CN111481532A - 化合物28d在制备提高γ-珠蛋白表达量的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，公开了化合物28d在制备提高γ‑珠蛋白表达量的药物中的应用，以及在制备治疗β‑地中海贫血或镰刀型细胞贫血的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及化合物28d（1，2-｛N1-【2（2-氯苯基）硫苯甲基】，N1-亚甲基｝联氨）的新用途，特别是涉及化合物28d在制备提高γ-珠蛋白表达量的药物中的应用，以及在制备治疗β-地中海贫血或镰刀型细胞贫血的药物中的应用。
背景技术
人类胚胎、胎儿和成人的血红蛋白在红细胞的发育和个体发生的过程中是时序表达的。人体内不同的珠蛋白主要由两个基因簇负责表达——16号染色体上的α基因簇（包含了胚胎的ζ基因和成人α1和α2基因）和11号染色体上的b基因簇（包含了胎儿Gγ和Aγ、成人ε和β基因）。胚胎期的血红蛋白（ζ2ε2）在妊娠早期转换为胎儿期血红蛋白（HbFα2γ2），在出生前后逐渐被成人血红蛋白(HbAα2β2)所替代。出生两年之后，胎儿期血红蛋白（HbF）在总血红蛋白中的含量已经降低为一个很小的组分。成人体内胎儿期血红蛋白（HbF）的表达也维持在较低的水平（大约在0.1%到1%之间）。
β-地中海贫血症和镰刀型细胞贫血是由于11号染色体上HBB基因的突变导致的，该基因也同样以常染色体隐性的方式遗传。传统的治疗地中海贫血症的治疗手段有输血、铁螯合物治疗、脾脏切除和骨髓移植等。但这些治疗手段只能相对缓和疾病，研究表明，药物诱导并重新激活成人体内已关闭了的γ-珠蛋白的表达能显著减轻或治疗上述贫血病人的临床症状。β-地中海贫血的主要发病原因在于α-珠蛋白亚基的过量与β-珠蛋白表达的不足所引起的两类终产物的不平衡，重新激活γ-珠蛋白的表达所形成α2γ2血红蛋白四聚体能够弥补这种不平衡，进而达到缓解病情的效果。而镰刀型细胞贫血发病的主要因素是脱氧产生的镰刀型血红蛋白多聚体所引起的血管阻塞，重新激活γ-珠蛋白的表达可以缓解镰刀型血红蛋白分子的聚化，从而达到治疗效果。高表达的胎儿期血红蛋白（HbF）对于临床上严重的镰刀型贫血症和β-地中海贫血症具有很好的缓解作用。近些年一些表观遗传学机制如DNA甲基化和组蛋白修饰被证实能够对珠蛋白进行辅助调控。5-氮杂胞苷（5-azacytidine）能够去甲基化沉默的γ-珠蛋白基因启动子上的CpG残基，具有提高地中海贫血症病人和镰刀型贫血症病人体内胎儿期血红蛋白的能力。去甲基化药物，包括去甲苯胺（decitabine），是成年人胎儿血红蛋白生成的有力激活剂。也有一些报导显示中药提取物如黄芪多糖对K562细胞中γ-珠蛋白基因的表达具有诱导作用。但目前hydroxyurea (HU)是唯一被批准能够用于该治疗途径的药物。因此，寻找新的能够诱导γ-珠蛋白基因表达的化合物迫在眉睫。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的是提供了一种效果较好的新型γ-珠蛋白诱导剂，提出了28d（DCPR049_12）在制备提高γ-珠蛋白表达量的药物中的应用，以及在制备治疗β-地中海贫血或镰刀型细胞贫血的药物中的应用。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
化合物28d在制备提高γ-珠蛋白表达量的药物中的应用。
化合物28d在制备治疗β-地中海贫血或镰刀型细胞贫血药物中的应用。
上述的应用，其所述的药物是以化合物28d为有效成分制备的药物。化合物28d的化学结构图如下所示：
所述的药物中还含有药学上可接受的载体。所述药物的剂型为药物治疗学上可接受的任一一种剂型。
所述的药物可单独给药或者联合治疗，所述的联合治疗包括与放疗，化疗，手术治疗，其它提高γ-珠蛋白表达量的药物，以及任何贫血或者肿瘤治疗药物和方法的联合应用。
本发明的有益效果：
人白血病红系细胞系K562细胞和胎儿脐带血中分离并永生化的CD34+细胞（HUDEP-2）具有极低的γ-珠蛋白表达，因此成为模拟β-地中海贫血的细胞工具。化合物28d具有抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶酶活的特性，发明人运用现代分子生物学方法和实验手段，发现28d能特异地提高K562细胞和HUDEP-2细胞内γ-珠蛋白的表达水平。本发明首次阐明28d这种化合物在人血红蛋白合成中的作用并为β-地中海贫血病或镰刀型细胞贫血的治疗提供了候选药物。28d无色无味、用量少（微摩尔级）、易溶解、作用浓度低，具有广阔的医学应用前景。
附图说明
图1化合物28d增加K562细胞中γ-珠蛋白表达(*P<0.01)。
A: 与对照(DMSO)相比，实时PCR分析发现经28d处理的K562细胞中γ-珠蛋白的基因转录表达水平增加8-10倍。B: 蛋白印记实验显示28d处理的K562细胞中γ-珠蛋白的蛋白水平显著增加。
图2化合物28d增加HUDEP-2细胞中γ-珠蛋白表达(*P<0.01)。
A: 与对照(DMSO)相比，实时PCR分析发现经28d处理的HUDEP-2细胞中γ-珠蛋白的基因转录表达水平增加0.5倍。B:流式细胞实验发现28d处理HUDEP-2细胞γ-珠蛋白水平增加一倍且细胞未发生分化。
具体实施方式
下面结合附图及实例对本发明进行详细说明。参照附图，化合物28d作为制备提高γ-珠蛋白表达量的药物中的应用；以及作为制备治疗β-地中海贫血或镰刀型细胞贫血的药物中的应用。
实施例1化合物28d增加K562细胞中γ-珠蛋白表达
实验方法
1）细胞培养
人红系K562细胞在RPMI1640培养基中37℃培养，10%(V/V)小牛血清，105U/L 青霉素，100mg/L 链霉素，5%CO2。K562细胞用终浓度5 μM的28d处理，对照组实验加入DMSO(体积比<0.01%)处理，48小时后收集细胞。
HUDEP-2细胞在含有10μM地塞米松、1μg/ml Dox、50 ng/ml SCF、3U/ml EPO、2%(V/V)双抗、1%(V/V) L-谷氨酰胺的SFEM培养基中37℃培养，加入5 μM 28d处理，对照组实验加入DMSO(体积比<0.01%)处理，48小时后收集细胞。
）RNA提取、实时 PCR分析
适量细胞加入1ml Trizol试剂（美国Invitrogen公司），充分破碎裂解细胞后，加入200μl氯仿，12000g离心10 分钟。取上清加入等体积的异丙醇，室温静置15分钟，12000 g离心10 分钟，沉淀用75% 酒精洗涤，干燥，20μl 无RNA酶的水溶解。1μg RNA 进行cDNA逆转录反应，按说明书操作（SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR，美国Invitrogen公司）。取1μl cDNA分别进行胎儿珠蛋白和GAPDH水平测定。实时PCR 反应条件：95℃ 5分钟，95℃ 30 秒，60℃ 30秒，72℃ 1 分钟，40个循环。胎儿珠蛋白：上游引物AATGTGGAAGATGCTGGAGGAGAA，下游引物 CTTCTTGCCATGTGCCTTGACTT，GAPDH：上游引物GAAGGTGAAGGTCGGAGTC, 下游引物GAAGATGGTGATGGGATTTC。
）蛋白印记实验
将K562细胞加药（28d）处理48小时后离心收集（1000rpm，5分钟），PBS洗涤一次，用RIPA裂解液提取蛋白（lysis buffer，含50 mM Tris-HCl，pH 8.0；50 mM KCl，5 mM DTT，1 mMEDTA，0.1%（W/V，g/100ml） SDS，0.5% (V/V)Triton X-100 和蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min后离心后取上清，用BSA法定量后进行蛋白上样（30μg/孔），SDS-PAGE电泳分离，PVDF转膜，后孵一抗过夜孵育，用PBST洗三遍，继续孵二抗，1小时后继续用PBST洗3遍，使膜与ECL显色液进行孵育1 min后沥干并放入塑料薄膜内，利用Chemi-doc imaging system（Bio-Rad）进行曝光。
结果见图1。
28d能够提高人K562细胞中γ-珠蛋白的表达：与对照相比，分析发现经28d处理（在0.2 μM到12.8 μM之间）的K562细胞中γ-珠蛋白的基因转录表达水平平均增加8-10倍；在高于3.2μM的28d处理时，p<0.05, 仍然表明γ-珠蛋白基因表达显著升高（图1A）。蛋白印记实验显示28d处理的K562细胞γ-珠蛋白显著增加（图1B）。
实施例2 化合物28d增加HUDEP-2细胞中γ-珠蛋白表达
实验方法：
1）细胞培养：同实施例1。
2）RNA提取、实时 PCR分析：同实施例1。
3）蛋白印记实验：同实施例1。
4）流式细胞分析
将HUDEP-2细胞加药（28d， 5μM）处理48小时后(2.5×107) 离心收集，经PBS充分洗涤后用终浓度为0.05%(V/V)的戊二醛进行固定。接着用含有0.1%（W/V，g/100ml）BSA的PBS洗3次并用终浓度为0.1% (V/V)的Triton X-100进行通透，将通透完的细胞用PBS洗3次并与胎儿血红蛋白的抗体孵育20分钟，最后进行流式细胞仪的测定。
结果见图2。
28d能够提高HUDEP-2细胞中γ-珠蛋白的表达：与对照相比，分析发现经28d处理的HUDEP-2细胞中γ-珠蛋白的转录表达增加0.5倍(图2A)。流式细胞实验显示经28d处理HUDEP-2细胞中γ-珠蛋白水平升高一倍左右；且红系祖细胞特异性标志 CD71在28d处理的HUDEP-2细胞中未显著升高，表明细胞未发生分化（图2B）。
Claims (6)
1.化合物28d在制备提高γ-珠蛋白表达量的药物中的应用。
2.化合物28d在制备治疗β-地中海贫血或镰刀型细胞贫血药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的药物是以化合物28d为主要有效成分制备的药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物中还含有药学上可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为药物治疗学上可接受的任一一种剂型。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物单独给药或者联合治疗，所述的联合治疗包括与其它提高γ-珠蛋白表达量的药物，以及贫血或者肿瘤治疗药物和方法的联合应用。
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