生理特征。本文中可使用回交方法来改进或引入到该品种中的特征。本文中使用的术语“回交”是指将杂交后代重复杂交回轮回亲本，即回交1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多次至轮回亲本。为期望特征贡献基因的亲本甜菊属植物被称为“非轮回”或“供体亲本”。该术语是指非轮回亲本在回交方案中使用一次并因此不再出现的事实。转移来自非轮回亲本的基因的亲本甜菊属植物被称为轮回亲本，因为其被用于数轮回交方案中(Poehlman&Sleper(1994)；Fehr(1987))。在典型的回交方案中，将感兴趣的原始品种(轮回亲本)与携带待转移的单个感兴趣基因的第二品种(非轮回亲本)杂交。然后将来自该杂交的所得后代再次杂交至轮回亲本，并重复该过程，直至获得这样的甜菊属植物，其中除了来自非轮回亲本的单个转移基因之外，在经转换植物中基本上恢复了轮回亲本的所有所期望形态和生理特征，如在相同环境条件下培养时在5％显著性水平下确定的。
合适的轮回亲本的选择是成功回交操作的重要步骤。回交方案的目标是改变或替代原始品种中的单个性状或特征。为了实现这一点，轮回品种的单个基因被来自非轮回亲本的期望基因修饰或替代，同时基本保留所有剩余的期望遗传基因，并因此保留原始品种的期望生理和形态构成。特定非轮回亲本的选择将取决于回交的目的。其中一个主要目的是为植物添加一些商业上期望的、农学上重要的性状。确切的回交方案将取决于被改变的特征或性状以确定适当的测试方案。虽然当被转移的特征是显性等位基因时简化了回交方法，但也可转移隐性等位基因。在这种情况下，可必需引入后代测试以确定是否已成功转移所期望特征。
已鉴定了许多单基因性状，其在新品种的开发中没有被定期选择，但是可通过回交技术来改善。单基因性状可以是或可以不是转基因的。这些性状的实例包括但不限于雄性不育，蜡质淀粉，除草剂抗性，对细菌、真菌或病毒病害的抗性，昆虫抗性，雄性能育性，增强的营养品质，工业用途，产率稳定性和产率提高。这些基因通常通过胞核遗传。这些单基因性状中的一些描述于美国专利No.5,959,185；5,973,234；以及5,977,445中，其公开内容特别地通过引用在此并入。
D.基因组编辑
基因组编辑技术例如成簇的规则间隔的短回文重复(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeat，CRISPR)-CRISPR相关蛋白(CRISPR associatedprotein，CRISPR-Cas)允许几乎任何作物基因组序列的靶向修饰以产生新变异，这在植物中促进了靶向的性状改良。最近，来自普氏菌属(Prevotella)和弗朗西斯氏菌属1(Francisella 1)的CRISPR(Cpfl)已经成为用于高效进行基因组编辑，包括植物中游离DNA基因组编辑的新工具。与CRISPR-Cas9系统相比，CRISPR-Cpf1系统显示出更高的效率、更高的特异性和更广泛的应用的潜力。
通过组织培养和再生可进一步繁殖该品种。甜菊属多种组织的组织培养和植物从其再生是公知且广泛发表的。例如，可参考Komatsuda，T.，et al.，Crop Sci.，31：333-337(1991)；Stephens，P.A.，et al.，Theor.Appl.Genet.，82：633-635(1991)；Komatsuda，T.，et al.，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，28：103-113(1992)；Dhir，S.，etal.Plant Cell Rep.，11：285-289(1992)；Pandey，P.，et al.，Japan J.Breed.，42：1-5(1992)；以及Shetty，K.，et a1.，Plant Science，81：245-251(1992)；以及1991年6月18日授予Collins，et al的美国专利No.5,024,944和1991年4月16日授予Ranch，et al的美国专利No.5,008,200。因此，本发明的另一个方面是提供在生长和分化时产生具有甜菊属栽培品种“16228013”的生理和形态特征的甜菊属植物的细胞。
本文中使用的术语“组织培养物”表示包含相同或不同类型的分离细胞的组合物或组织成植物部分的这样的细胞的集合。示例性类型的组织培养物是原生质体、愈伤组织、植物团块和植物细胞，其可产生在植物或植物部分(例如胚、花粉、花、种子、叶、茎、根、根尖、花药、雌蕊等)中的完整的组织培养物。用于制备和维持植物组织培养物的手段是本领域中公知的。举例来说，包含器官的组织培养物已用于产生再生植物。美国专利No.5,959,185；5,973,234；以及5,977,445描述了某些技术。
另一个实施方案涉及通过将第一亲本甜菊属植物与第二亲本甜菊属植物进行杂交用于产生甜菊属植物的方法，其中第一或第二亲本甜菊属植物是栽培品种“16228013”的甜菊属植物。此外，第一和第二亲本甜菊属植物二者均可来自甜菊属栽培品种“16228013”。因此，使用甜菊属栽培品种“16228013”的任何这样的方法都是本发明的实施方案的一部分：自交、回交、杂交体生产、与种群杂交，等等。使用甜菊属栽培品种“16228013”作为亲本产生的所有植物都在本发明的实施方案的范围内，包括从来源于甜菊属栽培品种“16228013”的品种中开发的哪些。有利地，甜菊属栽培品种可与其他不同的甜菊属植物杂交使用，以产生具有优良特征的第一代(F1)甜菊属杂交体种子和植物。本发明的实施方案的栽培品种还可用于其中通过本发明的实施方案的栽培品种引入和表达外源基因的转化。通过使用栽培品种“16228013”的传统育种方法或者通过本领域技术人员已知的多种方案中的任何一种通过对“16228013”的转化而产生的遗传变体均旨在本发明的实施方案的范围内。
以下描述了在另外的甜菊属植物的开发中可与栽培品种“16228013”一起使用的育种方法。一个这样的实施方案是用于在甜菊属植物育种程序中开发“16228013”后代甜菊属植物的方法，其包括：获得栽培品种“16228013”的甜菊属植物或其一部分，利用所述植物或植物部分作为育种材料的来源，以及选择具有与“16228013”共同的分子标记和/或具有选自表1、2、3、4、5、6、7、8或9中所列出特征的形态和/或生理特征的“16228013”后代植物。可用于甜菊属植物育种程序中的育种步骤包括谱系育种、回交、突变育种和轮回选择。结合这些步骤，可利用一些技术，例如标记增强选择、遗传标记增强选择(例如，SSR标记)和双单倍体制备。
另一方法涉及产生栽培品种“16228013”后代甜菊属植物群体，包括将栽培品种“16228013”与另一甜菊属植物进行杂交，从而产生甜菊属植物群体，该甜菊属植物群体平均从栽培品种“16228013”中获得其等位基因的50％。可选择该群体的植物，并用从这些连续的子代产生的甜菊属栽培品种反复自交或同胞杂交(sib)。本发明的一个实施方案是通过该方法产生的甜菊属栽培品种，并且已经从栽培品种“16228013”中获得了其等位基因的至少50％。
植物育种领域的普通技术人员将知晓如何评价两个植物品种的性状以确定由那些品种所表达的两个性状之间是否没有显著差异。例如，参见Fehr and Walt，Principlesof Cultivar Development，pp.261-286(1987)。因此，本发明的实施方案包括甜菊属栽培品种“16228013”后代甜菊属植物，其包含选自表1、2、3、4、5、6、7、8或9中所列出哪些的至少两种“16228013”性状的组合或者本内容中所列出的“16228013”性状组合，使得所述后代甜菊属植物的所述性状与甜菊属栽培品种“16228013”相比无显著差异，如在相同环境下培养时以5％显着性水平确定的。使用本文中所述的技术，可使用分子标记以将所述后代植物鉴定为“16228013”后代植物。可使用平均性状值来确定性状差异是否显著，并且在相同环境条件下培养的植物上测量性状。一旦开发出这样的品种，其价值是实质性的，由于重要的是总体上提高种质基础，以便在极端环境条件下维持或改良性状，例如产率、抗病性、有害生物抗性和植物性能。
栽培品种“16228013”的后代还可通过其与甜菊属栽培品种“16228013”的亲缘(filial)关系来表征，例如如，在甜菊属栽培品种“16228013”的一定数目的育种杂交内。育种杂交是将新的遗传学引入后代中而进行的杂交，并且区别于在现有遗传等位基因中用于选择而进行的杂交，例如自交或同胞杂交(sib cross)。谱系中育种杂交的数目越少，甜菊属栽培品种“16228013”与其后代之间的关系越紧密。例如，通过本文中所述方法产生的后代可在甜菊属栽培品种“16228013”的1、2、3、4或5次育种杂交内。
本文中使用的术语“植物”包括植物细胞，植物原生质体，可从其再生甜菊属植物的植物细胞组织培养物，植物愈伤组织，植物团块，以及在植物或植物的部分，例如胚、花粉、胚珠、花、叶、根、根尖、花药、雌蕊等中是完整的植物细胞。
尽管以上已经讨论了多个示例性方面和实施方案，但是本领域技术人员将认识到其某些修改、置换(permutation)、添加和子组合。因此，所附权利要求和此后引入的权利要求旨在被解释为包括在其真实精神和范围内的所有这样的修改、置换、添加和子组合。
在不脱离本发明的精神或本质特征的情况下，一个实施方案可以以其他具体形式实施。所描述的实施方案在所有方面被认为仅是举例说明性的而不是限制性的。落入权利要求书的等同意义和等同范围内的所有变化都包含在其范围内。
多个实施方案包括基本上如本文中所描绘和描述的组分、方法、过程、系统和/或装置，包括其多个实施方案、子组合以及子集。在理解本公开内容之后，本领域技术人员将理解如何制造和使用实施方案。
出于举例说明和描述的目的呈现了对实施方案的前述讨论。前述内容并非旨在将实施方案限制为本文中公开的形式。在前述实施例的详细描述中，出于简化本公开内容的目的，在一个或更多个实施方案中将实施方案的多种特征组合在一起。本公开内容的方法不应被解释为反映实施方案需要比每个权利要求中明确记载的更多特征的意图。相反，如所附权利要求书所反映的，创造性方面在于少于单个前述公开的实施方案的所有特征。因此，以下权利要求由此并入到该详细描述中。
此外，尽管对实施方案的描述已包括对一个或更多个实施方案的描述以及某些变化和修改，但是其他变化和修改也在实施方案的范围内(例如，可在理解本公开内容之后，在本领域技术人员的技术和知识范围内)。其旨在获得在允许的程度内包括替代实施方案的权利，所述权利包括对所要求保护的那些的替代的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或作用，无论本文中是否公开了这样的替代的、可互换的和/或等同的结构、功能、范围或作用，并且不旨在公开贡献任何可专利的主题。
除非在本文中另外指明或与上下文明显矛盾，否则在描述实施方案的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)，没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”将被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文中另有记载，否则本文中数值范围的记载仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独的数值被合并到说明书中，如同其在本文中单独记载。例如，如果公开了范围10至15，则也公开了11、12、13和14。除非本文中另外指明或者与上下文明显相矛盾，否则可以以任何合适的顺序进行本文中所描述的所有方法。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的使用仅仅旨在更好地举例说明实施方案并且不对实施方案的范围构成限制，除非另有说明。
保藏信息
以上公开的并在所附权利要求书中记载的，名称为“16228013”的甜菊属品种的植物组织(在保藏收据上也被称为品系指定编号15305091)的保藏，已在中国朝阳区大屯路100101，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)进行。保藏日期为2015年11月11日。CGMCC登录号为CGMCC No.11706。对保藏的所有限制均已去除，并且该保藏旨在满足37C.F.R.§§.1.801-1.809的所有要求。
尽管以上已经讨论了多个示例性方面和实施方案，但是本领域技术人员将认识到其某些修改、置换、添加和子组合。因此，所附权利要求和此后引入的权利要求旨在被解释为包括在其真实精神和范围内的所有这样的修改、置换、添加和子组合。
中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
China General Microbiological Culture Collection Center(CGMCC)
地址：中国北京朝阳区大屯路100101，中国科学院微生物研究所
电话：86-10-64807355 传真：86-10-64807288 E-mail：cgmcc@sun.im.ac.cn 主页：www.cgmcc.net
1.保藏人或机构的名称和地址
Xiu-Fang DENG
谱赛科(江西)有限公司
中国江西省赣县杨塘工业区341108
2.保藏人给出的品系参考
15305091
3.保藏的生物材料已于2015年11月11日收到并且编号为CGMCC No.11706。生存力测试已于2015年11月18日进行。结果是
■存活的； □不再存活
4.进行生存力测试的条件
培养基：具有1mg/L6-BA和0.3mg/LNAA的MS，pH6.2
温度：25℃
CGMCC负责人签字
日期2015年11月20日
序列表
<110> PureCircle USA Inc.
<120> 甜菊栽培品种“16228013”
<130> PURC.10WOU1
<140> 62/595,609
<141> 2017-12-07
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 102
<212> DNA
<213> 甜菊（Stevia rebaudiana）
<220>
<221> 变异
<222> (56)..(56)
<223> 其中“R”是“G”或“A”
<400> 1
aaaaatagac tttttaccat ctcttcctct caagtctcaa tctcaacacc tacacrtgta 60
tgttttttca aacaaaccac acacattggt tttgatctaa aa 102
<210> 2
<211> 102
<212> DNA
<213> 甜菊
<220>
<221> 变异
<222> (61)..(61)
<223> 其中“Y”是“C”或“T”
<400> 2
ggtaataaca accttagttg cctaattata tatgcttctt gtgatgaatt tccaatctaa 60
ytgtacttga gctaatatag aaaacctagt tgctgccaca tt 102
<210> 3
<211> 95
<212> DNA
<213> 甜菊
<220>
<221> 变异
<222> (52)..(52)
<223> 其中“S”是“G”或“C”
<400> 3
gattggtaat tggaagtgtt gtttattaca tatggcaaga gaggaacctt asattgtttc 60
aaggtaagtc tcgtggttat gatgatgtgt gcaag 95
<210> 4
<211> 98
<212> DNA
<213> 甜菊
<220>
<221> 变异
<222> (49)..(49)
<223> 其中“Y”是“T”或“C”
<400> 4
aaaatggaaa cattttcttt ttacatttca gcatctgagt tgactcggyt gcaatcacaa 60
atatgtggaa aaaatggtga tcaccaagtt ccagagtt 98
<210> 5
<211> 103
<212> DNA
<213> 甜菊
<220>
<221> 变异
<222> (49)..(49)
<223> 其中“W”是“A”或“T”
<400> 5
atggaagatg aacctgatgt tcctgaacaa ctcgttcgcc gatcggttwg tctcgaaatc 60
cattcacaag ttcttttata ttgcactgat ttgatactta ggg 103
<210> 6
<211> 101
<212> DNA
<213> 甜菊
<220>
<221> 变异
<222> (48)..(48)
<223> 其中“Y”是“C”或“T”
<400> 6
agaagaacag tgccagaata atctgtggcg ctaaagtgat ccaaccayac ccttgttctc 60
ccagttatat aaaagattaa aaattgctag ttgtccttcg c 101
Claims (26)
1.甜菊属栽培品种“16228013”的种子，其中所述栽培品种的植物组织的代表性样品以CGMCC No.11706保藏。
2.通过种植权利要求1所述的种子而产生的植物或其部分。
3.权利要求2所述的植物部分，其中所述植物部分是种子、叶、花粉、茎、根、胚珠或细胞。
4.具有权利要求2所述甜菊属植物的所有生理和形态特征的甜菊属植物或其部分。
5.包含权利要求2所述植物或其部分的食品或饲料产品。
6.权利要求2所述植物的可再生细胞的组织或细胞培养物。
7.权利要求6所述的组织或细胞培养物，其包含来自选自以下的植物部分的组织或细胞：叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根尖、雌蕊、花药、花和茎。
8.由权利要求7所述的组织或细胞培养物再生的甜菊属植物，其中所述植物具有表1中所列的甜菊属栽培品种“16228013”的所有形态和生理特征。
9.使权利要求2所述植物无性繁殖的方法，其包括以下步骤：
a.从根据权利要求2所述的植物收集能够繁殖的组织或细胞；
b.培养(a)的所述组织或细胞以获得增殖的芽；以及
c.使所述增殖的芽生根以获得生根的小植株；或者
d.培养所述组织或细胞以获得增殖的芽，或获得小植株。
10.通过种植权利要求9所述小植株或增殖的芽而产生的甜菊属植物。
11.用于产生F1甜菊属种子的方法，其中所述方法包括将权利要求2所述的植物与不同的甜菊属植物进行杂交，以及收获所得F1甜菊属种子。
12.通过权利要求11所述方法产生的甜菊属种子。
13.通过种植权利要求12所述种子而产生的甜菊属植物或其部分。
14.确定权利要求2所述甜菊属植物之基因型的方法，其中所述方法包括从所述植物获得核酸样品以及在所述核酸中检测多种多态性。
15.产生除草剂抗性甜菊属植物的方法，其中所述方法包括用转基因转化权利要求2所述的甜菊属植物，其中所述转基因赋予针对选自以下的除草剂的抗性：草甘膦、磺酰脲类、咪唑啉酮类、麦草畏、草铵膦、苯氧基丙酸类、环己二酮类、L-膦丝菌素、三嗪类、苄腈类和溴苯腈类。
16.通过权利要求15所述方法产生的除草剂抗性甜菊属植物。
17.产生昆虫抗性甜菊属植物的方法，其中所述方法包括用赋予昆虫抗性的转基因转化权利要求2所述的甜菊属植物。
18.通过权利要求17所述方法产生的昆虫抗性甜菊属植物。
19.权利要求18所述的甜菊属植物，其中所述转基因编码苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)内毒素。
20.产生抗病性甜菊属植物的方法，其中所述方法包括用赋予抗病性的转基因转化权利要求2所述的甜菊属植物。
21.通过权利要求19所述方法产生的抗病性甜菊属植物。
22.将期望性状引入到甜菊属栽培品种“16228013”中的方法，其中所述方法包括：
a.将“16228013”植物，其中所述植物的植物组织的代表性样品以CGMCC No.11706保藏，与包含期望性状的其他甜菊属栽培品种的植物进行杂交以产生后代植物，其中所述期望性状选自雄性不育、除草剂抗性、昆虫抗性、改进的碳水化合物代谢、改进的甜菊苷含量、改进的莱鲍迪苷含量、改进的甜菊属纤维特征以及针对细菌性病害、真菌性病害或病毒性病害的抗性；
b.选择具有所述期望性状的一个或更多个后代植物以产生经选择的后代植物；
c.将所述经选择的后代植物与所述“16228013”植物进行杂交以产生回交后代植物；
d.选择具有所述期望性状和表1中列出的甜菊属栽培品种“16228013”的生理和形态特征的回交后代植物，以产生经选择的回交后代植物；以及
e.连续重复步骤(c)和(d)两次或更多次，以产生包含所述期望性状和表1中列出的甜菊属栽培品种“16228013”的生理和形态特征的经选择的第四或更高代回交后代植物。
23.通过权利要求17所述方法产生的甜菊属植物，其中所述植物具有所述期望性状和表1中所列出的甜菊属栽培品种“16228013”的生理和形态特征。
24.用于在甜菊属植物育种程序中开发甜菊属植物的方法，其包括将植物育种技术应用于权利要求2所述的甜菊属植物或其部分，所述植物育种技术包括轮回选择、回交、谱系育种、标记增强选择、单倍体/双单倍体产生、或转化，其中所述技术的应用导致甜菊属植物的开发。
25.用于鉴定甜菊属品种“16228013”来源植物材料的六种高度多态性SNP基因座和相应的基因组序列，以及基于所述六种SNP序列进一步开发的任何SNP标志物。
26.通过将甜菊属栽培品种“16228013”的植物或植物部分或者其基因座转换体与其他植物进行杂交而产生的第二甜菊属种子、植物、植物部分或细胞，其中所述甜菊属栽培品种“16228013”的代表性植物组织已以CGMCC No.11706保藏，并且其中所述甜菊属栽培品种“16228013”种子、植物、植物部分或细胞与甜菊属栽培品种“16228013”的植物或植物部分具有相同的SNP ID NO：1、SNP ID NO：2、SNP ID NO：3、SNP ID NO：4、SNP ID NO：5和SNP IDNO：6单核苷酸多态性的多态性。
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