CN111492435A - 替莫唑胺反应预测因子和方法 - Google Patents

Abstract

设想的系统和方法使用替莫唑胺的反应预测模型，该反应预测模型是基于RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息，并且具有至少85％的预测准确度。

Description

替莫唑胺反应预测因子和方法

本申请要求我们于2017年10月30日提交的序列号62/579,127和2018年9月5日提交的序列号62/727,245的共同未决的美国临时申请的优先权，将这两个申请以其整体并入本文。

技术领域

本发明的领域是预测患者、尤其是在患者被诊断患有癌症的情况下对替莫唑胺的药物反应的系统和方法。

背景技术

背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

本文中的所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指明通过引用并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反的情况下，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。

替莫唑胺(TMZ)是化学治疗剂，其被用作胶质母细胞瘤和黑色素瘤的标准治疗，并且最近在患有转移性结直肠癌(mCRC)的患者中显示出有限但令人鼓舞的活性。TMZ是在DNA中的鸟嘌呤残基的N-7或O-6位置处具有烷基化/甲基化活性从而往往触发敏感细胞的细胞死亡的药剂。然而，各种DNA损伤修复酶、尤其是O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)可以抵消替莫唑胺在至少一些肿瘤细胞中的作用。最近，报道了MGMT基因的表观遗传沉默，并且发现具有MGMT基因的表观遗传沉默的肿瘤细胞对TMZ杀伤更为敏感。

因此，MGMT被认为是TMZ的抗性标志物。通常，可以通过称为甲基BEAMing(MB)的数字聚合酶链反应(PCR)方法来评估肿瘤的MGMT表达状态，并且MGMT甲基化>60％的截断值预测来自TMZ的益处。在另一种方法中，质谱(MS)蛋白质组学分析可以客观地定量在福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织切片中的MGMT蛋白和其他可执行的蛋白质生物标志物。此处，200amol/ug的MGMT蛋白截断值(根据测定的检测限预定义)预测用TMZ治疗的mCRC患者的益处。MGMT蛋白的量也可能与MGMT甲基化状态相关。

在经TMZ治疗的患有mCRC的患者中，其肿瘤表达低或不可检测的MGMT蛋白水平的患者具有比MGMT蛋白水平更高的对应者更长的mPFS。如伊利诺伊州芝加哥ASCO年度会议(2017年6月2日至6日)摘要编号11601中所述，在如通过质谱法定量的MGMT蛋白表达与通过MB得到的MGMT甲基化状态之间观察到80％的相关性。定量蛋白质组学客观地测量了FFPE肿瘤样品中的MGMT蛋白，并回顾性地鉴定了9名TMZ反应者中的9名。数字PCR甲基化测定(甲基BEAMing)回顾性地鉴定了8名TMZ反应者中的7名。因此，研究人员得出以下结论：MGMT的定量蛋白质组学分析可潜在地用于选择进行TMZ疗法的mCRC患者。

然而，这种方法仅以回顾性方式考虑了蛋白质组学和甲基化分析。此外，质谱分析的检测限和甲基化检测的可能不足进一步潜在地降低了反应者分析的准确度。实际上，观察到在质谱分析与甲基化分析之间在与MGMT的反应关联方面仅有约80％一致性。此外，作者没有提出任何能够支持或暗示具有临床上可用的预测准确度的反应预测的分析选择。

因此，即使在本领域中已知用于预测特定药物反应的各种系统和方法，仍需要如下系统和方法，所述系统和方法允许对药物进行具有高置信度的简单且稳健的治疗预测，并且还允许以患者特定方式进行治疗反应的预测。

发明内容

本发明的主题涉及用于在患者的实体瘤的治疗中对替莫唑胺的治疗反应预测的各种装置、系统和方法。在本发明的主题的一个方面，发明人设想了预测患者中对替莫唑胺的治疗反应的方法，该方法包括提供来自患者肿瘤的RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息的步骤，以及通过反应预测模型计算对替莫唑胺的反应预测的另一个步骤，其中该反应预测模型使用该RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息。

最优选地，该反应预测模型使用K最近邻方法，并且将该RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息进行亚分组。例如，RNAseq信息可以使用3.5的log2(TPM+1)截断值进行亚分组，蛋白质定量信息可以使用200amol/mL的截断值进行亚分组，和/或甲基化信息使用60％启动子CpG甲基化的截断值进行亚分组。最典型地，该反应预测模型具有至少80％或至少85％的预测准确度。

还设想从FFPE样品或新鲜肿瘤样品提供RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息，并且该肿瘤是实体瘤(例如，转移性结肠癌、胶质母细胞瘤或黑色素瘤)。

本发明的主题的另一方面包括治疗患有肿瘤的患者的方法。该方法包括提供来自该患者的肿瘤(例如，实体瘤)的RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息的步骤，以及通过反应预测模型计算对替莫唑胺的反应概率的步骤，其中该反应预测模型使用该RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息。然后，该方法继续进行以下步骤：向替莫唑胺反应概率>0.5的患者施用替莫唑胺。优选地，该反应预测模型使用K最近邻方法，和/或该反应预测模型具有至少85％的预测准确度。

在一些实施例中，将该RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息进行亚分组。优选地，RNAseq信息使用3.5的log2(TPM+1)截断值进行亚分组，和/或蛋白质定量信息使用200amol/mL的截断值进行亚分组，和/或甲基化信息使用60％启动子CpG甲基化的截断值进行亚分组。

在一些实施例中，RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息是从FFPE样品或新鲜肿瘤样品提供的。在一些实施例中，该肿瘤是转移性结肠癌、胶质母细胞瘤或黑色素瘤。

本发明的主题的多个对象、特征、方面和优点将根据以下关于优选实施例的详细描述以及附图而变得更清楚。

附图说明

图1描绘了实验研究中使用的样品和测定。

图2A和图2B描绘了根据(7A)MGMT蛋白状态和(7B)MGMT启动子高甲基化状态，经TMZ治疗的患者(n＝41)中的肿瘤体积的变化百分比(从基线)的图。

图3描绘了经TMZ治疗的患者中的肿瘤体积的变化百分比(从基线)的图。

图4A和图4B描绘了根据MGMT蛋白表达水平，经TMZ治疗的患有转移性结直肠癌的患者的无进展生存期(PFS，4A)和总生存期(OS，4B)的图。

图5A和图5B描绘了根据MGMT甲基化状态分层，经TMZ治疗的患有转移性结直肠癌的患者的PFS(5A)和OS(5B)的图。

图6A和图6B描绘了根据RNA-seq分析，经TMZ治疗的患有转移性结直肠癌的患者的PFS(6A)和OS(6B)的图。

图7A和图7B描绘了根据MGMT蛋白表达水平，经TMZ治疗的患有转移性结直肠癌的患者的图。

图8A和图8B是示意性地示出RNAseq数据的截断值的图。

图9A和图9B是示意性地示出RNAseq与蛋白质组学值之间的一致性的图。

图9C描绘了MGMT RNAseq中最佳阈值的条形图。

图9D描绘了MGMT蛋白量与MGMT甲基化之间的一致性的条形图。

图10A和图10B是描绘PFS(无进展生存期)和OS(总生存期)相对于MGMT蛋白水平亚组的图。

图11是描绘PFS(无进展生存期)相对于MGMT RNAseq水平亚组的图。

图12是描绘PFS(无进展生存期)相对于一种MGMT亚组组合的图。

图13A和图13B是描绘PFS(无进展生存期)和OS(总生存期)相对于另一个MGMT亚组组合的图。

图14是描绘基于各种分类器的各种输入变量的替莫唑胺反应预测准确度的图。

图15描绘了根据实例2中的留对(leave-pair-out)交叉验证的预测模型的平均准确度的图。

图16描绘了根据MGMT评估方法组，针对58种预测建模策略在未见样品中的平均预测准确度的图。各组按照在实例2中的平均准确度从左到右排序。

图17描绘了根据各种类型的数据进行药物反应预测的机器学习的示意图。

图18描绘了预测模型的回归和分类流程的流程图。

图19描绘了通过各种回归模型确定的所有表达与MGMT蛋白之间的关系的图。

图20描绘了通过各种回归模型确定的MGMT蛋白与MGMT基因之间的关系的图。

图21描绘了使用甲基化值的准确度值的图。

图22描绘了使用甲基化值的准确度值的另一幅图。

图23描绘了预测模型的训练数据集和测试数据集的热图。

具体实施方式

发明人现已发现，使用基于肿瘤的(优选地亚分组的)RNAseq信息、蛋白质定量信息和启动子甲基化信息的组合的模型，可以建立具有出乎意料地高准确度的临床上可用的替莫唑胺预测模型。在特别优选的方面，该模型是基于K最近邻方法。

尽管已经大体了解MGMT蛋白水平或启动子甲基化与替莫唑胺反应之间的事后(post hoc)关联，但应理解，这种关联不一定是预测性的，更不用说以高度准确度进行预测了。发明人现已观察到可以建立高度准确和预测性的模型，在该模型中可以根据定量的且优选亚分组的参数的组合来预测患者治疗反应：(1)RNAseq信息、特别是如以TPM测量的；(2)蛋白质定量信息、特别是如通过质谱法测量的；和(3)甲基化信息、特别是如在来自患者的肿瘤的MGMT启动子区域中测量的。

因此，发明人设想了预测患有肿瘤的患者中对替莫唑胺的治疗反应的方法，该方法包括提供来自患者的肿瘤的RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息的步骤。然后使用反应预测模型建立对替莫唑胺的反应预测，该反应预测模型考虑了RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息。如将容易理解的，信息的类型将至少在某种程度上决定样品的性质。

如本文所用，术语“肿瘤”是指以下项并且可与以下项互换使用：一种或多种癌细胞、癌组织、恶性肿瘤细胞或恶性肿瘤组织，它们可以位于或者发现于人体的一个或多个解剖位置中。应当注意，如本文所用的术语“患者”包括经诊断患有病症(例如，癌症)的个体以及出于检测或鉴定病症的目的经历检查和/或测试的个体二者。因此，患有肿瘤的患者是指诊断为患有癌症的个体以及被怀疑患有癌症的个体二者。如本文所用，术语“提供(provide)”或“提供(providing)”是指并且包括制造、产生、放置、使得能使用、转移或准备使用中的任何行为。

因此，在本发明的主题的大多数方面，肿瘤样品将用于获得所有相关信息。设想到了获得来自患者的肿瘤样品(肿瘤细胞或肿瘤组织)(或来自患者或健康个体的健康组织作为比较)的任何合适的方法。最典型地，可以经由活检(包括液体活检，或在手术期间经由组织切除术获得，或独立的活检程序等)获得来自患者的肿瘤样品，该肿瘤样品可以是新鲜的或经处理的(例如，冷冻的、福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的样品等)，直到进一步处理用于从组织获取组学数据为止。例如，肿瘤细胞或肿瘤组织可以是新鲜的或冷冻的。又例如，肿瘤细胞或肿瘤组织可以呈细胞/组织提取物的形式。在一些实施例中，肿瘤样品可以从单个或多个不同的组织或解剖区域获得。例如，对于转移的乳腺癌组织，可以从患者的乳房以及其他器官(例如，肝、脑、淋巴结、血液、肺等)获得转移性乳腺癌组织。优选地，可以获得患者的健康组织或匹配的正常组织(例如，患者的非癌性乳腺组织)，或者也可以经由类似的方式获得来自健康的个体(非患者)的健康组织作为比较。

在一些实施例中，为了确定在相关时间段内肿瘤样品的任何变化，可以在多个时间点从患者获得肿瘤样品。例如，可以在样品被确定或诊断为癌性之前和之后获得肿瘤样品(或疑似肿瘤样品)。在另一个实例中，可以在一次或一系列抗肿瘤治疗(例如，放疗、化疗、免疫疗法等)之前、期间和/或之后(例如，完成后等)获得肿瘤样品(或疑似肿瘤样品)。在仍另一个实例中，在鉴定新的转移的组织或细胞后，可以在肿瘤进展期间获得肿瘤样品(或疑似肿瘤样品)。

从获得的肿瘤细胞或肿瘤组织中，可以将DNA(例如，基因组DNA、染色体外DNA等)、RNA(例如，mRNA、miRNA、siRNA、shRNA等)和/或蛋白质(例如，膜蛋白、胞质蛋白、核蛋白等)分离并且进一步分析以获得组学数据。替代性地和/或另外地，获得组学数据的步骤可以包括从存储一位或多位患者和/或健康个体的组学信息的数据库接收组学数据。例如，可以从患者肿瘤组织中分离的DNA、RNA和/或蛋白质获得患者肿瘤的组学数据，并且所获得的组学数据可以与患有相同类型的肿瘤或不同类型的肿瘤的其他患者的其他组学数据集一起存储在数据库(例如，云数据库、服务器等)中。从健康个体或患者的匹配的正常组织(或健康组织)获得的组学数据也可以存储在数据库中，使得在分析时可以从数据库中检索相关的数据集。同样，在获得蛋白质数据的情况下，这些数据也可以包括蛋白质活性，尤其是在蛋白质具有酶活性(例如，聚合酶、激酶、水解酶、裂解酶、连接酶、氧化还原酶等)的情况下。

如本文所用，组学数据包括但不限于与基因组学、蛋白质组学和转录组学以及特定的基因表达或转录物分析和细胞的其他特征和生物学功能相关的信息。关于基因组学数据，合适的基因组学数据包括DNA序列分析信息，其可以通过肿瘤和匹配的正常样品的全基因组测序和/或外显子组测序(典型地在至少10倍、更典型地至少20倍的覆盖深度下)获得。可替代地，还可以从来自先前序列确定的已建立的序列记录(例如，SAM、BAM、FASTA、FASTQ或VCF文件)提供DNA数据。因此，数据集可以包括未处理的或已处理的数据集，并且示例性数据集包括具有BAM格式、SAM格式、FASTQ格式或FASTA格式的那些。然而，尤其优选的是，以BAM格式或作为BAMBAM diff对象提供数据集(例如，US2012/0059670A1和US2012/0066001A1)。组学数据可以源自全基因组测序、外显子组测序、转录组测序(例如，RNA-seq)或源自基因特异性分析(例如，PCR、qPCR、杂交、LCR等)。同样，可以按多种方式进行序列数据的计算分析。然而，在最优选的方法中，如例如在US 2012/0059670A1和US 2012/0066001A1中所披露，使用BAM文件和BAM服务器通过肿瘤和正常样品的位置引导的同步比对，在计算机中进行分析。这样的分析有利地减少假阳性新表位，并且显著地减少对存储器和计算资源的需求。

可替代地或另外地，尽管优选地直接从肿瘤获得相关信息，但是也可以从数据库获得一种或多种数据。例如，在使用新鲜肿瘤样品获得全基因组测序和RNA分析的情况下，相关信息可以最佳地从数据库或测序中心提供。可以使用激光显微解剖从FFPE样品进行蛋白质组学分析，并且可以使用此类样品进行质谱分析。因此，信息源不必一定源自单个来源，而可以从多个来源组合。同样，设想的分析可以采用来自不同时间点的数据，例如，手术前和施用替莫唑胺之前，或者手术后和施用替莫唑胺之前等。

因此，优选地，合适的基因组信息包括全基因组测序或外显子组测序，其可以例如鉴定MGMT基因突变、重复或缺失，以及MGMT的RNA序列信息、特别是RNAseq信息，以提供转录的定量信息(以及剪接变体或其他突变(在存在时))。可替代地，也可以通过杂交和/或其他基于PCR的方法获得定量信息。同样，蛋白质信息优选使用质谱法获得，这些质谱法包括选择的反应监测方法、基于抗体的信息和/或染色方法。

损伤DNA的烷基化剂替莫唑胺(TMZ)被批准用于治疗胶质母细胞瘤、黑色素瘤和淋巴瘤。MGMT酶参与修复来自烷基化剂的损伤。在黑色素瘤研究中MGMT表观遗传沉默与TMZ抗性有关，并且在约三分之一的结直肠癌(CRC)中发生。然而，令人困惑的是，先前的研究证明，在mCRC患者中，低MGMT蛋白表达可以增加对TMZ反应的预测，增加程度高于MGMT甲基化。各种MGMT测定与结果之间的关系仍不清楚。

因此，发明人设想在预测模型的构建中针对单个分子实体使用多于一种类型的数据集。有利地，合适的数据集类型包括DNA拷贝数数据、DNA突变数据、RNA剪接变体数据、RNA表达水平数据、启动子甲基化数据、表观遗传修饰数据、蛋白质数据和蛋白质活性数据。最典型地，此类数据是容易获得的和/或可以从各种途径模型(例如，PARADIGM)推知。还设想在使用多于一种类型的数据集的情况下，将采用至少三种不同类型的数据集。如将容易理解的，分类算法的选择将至少在某种程度上随着数据集类型而变化，并且PHOSITA将能够确定给定数据集的一种或多种适当分类算法。此外，并且如下文还示例性地指出的，截断值可以是预先确定的，或者可以使用进一步的机器学习来单独学习。

可以设想，不论用于获得定量度量的特定方法如何，通常优选的是使用一个或多个阈值将RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息中的一个或多个进行亚分组。例如，并且如下文更详细地解释，RNAseq信息可以通过TPM(每百万转录物)阈值进行亚分组，蛋白质定量信息可以通过检测阈值或特定值(如200amol)进行亚分组，并且甲基化信息可以通过如由甲基BEAMing确定的阈值(例如，60％甲基化MGMT启动子序列)进行亚分组。

发明人进一步设想，所述RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息和/或通过一种或多种阈值亚分组的信息中的一种或多种可以用于训练预测模型并验证预测模型的准确度。关于反应预测模型，应注意的是，本领域中已知有多种建立模型的方式，并且设想的模型可以以任何组合使用分组或未分组的RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息中的一种或多种。然而，优选的是，模型将使用亚分组的RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息，如在下文更详细地进一步描述。

同样，本领域中已知有多种用于预测任务的多变量分类算法，并且示例性分类器包括使用基于随机森林或决策树的估计器的额外树分类器、KNN分类器、RBF或线性支持向量分类器、决策树分类器、朴素贝叶斯(

Bayes)分类器、二次判别分类器、脊分类器、高斯过程分类器、随机森林分类器和AdaBoost分类器。类似地，本领域中已知存在用于预测任务的各种单变量分类算法，并且实例是使用尤登分析(Youden analysis)找到最佳分类阈值。如下所述，此类算法将提供不同的准确度度量，并且通常优选的是，将具有最高准确度(或准确度增益)的分类器用于反应预测模型的生成。值得注意的是，并且在其他相对较高的准确度中，当针对未见(unseen)的癌症患者(例如，mCRC患者等)中进行验证时，根据使用的分类器类型，所设想的方法允许至少70％、至少80％、至少85％的预测准确度。最优选地，在使用K最近邻分类器的情况下，获得约86％的准确度。

实例

归档的FFPE组织切片是从41名患有转移性结直肠癌的患者获得的，这些患者来自FELDSPAR群组，已经在3项II期临床试验中的一项中接受TMZ。如表1所示，来自41名经TMZ治疗的患者的肿瘤样品可用于分析。这些患者的中位年龄为69岁，并且在TMZ之前接受了中位数为3种的化疗方案。大多数患者具有0或1的ECOG状态(85％)；和至少2个转移部位(56％)，其中肝脏是最常见的部位。如在mCRC中所预期的，所有患者最终都对TMZ进展。ORR如下：26名患者(63％)具有进展疾病；9名(22％)具有部分反应；6名(15％)具有稳定疾病。如图1所示，在这41个样品中，39个成功地通过了RNAseq测序的质量控制标准，并且35个成功地通过了甲基BEAMing(数字MB)的质量控制标准。以下是对这次样品选择的简短分析。

表1

所有41个归档样品都可以通过LC-MS进行评价，35个通过数字MB进行分析，并且39个具有足以用于通过RNA-seq进行MGMT评估的质量(图1，表1)。在通过基于LC-MS的蛋白质组学评估的患者中，18名(44％)测试为MGMT蛋白阴性(<200amol/μg的肿瘤蛋白)，因此被认为可能对TMZ有反应。其余患者(n＝23)为MGMT蛋白阳性，并且被认为不太可能对TMZ疗法有反应。在临床试验参与者的这个分子富集群体中，MGMT率高达44％。相比之下，在一年的过程中，在提交给我们实验室进行蛋白质组学测试的所有CRC患者样品(n＝114)中，发现MGMT阴性的发生率为16％。通过MB，在12名(34％)患者中观察到MGMT启动子甲基化超过63％截断值；其余患者具有未甲基化的MGMT状态(表2)。在通过MB和LC-MS二者分析的35个肿瘤中，方法之间的一致率为77％；p＝0.004。

表2

MGMT测定预测反应和生存期的能力：定量蛋白质组学回顾性地鉴定了9名RECIST定义的TMZ反应者中的9名；通过LC-MS，所有9名反应者都具有阴性MGMT蛋白表达。另外9名具有MGMT阴性蛋白的患者不具有RECIST定义的对TMZ的反应(ORR，MGMT阴性患者：50％)。具有阳性MGMT蛋白表达的患者都对TMZ无反应(ORR，MGMT阳性患者：0％；p＝0.0001；表2，图2A)。

在通过MB分析的患者(n＝35)中，MGMT高甲基化状态回顾性地鉴定了8名TMZ反应者中的6名；通过MB，另外6名MGMT高甲基化的患者是无反应者(ORR，MGMT高甲基化的患者：50％)。具有阴性甲基化状态的两名患者对TMZ有反应(ORR：9％；p＝0.011；表2；图2B)。图3显示了根据MGMT蛋白<200amol/ug(n＝18；深蓝)和MGMT≥200amol/ug(n＝23；浅蓝)的患者，将甲基化状态和MGMT蛋白表达水平(肿瘤体积百分比变化(从基线))的数据组合的图。通过MB得到的MGMT甲基化状态(红色条形；n＝35)，并且阳性状态定义为>60％(红线)。

在生存期分析中，通过LC-MS，具有阴性MGMT蛋白表达的患者的中位PFS(mPFS)比蛋白质组学阳性患者长(3.7个月相对于1.8个月；HR：0.504[95％CI 0.27-0.94]；p＝0.014)(图4A)。在双变量Cox比例风险模型中，当与12种潜在的混杂因素(BRAF和KRAS突变状态、性别、ECOG、先前治疗次数、LDH基线水平、转移部位数、嗜中性粒细胞与淋巴细胞比率、腹膜疾病、原发性肿瘤位置、归档组织的部位和年龄)配对时，MGMT水平仍然是PFS的统计学上显著的预测因子。

尽管这些临床变量中的一些与结果相关(例如，LDH)，但MGMT蛋白表达是PFS的统计学上最显著的预测因子(表3)。通过MGMT蛋白表达，OS差异与PFS差异相似，但未达到统计学显著性(8.7个月相对于7.4个月，HR：0.593[95％CI：0.32至1.12]；p＝0.078)(图4B)。通过MGMT MB分层的患者中，PFS或OS没有统计学上显著的差异(图5A和图5B)。

表3

通过RNA测序得到的MGMT：使用与数据拟合的mRNA表达的实验切割点(≤3.5log2[TPM+1])，在大多数样品(n＝23；59％)中观察到低MGMT mRNA表达(表2)。通过RNA-seq，具有低MGMT RNA表达的患者肿瘤的ORR不显著地高于较高mRNA表达者(35％相对于6％；p＝0.115；表2)。在通过MGMT mRNA表达分层的患者中，没有统计学上显著的生存期差异(图6A和图6B)。图7A和图7B描绘了另一幅图，其显示在经TMZ治疗的患者(n＝41)中，MGMT蛋白水平<200amol/ug的那些患者(n＝18)的中位PFS(mPFS)比具有较高MGMT蛋白水平的患者长。所有患者最终都对TMZ进展。(图7A)通过RECIST标准重新定义进展，以反映临床反应：具有部分反应或稳定疾病≥6个月的患者被定义为反应者(n＝18)或无反应者(n＝23)。总生存期的结果是一致的，并且几乎具有统计学显著性(8.7个月相对于7.4个月，HR＝0.6，p＝0.077)(图7B)

RNAseq截断值与MS蛋白质组学截断值之间的相关性：在鉴定观察到的/实际的MS蛋白质组学截断值在RNAseq中的相应截断值的尝试中，发明人获得了所有COAD和READTCGA样品的MGMT表达水平，并且寻找与先前蛋白质组学分析提出的200amol截断值相匹配的表达模式的自然分界(break)。从图8A和图8B可以看出，MGMT TPM的分布呈双峰，在约3.5log2(TPM+1)处自然分界(垂直线所示)。在3.5log2(TPM+1)的截断值处，观察到200amol/mL MS蛋白质组学截断值与RNAseq类别之间的良好一致性，这也可以从下表4看出。蛋白质与RNA阈值之间的这种关联水平的费希尔精确p值是p<0.00082。

表4

在随访分析中，发明人发现，根据尤登分析，选择的截断值(3.5log2[TPM+1])对于该群组中RNAseq与蛋白质组学值之间的一致性是最佳的，如从图9A和图9B可以得出。在这个3.5的切割点处，与蛋白质组学MGMT类别相比时，在该群组中获得0.71的TPR和0.11的FPR。图9C显示了条形图，其显示在TMZ的无反应者和反应者中的RNAseq值(统计学＝-1.04，p值＝0.305)。图9D显示了条形图，其指示MGMT蛋白质组学测定与MB之间的一致率为80％；p＝0.0011费希尔检验(通过MB分析的35个肿瘤)。

定义与结果相关的MGMT亚组：在第一个分析中，发明人重新创建了先前的工作，证明了对具有<200amol/mL MGMT蛋白的患者的PFS益处，并且典型结果显示在图10A中。蛋白质组学类别之间的对数秩检验具有p<＝0.0186，并且Cox比例风险结果显示在表5中。

表5

应注意的是，尽管对于这两个亚组的对数秩检验得出p<0.0186(如先前的工作所示)，但Cox比例风险比率得出p<0.021。Cox模型稍微更保守，并且更多地考虑了组中的不平衡。两种统计学将在以下结果中讨论。还应注意的是，如从图10B可以看出，当使用OS作为生存期度量并以死亡为终点时，这种分割失去了p<0.05显著性。此处，蛋白质组分类之间的对数秩检验为p<＝0.0879，并且Cox比例风险如表6中所示。

表6

接下来，发明人研究了如使用RNAseq亚组观察到的关联。此处，如在TGCA COAD/READ数据中确立的3.5log2(TPM+1)的RNAseq截断值用于定义这些亚组，如在图11中所示。这提供了p<＝0.1731的RNAseq类别之间的对数秩检验，并且Cox比例风险显示在表7中。可以容易地看出，RNAseq类别的预测性不如蛋白质组学亚组，并且在这种群组大小下没有获得显著性。类似地，将OS用作生存期度量没有获得显著性。

表7

然后，发明人研究了如使用RNAseq亚组和蛋白质组学类别的组合所观察到的关联。如果样品在RNAseq或蛋白质中具有高MGMT，则将其视为高MGMT。这种分析的典型结果显示在图12中。此处，组合RNA+蛋白质类别之间的对数秩检验为p<＝0.0350，并且Cox比例风险结果显示在表6中。此处，应注意的是，尽管差异生存期是显著的并且在单独RNAseq时有改善，但不如单独的蛋白质组学200amol分割显著。

表8

在进一步的分析中，发明人研究了如使用上述组合加上MGMT启动子CpG甲基化亚组观察到的关联。更具体地，预期具有>60％甲基化的样品具有抑制的MGMT表达，并且最佳组合如下：MGMT高：甲基化低，并且RNA高或蛋白质高；以及MGMT低：甲基化高或者RNA低或蛋白质低。

图13A显示了这种分析的示例性结果。此处，3路组合类别之间的对数秩检验为p<＝0.0378，并且Cox比例风险显示在表9中。

表9

这种分离不是很像RNA+蛋白质或单独的蛋白质一样明显，但是它在OS是生存期度量时，在对数秩和Cox PH检验中仍然是显著的，如图13B所示。此处，3路组合类别之间的对数秩检验为p<＝0.0419，并且Cox比例风险显示在表10中。

表10

替莫唑胺反应预测实例I：发明人评价了基于MGMT-组学值建立替莫唑胺反应的预测模型的多种方法。更具体地，发明人使用以下MGMT测定中的每一种建立替莫唑胺反应的预测模型：RNAseq表达TPM、蛋白质amol/mL和甲基化百分比，及其组合和子组合。使用这些特征中的每一个的原始连续值及其亚分组的值(分别为3.5log2(TPM+1)、200amol/mL和60％CpG甲基化)二者建立其他模型。结合起来，这产生了10个不同的“数据集”：

1.单独的表达

2.单独的蛋白质

3.单独的甲基化

4.表达+蛋白质

5.表达+蛋白质+甲基化

6.表达(亚分组)+蛋白质

7.表达(亚分组)+蛋白质(亚分组)

8.表达(亚分组)+蛋白质(亚分组)+甲基化(亚分组)

9.表达+蛋白质+甲基化(亚分组)

10.表达+蛋白质(亚分组)+甲基化(亚分组)

为了评价预测性能，发明人使用了留对交叉验证(LPOCV)。这种验证方法需要在37/39个样品中建立预测模型，然后在一个未见阳性样品和一个未见阴性样品中测试预测性能。对阳性和阴性样品的所有可能组合重复进行这种验证，从而在该群组中产生308次性能评价。这308个未见测试集的平均性能是对于给定预测算法报告的准确度。

对于所有多特征数据集(上述4-10)，发明人评价用于该预测任务的13种不同的分类算法。对于单特征数据集(上述1、2和3)，使用Youden J统计学在训练样品中确立新的最佳截断值，并在未见样品对中测试新截断值的性能。

这10个数据集和14种分类算法组合成140种不同的建模策略。使用LPOCV在未见样品中评价这140种策略的预测性能需要建立另外的2772个独特的预测子模型。图14描绘了这些建模策略中的每一种在未见样品中的平均准确度。

如从计算结果和图14可以看出，最佳建模策略在未见样品中预测替莫唑胺反应的总体准确度为87％。应理解，该性能(87％准确度)显著优于大多数分类策略(即假设所有样品均具有抗性：71％)，并且相对于单独使用蛋白质值(80％)有所改善。选择该建模策略以提出最终的预测模型。

性能最高的建模策略使用K最近邻方法，利用呈亚分组转化形式的所有三个特征(RNA、蛋白质和甲基化)。这种方法如下对新样品进行替莫唑胺反应预测：1.使用上述预定义的截断值定义MGMT mRNA表达状态、蛋白质水平和启动子甲基化状态，2.使用所有三个MGMT相关特征计算每个训练实例与待预测的新样品之间的成对闵可夫斯基(Minkowski)距离(即，穷举(brute)树)，3.对于每个新样品，鉴定五个最接近的匹配，以及4.为新样品分配大多数最接近的训练样品的反应类别。

在本申请中提出了最终模型，该模型使用所有可用的样品进行训练，并坚信新样品中的预测性能将与交叉验证环境中的预测性能相似。由于对三个二元特征进行训练，最终模型描述了在8种不同状态下替莫唑胺敏感性的概率(表11)。新样品可以使用与上述相同的截断值进行亚分组，并将其分配至这8种状态中的一种。敏感性预测概率>0.5表示，该状态将对替莫唑胺敏感，准确度为约87％。相反，替莫唑胺反应概率<0.5与对替莫唑胺的抗性相关。

表11

替莫唑胺反应预测实例II：发明人试图基于3种单独的定量MGMT测定(启动子定量甲基化、RNA表达和蛋白质丰度)来训练TMZ反应的稳健预测模型，并在未见mCRC患者中验证其准确度。从不同的角度来看，与其鉴定单一类型的预测因子，发明人打算在机器学习环境中鉴定多个预测因子以整合各种变量，并由此得到具有高灵敏度和准确度的预测模型。

在一个实例中，使用了来自3个TMZ安全性试验(INT研究n.20/13；INT研究20/13和EudraCT 2012-002766-13)的41个归档肿瘤样品训练模型。根据RECIST v.1.1标准定义对TMZ的反应。MGMT状态通过以下3种方法进行评估：数字PCR/甲基BEAMing(MB)、RNAseq和液相色谱质谱法。在训练集内使用交叉验证(CV)对若干种多变量建模策略(kNN、SVM、决策树等)进行评价。由于缺乏临床级别的甲基化测试，还探索了如下模型，这些模型首先预测MGMT甲基化(基于完整RNAseq)，然后使用预测的甲基化对TMZ反应进行分类。在来自随访研究的进行类似测定的14个未见肿瘤样品中验证了CV中最准确的模型。每个MGMT测定中预定义的阈值用作比较的基础。

如从下表1的示例性结果可以看出，与单个变量(即单独使用的甲基化或蛋白质或表达)相比，当使用多个变量进行训练和验证时，对替莫唑胺的反应预测明显改善。实际上，基于多个变量的整合，难治性mCRC中的TMZ反应是可大致预测的。结合预测的甲基化、转录物水平和蛋白质丰度，得到最准确且最稳健的反应预测方法(82％-87％准确度)。

表12

在一组实验中，发明人研究了针对MGMT蛋白(如通过LC-MS测量)、MGMT表达(如通过TPM测量)和MGMT启动子甲基化(如通过数字PCR/甲基-BEAMing(MB)测量)的训练群组预测性能。更具体地，为了评价预定义的截断值预测对TMZ的反应的能力，我们使用留对交叉验证策略。分别在LC-MS、RNAseq和MB数据中在未见样品评估预定义和探索性截断值330、308和250次。LC-MS和RNA-seq中的预定义截断值显示出比MB模型(68.0％)更好的平均预测性能(分别为82.1％和72.2％)，并且典型结果示于图15中。

为了进一步研究各种分类算法和训练数据(即单变量相对于多变量)的影响，发明人执行了若干种学习方法，其中在具有或不具有预定义阈值的情况下，单独地或组合地使用蛋白质、RNA和甲基化数据。如从图16可以看出，基于蛋白质的模型具有相对较高的预测准确度，该模型甚至进一步被使用所有三个变量的模型取代。在提高准确度并简化临床或样品要求的仍其他尝试中，发明人使用先前的TMZ研究作为训练数据来建立10个候选模型(+3的预定义的截断值)，并且根据完整RNAseq和使用回归模型，用‘预测的甲基化’替代测量的甲基化。然后在未见测试群组(TEMIRI)中测试性能，如图17中示例性地显示。此处，训练数据集是TMZ群组，并且包括来自3项II期研究的41名经TMZ治疗的mCRC患者。对于所有患者，均可以获得通过质谱法得到的连续MGMT蛋白水平，以及通过RNA seq得到的RNA表达数据和连续MGMT甲基化百分比数据。药物反应记录为二元药物反应数据。测试数据集包括32名经TMZ+伊立替康治疗的mCRC患者。3名患者缺少二元药物反应数据，可获得14名患者的基因表达值，并且可获得21名患者的MGMT蛋白表达数据。参见表13。

表13

发明人进一步设想，可以建立解释甲基化和/或使用预测的甲基化值的用于机器学习的回归模型，其具有更高的准确度。图18显示了用于建立回归模型的回归和分类流程。如表14所示，在MGMT蛋白表达水平和MGMT RNAseq都用作数据集时，回归量模型的RMSE(残差方差的平方根，指示模型与数据的绝对拟合-观察到的数据点与模型的预测值有多接近)较低(更好的拟合)。

表14

图19显示了当所有表达(所有RNA的表达水平)和MGMT蛋白表达水平作为数据集时，各种回归量模型的平均准确度值，这也总结在表15中。

表15

图20显示了当MGMT基因表达和MGMT蛋白表达水平作为数据集时，各种回归量模型的平均RMSE值，这也总结在表16中。

表16

接下来，发明人使用预测的甲基化值建立回归量模型。图21和图22显示了当预测的甲基化值用作数据集时，各种回归量模型的平均准确度值，这也分别总结在表17和表18中。

表17

表18

图23描绘了热图，其具有使用所述的预先设定的阈值对44个样品中的1,000个最易变基因进行反应预测的示例性结果，并且表14是对所选数据集和数据集组合使用的示例性分类算法的列表。可以再次看出，使用MGMT RNAseq、MGMT蛋白和MGMT启动子甲基化为替莫唑胺的反应预测提供了极好的训练和测试准确度。同样，与其他分类器和单独数据集相比，灵敏度、特异性和F1得分均大大增加。表19的最佳模型的样品水平预测列于表20中，指示与其他模型相比时，同时考虑蛋白质、MGMT甲基化和mRNA的模型表现更好。

表19

表20

在对经TMZ治疗的患有难治性mCRC的患者的该回顾性分析中，基于MS的MGMT蛋白测试的灵敏度为50％并且特异性为100％。在患者的这个小群组中，蛋白质组学测试在预测对TMZ的反应方面的表现优于数字MB和RNA-seq二者。此外，低于预定义阈值(200amol/μg)的MGMT蛋白表达与mPFS增加2倍相关，并且这种关联与12个预后变量无关。有趣的是，通过LC-MS MGMT，具有阳性MGMT蛋白表达的患者的PFS与针对参与TMZ临床试验的mCRC患者报告的PFS相似。此类试验的令人失望的结果可能反映了标准MGMT评估方法(如MSP)选择TMZ最佳候选者的能力有限。本研究在前瞻性研究中为替代性MGMT平台(如LC-MS)的评估提供了支持。

在交叉验证环境中严格测试了MGMT测定作为TMZ反应的预测因子的准确度和稳健性。在该实践中，蛋白质组学MGMT测试的表现以82.1％的平均准确度优于其他测试平台。

值得注意的是，鉴定TMZ的潜在反应者的重要性已被认识到，因为经TMZ治疗的mCRC中DNA错配修复受到损害，其中TMZ反应者从微卫星稳定转变为微卫星不稳定(MSI)，从而使他们有资格进行采用免疫检查点抑制剂的疗法。换言之，对TMZ复发的患者可以开始免疫疗法。

鉴定TMZ的潜在反应者的重要性因最近发表的有关经TMZ治疗的mCRC中DNA错配修复受损的发现而被强调，其中TMZ反应者从微卫星稳定转变为微卫星不稳定(MSI)，从而使他们有资格进行采用免疫检查点抑制剂的疗法。这表明对TMZ复发的患者可以开始免疫疗法。因此，发明人进一步设想，可以基于预测结果为患者推荐或更新癌症治疗。例如，可以以有效治疗肿瘤的剂量和时间表向患者施用TMZ，其中反应预测模型预测该患者对TMZ有反应。在另一个实例中，可以向患者施用免疫疗法(例如，检查点抑制剂、癌症疫苗等)，其中反应预测模型预测，该患者不再对TMZ有反应或对TMZ的反应性大大降低(例如，与TMZ治疗前相比，或与具有类似癌症预后的其他个体相比等，降低至少30％、至少50％、至少70％)。

如本文所用，术语“施用”药物或癌症治疗是指直接或间接施用药物或癌症治疗。药物或癌症治疗的直接施用典型地由卫生保健专业人员(例如，医生、护士等)进行，并且其中间接施用包括向卫生保健专业人员提供药物或癌症治疗或使卫生保健专业人员可获得药物或癌症治疗用于直接施用(例如，经由注射、口服、局部应用等)的步骤。

如本文的说明书和下文的整个权利要求中所使用，“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”以及“该”的含义包括复数参照物，除非上下文清楚地另外指明。而且，如本文的说明书中所使用，“在……中(in)”的含义包括“在……中(in)”和“在……上(on)”，除非上下文另有明确说明。还如本文中所使用，并且除非上下文另有指示，否则术语“偶联至”旨在包括直接偶联(其中两个彼此偶联的元件彼此接触)和间接偶联(其中至少一个另外的元件位于两个元件之间)。因此，术语“偶联至”和“与……偶联”同义使用。最后，并且除非上下文指明相反，本文列出的所有范围应当被解释为包括其端点，并且开放式范围应当被解释为包括商业实用值。类似地，除非上下文指出相反的情况，否则应将所有值的列表视为包含中间值。

对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，除了在所附权利要求的范围中之外，本发明主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求书时，所有术语应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包含”(“comprises”和“comprising”)应被解释为以非排他性方式指代要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。在说明书权利要求涉及选自由A、B、C……和N组成的组中的至少一种的情况下，该文字应被解释为只需要该组中的一个元素，而不是A加N、或B加N等。

Claims (18)

1.一种预测患者中对替莫唑胺的治疗反应的方法，该方法包括：

提供来自该患者的肿瘤的RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息；

通过反应预测模型计算对替莫唑胺的反应预测，其中该反应预测模型使用该RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息。

2.如权利要求1所述的方法，其中该反应预测模型使用K最近邻方法。

3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中对该RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息进行亚分组。

4.如权利要求3所述的方法，其中使用3.5的log2(TPM+1)截断值对该RNAseq信息进行亚分组。

5.如权利要求3所述的方法，其中使用200amol/mL的截断值对该蛋白质定量信息进行亚分组。

6.如权利要求3所述的方法，其中使用60％启动子CpG甲基化的截断值对该甲基化信息进行亚分组。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息是从FFPE样品或新鲜肿瘤样品提供的。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中该肿瘤是实体瘤。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该肿瘤是转移性结肠癌、胶质母细胞瘤或黑色素瘤。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该反应预测模型具有至少85％的预测准确度。

11.如权利要求1所述的方法，其中对该RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息进行亚分组。

12.如权利要求11所述的方法，其中使用3.5的log2(TPM+1)截断值对该RNAseq信息进行亚分组。

13.如权利要求11所述的方法，其中使用200amol/mL的截断值对该蛋白质定量信息进行亚分组。

14.如权利要求11所述的方法，其中使用60％启动子CpG甲基化的截断值对该甲基化信息进行亚分组。

15.如权利要求1所述的方法，其中该RNAseq信息、蛋白质定量信息和甲基化信息是从FFPE样品或新鲜肿瘤样品提供的。

16.如权利要求1所述的方法，其中该肿瘤是实体瘤。

17.如权利要求1所述的方法，其中该肿瘤是转移性结肠癌、胶质母细胞瘤或黑色素瘤。

18.如权利要求1所述的方法，其中该反应预测模型具有至少85％的预测准确度。

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