CN111484498A - 咪唑并[1,5-a]吡嗪类化合物的晶型及其制备方法 - Google Patents

咪唑并[1,5-a]吡嗪类化合物的晶型及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本公开中提供了咪唑并[1,5‑a]吡嗪类化合物的晶型及其制备方法。具体而言，本公开中提供了化合物(S)‑N7‑(3‑氰基‑4‑氟苯基)‑6‑甲基‑N1‑((R)‑1,1,1‑三氟丙‑2‑基)‑5,6‑二氢咪唑并[1,5‑a]吡嗪‑1,7(8H)‑二甲酰胺的晶型及其制备方法。本公开中的晶型具备良好的晶型稳定性，可更好地用于临床治疗。

Description

咪唑并[1,5-a]吡嗪类化合物的晶型及其制备方法
技术领域
本公开中提供了化合物(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺的晶型及其制备方法。
背景技术
PCT/CN2018/097170(申请日2018年7月26日)描述了一种化合物(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺，药效实验显示了该化合物对HBV衣壳蛋白正常装配具有明显的抑制作用，并且其药代吸收良好，生物利用度高。同时该新型结构的化合物对HepG2细胞体外增殖抑制没有影响或影响较小，表现出较好的安全性。
多晶型现象是指固态物质存在两种或两种以上不同的空间排列方式，从而具有不同物理、化学性质。同种药物不同晶型之间由于排列方式的不同，其生物利用度也可能会存在差别。同时，鉴于固体药物晶型及其稳定性对其在临床治疗中的重要性，深入进行化合物(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺的多晶型研究，获得纯度高且化学性质稳定的晶型，对开发适合工业生产且生物活性良好的药物具有重要意义。
发明内容
本公开(The disclosure)提供了化合物(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺的晶型I，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在9.377、11.039、13.322、20.260、20.800、21.740和25.721处有特征峰。
在可选实施方案中，所述的I晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在9.377、11.039、12.542、13.322、16.761、17.440、20.260、20.800、21.740和25.721处有特征峰。
在一些实施方案中，所述的I晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在7.759、9.377、11.039、11.781、12.542、13.322、15.779、16.761、17.440、20.260、20.800、21.740和25.721处有特征峰。
在另一些实施方案中，所述的I晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱如图2所示。
本公开还提供了制备化合物(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-
基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺的晶型I的方法，所述方法包括：
(a)将化合物(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺加入溶剂(I)中，搅拌溶解或加热溶解，所述溶剂(I)优选自乙酸异丙酯与正己烷、环己烷或正庚烷的混合溶剂，
(b)任选加入晶型I晶种，
(c)搅拌析晶。
在一些实施方案中，本法所述溶剂(I)选自乙酸异丙酯与环己烷的混合溶剂，乙酸异丙酯与环己烷的体积比为2:1～1:10，可以为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:,9或1:10，优选1:3、1:4或1:5。
在一些实施方案中，本法所述溶剂(I)选自乙酸异丙酯与正庚烷的混合溶剂，乙酸异丙酯与正庚烷的体积比为2:1～1:10，可以为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:,9或1:10，优选1:3、1:4或1:5。
在一些实施方案中，本法所述溶剂(I)所用体积(ml)为化合物重量(g)的1～20倍，可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍。
本公开还提供了化合物(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺的晶型II，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在10.220、11.900、14.220、15.700、16.600、17.100和22.140处有特征峰。
在可选实施方案中，所述的II晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在10.220、11.900、14.220、14.979、15.700、16.600、17.100、18.419、19.360和22.140处有特征峰。
在可选实施方案中，所述的II晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在10.220、11.900、14.220、14.979、15.700、16.600、17.100、18.419、19.360、20.679、22.140和24.960有特征峰。
在另一些实施方案中，所述的II晶型，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱如图3所示。
本公开还提供了制备化合物(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-
基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺的晶型II的方法，所述方法包括：
(a)将化合物(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺加入溶剂(II)中，搅拌溶解或加热溶解，所述溶剂(II)优选自甲基异丁基酮、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、甲基叔丁基醚、醋酸异丙酯、正庚烷、石油醚或环己烷中的至少一种，
(b)任选加入晶型II晶种，
(c)搅拌析晶。
进一步地，所述溶剂(II)为高极性溶剂与低极性溶剂的混合溶剂，所述高极性溶剂选自甲基异丁基酮、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、甲基叔丁基醚或醋酸异丙酯，所述低极性溶剂选自正庚烷、石油醚或环己烷。在一些实施方案中，本法所述溶剂(II)选自乙酸异丙酯与环己烷的混合溶剂，乙酸异丙酯与环己烷的体积比为2:1～1:10，可以为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，优选1:3、1:4或1:5。
在一些实施方案中，本法所述溶剂(II)选自乙酸异丙酯与正庚烷的混合溶剂，乙酸异丙酯与正庚烷的体积比为2:1～1:10，可以为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，优选1:3、1:4或1:5。
优选地，本法所述溶剂(II)所用体积(ml)为化合物重量(g)的1～20倍，可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍。
本公开还提供了一种由前述晶型I或II任意一种制备而成的药物组合物。进一步地，所述药物组合物中还含有自药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的药用辅料。
本公开还提供了一种药物组合物，其含有前述可药用盐的晶型和任选自药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的药用辅料。
本公开还提供了前述晶型I或II的化合物或前述药物组合物在制备用于预防和/或治疗病毒性感染疾病的药物中的用途，所述病毒可以为乙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒和艾滋病毒，所述疾病可以为乙型肝炎、流感、疱疹和艾滋病。
本公开还提供了前述晶型I或II的化合物或前述药物组合物在制备用于衣壳蛋白抑制剂的药物中的用途。
本公开还提供了一种预防和/或治疗病毒性感染疾病的方法，其包括向需要其的患者施用治疗有效剂量的前述晶型I或II的化合物，所述病毒可以为乙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒和艾滋病毒，所述疾病可以为乙型肝炎、流感、疱疹和艾滋病。
依据《中国药典》2015年版四部中“9103药物引湿性指导原则”中引湿性特征描述与引湿性增重的界定，
潮解：吸收足量水分形成液体；
极具引湿性：引湿增重不小于15％；
有引湿性：引湿增重小于15％但不小于2％；
略有引湿性：引湿增重小于2％但不小于0.2％；
无或几乎无引湿性：引湿增重小于0.2％。
本公开所述(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-基)-5,6-二氢咪唑并
[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺的晶型II在10％RH-80％RH条件下，引湿增重0.92％，小于2％，略有引湿性。
本公开所述的“X-射线粉末衍射图谱”为使用Cu-Kα辐射测量得到。
本公开所述晶型的制备方法中还包括过滤或干燥的步骤。
本公开所述的“X-射线粉末衍射图谱或XRPD”是指根据布拉格公式2d sinθ＝nλ(式中，λ为X射线的波长，
Figure BDA0002377744590000031
衍射的级数n为任何正整数，一般取一级衍射峰，n＝1)，当X射线以掠角θ(入射角的余角，又称为布拉格角)入射到晶体或部分晶体样品的某一具有d点阵平面间距的原子面上时，就能满足布拉格方程，从而测得了这组X射线粉末衍射图。
本公开所述的“2θ或2θ角度”是指衍射角，θ为布拉格角，单位为°或度；每个特征峰2θ的误差范围为±0.20，可以为-0.20、-0.19、-0.18、-0.17、-0.16、-0.15、-0.14、-0.13、-0.12、-0.11、-0.10、-0.09、-0.08、-0.07、-0.06、-0.05、-0.04、-0.03、-0.02、-0.01、0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20，优选±0.20。
本公开所述的“晶面间距或晶面间距(d值)”是指空间点阵选择3个不相平行的连结相邻两个点阵点的单位矢量a，b，c，它们将点阵划分成并置的平行六面体单位，称为晶面间距。空间点阵按照确定的平行六面体单位连线划分，获得一套直线网格，称为空间格子或晶格。点阵和晶格是分别用几何的点和线反映晶体结构的周期性，不同的晶面，其面间距(即相邻的两个平行晶面之间的距离)各不相同；单位为
Figure BDA0002377744590000041
或埃。
本公开所述的“差示扫描量热分析或DSC”是指在样品升温或恒温过程中，测量样品与参考物之间的温度差、热流差，以表征所有与热效应有关的物理变化和化学变化，得到样品的相变信息。
本公开所述干燥温度一般为20℃～100℃，优选25℃～70℃，可以为，可以常压干燥，也可以减压干燥(真空干燥)。优选的，干燥在减压下干燥。
本公开所用化学试剂、生物试剂可通过商业途径获得获得。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂，纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：A：二氯甲烷/甲醇体系，B：正己烷/乙酸乙酯体系，C：石油醚/乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。本公开中实验所用仪器的测试条件：
XRPD为X射线粉末衍射检测：测定使用BRUKER D8型X射线衍射仪进行，具体采集信息：Cu阳极(40kV，40mA)，Cu-Kα1射线
Figure BDA0002377744590000042
Kα2射线
Figure BDA0002377744590000043
Kβ射线
Figure BDA0002377744590000044
扫描范围(2q范围)：3～64°、扫描步长0.02、狭缝宽度(准直器)1.0mm。采用分步扫描法，扫描步数为3步，每步扫描范围19°，起始度数5°，终止度数48°，每步时长75s。
DSC为差示扫描量热：测定采用METTLER TOLEDO DSC 3+示差扫描量热仪，升温速率10℃/min，温度具体范围参照相应图谱(为25-300或25-350℃)，氮气吹扫速度50mL/min。
TGA为热重分析：检测采用METTLER TOLEDO TGA 2型热重分析仪，升温速率10℃/min，温度具体范围参照相应图谱(为25-300℃)，氮气吹扫速度20mL/min。
DVS为动态水分吸附：检测采用SMS DVS Advantage，在25℃，湿度变化为50％-95％-0％-95％-50％，步进为10％(最后一步为5％)(湿度具体范围以相应图谱为准，此处所列为大多使用方法)，判断标准为dm/dt不大于0.02％。
HPLC的测定使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(Sunfire C18 150×4.6mm色谱柱)和Waters 2695-2996高压液相色谱仪(Gimini C18 150×4.6mm色谱柱)。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)来确定的。NMR位移(δ)以10-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)；MS的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Thermo，型号：Finnigan LCQ advantage MAX)。
附图说明
图1：化合物的无定型的XRPD图谱。
图2：化合物的晶型I的XRPD谱图。
图3：化合物的晶型II的XRPD图谱。
图4：化合物的晶型II的DVS前后X-射线粉末衍射对比图。
具体实施方式
以下将结合实施例或实验例更详细地解释本公开，本公开中的实施例或实验例仅用于说明本公开的技术方案，并非限定本公开的实质和范围。
实施例1：(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺的制备(化合物A)
Figure BDA0002377744590000051
第一步：(S)-5–(((1-羟丙基-2-基)(4-甲氧基苄基)氨基)甲基)-1H-咪唑-4-羧酸甲酯1c
将(S)-2-((4-甲氧基苄基)氨基)丙-1-醇1a(34.92g，179.08mmol，采用公知的方法“Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2015,25(5),1086-1091”制备而得)溶解于600mL四氢呋喃中，再加入5-醛基咪唑-4-甲酸甲酯1b(23g，149.23mmol，采用公知的专利方法“US2008/318935”制备而得)，分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(47.44g，223.85mmol)，搅拌反应12小时。反应液过滤，滤液减压浓缩，所得残余物中加入600mL乙酸乙酯，用水洗涤(200mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得粗品标题化合物1c(40g)，产物不经纯化，直接用于下一步反应。MS m/z(ESI):334.2[M+1]。
第二步：(S)-7-(4-甲氧基苄基)-6-甲基-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-羧酸甲酯1d
将粗品化合物1c(11g，33.03mmol)和三苯基膦(12.98g，49.49mmol)(国药试剂)溶解于400mL四氢呋喃中，冰浴下缓慢滴加入偶氮二甲酸二异丙酯(10g，49.45mmol)(上海韶远试剂有限公司)，缓慢升至室温，搅拌反应12小时。反应液减压浓缩，所得残余物中加入400mL乙酸乙酯，用水洗涤(100mL×2)，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系A纯化，得标题化合物1d(4.5g，产率：43.2％)。
MS m/z(ESI):315.9[M+1]。
第三步：(S)-6-甲基-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-羧酸甲酯三氟乙酸盐1e
将化合物1d(0.6g，2.33mmol)溶解于2mL三氟乙酸中，微波加热至100℃，反应5分钟。反应液冷却至室温，减压浓缩，得粗品标题化合物1e(0.6g)，产物不经纯化，直接用于下一步反应。MS m/z(ESI):196.1[M+1]。
第四步：(S)-7-甲基((3-氰基-4-氟苯基)氨基甲酰基)-6-甲基-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-羧酸甲酯1g
将粗品化合物1e(9.2g，47.13mmol)溶解于50mL四氢呋喃中，加入化合物1f(6.5g，47.13mmol，采用公知的方法“Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2006,16(19),5176-5182”制备而得)和三乙胺(5.82g，56.55mmol)，于0℃，加入双(三氯甲基)碳酸酯(4.9g，16.49mmol)，缓慢升至室温搅拌反应12小时。反应液过滤，减压浓缩，得标题化合物1g(16.84g，产率：100％)。MS m/z(ESI):358.1[M+1]。
第五步：(S)-7-甲基((3-氰基-4-氟苯基)氨基甲酰基)-6-甲基-5,6,7,8-四氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1-甲酸1h
将粗品化合物1g(16.84g，47.13mmol)溶解于50mL甲醇中。氢氧化钠(12g，282.76mmol)溶解于60mL水，于0℃，滴加至上述溶液中。缓慢升至室温搅拌反应4小时。反应液减压浓缩，用二氯甲烷洗，二氯甲烷层丢弃，水相用6NHCl调节PH至1-2，水相浓缩干，得标题化合物1h(16.18g，产率：100％)。MS m/z(ESI):344.1[M+1]。
第六步：(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺A
将粗品化合物1h(13g，37.87mmol)，(2R)-1,1,1-三氟丙基-2-胺盐酸盐1i(7.4g，49.23mmol，采用专利申请“CN102875270A”公开的方法制备而得)和三乙胺(11.6g，113.6mmol)，溶解于200mL N,N-二甲基甲酰胺中。冷却到0℃，加入O-(7-氮杂苯并三氮唑基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(29g，75.73mmol)。缓慢升至室温搅拌反应12小时。反应液加入300mL乙酸乙酯，用100mL水洗3次。有机相浓缩干，送制备得标题化合物A(1.8g，产率：10.8％)。经X-射线粉末衍射检测为无定型，谱图如图1。
MS m/z(ESI):439.0[M+1]。
1H NMR(400MHz，CD3OD)：7.87-7.85(m，1H)，7.73-7.70(m，1H)，7.69-7.27(m，1H)，5.30-5.26(d，1H)，4.83-4.82(m，1H)，4.85-4.72(m，2H)，4.23-4.21(m，2H)，3.35(s，2H)，1.43(d，3H)，1.20(d，3H)。
测试例1：体外抗HBV活性测试(细胞内HBV DNA定量分析)
一、实验材料及仪器
1.QIAamp 96DNAQIAcube HT Kit(Qiagen)
2.QIAcube HT plasticware(Qiagen)
3.乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(泰普生物)
4.DNA提取设备(QIAcube)(Qiagen)
5.QuantStudio 6Fiex(ABI,ThermFisher)
6.酶标仪(BMG)
7.HepG2.2.15细胞(上海瑞鹿生物技术有限公司)
二、实验步骤
HepG2.2.15细胞是整合了HBV基因组的稳定表达细胞株，可通过复制、转录、翻译、并包装成带有HBV DNA的病毒颗粒分泌到细胞外。本研究采用定量PCR的方法对HepG2.2.15体外增殖产生的HBV DNA进行定量分析，测定本公开中化合物通过对HBV衣壳蛋白装配抑制进而抑制HBV DNA复制的活性。
HepG2.2.15细胞在DMEM/高葡萄糖培养基(10％FBS,400μg/ml G418)中培养，每3天传代一次。实验当天以新鲜细胞培养基制取细胞悬液，以40,000细胞/孔96孔板(Corning,#3599)，5％二氧化碳，于37℃培养。第二天先将化合物溶解在纯DMSO中浓度为20mM，再用DMSO配制成首个浓度2mM，并以4倍依次稀释成8个浓度，设置对照的孔加入90μlDMSO。用含DMEM/高葡萄糖培养基稀释200倍。取出第一天接种的细胞培养板，用负压吸取装置吸出孔板内的培养基，再将配制好的含有各浓度的化合物培养基分别加入各孔中，以200μl/孔，于37℃培养72小时。第五天，用含有同样化合物的新鲜培养基对该培养细胞进行换液，方法等同第二天，再于37℃培养72小时。第八天，取出细胞培养板，以300g离心3分钟，收集培养上清液200μl/孔。采用Qiagen自动DNA提取设备进行细胞培养上清液内HBV DNA提取，具体方法参考试剂和仪器使用说明。最后以100μl/孔，用DNA洗脱缓冲液洗脱提取的DNA。采用泰普生物的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒对提取的DNA进行HBV DNA定量PCR分析，具体方法参考试剂盒说明。定量标准曲线采用试剂盒自带标准样品，平行进行实验。根据标准曲线对各个样品进行定量换算。最后用Graphpad Prism软件根据化合物各浓度与相应的DNA值计算化合物的EC50值。Emax为化合物最大限度抑制HBV DNA复制的效应值。
本公开中化合物A通过对HBV衣壳蛋白装配抑制进而抑制HBV DNA复制体外活性通过以上的试验进行测定，测得的EC50＝18nM，Emax＝100％，表明对HBV DNA复制具有明显的抑制作用。
测试例2：对HepG2细胞体外增殖的影响
一、实验材料及仪器
1.HepG2细胞(ATCC)
2.CellTiter-GloTM细胞增殖试剂盒(Promega)
3.自动移液工作站(Bravo)：Agilent Technologies公司
4.酶标仪(VICTOR 3)：PerkinElmer公司
5.CO2培养箱(Fisher Scientific)
6.离心机(Fisher Scientific)
二、实验步骤
取对数生长期的HepG2细胞，用胰蛋白酶消化制备细胞悬液，以6,000细胞/孔96孔板(底透白色96孔板，PerkinElmer)，5％二氧化碳，于37℃培养16-20小时。第二天，化合物溶解在纯DMSO中浓度为20mM，利用自动移液工作站(Bravo)对化合物进行梯度稀释，3倍稀释，每个化合物设8个浓度点，对照的孔为DMSO；接着用EMEM(含10％FBS)培养基对DMSO配制的各浓度点化合物进行200倍稀释。取出第一天接种的细胞培养板，用负压吸取装置吸出孔板内的培养基，再将配制好的含有各浓度的化合物培养基分别加入各孔中，以100μl/孔，于37℃培养72小时。第五天，取出96孔细胞培养板，向各孔中加入新鲜配制的CellTiter Glo，以100μl/孔，放置5-10分钟，用白色封底膜(PerkinElmer)将该96孔板底部封膜，置于酶标仪中，用酶标仪测定Luminescence信号。用Graphpad Prism软件根据化合物各浓度与相应的增殖抑制信号值计算化合物的CC50值，CC50>100μM，表明对HepG2细胞体外增殖抑制没有影响或影响较小，表现出高的安全性。
实施例2：晶型I
将化合物A(20mg，0.046mmol)加入到1mL乙酸异丙酯和正己烷(V:V＝1:5)混合溶剂中，加热搅拌溶清，缓慢降至室温，搅拌析晶，过滤，干燥得产物(10mg，产率：46％)。经XRPD检测为晶型I。
实施例3：晶型I
将化合物A(50mg，0.11mmol)加入到1mL乙酸异丙酯和正己烷(V:V＝1:3)混合溶剂中，加热搅拌溶清，缓慢降至室温，加入晶型I晶中(来自实施例2)，搅拌析晶，过滤，干燥得到产物25mg，产率：50％，该结晶样品的XRPD图谱见图2，熔点在115.29℃附近，其特征峰位置如下表1所示：
表1
Figure BDA0002377744590000081
实施例3：晶型I
将化合物A(20mg，0.046mmol)加入到1mL乙酸异丙酯和正己烷(V:V＝1:5)混合溶剂中，加热搅拌溶清，缓慢降至室温，搅拌析晶，过滤，干燥得产物(10mg，产率：46％)。经XRPD检测为晶型I。
实施例4：晶型II
将化合物A(1g，2.3mmol)加入到10mL乙酸异丙酯和正己烷(V:V＝1:2)混合溶剂中，加热搅拌溶清，，缓慢降至室温，搅拌析晶，过滤，干燥得产物250mg，产率：25％，该结晶样品的XRPD图谱见图3，熔点在143.67℃附近，其特征峰位置如下表2所示：
表2
Figure BDA0002377744590000091
引湿性研究
采用Surface Measurement Systems advantage，在P/P0 50开始迅速吸湿；根据相对质量变化曲线，在10％RH-80％RH之间，随着湿度增加，质量增加约为0.92％，小于2％，根据《中华人民共和国药典》2015年版药物引湿性试验指导原则，该样品略有引湿性；在正常储存条件(即25℃湿度60％)，吸水约为0.673％；在加速试验条件(即湿度70％)，吸水约为0.832％；在极端条件(即湿度90％)，吸水约为1.305％
在0％-95％的湿度变化过程中，该样品的解吸附过程与吸附过程不重合。DVS检测前后晶型未转变，见图4(a为DVS检测后XRPD图谱，b为DVS检测前XRPD图谱)。
实施例5：晶型II
将化合物A(1g，2.3mmol)加入到20mL乙酸异丙酯和正庚烷(V:V＝1:2.5)混合溶剂中，加热溶解，缓慢冷却至50℃，加入晶种(来自实施例4)，再冷却至室温搅拌析晶，过滤，干燥得产物835mg，产率：83.5％。经XRPD检测为晶型II。
实施例6：晶型II
将化合物A的II晶型(20mg，0.046mmol，来自实施例4)加入到0.5mL甲苯中，室温打浆搅拌72小时，过滤，干燥得产物10mg，产率：50％)。经XRPD检测为晶型II。
实施例7：晶型II
将化合物A(300mg)加入到0.75mL乙酸异丙酯溶剂中，搅拌溶解，加入11.25ml正庚烷，加热搅拌，冷却过滤，洗涤，干燥得样品。经XRPD检测为晶型II。
实施例8：晶型II
将化合物A(20mg)加入到0.5mL石油醚和0.5mL甲基叔丁基醚溶剂中，加热搅拌，冷却过滤，干燥得样品。经XRPD检测为晶型II。
实施例9：晶型II
将化合物A(20mg)加入到0.06mL甲基叔丁基醚和0.12mL正庚烷溶剂中，加热搅拌，冷却过滤，干燥得样品。经XRPD检测为晶型II。
实施例10：晶型II
将化合物A(20mg)加入到0.04mL乙酸异丙酯和0.14mL正庚烷溶剂中，加热搅拌，冷却过滤，干燥得样品。经XRPD检测为晶型II。
实施例11：晶型II
将化合物A(20mg)加入到0.04mL乙酸乙酯和0.4mL正庚烷溶剂中，加热搅拌，冷却过滤，干燥得样品。经XRPD检测为晶型II。
实施例12：晶型II
将化合物A(20mg)加入到0.04mL甲基叔丁基醚和0.26mL正庚烷溶剂中，加热搅拌，冷却过滤，干燥得样品。经XRPD检测为晶型II。
实施例13：
实验例1：影响因素考察
将晶型II(实施例4)敞口平摊放置，考察在光照(4500Lux)、高温(40℃、60℃)、高湿(RH75％、RH 90％)条件下稳定性，取样，考察期为30天。
表3
Figure BDA0002377744590000111
注：NA为未检测
表4
Figure BDA0002377744590000112
Figure BDA0002377744590000121
注：NA为未检测
响因素实验表明：在光照、高温40℃和60℃、高湿75％和90％条件下，晶型II和无定型的物理、化学稳定性好。
实验例2：长期/加速稳定性
将晶型II(实施例4)和无定型分别放置25℃，60％RH和40℃，75％RH条件考察其稳定性
表5
Figure BDA0002377744590000122
长期加速稳定性实验结果显示：无定型样品在长期(25℃、60％RH)、加速(40℃、75％RH)稳定性条件下纯度有下降明显；晶型II于25℃、60％RH和40℃、75％RH条件下放置展现优异的化学、物理稳定性。

Claims (15)

1.化合物(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺的晶型I，其特征在于，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在9.377、11.039、13.322、20.260、20.800、21.740和25.721处有特征峰。
2.根据权利要求1所述的晶型I，其特征在于，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在9.377、11.039、12.542、13.322、16.761、17.440、20.260、20.800、21.740和25.721处有特征峰。
3.根据权利要求1或2所述的晶型I，其特征在于，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在7.759、9.377、11.039、11.781、12.542、13.322、15.779、16.761、17.440、20.260、20.800、21.740和25.721处有特征峰。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的晶型I，其特征在于，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱如图2所示。
5.制备权利要求1-4任意一项所述的晶型I的方法，包括：
(a)将化合物(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺加入溶剂(I)中，搅拌溶解或加热溶解，所述溶剂(I)优选自乙酸异丙酯与正己烷、环己烷或正庚烷的混合溶剂，
(b)任选加入晶型I晶种，
(c)搅拌析晶。
6.化合物(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺的晶型II，其特征在于：以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在10.220、11.900、14.220、15.700、16.600、17.100和22.140处有特征峰。
7.根据权利要求6所述的晶型II，其特征在于，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在10.220、11.900、14.220、14.979、15.700、16.600、17.100、18.419、19.360和22.140处有特征峰。
8.根据权利要求6或7所述的晶型II，其特征在于，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱，在10.220、11.900、14.220、14.979、15.700、16.600、17.100、18.419、19.360、20.679、22.140和24.960处有特征峰。
9.根据权利要求1-3任意一项所述的晶型II，其特征在于，以衍射角2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱如图3所示。
10.根据权利要求6～9任意一项所述的晶型II，其特征在于，其在20.0％RH-80％RH条件下，略有引湿性。
11.制备权利要求6所述的晶型II的方法，包括：
(a)将化合物(S)-N7-(3-氰基-4-氟苯基)-6-甲基-N1-((R)-1,1,1-三氟丙-2-基)-5,6-二氢咪唑并[1,5-a]吡嗪-1,7(8H)-二甲酰胺加入溶剂(II)中，搅拌溶解或加热溶解，所述溶剂(II)优选自甲基异丁基酮、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、甲基叔丁基醚、醋酸异丙酯、正庚烷、石油醚或环己烷中的至少一种，
(b)任选加入晶型II晶种，
(c)搅拌析晶。
12.根据权利要求1-4或6任一项所述的晶型，其特征在于，所述2θ角误差范围为±0.20。
13.一种药物组合物，含有权利要求1-4或6任一项所述的的晶型和任选自药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
14.一种药物组合物，由权利要求1-4或6任一项所述的晶型和任选自药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂制备。
15.权利要求1-4或6任一项所述的晶型，权利要求13或14所述的组合物在制备用于预防和/或治疗病毒性感染疾病的药物中的用途，所述病毒优选乙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒和艾滋病毒。
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