CN111454995B - 一种促进生物质材料产醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进生物质材料产醇的方法，所述方法包括：(1)收集生物质材料，生物质材料预处理，得到预处理后的生物质材料；(2)将预处理后的生物质材料水洗至中性，进行酶解，同时添加籽粒苋蛋白(AP)，得到添加AP的酶解液；(3)将添加AP的酶解液直接用于乙醇发酵，添加酵母，进行发酵产醇。所述方法可显著提高酶解效率和糖醇转化率，增加乙醇产量。

Description

一种促进生物质材料产醇的方法
技术领域
本发明涉及生产纤维素乙醇的技术领域，特别是涉及一种促进生 物质材料产醇的方法。
背景技术
木质纤维素作为生物能源利用是一项系统工程，为了提高转化效 率、降低成本，在其发酵产醇的各个技术层面上均需突破，包括充分 提高木质纤维素酶解效率、降低发酵抑制物以增加糖醇转化效率、降 低预处理成本和减少预处理中的二次污染。酶解过程中投加添加剂 (如表面活性剂等)是提高酶解效率和糖醇转化效率的有效途径之一， 这方面已取得一定进展，但在投加的添加剂选择上仍存在以下问题： 1、酶解效率提高不明显；2、不能有效降低发酵抑制物；3、成本高。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种 微弱预处理条件下就能够显著提高生物质材料酶解效率、降低发酵成 本的方法，具体为一种利用籽粒苋蛋白促进生物质材料产醇的方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种促进生物质材料产醇的方法，在生物质材料酶解 过程中添加籽粒苋蛋白。籽粒苋蛋白的添加量优选8wt％(基于生物 质材料的质量)。
作为本发明的进一步改进，所述方法包括以下步骤：
(1)收集生物质材料，生物质材料预处理，得到预处理后的生 物质材料；
(2)将预处理后的生物质材料水洗至中性，进行酶解，同时添 加籽粒苋蛋白；
(3)将添加了籽粒苋蛋白的酶解后的糖液直接用于乙醇发酵， 添加酵母，进行发酵产醇。
作为本发明的进一步改进，所述籽粒苋蛋白通过酶解缓冲液或者 ddH2O提取法得到。
作为本发明的进一步改进，所述籽粒苋蛋白的提取具体过程包括： 取生长期籽粒苋新鲜叶片组织，液氮磨样，加入缓冲液，缓冲液为配 制好浓度为0.2M的NaAC后加醋酸调pH为4.8左右的溶液，或直 接加入ddH2O研磨至匀浆，4℃40000rpm离心10min，上清为提取的总蛋白，Brandford法测定上清液中蛋白质浓度，-20℃保存或烘 干成干粉后室温保存，待用；。
作为本发明的进一步改进，步骤(1)中生物质材料包括C4植物 (籽粒苋、玉米、芒草)；C3植物(水稻、小麦、油菜等)；木本植 物(杨树、桉树等)。生物质材料预处理包括热水预处理、气爆预处 理、CaO预处理或者碱预处理。
作为本发明的进一步改进，生物质材料预处理中热水预处理的过 程为：
①称取生物质材料粉末于聚四氟乙烯罐中，加入dH2O，然后将聚 四氟乙烯罐放入不锈钢反应釜中，最后放入油浴锅中加热，当导热油 的温度达到设置温度后处理8-10min；
②处理完成后将样品冷却，然后加入适量dH2O将样品转移至离 心管，将样品离心。
③将剩余上清液去掉，加入蒸馏水洗涤，离心，倒掉上清，重复 洗涤残渣，最后检查pH，确保洗至中性；残渣最后用醋酸缓冲液洗 涤，待酶解反应。
作为本发明的进一步改进，生物质材料预处理中CaO预处理的过 程为：
①称取生物质粉末于离心管中，加入一定质量的CaO粉末(CaO/ 样品＝10％，w/w)和水，处理1-3h，优选处理2h；
②处理完成后加入HCl溶液，摇匀，在30-70℃，100-200r/min 的条件下进行中和反应1-3h，优选在50℃，150r/min中和反应2h， 离心，倒掉上清；
④加入蒸馏水洗涤，离心3-7min，优选离心5min，倒掉上清。 重复洗涤残渣6次，最后检查pH，确保洗至中性；残渣最后用醋酸 缓冲液洗洗涤，优选用0.2mol/L pH 4.8的醋酸缓冲液洗1次，待 酶解反应。
作为本发明的进一步改进，生物质材料预处理中蒸气爆破预处理 (气爆预处理)过程为：
①将烘干生物质的材料截成5～8cm的小段，喷施蒸馏水使材料 湿度达到50％(即材料的湿重等于两倍的干重)；
②将截短喷湿后的生物质材料装到容量为5L的气爆反应器中， 225℃、2.5MPa处理3-20min；
③收集处理后的残渣，风干，用小型粉样机将其粉碎，40目过 筛，50℃烘干至恒重，即获得气爆后的实验材料，待酶解反应。
作为本发明的进一步改进，生物质材料预处理中碱预处理过程为：
①称取生物质粉末置于离心管中，加入6mL 1-5％(w/v)的碱溶 液，50℃，150r/min，处理2h。②离心，去掉上清，沉淀加入蒸馏 水洗涤，离心5min，去上清。重复6次，确保洗涤液至中性；上述 残渣最后用0.2mol/L pH为4.8的醋酸缓冲液洗1次；待酶解反应。
作为本发明的进一步改进，步骤(2)中酶解过程中底物生物质 材料和酶解液的固液体为1:20，比如1g生物质材料中添加20ml酶 解反应液。
作为本发明的进一步改进，步骤(2)中的每1L反应体系中添加 1.6g的纤维素复合酶。
作为本发明的进一步改进，所述纤维素复合酶通过商业途径购买 得到。
作为本发明的进一步改进，步骤(2)中籽粒苋蛋白的添加量为 6wt％-10wt％。
作为本发明的进一步改进，步骤(2)中籽粒苋蛋白的添加量为 8wt％。
作为本发明的进一步改进，步骤(3)发酵体系中酵母的加入终 浓度为0.5g/L。
本发明公开了以下技术效果：
(1)籽粒苋具有生物量大，抗逆性强，蛋白质含量高等优点， 茎秆可以直接作为生物质原材料用于生物乙醇生产；蛋白质提取步骤 简单，成本低，在酶解过程中添加籽粒苋蛋白(AP)后，可以提高酶 解效率和糖醇转化率，含有AP的酶解液可直接用于乙醇发酵，使乙 醇产量升高。将籽粒苋蛋白用于能源作物生物质酶解过程，酶解过程 中添加8％(mg/g)的AP可使酶解效率最高增加105％，使发酵过程中 糖醇转化效率平均增加22％。每公顷籽粒苋作物提取的蛋白质可投用 于13万吨干物料的酶解过程，可增加7000吨以上乙醇产量。
(2)气爆预处理条件下，添加AP可使小麦、芒草、玉米等生物 质材料的酶解效率提高65％-89％；碱处理条件下，添加AP可使桉树 酶解效率提高105％。
(3)添加AP提高了发酵过程中的糖醇转化率，使乙醇产量升高 了50％以上，最多升高90％。
(4)平均每吨禾本科作物(如水稻、小麦、玉米等)秸秆添加 AP平均可以多产60kg乙醇。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面 将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描 述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来 讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图。
图1为籽粒苋介绍，其中A为盛花期籽粒苋植株，B为每公顷籽 粒苋生物量(鲜重，干重)和蛋白质含量，C为籽粒苋茎秆和叶片基 本组成成分；
图2为添加籽粒苋蛋白后酶解效率分析，其中A为酶解过程中籽 粒苋蛋白的最佳投放量分析：以籽粒苋生物质材料为底物，复合酶中 添加不同浓度的AP进行酶解反应，筛选最适AP添加量；B为不同物 种生物质材料添加籽粒苋蛋白后酶解效率分析；
图3为添加籽粒苋蛋白后发酵产醇分析，其中A为不同生物质材 料添加籽粒苋蛋白及不同预处理方式对发酵产醇效果的分析；B为添 加籽粒苋蛋白后的糖醇转化效率分析；C为每公顷作物生物质添加籽 粒苋蛋白后可提高的乙醇产量；D为每公顷籽粒苋中提取的蛋白可增 加的乙醇产量；
图4为籽粒苋蛋白提高酶解效率的机理分析，其中A为酶解液上清SDS分 析，B为酶解上清中纤维素酶CBHI western blot分析，C为酶解上清中半纤维 素酶XynATM western分析，D为酶解上清中CBHI相对量分析，E为酶解上清中 XynATM相对量分析，F为酶解上清中总蛋白含量分析，G为酶解后上清和残渣中 蛋白质SDS分析，H为籽粒苋蛋白与不同底物吸附效率分析，I为Rice(LHW) 和Com(SE)随酶解时间的变化Zata电位变化图，J为表面张力随浓度变化的 结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为 是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施 方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非 用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体 公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述 范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间 的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可 独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明 所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了 优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文 所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过 引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与 任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具 体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易 见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等， 均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明纤维素复合酶可通过商业途径购买得到，本发明实施例所 用的为购买得到的‘和氏璧’复合酶。
实施例1
(1)籽粒苋蛋白的提取
取生长期籽粒苋新鲜叶片组织，液氮磨样，加入0.2M NaAC (pH＝4.8)作为缓冲液研磨至匀浆，4℃40000rpm离心10min， Brandford法测定上清液中蛋白质浓度，上清液中的蛋白质浓度多于 10ug/ml的浓度时，-20℃保存待用。
(2)生物质材料的预处理
以籽粒苋作为生物质材料原料气爆预处理：①将烘干的材料截成 7cm的小段，喷施蒸馏水使材料湿度达到50％(即材料的湿重等于两 倍的干重)；②将截短喷湿后的材料装到容量为5L的气爆反应器中， 225℃、2.5MPa处理8min；③收集处理后的残渣，风干，用小型粉样 机将其粉碎，40目过筛，50℃烘干至恒重，即获得气爆后的生物质 材料，待酶解反应。
(3)籽粒苋蛋白的添加和生物质材料的酶解
称取0.3g气爆后的生物质材料，水洗至中性，再用10mL浓度 为0.2mol/L pH为4.8的醋酸缓冲液洗1次，接着加入3mL浓度为 3.2g/L的购买得到的‘和氏璧’复合酶，同时添加2ml由pH为4.8 的醋酸缓冲液提取的浓度为12ug/ml的籽粒苋蛋白，最后用pH 4.8 的醋酸缓冲液定容至6mL，使得酶的终浓度为1.6g/L。将离心管放入 摇床，150r/min，50℃酶解48h。酶解反应结束后将样品3000g离 心5min，取酶解上清液1mL，稀释10倍，测定己糖、戊糖含量。
(4)酶解糖液的发酵
酶解后的糖液中加入600ul浓度为5g/L的安琪耐高温酵母，摇 匀后30℃发酵48h，重铬酸钾法测定乙醇浓度。
实施例2
同实施例1，不同之处仅在于生物质材料预处理过程为10％CaO 处理，具体过程为：①材料烘干后经粉样机粉碎，过40目筛；②称 取生物质粉末0.300g于15mL离心管中，加入CaO粉末(CaO/生物质 粉末＝10％，w/w)和水，离心处理2h，每份样品3个重复；③处理完成后加入HCl溶液，摇匀，在50℃，150r/min中和反应2h，离心， 倒掉上清；④加入蒸馏水洗涤，离心5min，倒掉上清。重复洗涤残 渣6次，最后检查pH，确保洗至中性；残渣最后用醋酸缓冲液洗洗 涤，用10mL 0.2mol/L pH 4.8的醋酸缓冲液洗1次，待酶解反应。
实施例3
本实施例以水稻为生物质材料原材料，其余步骤同实施例1，不 同之处仅在于气爆时间为16min。
实施例4
本实施例以水稻为生物质材料原材料，其余步骤同实施例2。
实施例5
本实施例以小麦生物质材料为原料，其余步骤同实施例2，不同 之处仅在于生物质预处理过程采用热水预处理，具体过程为：①称取 生物质粉末0.300g于25mL聚四氟乙烯罐中，加入2.4mL dH2O，然后 将聚四氟乙烯罐放入不锈钢反应釜中，最后放入油浴锅中加热，当导 热油的温度达到设置温度200℃后处理3min；②处理完成后将样品冷 却，然后加入10ml dH2O将3000g样品转移至15mL离心管，将样品 离心5min；③将剩余上清液去掉，加入10mL蒸馏水洗涤，离心5min， 倒掉上清，重复洗涤残渣6次，最后检查pH，确保洗至中性；残渣 最后用10mL浓度为0.2mol/L pH为4.8的醋酸缓冲液洗涤1次，待 酶解反应。
实施例6
本实施例以油菜为生物质材料原料，生物质材料预处理过程同实 施例5，其余步骤同实施例1。
实施例7
本实施例以芒草为生物质材料原料，生物质材料预处理过程同实 施例5，其余步骤同实施例1。
实施例8
本实施例以玉米为生物质材料原料，生物质材料预处理过程同实 施例5，其余步骤同实施例1。
实施例9
本实施例以杨树为生物质材料原料，生物质材料预处理过程为碱 处理过程，具体为：①材料烘干后经粉样机粉碎，过40目筛，称取 杨树树枝粉末0.300g置于15mL离心管中；②加入6mL 4％(w/v)的 NaOH溶液，50℃，150r/min，处理2h。沉淀加入10mL蒸馏水洗涤， 离心5min，去上清。重复6次，确保洗涤液至中性；上述残渣最后 用10mL 0.2mol/L pH为4.8的醋酸缓冲液洗1次；待酶解反应，其 余步骤同实施例1。
实施例10
本实施例以桉树为生物质材料原料，生物质材料预处理过程同实 施例9，其余步骤同实施例1。
对比例1
同实施例1，不同之处仅在于酶解过程中未添加AP。
对比例2
同实施例2，不同之处仅在于酶解过程中未添加AP。
对比例3
同实施例3，不同之处仅在于酶解过程中未添加AP。
对比例4
同实施例4，不同之处仅在于酶解过程中未添加AP。
对比例5
同实施例5，不同之处仅在于酶解过程中未添加AP。
对比例6
同实施例6，不同之处仅在于酶解过程中未添加AP。
对比例7
同实施例7，不同之处仅在于酶解过程中未添加AP。
对比例8
同实施例8，不同之处仅在于酶解过程中未添加AP。
对比例9
同实施例9，不同之处仅在于酶解过程中未添加AP。
对比例10
同实施例10，不同之处仅在于酶解过程中未添加AP。
由上述内容可知，本发明选用的生物质材料包括C4植物籽粒苋 (籽粒苋介绍见图1)、玉米、芒草；C3植物水稻、小麦、油菜；木 本植物杨树、桉树。预处理方法包括热水预处理、CaO预处理、气爆 预处理、碱预处理(NaOH)。预处理后加入纤维素复合酶和籽粒苋蛋 白质酶解48h,再接种酵母，30℃发酵48h，重铬酸钾法测定乙醇浓 度。其中，生物质原料细胞壁的三大成分见表1。
表1
样品 纤维素(％干物重) 半纤维素(％干物重) 木质素(％干物重)
籽粒苋 26.99±0.70 13.79±0.12 11.29±0.37
水稻 28.30±2.79 21.34±0.36 14.99±0.13
小麦 30.44±0.70 28.42±0.37 24.48±0.37
油菜 31.86±1.78 23.99±0.78 18.37±1.13
芒草 35.18±1.17 22.89±0.37 20.48±0.36
玉米 30.81±1.35 23.72±1.88 19.54±0.57
杨树 32.30±1.34 21.08±1.03 26.81±1.32
桉树 30.21±1.09 20.20±0.88 31.03±1.32
分析实施例添加籽粒苋蛋白后的酶解效率、添加籽粒苋蛋白后发 酵产醇量以及籽粒苋蛋白提高酶解效率的机理，具体过程如下：
a、SDS PAGE
(1)SDS PAGE胶配制，详见表2。
表2
Figure BDA0002441992100000121
Figure BDA0002441992100000131
①按表2中所列顺序从上到下加试剂配制分离胶，加完TEMED后， 轻轻摇匀液体，一块胶加7mL溶液。然后，用1mL ddH2O封住分离胶 液面，37℃凝固15min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线， 倾倒水层，用滤纸条将残余的水吸干；②浓缩胶配好后混匀，灌胶 2mL，立即插梳子，插梳子时根据点样量和浓缩胶长短调整梳子插入 的深度，于37℃凝固15min；
(2)胶凝固好后，将胶放入电泳槽中，加入1×Tris-Gly电泳缓 冲液没过点样孔，取出梳子，胶外侧缓冲液界面应完全没过电极；
(3)点样后，先用50V电压电泳30min，待蛋白进入分离胶，70V 电压电泳3h；
(4)当溴酚蓝电泳至胶槽底部时，停止电泳，剥胶，切除浓缩胶， 将分离胶加入考马斯亮蓝染色液，40r/min，染色3h以上；
(5)将凝胶用蒸馏水冲洗1遍，倒入考马斯亮蓝脱色液，40r/min 脱色至背景透明，每60min更换一次脱色液。
b、Western blot
(1)SDS-PAGE电泳结束后，取出PAGE胶，切除多余的部分(溴 酚蓝条带和空白胶)，测量并记录胶的长和宽；
(2)转模：裁出6张比蛋白胶稍大一些的滤纸片和1张硝酸纤维 素膜(或PVDF膜)；将胶、膜、滤纸和海绵放在盛有转膜缓冲液的培 养皿中浸泡5min。在胶夹板的黑色板面上依次铺上海绵、3层滤纸、 硝酸纤维膜(或PVDF膜)、蛋白胶和3层滤纸。每次铺完3层滤纸后要赶气泡，尽量保证滤纸和硝酸纤维膜之间对齐；
(3)将胶板夹放入转移电泳槽(注意：膜朝正极放置，即黑色一 面朝正极)。倒入转膜缓冲液，一定要没过胶。75V，60mA，4℃冰箱 里电泳10h；
(4)关闭电源，用小镊子夹着膜的一角取出膜，放入用单蒸水洗 净的平皿中；加入15mL封闭液，膜刚好被没过即可，室温平缓摇动 1h；回收封闭液，用TTBS洗膜3次，每次3min；
(5)加入一抗溶液，室温平缓摇动1h；回收一抗溶液，用TTBS 洗膜3次，每次5min；加入二抗溶液，室温平缓摇动1h；回收二抗 溶液，用TTBS洗膜3次，每次5min，最后再用TBS洗膜5min；
(6)加入ECL显色液，室温平缓摇动3min，将膜用镊子取出，放 在一次性手套上晾干；扫描图片，写好标记，将膜放入自封袋中保存。
c、Zeta电位检测
Zeta电位的重要意义在于它的数值与胶态分散的稳定性相关。 Zeta电位是对颗粒之间相互排斥或吸引力的强度的度量，分子或分 散粒子越小，Zeta电位(正或负)越高，体系越稳定，即溶解或分 散可以抵抗聚集。反之，Zeta电位(正或负)越低，越倾向于凝结或聚集，即吸引力超过排斥力，分散被破坏而发生凝结或凝聚。通过 测定Zeta电位可以检测AP与底物结合情况。检测步骤：①称取预处 理后的水稻和玉米材料，加入AP后按酶解时间梯度取样，用Zeta电 位分析仪测定Zeta电位。
d、AP吸附实验
①平行配制5份一定AP浓度的溶液，计溶液中总蛋白质量w1； ②向溶液中分别加入预处理后的生物质材料、商业购买的木质素、半 纤维素和微晶纤维素，对照组为蛋白质溶液；③室温悬浮24h，3000 rpm离心后测定上清中蛋白质浓度，计算上清中蛋白质量w2；④底物 对蛋白质吸附效率(w1-w2)/w1，由此可计算不同底物对蛋白质的吸 附能力。
添加籽粒苋蛋白质后酶解效率分析结果见图2。添加籽粒苋蛋白 质后发酵产醇分析结果见图3。添加AP后的酶解上清中检测到更高 的蛋白质浓度，SDS PAGE结果显示出添加AP后的酶解上清中有更清 晰的蛋白质条带。Western blot结果显示了添加AP后的酶解上清中 含有更多的纤维素酶CBHI和半纤维素酶XynATM。AP与木质纤维底物 互作结果显示，底物对AP有较强的非特异性吸附作用，主要体现在 木质素的非特异性吸附；底物Zate电位进一步证明了AP与底物的非 特异性结合过程。表面张力测定结果显示AP具有表面活性剂性质， 结果见图4。
添加AP前后酶解效率分析结果如表3，由表3可知本发明用的 不同底物材料和不同预处理方法下，添加籽粒苋蛋白质都可以显著提 高木质纤维素的酶解产糖效率，最多可以提高105％。
表3
Figure BDA0002441992100000151
Figure BDA0002441992100000161
不同预处理后，添加籽粒苋蛋白显著提高了发酵过程中的糖醇转 化效率，进一步提高了乙醇产量，如表4。
表4
Figure BDA0002441992100000162
Figure BDA0002441992100000171
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本 发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普 通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本 发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种促进生物质材料产醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)收集生物质材料，生物质材料预处理，得到预处理后的生物质，所述生物质材料预处理包括热水预处理、气爆预处理、CaO预处理或者碱预处理；
(2)将预处理后的生物质材料水洗至中性，加入酶进行酶解，同时添加籽粒苋蛋白，籽粒苋蛋白的添加量为8wt％，得到添加了籽粒苋蛋白的酶解后的糖液；
(3)将添加了籽粒苋蛋白的酶解后的糖液直接用于乙醇发酵，添加酵母，进行发酵产醇。
2.根据权利要求1所述的促进生物质材料产醇的方法，其特征在于，所述籽粒苋蛋白通过酶解缓冲液或者ddH2O提取法得到。
3.根据权利要求1所述的促进生物质材料产醇的方法，其特征在于，步骤(2)中酶解过程中底物生物质材料和酶解液的固液体为1:20。
4.根据权利要求1所述的促进生物质材料产醇的方法，其特征在于，步骤(2)所述酶为纤维素复合酶，每1L反应体系中添加1.6g的纤维素复合酶。
5.根据权利要求1所述的促进生物质材料产醇的方法，其特征在于，步骤(3)中发酵体系中酵母的终浓度为0.5g/L。
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