CN111500624A - CrSMT基因在提高植物对于生物胁迫以及非生物胁迫抗性中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了CrSMT基因在提高植物对于生物胁迫以及非生物胁迫抗性中的用途。本发明将来源于莱茵衣藻的CrSMT基因通过农杆菌介导的遗传转化方法，将CaMV 35S启动子驱动的CrSMT基因导入陆地棉受体材料R15中，经过PCR鉴定，获得了多个转基因阳性株系。室内抗虫实验表明害虫对转基因棉花植株的取食偏好性降低，而且取食转基因棉叶显著延长了害虫的生育期；此外，转基因棉花的耐盐性也有显著的提高，盐胁迫下其长势和一些生理指标均优于野生型棉花。因此，将CrSMT基因在植物中进行过表达能够提高转基因植物对于生物胁迫以及非生物胁迫的抗性。

Description

CrSMT基因在提高植物对于生物胁迫以及非生物胁迫抗性中 的用途

技术领域

本发明涉及CrSMT基因的新用途，尤其涉及CrSMT基因在提高植物耐生物胁迫以及非生物胁迫抗性中的新用途，属于CrSMT基因的新用途领域。

背景技术

棉花是世界上最重要的纤维作物，每年因虫害造成的棉花产量损失高达10-15%。中国常见的棉花害虫多达300余种。上世纪90年代初，棉铃虫危害最为严重，随着Bt棉的大面积推广，棉铃虫逐渐产生了对Bt毒素的抗性，同时，化学用药的大幅度减少加剧了绿盲蝽和斜纹夜蛾等非靶标害虫的危害（Wan P, Wu K, Huang M, et al. Population Dynamicsof Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae) on Bt Cotton in the YangtzeRiver Valley of China[J]. Environmental entomology. 2008, 37: 1043-1048.）。全球气候变暖导致昆虫代谢加快、种群增长加速，又加重了植食性昆虫对作物的危害。棉花还是盐碱地开发的先锋作物，近年来为了缓解粮棉争地矛盾，中国棉田逐渐向盐碱地转移，这对棉花品种的耐盐性能提出了更高要求。棉花是中国国民经济的支柱产业，综上所述，提高棉花的抗虫和盐胁迫能力、保证棉花高产稳产具有重要意义。

陆地棉遗传资源狭窄，使得传统育种难以取得突破（孔令甲，夏珍芳，韦贞国，等.棉属八个异质同核系抗枯萎病性鉴定[J]. 湖北农业科学. 1990(02): 26-28.）。运用基因工程手段培育棉花新品种是解决问题的根本，但现有的转Bt基因抗虫棉，只对鳞翅目的棉铃虫和红铃虫等有显著效果，其他类型的转基因棉也通常只对一种害虫有抗性，而且，绿盲蝽，斜纹夜蛾和抗性棉铃虫等害虫目前只能通过化学杀虫剂来进行有效地防治，这违背了追求绿色农业的目标。因此，寻找广谱性、环境友好型的目的基因，通过基因工程手段提高棉花对生物和非生物胁迫的抗性对于棉花的高产稳产具有重要意义。

植物甾醇被誉为“生命的钥匙”，在动植物生命活动中都发挥着重要的作用（何小钊，徐慧妮，龙娟，等. 植物甾醇在植物逆境胁迫中的研究进展[J]. 生命科学研究. 2013,17(03): 267-273）。目前甾醇参与植物非生物胁迫的研究较多，生物胁迫方面的研究较少，且集中在抗病方面，关于抗虫的研究很少，甾醇参与棉花抗虫的研究还未见报道。

改变植物甾醇组成的抗虫策略在小麦和烟草中均有过报道。然而，改变植物甾醇组成的抗虫策略在棉花中也未见报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供来源于莱茵衣藻的CrSMT基因在提高植物抗生物胁迫性能的新用途；

本发明的目的之二是提供来源于莱茵衣藻的CrSMT基因在提高植物抗非生物胁迫的新用途；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供了来源于莱茵衣藻的CrSMT基因在提高植物对于害虫抗性的用途；

本发明还提供了来源于莱茵衣藻的CrSMT基因在提高植物耐盐胁迫的用途。

CrSMT基因从莱茵衣藻中克隆得到，编码C-24甲基转移酶，能催化谷甾醇转化为赪桐甾醇和松藻甾醇。本发明将CrSMT基因通过农杆菌介导的遗传转化方法，将CaMV 35S启动子驱动的CrSMT基因导入陆地棉受体材料R15中，经过PCR鉴定，获得了多个转基因阳性株系，对随机选取的两个转基因株系L17和L25开展了进一步分析；GC-MS分析结果显示转基因棉花植株的植物甾醇组成有了显著的变化。室内抗虫实验表明斜纹夜蛾幼虫对转基因棉花表现出一定的拒食性，对野生型棉花具有取食偏好性，这表明植物甾醇的组成可能影响害虫的取食行为。对斜纹夜蛾，绿盲蝽，Bt敏感型和抗性虫开展的室内抗虫实验显示，这4种害虫取食转基因棉花的叶片后生长发育都变得迟缓。这表明，害虫对转基因棉花植株的取食偏好性降低，而且取食转基因棉叶显著延长了害虫的生育期。因此，将CrSMT基因在植物中进行过表达能够提高转基因植物的对于害虫的抗性。

因此，本发明提供了一种提高植物对害虫抗性的方法，包括：将CrSMT基因在植物中进行过表达得到转基因植物；所得到的转基因植物对于害虫的抗性增强；譬如：将CrSMT基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；将所述重组植物表达载体转化目标植物，使CrSMT基因在植物中进行过表达。

此外，转基因棉花的耐盐性也有显著的提高，盐胁迫下其长势和一些生理指标均优于野生型棉花。

从表型上来看，转基因棉花植株显然比野生型耐盐性更强，在生理指标测定中，耐盐性强的转基因棉花叶绿素含量更高，MDA含量更低，这表明盐胁迫下的转基因植株受到的光合作用抑制作用更轻，受到的损伤更少，呈现出更强的耐盐性；从本发明的试验结果看，甾醇组成的改变可能为棉花提供了一个避盐型策略，提高了棉花细胞膜在盐胁迫下的稳定性，减少了Na⁺进入细胞造成的伤害。因此，丙二醛含量更低，盐胁迫下的转基因叶绿素含量依旧较高，光合作用受到较小的抑制，生长势较强，其内源合成渗透调节物质的基因诱导程度低，脯氨酸和可溶性糖含量自然较低。

本发明还提供了一种提高植物对盐胁迫抗性的方法，包括：将CrSMT基因在植物中进行过表达得到转基因植物；所得到的转基因植物对于盐胁迫的抗性增强；譬如：将CrSMT基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；将所述重组植物表达载体转化目标植物，使CrSMT基因在植物中进行过表达。

本领域人员可以采用各种常规的方法对CrSMT基因所编码的蛋C-24甲基转移酶进行突变使C-24甲基转移酶的功能缺失或出现缺陷。

本发明进一步公开了含有所述CrSMT基因的重组植物表达载体以及含有所述重组植物表达载体的重组宿主细胞。将所述CrSMT基因可操作的与表达调控元件相连接得到重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，CrSMT基因和3′非编码区组成；其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

所述的目标植物包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。更优选的，所述的目标植物包括农作物、蔬菜或观赏植物、果树等，例如，可以是棉花、玉米、水稻、高粱、小麦、大豆、马铃薯、大麦、番茄、菜豆、花生或甘蔗等，优选为棉花。

转化方案以及将所述基因（或多核苷酸）引入植物的方案可视用于转化的植物（单子叶植物或双子叶植物）或植物细胞的类型而变化。将所述基因多（或核苷酸）引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将所述基因（或多核苷酸）提供给植物。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株（McCormick et al.Plant CellReports. 1986. 5:81-84）。

本发明中所述的CrSMT基因的多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。另外，本领域技术人员还可以将SEQ ID NO.1所示的多核苷酸进行优化以增强在植物（尤其是棉花）中的表达效率。

本发明整体技术方案的详述

本发明通过农杆菌介导的遗传转化方法，将CaMV 35S启动子驱动的CrSMT基因导入陆地棉受体材料R15中，经过PCR鉴定，获得了多个转基因阳性株系，对随机选取的两个转基因株系L17和L25开展了进一步研究，取得如下结果：

（1）qPCR和RT-PCR结果显示CrSMT在转基因株系中均有表达，L17的表达量约为L25的2.2倍。GC-MS结果表明转基因株系中的甾醇组分发生显著变化，L17中的谷甾醇比例显著下降，菜油甾醇和豆甾醇的比例显著升高；L25中的谷甾醇比例下降，菜油甾醇的比例也显著升高。转基因株系的农艺性状与野生型无显著差异。

（2）斜纹夜蛾幼虫对野生型棉花具有取食偏好性；取食转基因棉花叶片后显著延缓了斜纹夜蛾的生长发育进程，其幼虫存活率、化蛹率、蛹重和羽化率都显著降低。取食转基因棉花叶片的绿盲蝽生长缓慢，死亡率较高。取食转基因植株棉叶的抗性和敏感棉铃虫其生长都比较缓慢，但死亡率与野生型比较没有显著差异。

（3）转基因棉花的耐盐性也有显著的提高，盐胁迫下其长势和一些生理指标均优于野生型棉花。

结合本发明的试验结果来看，甾醇组成可能影响害虫的取食行为和生长发育进程，且对两种不同科的害虫都有显著效果。本发明进行抗性鉴定的害虫中，斜纹夜蛾和棉铃虫都属于鳞翅目夜蛾科昆虫，然而归属于不同的属，两者在对Bt毒素的抗性上存在很大区别，斜纹夜蛾对Bt毒素不敏感，随着转基因棉的大量种植和化学农药的大幅度减少，斜纹夜蛾已经发展成为棉田中的主要害虫之一。绿盲蝽则属于半翅目盲蝽科，也与斜纹夜蛾一样对Bt毒素不敏感，发展成为当今转基因棉田中的主要害虫。本试验中的转基因棉花对这两种不同科的害虫都呈现出了较好的抗性，根据昆虫中甾类激素的保守性，能够合理推测这种改变甾醇组成的抗虫策略可能对其他害虫也有效果。相比于一般的植物，陆地棉的基因组足够庞大和复杂，因此认为这种对受体植物无不利影响、环境友好型的广谱型抗虫策略未来在很多作物中都能有效应用。

从表型上来看，转基因植株显然比野生型耐盐性更强，在生理指标测定中，耐盐性强的转基因棉花叶绿素含量更高，MDA含量更低，这表明盐胁迫下的转基因植株受到的光合作用抑制作用更轻，受到的损伤更少，呈现出更强的耐盐性，这与前人的研究结果基本一致。研究发现，植物抵抗盐胁迫的机制分为两种，避盐型和耐盐型。避盐型就是通过各种方式躲避重度盐胁迫带来的危害，这些方式包括拒盐，泌盐和稀盐。拒盐植物如芦苇可以限制Na⁺进入地上部，泌盐植物如柽柳可以通过泌腺将盐分分泌出去，而盐角草等稀盐植物则可以通过加快水分吸收稀释盐分。无论拒绝盐分进入，还是进入之后选择排出或稀释，这些方式都导致了耐盐植物体内盐分浓度低，受到的伤害小，反之，盐敏感植物体内盐分高，受到的伤害大，因此可能诱导相关基因表达，提高可溶性糖和脯氨酸等物质含量，提高渗透势以抵御盐胁迫伤害。在另一种耐盐型的机制中，植物要忍耐外界较低的渗透压，防止体内水分外流。因此也诱导相关基因表达，加快可溶性糖，脯氨酸和甜菜碱等渗透调节物质的合成，以此来降低渗透势，防止细胞过度失水，造成植物萎蔫死亡。此时，能在短时间内大量生成渗透调节物质或者原本含量就高的植物耐盐性更高，所以与采取避盐型策略的耐盐植物渗透调节物质含量变化恰恰相反。

植物甾醇是植物生物膜系统的重要组分，细胞膜的甾醇组成与膜的稳定性密切相关，在植物响应逆境胁迫中发挥重要作用。从本试验的结果看，甾醇组成的改变可能为棉花提供了一个避盐型策略，提高了棉花细胞膜在盐胁迫下的稳定性，减少了Na⁺进入细胞造成的伤害。因此，丙二醛含量更低，盐胁迫下的转基因叶绿素含量依旧较高，光合作用受到较小的抑制，生长势较强，其内源合成渗透调节物质的基因诱导程度低，脯氨酸和可溶性糖含量自然较低。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人, J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); 和Cassol等人, (1992)；Rossolini等人, Mol Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“重组植物表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

术语“转化”指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

附图说明

图1转CrSMT基因株系表达量分析；a, 荧光定量PCR结果；b, 反转录PCR结果。GhUBQ7是持家内参基因，*表示在0.01水平上差异显著。

图2棉花内源SMT基因表达量分析；a：棉花以及几种常见植物SMT基因系统进化分析结果；b：棉花中的SMT同源基因荧光定量表达分析结果。

图3棉花叶片的甾醇组成；（sitosterol：谷甾醇，stigmasterol：豆甾醇，campesterol：菜油甾醇，*表示与野生型相比在0.05水平上差异显著。

图4斜纹夜蛾非选择性取食面积；a，取食后的缺失叶片；b，野生型和转基因株系的取食面积。

图5斜纹夜蛾取食面积及取食指数；a，叶圆盘的取食面积；b，野生型和转基因株系的取食指数。

图6斜纹夜蛾体重；a，斜纹夜蛾幼虫大小；b，体重增长折线图。

图7斜纹夜蛾幼虫存活率。

图8斜纹夜蛾蛹期及羽化表现；a，蛹的外形；b，蛹重；c，化蛹率；d，羽化率。

图9斜纹夜蛾世代历期。

图10绿盲蝽体长与存活率；a，绿盲蝽幼虫表型；b，个体长度；c，存活率。

图11棉铃虫表型及体重；a-b，Bt敏感型棉铃虫96S表型及体重；c-d，抗性棉铃虫表型及体重。

图12棉铃虫体长及存活率；a-b，Bt敏感型棉铃虫96S体长及存活率； c-d，抗性棉铃虫体长及存活率。

图13盐胁迫下的地上部植株及根部表型。

图14盐胁迫下的地上部植株及根部鲜重。

图15盐胁迫下的生理指标。

图16野生型和转基因棉花全生育期表现；a，出苗；b，现蕾；c，花铃期；d，吐絮成熟期。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验例1 CrSMT基因转棉花提高棉花抗虫性及耐盐性功能分析试验

㈠供试材料

⒈棉花与供试昆虫

陆地棉品系R15种子由山西省农科院棉花研究所焦改丽研究员惠赠，本发明人课题组每年自交保纯。所有供试昆虫均由中国农科院植保所棉虫组提供。

⒉载体和菌株

CrSMT序列由西澳大学提供，所用载体为pGreenII0029-62SK，农杆菌LBA4404由本发明人实验室保存。

⒊引物

⒋常用培养基配制

①种苗培养基：1/2 MS（其中的大量以及微量元素减少一倍，铁盐与有机含量保持不变）+ 3 g/L 植物凝胶；

②共生培养基：MS + 2,4-D 0.1 mg/L + Kt 0.1 mg/L + gluctose30 g/L + 植物凝胶 3 g·L^-1；

③抗性愈伤诱导培养基：MS+ 2,4-D 0.1 mg/L + Kt 0.1 mg/L + gluctose30 g/L +植物凝胶 3 g/L + 卡那霉素 50 mg/L + 头孢霉素 500 mg/L；

④分化诱导培养基：MS+ KNO₃1.9 g/L + gluctose 30 g/L + 植物凝胶 3 g/L；

⑤胚性愈伤诱导培养基：MS（大量元素中减去NH₄NO₃）+ KNO₃ 1.9 g/L + gluctose30g/L+ Gln 1 g/L + Asp 0.5 g/L + 植物凝胶 3 g/L；

⑥生根培养基：1/2 MS + gluctose 30 g/L + 植物凝胶 2.8 g/L。

㈡实验方法

⒈棉花遗传转化

农杆菌介导的棉花遗传转化简要步骤如下：（1）无菌苗的制备。挑选健康饱满的R15种子，用剪刀轻轻剥去种壳，用1‰升汞消毒5分钟，再用无菌水漂洗5-6次，植于种苗培养基上，弱光条件，20 µmol·m^-2·s^-2，16/8 day/night，28 ± 2℃条件下培养一周。（2）农杆菌的制备。取-80℃保存的农杆菌，在固体培养基上划板，培养基内的Kan和Rif浓度分别为0.1g·L^-1和0.05 g·L^-1，28℃暗培养48-72h。挑选单克隆到液体培养基中，培养基内的Kan和Rif浓度同上，28℃，200 转每分钟震荡培养至OD₆₀₀值至0.4-0.6。转接并活化2-3次为宜。将菌液倒入无菌离心管中，每分钟6千转离心5分钟，倒掉上清，MS液体培养基重悬，稀释到OD₆₀₀值在0.3- 0.4之间，4℃保存备用。（3）侵染及共培养。将无菌苗下胚轴切成5-7 mm茎段，用农杆菌菌液浸泡外植体5-10 min，立即取出并在培养皿中晾干，用无菌滤纸吸掉多余菌夜，在铺有滤纸的共培养基上暗培养48h。（4）愈伤诱导及转基因植株的获得。抗性愈伤诱导：将共培养后的茎段转接到含有2,4-D和KT的抗性愈伤诱导培养基上，根据载体选择相应的筛选剂，加入500 mg·L^-1Cef抑制农杆菌生长，在135µmol·m^-2·s^-2，16/8 day/night，28±2℃条件下培养2-4个月左右，诱导抗性愈伤组织生长，30d左右继代培养一次。分化诱导：在超净工作台中，切取外植体两端疏松的淡黄或白色愈伤，待愈伤组织长至指甲盖大小时，将其转接至去掉所有激素和抗生素的分化培养基上继续增殖诱导，直至胚性愈伤组织产生。在继代培养过程中，应舍弃疯涨型、翠绿型愈伤块，及时将分化的胚性愈伤组织挑选出来，并将其转接到胚性愈伤诱导培养基上，进行胚状体诱导直至再生苗发生。胚状体及植株再生：挑选淡黄色、小米粒状的胚性愈伤至三角瓶中的胚性愈伤诱导培养基上。此时三角瓶应采用透气封口膜，且在小瓶的培养基上铺垫一层滤纸，适当增加光照，防止玻璃苗、畸形苗产生。生根及嫁接：待瓶中的再生苗萌发出真叶，约3-4cm高时，将小苗转接到生根培养基上继续培养。当小苗长到6-8 cm，约到100mL三角瓶瓶口时嫁接到海岛棉7124上。

⒉阳性植株鉴定

提取幼苗DNA，以UBQ引物进行PCR，检测DNA提取效果，用CrSMT引物进行阳性植株检测，以R15为阴性对照，菌液为阳性对照。

DNA提取按照试剂盒说明书进行。

⒊ qPCR测定表达量

RNA提取按照试剂盒说明书进行；

反转录：PCR具体步骤如下（在冰上配制，最好多配两份）：

⑴第一链cDNA合成和gDNA去除

⑵反转录反应

轻轻混匀之后快速开始反转录，42℃孵育30 min，85℃加热5 s，将cDNA置于-20℃冰箱中。qPCR引物：用来测定外源基因CrSMT表达量的qCrSMT，用来测定棉花内源SMT基因的GhSMT1、GhSMT2-1和GhSMT2-2，以及用来作内参的UBQ7。

⑶ qPCR反应体系

采用TransStart Tip Green qPCR SuperMix，实验操作按照试剂盒说明书进行，具体反应体系如下：

按照说明书采用三步法进行扩增，反应条件如下：94℃ 30 s，94℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 10 s，40个循环，所用荧光定量PCR仪为ABI 7500 real-time system (AppliedBiosystems, USA)，采用2^-△△Ct相对定量法开展基因表达量分析。

根据Shi等和Luo等的研究报道，棉花中有3个SMT基因，分别是GhSMT1，GhSMT2-1和GhSMT2-2，检测这些基因的引物见表2.1（Shi Y, Zhu S, Mao X, et al. TranscriptomeProfiling, Molecular Biological, and Physiological Studies Reveal a MajorRole for Ethylene in Cotton Fiber Cell Elongation[J]. The Plant cell. 2006,18: 651-664；Luo M, Tan K, Xiao Z, et al. Cloning and expression of two sterolC-24 methyltransferase genes from upland cotton (Gossypium hirsuturm L.)[J].J Genet Genomics. 2008, 35(6): 357-363.）。

⒋ GC-MS测定甾醇含量

⑴取样：从温室内取生长一致的幼嫩棉花叶片，与冰袋一同运回实验室，置于超低温冰箱内。

⑵预处理：将样品用液氮碾磨成粉状，装入2mL离心管中，打开盖子，用封口膜封口，并用10μL枪头戳若干小洞，放入冷冻干燥仪干燥。干燥完成后，将样品置于4℃冰箱。内标胆甾烷醇10ug（8）每20mg样品，外标谷甾醇100ug每20mg样品。

⑶准备工作：佩戴手套、口罩，打开水浴锅。准备装去离子水10mL、无水乙醇50mL、内标萃取溶剂40mL和外标萃取溶剂4mL的离心管。装好去离子水7.5mL，正己烷0.6mLx待测样品数。

萃取溶剂的配制：5.61gKOH溶解在7.5mL水中，冷至室温，加入无水乙醇至50mL。取40mL加入0.001g cholestanol配成含内标的萃取溶剂；另取4mL加入0.001g sitosterol用于外标萃取溶剂。

⑷每个材料7个生物学重复，共21管处理如下：

①皂化：称取0.02g干粉于2mL离心管中，加入400μLKOH-乙醇溶液（内标萃取溶剂），关紧盖子并用封口膜密封，保持液面水平，在200mL水中超声水浴5min。80℃水浴，1h，每10min取出震荡一次（此时可写样品瓶和进样瓶编号）。摇床震荡2min，冷却至室温。

②萃取：加入600μL正己烷，400μL去离子水，170r/min摇床震荡2min，5000r/min离心3min，将400μL上层清液转移至样品瓶（每次转移200μL），氮吹仪吹干（注意轻吹，防止溢出）。

③衍生化：加入40μL BSTFA-TMCS和40 μL吡啶，80℃水浴加热10min。转移到自动进样瓶。

④ 1管外标处理如下：除不加样品，在皂化步骤中加入的是400μL外标萃取溶剂于外，其余步骤同上。

⑤ 1管BLANK-BSTFA处理如下：样品瓶加入40μL BSTFA-TMCS和40μL吡啶，80℃水浴加热10min。全部转移到自动进样瓶。

⑥ 1管BLANK-hexane处理如下：向进样瓶加入80μL 正己烷。

⒌农艺性状调查

R15和T2代转基因株系（L17和L25）均种植在温室内，蛭石与营养土1:1混匀，16/8 day/night，28±2℃。待成熟时，进行株高，果枝层数，单株铃数，铃重和籽棉产量等农艺性状的调查，将植株分为三组，每组作为一个生物学重复。

⒍昆虫饲喂条件

斜纹夜蛾非选择性拒食实验：培养皿底部覆盖一个湿润的滤纸圆片，将新展开的叶片放置在纸片上，新孵化的斜纹夜蛾幼虫接种在叶片上,每个叶片接种10头，每个材料总共接18皿，然后随机分为3组。将所有培养皿放入人工气候箱中，在27±2℃，16/8h 光/暗，60%相对湿度下放置2天后取出，用Photoshop软件测量叶片缺失的面积。

斜纹夜蛾选择性取食实验：将转基因和野生型棉花叶片剪成直径为3cm的圆片，每个材料的叶片均匀放置在培养皿中。将事先用反枝苋，狗尾草和田旋花等常见杂草饲喂至3龄的斜纹夜蛾幼虫饥饿4小时，随后快速转移到培养皿中，并立即遮光。4次重复，每个重复12皿，每皿接3头幼虫。在27±2℃，60%相对湿度下暗处理8小时，取食面积用网格法测定，每个材料的取食面积占比即为取食指数。

斜纹夜蛾抗性实验：取棉花嫩叶置于铺有湿润滤纸的培养皿上，3次重复，每个重复30皿。每皿接初孵幼虫10头，每天在更换新鲜叶片时记录龄期和存活率。13天后每隔1天称一次体重。待幼虫长到6龄时，将其转移到含有1 cm厚湿润土壤的培养皿中，待其入土化蛹后，从培养皿底部观察并记录化蛹率，待成虫从土中钻出时记录羽化率。16/8h光/暗，27±2℃。

绿盲蝽饲喂实验：配制2%的琼脂粉溶液，加热溶解后倒至小烧杯中，约1 cm厚。待其冷凝后，将剪好的滤纸圆片中间捅破，置于琼脂上。取带长柄的幼嫩棉叶，插入琼脂中，接上初孵绿盲蝽幼虫，立即用滤网封口。3次重复，每个重复包含100头。16/8h 光/暗，25±2℃，60%相对湿度。每隔一天更换新鲜叶片，一周后检查存活率，测量体长。

棉铃虫饲喂实验：取棉花嫩叶置于铺有湿润滤纸的培养皿上，每皿接初孵幼虫10头，3次重复，每个重复10皿。四天后换叶，一周后检查存活率，测量体重和体长。16/8h 光/暗，25±2℃，60%相对湿度。

⒎盐胁迫及相关指标测定

R15和转基因材料（L17和L25）均种植于温室内，待幼苗子叶平展后，进行阳性植株鉴定。待幼苗长至3-4片真叶后，开始进行盐胁迫处理。一周浇2次200 mM NaCl溶液，对照浇清水。两周后测量地上部和地下部鲜重以及部分生理指标。各项生理指标测定参考Hao等的方法，并稍作修改，具体步骤如下：

⑴叶绿素含量的测定

①取相同部位的新鲜棉花叶，称量0.2 g，置于研钵中，放进少许石英砂，佩戴口罩和手套，添加80%丙酮2000 uL，研磨，再加入5 mL丙酮，用研磨棒搅拌均匀，全部倒入15 mL离心管中，再加80%丙酮到10 mL，摇匀后等待10分钟；

②向直径1 cm的比色杯中加入上一步得到的叶绿素提取液0.5mL，再加入80%丙酮1.5mL至总体积为2 mL，将80%丙酮作为对照，在663 nm和645 nm波长下测定吸光值。

③计算。用公式计算出叶绿素a、b含量以及叶绿素总量，如下：

C_a=12.7×A663 - 2.59×A645

C_b=22.9×A645 - 4.67×A663

C_r=20.29×A645+8.05×A663

C=叶绿素浓度（mg·mL^-1）

V=提取液总体积（L）

A=取样鲜重（g）

⑵可溶性糖含量的测定

①配制蒽酮试剂：佩戴口罩和手套，称取蒽酮0.2 g溶于100 mL浓硫酸中（放热，需小心），避光贮于棕色瓶中。

②绘制标准曲线：准确称取蔗糖10 mg，用蒸馏水溶解，最后定容至100 mL，得到浓度为100 ug·mL^-1的标准蔗糖溶液。

在6支干净的离心管中，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的标准蔗糖溶液，再分别加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL的蒸馏水，配制浓度分别为0、10、20、30、40、50 μg·mL^-1，总体积为2 mL的蔗糖溶液。冰浴中，分别加入4000 μL蒽酮试剂（注意是放热反应，需缓缓加入），静置10min，冷却后使用分光光度计测定OD₆₂₀。以蔗糖浓度含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

③样品可溶性糖含量的测定：

取相同部位的新鲜棉花叶片，称量0.2 g，磨成匀浆，用蒸馏水定容至终体积50 mL，95℃水浴半个小时。12,000 rpm离心10 min。取2000 μL上清液，加入4000 μL蒽酮试剂，立即上下颠倒摇匀（注意是放热反应，谨慎操作），静置10 min，冷却后测定OD₆₂₀。

④计算。可溶性糖含量通过比对标准曲线公式获得，再按照以下公式计算样品中的可溶性糖含量：

公式中的x为从标准曲线查得的可溶性糖浓度。

⑶脯氨酸含量的测定

①试剂的配制：

酸性茚三酮溶液：佩戴口罩和手套，准确称取1.25 g茚三酮，加入30毫升冰醋酸和20毫升6 mol·L^-1磷酸溶液，70℃水浴中搅拌直到完全溶解，避光保存，放在冰箱中备用。

3％磺基水杨酸：准确称量3 g磺基水杨酸粉末，放入蒸馏水中，搅拌溶解到0.1 L，备用。

②标准曲线的制作：

脯氨酸标准溶液：准确称量0.025 g脯氨酸，放入蒸馏水中，搅拌溶解到0.25 L，得到浓度为0.1 mg·mL^-1脯氨酸标准液。向6个干净的离心管中分别加入脯氨酸标准液0、200、400、600、800、1000、1200 μL，再添加蒸馏水到2000 μL，震荡混匀，得到浓度分别为0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg·mL^-1的脯氨酸溶液。向每个离心管中分别加入2000 μL冰醋酸和2000 μL酸性茚三酮溶液，95℃水中加热半个小时。放置到室温后，往每个离心管中滴加4000 μL甲苯，剧烈震荡后静置。将离心管最上面的蓝色溶液转移到比色皿中，以甲苯溶液为空白对照，在520 nm波长下测定吸光值。以脯氨酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

③样品的测定：

取相同部位的新鲜棉花叶片，称量0.2 g，剪碎后放置离心管中，加入5 mL配好的3％磺基水杨酸酸溶液，95℃水中加热10 min，分装到两个2 mL离心管，4℃ 10,000 rpm离心10min，上清液即为棉花叶片的脯氨酸提取液。从中吸取2 mL加入到新的离心管中，向每个离心管中分别加入2000 μL冰醋酸和2000 μL酸性茚三酮溶液，95℃水中加热半个小时。往每个离心管中滴加4000 μL甲苯，剧烈震荡后静置。将离心管最上面的蓝色溶液转移到比色皿中，以甲苯溶液为空白对照，在520 nm波长下测定吸光值。棉叶中的脯氨酸含量可以通过比对标准曲线获得。

④按照以下公式计算叶片中脯氨酸含量：

公式中的x为从标准曲线查得的脯氨酸浓度。

⑷丙二醛含量的测定

①试剂的配制：

a. 5%TCA：称量5000 mg TCA，加入蒸馏水到0.1L。

b. 0.5%TBA：称量500 mg TBA，用上一步中配好的TCA溶解到0.1L。

c. 0.05mol·L^-1 pH7.8磷酸钠缓冲液

② MDA的提取

取相同部位的新鲜棉花叶片，称量0.2 g，加2000 μL在冰上放置后的磷酸钠缓冲液，在冰上研磨成匀浆，再加入2000 μL清洗，全部转移到离心管中，定容到5000 μL，每分钟4500转离心10 min，储存在冰箱中备用。

向离心管中加入上清液2000 μL（对照加2000 μL TCA），添加2000 μL 0.5%TBA溶液，震荡混匀，95℃水中放置10分钟，冰中快速冷却，每分钟4500转离心10 min。吸上清液到比色皿中，在532 nm、600 nm和450 nm波长下的吸光值，以蒸馏水为空白对照。

③根据以下公式计算样品中MDA的含量：

式中

C——MDA的浓度，μmol·L^-1；C=6.452×(D₅₃₂－D₆₀₀)－0.559×D₄₅₀

D₄₅₀、D₅₃₂、D₆₀₀——450 nm、532 nm和600 nm波长下的吸光值

Vt——提取液总体积（L）

FW——植物鲜重（g）

⒏数据分析与绘图

所有显著性差异均由SPSS 20.0经t检验或者经单因素方差分析和LSD检验得到，统计图由Origin软件绘制。系统进化分析采用ClustalX2和MEGA7软件。

㈢试验结果

⒈农杆菌介导的遗传转化

CrSMT基因(NCBI: XM_001690723.1)的cDNA序列在CaMV 35S启动子的驱动下被转入到农杆菌中，农杆菌侵染R15的下胚轴后，进行抗性愈伤诱导。待下胚轴两端开始膨大，形成抗性愈伤细胞团后，将其切下进行胚性愈伤诱导。待胚状体出现并长成新的幼苗后，将其嫁接到海岛棉上。

⒉基因表达分析

⑴外源CrSMT基因的表达量分析

以GhUBQ7为内参基因，进行荧光定量分析和反转录PCR。结果表明，CrSMT基因在转基因株系L17中的表达量约为L25的2.2倍，L25中的表达水平极显著低于L17。反转录PCR结果表明外源CrSMT基因在转基因株系中表达，在野生型R15中没有表达（图1）。

⑵SMT基因的进化及在棉花中的内源表达量分析

当过表达外源基因时，可能发生同源抑制现象。因此，本试验联合棉花及几种常见植物的SMT基因进行系统进化分析，结果显示莱茵衣藻中的CrSMT基因与棉花中的内源基因GhSMT1亲缘关系最近，与GhSMT2-1和GhSMT2-2亲缘关系较近，与玉米和水稻中的同源基因亲缘关系较远，与小麦和拟南芥中的亲缘关系最远。因此，对棉花中的SMT同源基因开展了荧光定量表达分析。GhSMT1，GhSMT2-1和GhSMT2-2这3个陆地棉中的内源基因在野生型和转基因棉花叶片中的表达量如（图2）所示，结果显示这些基因在3个材料中的表达量都没有显著差异，说明过表达CrSMT基因未引起棉花内源SMT基因的沉默。

⒊棉花甾醇含量分析

与野生型棉花R15相比，转基因株系中的甾醇比例发生了显著的变化。L17中的谷甾醇比例显著下降，比野生型降低了4.3%，菜油甾醇和豆甾醇的比例显著升高，分别比野生型高出了3%和1.3%。L25中的菜油甾醇的比例也显著升高，比野生型高出了1.5%，谷甾醇比例有所下降，但未达到显著水平，这可能是因为相比L17，L25中CrSMT的基因表达量较低（图3）。

⒋转基因棉花的抗虫性鉴定

⑴非选择性拒食实验

为测定甾醇组成的改变对害虫取食行为有无影响，对斜纹夜蛾幼虫取食后的叶片缺失面积进行了测量。结果表明，相比转基因棉花，斜纹夜蛾取食更多的野生型R15叶片，R15的平均被取食面积达到了39.4 cm²，L17和L25的平均被取食面积分别只有19.2和25.1 cm²，R15的平均被取食面积分别是L17和L25的2.1和1.6倍。野生型R15和两个转基因株系L17、L25的取食面积差异都达到显著水平，L17和L25之间没有显著差异（图4）。

⑵选择性取食偏好实验

为了探究本试验中转基因棉花的甾醇变化是否会影响害虫的取食偏好，测定了斜纹夜蛾幼虫对各个材料的取食指数。结果显示在相同的取食机会下，幼虫取食更多的野生型棉花叶片。野生型R15的取食指数为0.45，L17和L25的取食指数分别仅有0.30和0.25，R15的取食指数分别比L17和L25高出50%和80%。野生型R15和两个转基因株系L17、L25的取食指数差异都达到显著水平，L17和L25之间没有显著差异（图5）。

⑶转基因棉花对斜纹夜蛾生长发育的影响

虫体重量是衡量昆虫生长发育的一个重要指标，为了研究取食转基因棉花对斜纹夜蛾生长发育的影响，本试验统计了饲喂13到21天的昆虫体重变化。由图6可知，与取食野生型棉花叶片的斜纹夜蛾相比，取食转基因棉花叶片的斜纹夜蛾体重增加更缓慢。取食L17的幼虫平均体重在接虫后13，15和17天都比取食L25的低，在接种后的19和21天二者的差异达到显著水平。取食各个株系的斜纹夜蛾幼虫体重差异随着天数增加日渐加大，接种后第13天，取食R15的斜纹夜蛾幼虫平均体重是7.5 mg，取食L17和L25的平均体重分别为6.8和7.0mg，取食野生型R15的斜纹夜蛾平均体重分别是取食L17和L25斜纹夜蛾幼虫的1.10和1.07倍。接虫21天后，取食R15的斜纹夜蛾幼虫平均体重是573.6 mg，取食L17和L25的平均体重分别为297.2和369.3 mg，取食野生型R15的斜纹夜蛾平均体重分别是取食L17和L25斜纹夜蛾幼虫的1.93和1.55倍。自斜纹夜蛾幼虫长至1龄以后，取食转基因棉花叶片的幼虫每个龄期的存活率也显著降低（图7）。取食野生型R15斜纹夜蛾幼虫5个龄期的平均存活率为0.88，取食L17和L25的斜纹夜蛾幼虫5个龄期的平均存活率分别只有0.79和0.77。

到了化蛹阶段，取食野生型棉花R15叶片的斜纹夜蛾幼虫蛹重293 mg，与之相比，取食L17和L25棉花叶片的斜纹夜蛾幼虫蛹重分别为240 mg和260 mg，取食野生型棉花R15叶片的斜纹夜蛾幼虫蛹重显著大于取食L17棉花叶片的斜纹夜蛾幼虫蛹重，取食L25棉花叶片的斜纹夜蛾幼虫蛹重与另外两组幼虫蛹重无显著差异（图8a，8b）。取食转基因棉花L17和L25叶片的幼虫化蛹率也显著降低，取食野生型棉花R15的斜纹夜蛾化蛹率为0.69，取食转基因棉花L17和L25叶片的幼虫化蛹率分别为0.61和0.63（图8 c）。到了羽化阶段，与取食野生型棉花R15叶片的幼虫相比，取食L17棉花叶片的幼虫羽化率显著降低，取食野生型棉花R15的斜纹夜蛾羽化率为0.83，取食转基因棉花L17和L25叶片的幼虫羽化率分别为0.71和0.80（图8 d）。从孵化到羽化，取食转基因棉花L17和L25叶片的斜纹夜蛾平均分别历时37.1和35.6天，取食野生型棉花R15叶片的斜纹夜蛾平均历时只有31.6天，取食野生型棉花R15叶片的斜纹夜蛾世代历期显著低于取食转基因棉花叶片斜纹夜蛾的世代历期，取食L25叶片的斜纹夜蛾世代历期显著低于取食L17棉花叶片斜纹夜蛾的世代历期（图9）。

总之，转基因棉花不仅抑制了斜纹夜蛾整个生育期的生长发育，还对其幼虫有一定的致死性。

⑷转基因棉花的绿盲蝽抗性

本试验也对目前转Bt基因棉田中的爆发的主要害虫——绿盲蝽进行了抗性鉴定。初孵绿盲蝽幼虫分别取食野生型棉花R15和转基因棉花叶片一周后，不同组幼虫个体的体长有了显著变化，取食野生型棉花R15叶片的绿盲蝽幼虫体长2.17 mm，取食L17和L25叶片的绿盲蝽体长分别为1.67和1.73 mm，取食野生型棉花R15叶片的绿盲蝽幼虫体长分别比L17和L25高出30 %和25 %，差异达到显著水平，取食L17和L25的绿盲蝽幼虫体长没有显著差异。取食野生型棉花R15叶片的绿盲蝽幼虫存活率为49.7 %，取食L17和L25叶片的绿盲蝽存活率分别为29.7 %和33.7 %，取食野生型棉花R15叶片的绿盲蝽幼虫存活率分别比L17和L25高出20 %和16 %，差异达到显著水平，取食L17和L25的绿盲蝽幼虫存活率没有显著差异（图10）。

⑸转基因棉花的棉铃虫抗性

分别用野生型和转基因株系的嫩叶饲喂Bt敏感型棉铃虫96S的初孵幼虫，与取食野生型棉花R15叶片的棉铃虫相比，取食转基因棉花叶片的棉铃虫生长较为缓慢，饲喂一周后的体重与对照差异显著，取食野生型棉花R15的96S棉铃虫幼虫平均体重是17.7 mg，取食L17和L25的平均体重分别为8.7和9.9 mg，取食野生型R15的棉铃虫平均体重分别是取食L17和L25棉铃虫幼虫的2.03和1.79倍，取食野生型棉花R15和转基因株系的96S棉铃虫幼虫体重达到显著差异水平，取食L17和L25的96S棉铃虫幼虫体重没有显著差异（图11 a, b）。

随着Bt作物在全球的广泛种植，越来越多的棉铃虫产生了对Bt毒素的抗性。因此本试验也针对Bt抗性棉铃虫开展了饲喂实验。与取食野生型棉花R15叶片的抗性棉铃虫相比，取食转基因棉花叶片的棉铃虫生长缓慢，饲喂一周后的体重与对照差异显著，取食野生型棉花R15的抗性棉铃虫幼虫平均体重是20.3 mg，取食L17和L25的平均体重分别为10.6和10.9 mg，取食野生型R15的棉铃虫平均体重分别是取食L17和L25棉铃虫幼虫的1.92和1.86倍，取食野生型棉花R15和转基因株系的抗性棉铃虫幼虫体重达到显著差异水平，取食L17和L25的抗性棉铃虫幼虫体重没有显著差异（图11c, d）。

另外，取食野生型棉花R15的96S棉铃虫幼虫平均体长是11.0 mm，取食L17和L25的平均体重分别为7.6和7.9 mm，取食野生型R15的斜纹夜蛾平均体长分别是取食L17和L25斜纹夜蛾幼虫的1.45和1.39倍，取食野生型棉花R15和转基因株系的96S棉铃虫幼虫体长达到显著差异水平，取食L17和L25的抗性棉铃虫幼虫体长没有显著差异（图12a, b）。取食野生型棉花R15的抗性棉铃虫幼虫平均体长是12.0 mm，取食L17和L25的平均体重分别为9.2和9.3 mm，取食野生型R15的斜纹夜蛾平均体长分别是取食L17和L25斜纹夜蛾幼虫的1.30和1.29倍，取食野生型棉花R15和转基因株系L17的抗性棉铃虫幼虫体长达到显著差异水平，取食野生型棉花R15和转基因株系L25的抗性棉铃虫幼虫体长没有达到显著差异水平。然而，无论是96S敏感型棉铃虫还是抗性棉铃虫，取食野生型棉花R15和转基因株系的幼虫存活率均无显著差异（图12c, d）。

⒌转基因棉花的耐盐性鉴定

⑴盐胁迫下的表型分析

由图13可知，对照清水处理情况下，野生型对照R15和转基因株系的生长没有显著差别。盐处理后，野生型对照R15和转基因株系的生长都受到抑制，但R15受到的伤害更加严重，其下部的叶片已经开始发黄、脱落，呈现出典型的盐胁迫症状。相比之下，转基因株系L17和L25只有下部的子叶有些萎蔫，没有叶片泛黄和脱落的现象。与野生型对照R15相比，盐胁迫下转基因株系L17和L25的主根更长，侧根更多，根系较为发达。

对照清水处理下，野生型棉花R15地上部的单株鲜重平均为5.15 g，转基因株系L17和L25的地上部单株鲜重平均分别为6.28和6.14 g，转基因棉花地上部的鲜重与野生型对照没有显著差异。盐胁迫下，野生型棉花R15地上部的单株鲜重平均为3.06 g，转基因株系L17和L25的地上部单株鲜重平均分别为4.79和4.65 g，转基因棉花地上部的鲜重显著大于野生型对照，转基因株系L17和L25的地上部鲜重没有显著差异。对照清水处理下，野生型棉花R15单株根部鲜重平均为1.06 g，转基因株系L17和L25的单株根部鲜重平均分别为1.22和1.06 g，转基因棉花单株根部鲜重与野生型对照没有显著差异。盐胁迫下，野生型棉花R15单株根部的鲜重平均为0.43 g，转基因株系L17和L25的单株根部鲜重平均分别为0.69和0.57 g，转基因棉花株系L17根部的鲜重显著大于野生型对照，转基因株系L17的根部鲜重与L25和野生型棉花没有显著差异（图14）。

⑵盐胁迫下的生理指标分析

由图15可知，对照清水处理下，野生型棉花R15的叶绿素含量平均为3.13 mg/g，转基因株系L17和L25的叶绿素含量平均分别为2.69和3.10 mg/g，转基因棉花的叶绿素含量与野生型对照没有显著差异。盐胁迫下，野生型对照R15和转基因株系的叶绿素含量都有所下降，野生型棉花R15的叶绿素含量平均为1.89 mg/g，转基因株系L17和L25的叶绿素含量平均为2.87和2.73 mg/g，转基因棉花的叶绿素含量显著大于野生型对照，转基因株系L17的叶绿素含量显著大于转基因株系L25。

对照清水处理下，野生型棉花R15的MDA含量平均为19.48 nmol/g，转基因株系L17和L25的MDA含量平均分别为17.72和16.58 nmol/g，转基因棉花的MDA含量与野生型对照没有显著差异。盐胁迫下，野生型对照R15和转基因株系的MDA含量都有所升高，野生型棉花R15的MDA含量平均为35.04 nmol/g，转基因株系L17和L25的MDA含量平均为24.70和27.76nmol/g，转基因棉花株系L17的MDA含量显著小于野生型对照，转基因株系L17的MDA含量与转基因株系L25和野生型对照没有显著差异。

对照清水处理下，野生型棉花R15的可溶性糖含量平均为3.83 mg/g，转基因株系L17和L25的可溶性糖含量平均分别为3.60和3.87 mg/g，转基因棉花的可溶性糖含量与野生型对照没有显著差异。盐胁迫下，野生型对照R15和转基因株系的可溶性糖含量都升高几倍，野生型棉花R15的可溶性糖含量平均为12.23 mg/g，转基因株系L17和L25的可溶性糖含量平均为9.80和9.98 mg/g，转基因棉花株系的可溶性糖含量显著小于野生型对照，转基因株系L17的可溶性糖含量与转基因株系L25没有显著差异。

对照清水处理下，野生型棉花R15的脯氨酸含量平均为32.83 μg/g，转基因株系L17和L25的脯氨酸含量平均分别为28.50和28.33 μg/g，转基因棉花的脯氨酸含量与野生型对照没有显著差异。盐胁迫下，野生型对照R15和转基因株系的脯氨酸含量都大幅度提高，野生型棉花R15的脯氨酸含量平均为465.83 μg/g，转基因株系L17和L25的脯氨酸含量平均为135.00和207.67 μg/g，转基因棉花株系的脯氨酸含量显著小于野生型对照，转基因株系L17的脯氨酸含量与转基因株系L25没有显著差异。

⒍植株表型分析

根据图16可见，与野生型棉花R15相比，转基因株系L17和L25出苗，现蕾，开花结铃和吐絮成熟等时期的表型均无显著差异。常规的农艺性状如表6所示，转基因株系L17和L25与野生型棉花R15在株高，果枝层数，单株铃数，单铃重和单株产量等性状上均无显著差异。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> CrSMT基因在提高植物对于生物胁迫以及非生物胁迫抗性中的用途

<130> BJ-2002-200509A-L

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1164

<212> DNA

<213> Chlamydomonas reinhardtii

<400> 1

atggccgtcg cgcttcctgc ggccgtcacc agcgcctacg agcgcctggc tggcgagttt 60

gacaagctca gcaccaccca gaagtatgcc gtcggcatcg cgggtggtgt cacctctcta 120

tacctgctcg ccaaggtgct gaagggcagc gatcgcgaca agccgaccac cctgcagctc 180

agcggcggtt ctattgactc ttccaaggtc aaggatgagt tcaccgctta cgcggacagc 240

tatggcaaga acgcgggcga gggcatcact gaccgctcga agaccgttca cctggtggac 300

gtgttctaca gcctagtcac tgacatttac gagtggggct ggggccagtc gttccacttc 360

tctcccaagc tgcccaacaa ggacctgaag gcctccgagg ccgcgcacga ggcgcgcatc 420

gctgccctgc tgcgcctgca gcccggccag aaggcgctgg actgcggctg cggtgtgggt 480

ggcccgatgc gtaccgtcgc tgctgtcagc ggcgcgcaca tcaccggcat caccatcaac 540

cagtaccagg tggaccgcgc caagacgcac aacgcacggc aaggtctggc tccgctgacg 600

gacgttgtcc gcggcgactt cactaacatg ccgttcaagg agaacacctt cgacggcgcc 660

tacgctattg aggcgacctg ccacgccccc aagctggagc aggtgtacgg cgagatctac 720

cgcgtgctca agcccggcag ctacttcgtg tcgtacgagt gggtgtcgac ccagaagttt 780

gacgtcaaca acgccgagca cgtcaagatt atggacgaga ttaacttcgg caacggcctg 840

ccggagatgc gcacctggaa ggaggctgag gacgccggca agaacgtggg cttcgagctg 900

gtcatgtcgc tggacctggc caccgcctcc gtcgtcgccg gcccctggta cgagcgcctg 960

cgtatgggca agtacacgca cgccatcaac cacggcattg tgtccaccgt cgacgccctg 1020

ggcctggctc ccaagggcct caaggaggtt caccacatgc tcgtggaggt tgccaagtcg 1080

ctcatccagg gcggcgagtc cggcatcttc acccccatgc acctgctgct gttccgcaag 1140

cccggtgccg acaagaagaa gtaa 1164

Claims (10)

1.CrSMT基因在提高植物对于生物胁迫抗性中的用途。

2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的生物胁迫是害虫。

3.CrSMT基因在提高植物对于非生物胁迫抗性中的用途。

4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的非生物胁迫是盐胁迫。

5.按照权利要求1或3所述的用途，其特征在于，所述的植物是棉花。

6.按照权利要求1或3所述的用途，其特征在于，所述CrSMT基因的多核苷酸序列为SEQID NO.1所示。

7.一种提高植物对生物胁迫抗性的方法，其特征在于，包括：将CrSMT基因在植物中进行过表达得到转基因植物；所得到的转基因植物对于生物胁迫的抗性增强。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的生物胁迫是害虫胁迫；所述的植物是棉花。

9.一种提高植物对非生物胁迫抗性的方法，包括：将CrSMT基因在植物中进行过表达得到转基因植物；所得到的转基因植物对于非生物胁迫的抗性增强。

10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的非生物胁迫是盐胁迫；所述的植物是棉花。

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