CN111454293A - 一种具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的探针及其应用 - Google Patents
一种具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的探针及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分子探针的技术领域，公开了一种具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的探针及其应用。所述探针的结构为式I，其中X优选为氢；Y优选为连接键；Z优选为O；R优选为氢；W优选不存在；L优选为C1–C16亚烷基醚基；T+为三环己基膦盐阳离子、三苯基膦盐阳离子和吡啶阳离子中的一种；Q–为一价阴离子。本发明的探针在制备抗菌和/或抗癌药物以及制备荧光成像剂中的应用。本发明的探针通过增加细菌细胞膜的通透性和破坏癌细胞中线粒体的功能实现抗菌和抗癌的双重效果，具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能。
Description
技术领域
本发明属于分子探针的技术领域，涉及一种实现细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的探针及其应用，具体涉及一种基于细菌膜电势和细胞膜电势的不同，实现细菌和癌细胞的逐次荧光成像和具有抗菌抗癌功能的分子探针及其应用。
背景技术
细菌感染与癌症的发生与发展是密切相关的，细菌的有效杀灭能够显著地提高癌症的治疗效果。例如，梭杆菌的感染与结直肠癌是密切相关的，用抗生素杀灭梭杆菌能极大地提高结直肠癌的治疗效果。另外，免疫力低下的癌症患者更容易遭受细菌感染。例如，肺癌病人常常遭受细菌感染引起的肺炎。所以，在临床上抗生素和抗癌药物需要同时联合使用才能治疗细菌感染和相关的癌症。但是，多重化疗药物的联合使用会显著地增加患者的不良反应，具有潜在的风险。最近，一系列的抗菌剂已经被研发，包括抗菌肽，阳离子聚合物，水凝胶和无机纳米粒子。但是，这些抗菌剂面临着一些缺陷限制了在临床上的应用，比如容易被酶降解，生物相容性差，合成成本昂贵和不可降解性等。同时，它们在抗癌方面的潜力却很少被研究。为了攻克这个挑战，它是迫切需要发展一种诊疗剂，不仅能有效地杀灭细菌和相关的癌细胞，而且能够通过成像实时和原位地监测治疗的过程。
当前，随着激光共聚焦显微镜的迅速发展，荧光成像具有明显的优势，比如操作简单，原位观察和监测，以及高的时空分辨率等。在荧光成像方面，传统的具有聚集诱导猝灭(ACQ)效应的荧光探针，具有以下缺点：1)局部的高浓度聚集，容易发生荧光的自我猝灭现象；2)光稳定性差，容易在光照下发生猝灭；3)在荧光成像时有很强的背景噪音，需要经过繁琐的洗涤步骤除去背景干扰；4)斯托克斯位移小(小于40nm)，荧光成像时激发光产生的干扰需要通过滤光片除去，但是会极大地影响发射光的强度。因此，具有ACQ效应的荧光探针限制了其在荧光成像方面的应用。与之相反，具有聚集诱导发光(AIE)效应的荧光探针在聚集态，能够发出高亮度的荧光，背景噪音低，光稳定性好，斯托克位移大，在荧光成像中能够实现免洗成像，简化了实验操作步骤，特别适于细菌和细胞器的成像，对研究其生理过程具有重要的意义。同时，AIE在细菌和细胞器中的累积对于获取足够的治疗剂量和提高治疗效果具有重要的意义。最近，一系列具有光动力活性的AIE分子已经被用于细菌和癌细胞的杀灭，但是它们并不能抗厌氧菌引起的细菌感染和处于乏氧环境的实体肿瘤。因此，现需要研发一种具有化疗活性并在荧光成像下抗细菌感染和肿瘤的AIE分子。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺陷，本发明的目的在于提供一种具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的荧光探针及其应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的探针，其结构为式I：
其中：
X为氢、烷基、炔基或杂芳基中的一种；Y为连接键、取代或未取代的芳香基或杂芳基中的一种；Z为O、-NH-或者NR′，R′为烷基，炔基或者杂芳基；R为氢，乙基、乙酰基、硫酸盐(HO-SO2-O-)、噻吩结构上失去一个氢的2-乙基-5-硝基噻吩基团、失去一个氢的芳基硼酸酯、苯环上失去一个氢的对氨基酚的基团、失去一个氢的高烯丙基醚基团、二苯基膦基团(Ph2P-)、2,4-二硝基苯磺酰基、失去一个氢的糖基或失去一个氢的肽中的一种；W为不存在或者卤素、氰基、烷基、全氟烷基、烷氧基、芳氧基、烯基、炔基、环烷基、烷硫基、酰胺基、氨基、单烷基氨基、二烷氨基、羧酰胺、羟基、巯基、芳基或杂芳基中的一种或多种取代基；L为连接键或者含有1到16个碳原子的饱和或部分饱和的亚烃基、C1–C16亚烃基醚基(-C1–C16-O-)、C1–C16亚烃基硫醚基(C1–C16-S-)、C1–C16亚烃基胺(-C1–C16-NH-)、C1–C16亚烃基酯基、C1–C16亚烃基酰胺基、C1–C16亚烃基磺酰胺基，优选为C1–C16亚烷基醚基；T+为吡咯烷阳离子、哌啶阳离子、哌嗪阳离子、吗啡啉阳离子、咪唑阳离子、二氮嗪阳离子、三氮嗪阳离子、恶嗪阳离子、三环己基膦阳离子、三苯基膦阳离子、吡啶阳离子、肽对应的阳离子中的一种，式I中L与T+所选基团中“N”或“P”连接，优选三环己基膦盐阳离子、三苯基膦盐阳离子和吡啶阳离子中的一种；Q–为一价阴离子，优选卤素或OTs–阴离子中的一种。
Y基团中取代芳基或取代杂芳基中取代基为卤素、氰基、烷基、全氟烷基、烷氧基、芳氧基、烯基、炔基、环烷基、烷硫基、酰胺基、氨基、单烷基氨基、二烷氨基、羧酰胺、羟基、巯基、芳基或杂芳基。
更优选地，X为氢；Y为连接键；Z为O；R为氢；W不存在，此时探针的结构式为式II；其结构为：
更优选地，L为C2～C6亚烷基醚基(该基团中O与苯环连接)；T+为三环己基膦阳离子或三苯基膦盐阳离子中的一种；Q–为卤素离子，更优选为Iˉ，Brˉ，Clˉ；
更优选地，L为C6亚烷基醚基；T+为三苯基膦阳离子；Q–为Brˉ；其结构为式III：
所述具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的荧光探针的结构为式II时，其制备方法，包括以下步骤：将式IV化合物与式V化合物反应，获得荧光探针；
所述式IV化合物的结构为式IV：
所述VI化合物为水合肼，其结构为式VI：H2N-NH2 H2O；
式IV中L，T+，Q–如式II中所定义。
L为C1～C12亚烷基醚基，优选为C2～C6亚烷基醚基；Q为卤素；
更优选地，L为C6亚烷基醚基；T+为三苯基膦阳离子；Q为Brˉ；
在上述制备方法中，所述反应在有机溶剂中进行；所述有机溶剂为乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲醇、乙醇或者二甲基亚砜中一种以上；优选为甲醇，乙醇；更优选为乙醇；
所述反应温度为20～85℃，优选为60～85℃，更优选为65℃；所述反应时间为1～5h；所述式IV化合物与式V化合物的摩尔比为1:1～5:1。
本发明的探针为细菌靶向和/或癌细胞线粒体靶向的AIE分子，也为细菌靶向和/或癌细胞线粒体靶向的分子探针：
所述的细菌靶向和癌细胞线粒体靶向的AIE分子，是指带有正电荷且对细菌和癌细胞具有逐次成像与逐次杀灭功能的两亲性AIE分子。
本发明的AIE分子探针在制备抗菌和/或抗癌药物(制剂)中的应用；在细菌靶向和/或癌细胞线粒体靶向荧光成像剂中的应用。本发明的AIE分子探针可在细菌和癌细胞共存的体系中实现细菌与癌细胞的逐次成像和杀灭。所述荧光成像剂为在细菌和癌细胞共存的体系中利用细菌的膜电势高于哺乳动物细胞的膜电势实现细菌与癌细胞的逐次成像的成像剂。
所述的细菌包括野生型革兰氏阳性菌，耐药型革兰氏阳性菌，野生型革兰氏阴性菌和耐药型革兰氏阴性菌等微生物菌群。
所述的癌症包括胃癌，结直肠癌，肺癌，胆囊癌等癌症。
所述的抗菌抗癌药物为具有化疗活性的药物：通过增加细菌细胞膜的通透性和破坏癌细胞中线粒体的功能实现抗菌和抗癌的双重效果。
所述的细菌和癌细胞的杀灭，包括细菌与肺癌细胞共存，细菌与胃癌细胞共存，细菌与胆囊癌细胞共存，细菌与结直肠癌细胞共存等情况下的杀灭。
本发明的优点是：
1、本发明中带正电荷的两亲性分子探针，可以实现细菌的免洗荧光成像，同时有效地改变细菌细胞膜的通透性，并诱导细菌细胞膜上孔洞的形成，破坏细菌细胞的结构和功能，实现其有效的杀灭。
2、本发明中带正电荷的两亲性分子探针，基于细菌的膜电势高于哺乳动物细胞的膜电势，实现细菌和癌细胞的逐次成像。
3、本发明中带正电荷的两亲性分子探针，具有化疗的活性，实现细菌和癌细胞的有效杀灭。
附图说明
图1为细菌的荧光成像：AIE-Mito-TPP分别处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌30分钟后的共聚焦显微镜图片，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm，标尺为10μm；其中AIE-Mito-TPP的浓度为5μM；
图2为AIE-Mito-TPP分别处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌30分钟后的荧光光谱，激发波长为364nm；其中AIE-Mito-TPP的浓度为5μM；
图3为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、AIE-Mito-TPP、AIE-Mito-TPP处理的金黄色葡萄球菌和AIE-Mito-TPP处理的大肠杆菌在365nm紫外灯照射下的照片；其中AIE-Mito-TPP的浓度为5μM；
图4为AIE-Mito-TPP分别处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌30分钟后流式细胞分析荧光强度的结果；其中AIE-Mito-TPP的浓度为5μM；
图5为革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的大肠杆菌经过AIE-Mito-TPP处理前后分散在超纯水中的zeta电位图；其中AIE-Mito-TPP的浓度为5μM；
图6中(A)为罗丹明分别处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌30分钟后的共聚焦显微镜图片，激发波长为488nm，发射波长为500–650nm，标尺为10μm；(B)为选定区域的荧光信号变化图；其中罗丹明的浓度为5μM；
图7为不同浓度下的AIE-Mito-TPP处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌存活率图和琼脂糖板的照片；
图8为不同浓度下的AIE-Mito-TPP处理耐甲氧西林金黄色葡萄球菌存活率图和琼脂糖板的照片；
图9为(A)金黄色葡萄球菌和(B)大肠杆菌用AIE-Mito-TPP处理30分钟，与PI共染后的共聚焦显微镜图；对于AIE-Mito-TPP，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm；对于PI，激发波长为543nm，发射波长为550–650nm；
图10为(A)金黄色葡萄球菌和(B)大肠杆菌用AIE-Mito-TPP处理30分钟，与PI共染后的流式细胞分析结果；
图11为(A)金黄色葡萄球菌和(C)大肠杆菌用AIE-Mito-TPP和FITC-葡聚糖处理30分钟后的共聚焦显微镜图；对于AIE-Mito-TPP，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm；对于FITC-葡聚糖，激发波长为488nm，发射波长为550–650nm；B和D分别为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌经AIE-Mito-TPP处理后的场发射扫面显微镜图；
图12为细菌和癌细胞的逐次成像：(A)为金黄色葡萄球菌用AIE-Mito-TPP处理后在不同时间点的共聚焦显微镜图；(B)为肺癌细胞A549细胞用AIE-Mito-TPP细胞处理后在不同时间点的共聚焦显微镜图；(C)为金黄色葡萄球菌和肺癌细胞A549细胞共存情况下用AIE-Mito-TPP处理后在不同时间点的共聚焦显微镜图；对于AIE-Mito-TPP，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm；
图13为线粒体的共定位：(A)金黄色葡萄球菌和A549细胞经AIE-Mito-TPP和MitoTracker Red共染后的共聚焦图；对于AIE-Mito-TPP，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm；对于MitoTracker Red，激发波长为543nm，发射波长为575–625nm；(B)为选定区域中，AIE-Mito-TPP与MitoTracker Red的荧光信号变化相关图；
图14为细菌和癌细胞的杀灭：抗菌与抗癌的(A)二维和(C)三维培养模型示意图；(B)体外共培养的金黄色葡萄球菌和肺癌A549细胞被AIE-Mito-TPP和PI处理后在不同时间点拍摄的共聚焦显微镜图；(D)金黄色葡萄球菌与A549多细胞肿瘤球共培养的体内模型被AIE-Mito-TPP处理18小时后的共聚焦显微镜图；对于AIE-Mito-TPP通道，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm；对于PI通道，激发波长为543nm，发射波长为550-700nm。其中AIE-Mito-TPP的浓度为10μM，PI的浓度为3μg/mL。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的AIE-Mito-TPP探针的制备
(1)将2,4-二羟基苯甲醛(690mg，5.0mmol)和1,6-二溴己烷(1.22g，5.0mmol)加入20mL的乙腈中，然后加入碳酸钾(690mg,5.0mmol)在N2下回流，搅拌反应6h，旋干溶剂，过硅胶柱(PE：EA＝80:1)分离得到化合物IX。
(2)将化合物IX(300mg,1.0mmol)和三苯基膦(262mg，1.0mmol)溶于5mL的乙腈中，在N2下回流，搅拌反应5h，减压下旋蒸，除去溶剂，重结晶得到化合物X。
(3)将化合物X(250mg，0.44mmol)溶于乙醇，然后加入水合肼(11mg,0.22mmol)，在N2下回流，搅拌反应4h，过滤，无水乙醇洗三次，真空干燥得到探针III(即AIE-Mito-TPP)。
反应式如下：
实施例2细菌的荧光成像
(1)细菌的培养与稀释
将琼脂板上的金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)的一个单克隆加到5mL的NB液体培养基中，置于温度为37℃，转速为180rpm的摇床上培养12小时。然后将细菌悬液在7100g的转速下离心3分钟，用PBS洗3次，弃去上清，将剩余的细菌重悬在PBS中。接着将细菌悬液稀释为在600nm处的吸收值为1.0(OD600＝1.0)。对于大肠杆菌(革兰氏阴性菌)的培养，除了培养基用LB液体培养基以外，其他的实验条件和操作与金黄色葡萄球菌的一样。
(2)细菌的荧光成像实验
将100μL细菌悬液(OD600＝1.0)加入含有AIE-Mito-TPP的PBS(400μL)溶液中，使AIE-Mito-TPP的最终浓度为5μM；然后混合均匀，置于温度为37℃，转速为180rpm的摇床上孵育30分钟；接着将细菌悬液在7100g的转速下离心3分钟，弃去490μL的上清液，重悬细菌。取2μL细菌悬液滴加在盖玻片上，用镊子夹取另外一个盖玻片，小心地盖在上述滴有菌液的盖玻片上固定细菌，紧接着在激光共聚焦显微镜上用100×油镜对细菌进行荧光成像。对于AIE-Mito-TPP，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm。
(3)荧光光谱变化
将1.5mL细菌悬液(OD600＝1.0)加入含有AIE-Mito-TPP的PBS(1.5mL)溶液中，使AIE-Mito-TPP的最终浓度为5μM；然后混合均匀置于温度为37℃，转速为180rpm的摇床上孵育30分钟，用荧光光谱仪检测其荧光光谱。激发波长为：364nm。
(4)流式细胞分析荧光强度的变化
将100μL细菌悬液(OD600＝1.0)加入含有AIE-Mito-TPP的PBS(400μL)溶液中，使AIE-Mito-TPP的最终浓度为5μM；然后混合均匀，置于温度为37℃，转速为180rpm的摇床上孵育30分钟；接着将细菌悬液加入2.5mL的PBS中进行稀释，最后用流式细胞仪检测细菌的荧光强度。
(5)细菌的zeta电位变化
将细菌悬液稀释到OD600＝1.0，取200μL细菌悬液加入含有AIE-Mito-TPP的PBS(800μL)溶液中，使AIE-Mito-TPP的最终浓度为5μM；然后混合均匀，置于温度为37℃，转速为180rpm的摇床上孵育30分钟；接着将细菌悬液在7100g的转速下离心3分钟，弃去上清液，PBS洗3次，然后加入1mL的超纯水重悬细菌。用Nano ZS测细菌悬液的Zeta电位。对照组(没有加入AIE-Mito-TPP)也在上述同样的条件下测定。
图1为细菌的荧光成像：AIE-Mito-TPP分别处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌30分钟后的共聚焦显微镜图片，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm，标尺为10μm；其中AIE-Mito-TPP的浓度为5μM。图2为AIE-Mito-TPP分别处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌30分钟后的荧光光谱，激发波长为364nm；其中AIE-Mito-TPP的浓度为5μM。图3为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、AIE-Mito-TPP、AIE-Mito-TPP处理的金黄色葡萄球菌和AIE-Mito-TPP处理的大肠杆菌在365nm紫外灯照射下的照片；其中AIE-Mito-TPP的浓度为5μM。图4为AIE-Mito-TPP分别处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌30分钟后流式细胞分析荧光强度的结果；其中AIE-Mito-TPP的浓度为5μM。图5为革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的大肠杆菌经过AIE-Mito-TPP处理前后分散在超纯水中的zeta电位图；其中AIE-Mito-TPP的浓度为5μM。图6中(A)为罗丹明分别处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌30分钟后的共聚焦显微镜图片，激发波长为488nm，发射波长为500–650nm，标尺为10μm；(B)为选定区域的荧光信号变化图；其中罗丹明的浓度为5μM。
AIE-Mito-TPP探针对细菌的荧光成像能力被研究。如图1所示，当用AIE-Mito-TPP(5μM)处理细菌30分钟以后，大部分革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的大肠杆菌都被AIE-Mito-TPP点亮，发出强的绿色荧光；通过荧光光谱的测定进一步地证实AIE-Mito-TPP探针能够实现细菌的荧光点亮(图2)。单独的AIE-Mito-TPP在溶液态下发光很弱，在与细菌相互作用以后，发射出明亮的绿色荧光，可以实现细菌的免洗成像(图3)。从流式细胞分析得到的AIE-Mito-TPP荧光强度结果可以看出，99.63％的金黄色葡萄球菌和91.62％的大肠杆菌被该探针染色(图4)。另外，AIE-Mito-TPP处理细菌以后，细菌的zeta电位有正电势的转移；对于金黄色葡萄球菌，电势从–31.3变为–23.3mV，对于大肠杆菌，电势从–34.9变为–32.6mV，主要归因于带正电的AIE-Mito-TPP在负电性的细菌膜上的有效结合(图5)。具有ACQ效应的罗丹明与细菌相互作用以后，有很强的背景噪音(图6)。所以，AIE-Mito-TPP探针在实现细菌免洗成像方面是非常有前景的。
实施例3抗菌活性实验
细菌(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)悬液(106CFU mL-1)分别与不同浓度的AIE-Mito-TPP混合均匀，置于温度为37℃，转速为180rpm的摇床上孵育30分钟；然后对上述细菌混合液梯度稀释成细菌的浓度为104CFU mL-1；接着取10μL滴到琼脂板上，用细菌涂棒在琼脂糖凝胶板上轻轻地涂抹，目的是将菌液均匀地分散在琼脂板上；在涂抹过程中，涂棒与琼脂板的摩擦力增大时，停止涂抹；最后将这些琼脂板置于37℃下培养18小时，记录细菌克隆数。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌实验操作与上述操作相同。
图7为不同浓度下的AIE-Mito-TPP处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌存活率图和琼脂糖板的照片；A为处理金黄色葡萄球菌的细菌存活率图，C为处理金黄色葡萄球菌的琼脂糖板图，B为处理大肠杆菌的细菌存活率图，D为处理大肠杆菌的琼脂糖板图。图8为不同浓度下的AIE-Mito-TPP处理耐甲氧西林金黄色葡萄球菌存活率图(A)和琼脂糖板的照片(B)。
AIE-Mito-TPP的抗菌活性被评估。如图7A-D，与对照组相比，用AIE-Mito-TPP(2.0μM)处理后的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性比例分别降到0％和68.8％，说明AIE-Mito-TPP具有很好的抗菌效果。随着AIE-Mito-TPP浓度的增加到10μM时，大肠杆菌的活性比例逐渐降低到25.4％。更重要的是，当AIE-Mito-TPP的浓度为2μM时，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)也可以被有效地杀灭，其活力降为0％(图8A-B)，这说明AIE-Mito-TPP对耐药的金黄色葡萄球菌仍然能够实现有效地杀灭。
实施例4最低抑菌浓度的测定
将琼脂板上的细菌菌落(大肠杆菌或者金黄色葡萄球菌)的一个单克隆加到5mL的液体培养基中，置于温度为37℃，转速为180rpm的摇床上培养12小时。然后将细菌悬液在7100g的转速下离心3分钟，用PBS洗3次，弃去上清，将细菌重悬在PBS中。接着将细菌悬液稀释到2×106CFU mL-1；将100μL含有AIE-Mito-TPP的液体培养基(金黄色葡萄球菌用NB培养基，大肠杆菌用LB培养基)加入96孔板中，2倍梯度稀释，随后加入100μL的细菌悬液。将孔板放到酶标仪上测定在600nm处的吸收值，然后置于37℃的细菌培养箱里面培养18小时，最后取出孔板，在酶标仪上测定波长在600nm处的吸收。对于阳性组，不含有AIE-Mito-TPP的细菌悬液；对于阴性组，既不含细菌也不含AIE-Mito-TPP。如表1所示，带正电性和两亲性的AIE-Mito-TPP，对于革兰氏阳性菌–金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌–大肠杆菌的最低抑菌浓度分别为1μM和4μM。另外，与基于TPP+片段的杀菌剂(例如修饰TPP+吡哆醇衍生物，迷迭香酸和芳香胺基酸等)和传统的抗菌剂(例如青霉素，万古霉素和丁胺卡那霉素)相比，AIE-Mito-TPP有更低的MICs值(表1，表中1,2,3,4,5,6为基于TPP+片段的杀菌剂)，暗示了AIE-Mito-TPP能够作为一种良好的抗菌剂使用。
表1各抗菌剂的最低抑菌浓度
实施例5抗菌机制实验
(1)AIE-Mito-TPP诱导细菌膜破损的实验
将100μL细菌悬液(OD600＝1.0)加入含有AIE-Mito-TPP的PBS(400μL)溶液中，使AIE-Mito-TPP的最终浓度为5μM；然后混合均匀，置于温度为37℃，转速为180rpm的摇床上孵育30分钟；将细菌悬液在7100g的转速下离心3分钟，用PBS洗3次，弃去上清，将细菌重悬在PBS中。接着将细菌悬液中加入碘化丙啶(PI)，使PI的最终浓度为3μg mL-1，重新置于温度为37℃，转速为180rpm的摇床上继续孵育10分钟；紧接着将细菌悬液在7100g的转速下离心3分钟，用PBS洗3次，弃去上清，接着用10μL的PBS重悬细菌。取2μL悬液滴加在盖玻片上，用镊子夹取另外一个盖玻片，小心地盖在上述滴有菌液的盖玻片上固定细菌，紧接着在激光共聚焦显微镜上用100×油镜对细菌进行荧光成像。对于AIE-Mito-TPP，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm。对于PI，激发波长为543nm，发射波长为550–700nm。
(2)AIE-Mito-TPP诱导细菌孔洞的测定
将100μL细菌悬液(OD600＝1.0)加入含有AIE-Mito-TPP和修饰了异硫氰酸荧光素的葡聚糖(FITC-葡聚糖，分子量为500kDa)的PBS(400μL)溶液中，使AIE-Mito-TPP最终浓度为5μM，FITC-葡聚糖最终浓度为500μg mL-1；然后混合均匀，置于温度为37℃，转速为180rpm的摇床上孵育30分钟。将细菌悬液在7100g的转速下离心3分钟，弃去上清，用PBS洗3次，然后重悬在10μL的PBS中。取2μL悬液滴加在盖玻片上，用镊子夹取另外一个盖玻片，小心地盖在上述滴有菌液的盖玻片上固定细菌，紧接着在激光共聚焦显微镜上用100×油镜对细菌进行荧光成像。对于AIE-Mito-TPP，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm。对于FITC-dextrande，激发波长为488nm，发射波长为550–650nm。
(3)细菌形态观察
将100μL细菌悬液(OD600＝1.0)加入含有AIE-Mito-TPP的PBS(400μL)溶液中，使AIE-Mito-TPP的最终浓度为5μM；然后混合均匀，置于温度为37℃，转速为180rpm的摇床上孵育30分钟；接着将细菌悬液在7100g的转速下离心3分钟，弃去上清，用PBS洗3次，用4％的多聚甲醛固定细菌，置于4℃下12小时。接着在7100g的转速下离心3分钟，弃去上清，PBS洗3次，用不同浓度的酒精溶液(30％、50％、60％、70％、80％、90％、95％和100％)梯度脱水30分钟，接着小心地将细菌悬液滴在硅片上，置于干燥箱里面自然干燥。最后，对样品进行90秒的喷金，用场发射扫面电子显微镜(SEM)观察细菌的形态。
图9为(A)金黄色葡萄球菌和(B)大肠杆菌用AIE-Mito-TPP处理30分钟，与PI共染后的共聚焦显微镜图；对于AIE-Mito-TPP，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm；对于PI，激发波长为543nm，发射波长为550–650nm。图10为(A)金黄色葡萄球菌和(B)大肠杆菌用AIE-Mito-TPP处理30分钟，与PI共染后的流式细胞分析结果。
AIE-Mito-TPP探针的抗菌机制被研究。对于碘化丙啶(PI)，只能穿透细菌细胞膜发生破坏的细菌，然后与细菌细胞里面的核酸结合，发出红色荧光。如图9A-B所示，当用浓度为5μM的AIE-Mito-TPP分别处理革兰氏阳性菌–金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌–大肠杆菌30分钟后，几乎所有的金黄色葡萄球菌和部分的大肠杆菌被PI染色，发出红色荧光。另外，通过流式细胞术测定的PI荧光强度的结果进一步证明了细菌的细胞膜被携带正电荷的AIE-Mito-TPP有效地破坏(图10)。
图11为(A)金黄色葡萄球菌和(C)大肠杆菌用AIE-Mito-TPP和FITC-葡聚糖处理30分钟后的共聚焦显微镜图；对于AIE-Mito-TPP，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm；对于FITC-葡聚糖，激发波长为488nm，发射波长为550–650nm；B和D分别为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌经AIE-Mito-TPP处理后的场发射扫面显微镜图。
为了评估AIE-Mito-TPP诱导的细菌细胞膜破损以后产生的孔洞的大小，金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌分别与AIE-Mito-TPP和分子量500kDa的异硫氰酸荧光素修饰的葡聚糖(FITC-葡聚糖)共孵育。正如图11A与C所示，用AIE-Mito-TPP和FITC-葡聚糖共处理30分钟以后，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌同时染上AIE-Mito-TPP的绿色荧光和FITC-葡聚糖的红色荧光(伪彩)。另外，分子量为500kDa的FITC-葡聚糖纳米粒子的粒径大约为29nm。所以，这些结果说明了AIE-Mito-TPP诱导的细菌细胞膜破坏以后产生的孔洞的尺寸大于29nm。
为了观察AIE-Mito-TPP处理后的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的形态，用场发射扫面电子显微镜观察并拍摄照片。如图11B与D所示，与对照组相比，经过AIE-Mito-TPP处理过的金黄色葡萄球菌的形态发生明显的变化，其细胞形状变的不规则和褶皱的细胞壁。对于大肠杆菌，与对照组相比，经过AIE-Mito-TPP处理过的大肠杆菌呈现出明显褶皱的细胞壁。这些都说明了AIE-Mito-TPP能够诱导细菌细胞膜发生破坏。
实施例6细菌和癌细胞的逐次成像
(1)细胞培养
肺癌细胞(A549细胞)购自于ATCC公司，用含有1％青霉素–链霉素，10％胎牛血清(FBS)的DMEM在37℃含有5％二氧化碳的培养箱中培养。
(2)细菌与癌细胞共存的二维模型构建
将对数期生长的A549细胞，消化，离心，重悬，以10×104个细胞的密度种在25mm玻璃底的共聚焦培养皿中，37℃下贴壁生长24小时；随后用PBS洗涤3次，将200μL细菌悬液(OD600＝1.0)加入上述共聚焦培养皿中。
(3)细菌与癌细胞的荧光成像
对于单独的细菌组，将200μL细菌悬液加入25mm玻璃底的共聚焦培养皿，同时加入800μL含有AIE-Mito-TPP的DMEM培养基，使AIE-Mito-TPP的最终浓度为5μM；对于单独的A549细胞组，将1000μL含有AIE-Mito-TPP的DMEM培养基加到含有A549细胞的25mm玻璃底的共聚焦培养皿，使AIE-Mito-TPP的最终浓度为5μM；对于细菌与癌细胞共存，将200μL细菌悬液(OD600＝1.0)加入到细菌与癌细胞共存的共聚焦培养皿中，同时加入800μL含有AIE-Mito-TPP的DMEM培养基，使AIE-Mito-TPP的最终浓度为5μM；继续在37℃下孵育不同时间，并在相应的时间点在激光共聚焦显微镜下用63×油镜对其成像。对于AIE-Mito-TPP，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm。
图12为细菌和癌细胞的逐次成像：(A)为金黄色葡萄球菌用AIE-Mito-TPP处理后在不同时间点的共聚焦显微镜图；(B)为肺癌细胞A549细胞用AIE-Mito-TPP细胞处理后在不同时间点的共聚焦显微镜图；(C)为金黄色葡萄球菌和肺癌细胞A549细胞共存情况下用AIE-Mito-TPP处理后在不同时间点的共聚焦显微镜图；对于AIE-Mito-TPP，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm。
图13为线粒体的共定位：(A)金黄色葡萄球菌和A549细胞经AIE-Mito-TPP和MitoTracker Red共染后的共聚焦图；对于AIE-Mito-TPP，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm；对于MitoTracker Red，激发波长为543nm，发射波长为575–625nm；(B)为选定区域中，AIE-Mito-TPP与MitoTracker Red的荧光信号变化相关图。
为了研究AIE-Mito-TPP对细菌和癌细胞的逐次成像能力，我们首先用激光共聚焦显微镜实时地检测AIE-Mito-TPP对体外共培养的细菌与肺癌A549细胞的成像能力。如图12A-B所示，将浓度为5μM的AIE-Mito-TPP加入培养皿中共孵育2分钟后，单独的金黄色葡萄球菌和肺癌A549细胞都能观察到AIE-Mito-TPP在聚集态下的绿色荧光信号。有趣的是，对于体外共培养的金黄色葡萄球菌与肺癌A549细胞体系，AIE-Mito-TPP在2分钟内优先染色金黄色葡萄球菌(图12C)。AIE-Mito-TPP实现细菌与癌细胞的逐次成像，很可能是由于细菌的细胞膜电势(～–140mV)高于哺乳动物细胞膜的电势(～–30–40mV)所造成的。同时，将孵育时间延长到60分钟，可以看到A549细胞线粒体中的绿色荧光信号逐渐增强，这可能归因于癌细胞高的线粒体膜电势(～–180mV)。另外，AIE-Mito-TPP探针可以选择性地靶向A549细胞的线粒体，通过MitoTracker Red共染色验证(图13)。这些结果说明AIE-Mito-TPP能够实现细菌与癌细胞的逐次成像。
实施例7二维和三维的抗菌抗癌实验
(1)二维的抗菌抗癌实验
将A549细胞以10×104个细胞的密度种在25mm玻璃底的共聚焦培养皿中，在37℃下贴壁生长24小时；随后用PBS洗涤3次，将200μL细菌悬液(OD600＝1.0)加入上述共聚焦培养皿中，同时加入800μL含有AIE-Mito-TPP和PI的DMEM培养基，使AIE-Mito-TPP的最终浓度为5μM，PI的浓度为3μg/mL，用激光共聚焦显微镜在预设的时间点进行观察拍照。对于AIE-Mito-TPP，激发波长为405nm，发射波长为450–550nm。对于PI，激发波长为543nm，发射波长为550–700nm。
(2)三维的抗菌抗癌实验
将肿瘤球在800rpm的转速下离心5分钟，小心吸取上清，PBS洗3次，加入DMEM用移液枪轻轻地吹打，悬浮肿瘤球，加入共聚焦培养皿中；紧接着加入200μL细菌悬液(OD600＝1.0)，随后加入含有AIE-Mito-TPP的DMEM培养基，使AIE-Mito-TPP的最终浓度为5μM；继续在37℃下孵育18小时，加入PI(3μg/mL)染色，用激光共聚焦显微镜的3D层扫模式进行层扫成像。对于AIE-Mito-TPP，激发波长为405nm，发射波长为450-550nm。对于PI，激发波长为543nm，发射波长为550-700nm。
图14为细菌和癌细胞的杀灭：抗菌与抗癌的(A)二维和(C)三维培养模型示意图；(B)体外共培养的金黄色葡萄球菌和肺癌A549细胞被AIE-Mito-TPP和PI处理后在不同时间点拍摄的共聚焦显微镜图；(D)金黄色葡萄球菌与A549多细胞肿瘤球共培养的体内模型被AIE-Mito-TPP处理18小时后的共聚焦显微镜图；对于AIE-Mito-TPP通道，激发波长为405nm，发射波长为450-550nm；对于PI通道，激发波长为543nm，发射波长为550-700nm。其中AIE-Mito-TPP的浓度为10μM，PI的浓度为3μg/mL。
为了进一步地研究AIE-Mito-TPP对细菌和癌细胞的逐次杀灭的能力，我们用碘化丙啶(PI)做共染。考虑到很多肺癌患者普遍存在金黄色葡萄球菌的感染，本研究中用金黄色葡萄球菌和肺癌A549细胞的共培养作为体外的模型(图14A)，将AIE-Mito-TPP加入金黄色葡萄球菌和肺癌A549的共培养体系中，在共聚焦显微镜下观察其成像情况。如图14B所示，用AIE-Mito-TPP处理10分钟后，大部分的金黄色葡萄球菌优先被PI染色，说明AIE-Mito-TPP能够快速地破坏细菌的细胞膜。同时，将AIE-Mito-TPP的孵育时间延长至240分钟，可以观察到肺癌A549细胞也逐渐地被PI所染色，说明A549细胞的细胞膜通透性也发生了变化。所以，以上结果说明了AIE-Mito-TPP探针能够实现细菌和肺癌A549细胞的逐次杀灭。
三维的多细胞肿瘤球与体内的肿瘤在形状、细胞形态、生长动力学、基因表达和药物响应等方面是相类似的。为了研究AIE-Mito-TPP针对细菌和三维多细胞肿瘤球的治疗能力，我们用共培养的金黄色葡萄球菌和A549多细胞肿瘤球作为体内的研究模型(图14C)，AIE-Mito-TPP被加入到金黄色葡萄球菌和A549多细胞肿瘤球共培养体系中，在共聚焦显微镜下观察其成像情况。如图14D所示，用AIE-Mito-TPP处理18小时以后，可以观察到金黄色葡萄球菌沉积在培养皿的底部，被AIE-Mito-TPP点亮发出明亮的绿色荧光；由于细菌在AIE-Mito-TPP的作用下，细菌的细胞膜的通透性发生变化，金黄色葡萄球菌被PI染色发出红色荧光。同时，A549多细胞肿瘤球在不同深度的癌细胞也被AIE-Mito-TPP和PI所共染，分别发出绿色和红色的荧光。这些结果说明了AIE-Mito-TPP探针能够有效地杀灭金黄色葡萄球菌和肿瘤球里面的A549细胞。
本发明的具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：将式IV化合物与式V化合物反应，获得荧光探针；
所述荧光探针，其结构为式II：
所述式IV化合物的结构为式IV：
式IV中L、T和Q的定义与式II相同
所述VI化合物为水合肼，其结构为式VI：H2N-NH2 H2O；
式II，式IV中L为C1～C12亚烷基醚基，优化为C2～C6亚烷基醚基；Q为卤素；
更优选地，L为C6亚烷基醚基；T为三苯基膦；Q为Br；
在上述制备方法中，所述反应在有机溶剂中进行；所述有机溶剂为乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲醇、乙醇或者二甲基亚砜中一种以上；优选为甲醇，乙醇；更优选为乙醇；
所述反应温度为20～85℃，优选为60～85℃，更优选为65℃；所述反应时间为1～5h；所述式IV化合物与式V化合物的摩尔比为1:1～5:1。
所述式IV化合物，其制备方法包括以下步骤：
(S)将式VI化合物和T化合物溶于有机溶剂中，在气体保护下回流，搅拌反应，减压下旋蒸，除去溶剂，重结晶；T化合物为式IV中基团T所形成的化合物；
步骤S中所述的有机溶剂为乙腈，二氯甲烷、三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲醇、乙醇或者二甲基亚砜中一种以上；优选为乙腈；所述气体为氮气或者氩气；所述反应时间为1～6h；所述的式VI化合物与T化合物的摩尔比为1:1～1:5，温度为50～80℃；
所述式VI化合物的制备方法包括以下步骤：
(P)将式VII化合物与式VIII化合物加入有机溶剂中，然后加入碳酸盐，在气体保护下回流，搅拌反应，旋干，过硅胶柱分离得到式VI化合物；
所述式VII化合物的结构如下：
所述式VIII化合物为二卤代烷烃类，其结构为式VIII：Q-R1-Q；
式VIII中R1为C1～C12的烷基；优化为C2～C6的烷基；更优化为C6；Q的定义与式II相同；
步骤P中所述的有机溶剂为乙腈，二氯甲烷、三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲醇、乙醇或者二甲基亚砜中一种以上；优选为乙腈；所述碳酸盐为碳酸钾，碳酸钠或者碳酸铯；所述气体为氮气或者氩气；所述反应时间为1～6h；所述的式VII化合物与式VIII化合物的摩尔比为1:1～1:5，温度为50～80℃。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的探针，其特征在于：其结构为式I：
其中：X为氢、烷基、炔基或杂芳基中的一种；Y为连接键、取代或未取代的芳香基或杂芳基中的一种；Z为O、-NH-或者NR′，R′为烷基，炔基或者杂芳基；R为氢，乙基、乙酰基、硫酸盐HO-SO2-O-、噻吩结构上失去一个氢的2-乙基-5-硝基噻吩基团、失去一个氢的芳基硼酸酯、苯环上失去一个氢的对氨基酚的基团、失去一个氢的高烯丙基醚基团、二苯基膦基团Ph2P-、2,4-二硝基苯磺酰基、失去一个氢的糖基或失去一个氢的肽中的一种；W为不存在或者卤素、氰基、烷基、全氟烷基、烷氧基、芳氧基、烯基、炔基、环烷基、烷硫基、酰胺基、氨基、单烷基氨基、二烷氨基、羧酰胺、羟基、巯基、芳基或杂芳基中的一种或多种取代基；L为连接键或者含有1到16个碳原子的饱和或部分饱和的亚烃基、C1–C16亚烃基醚基、C1–C16亚烃基硫醚基、C1–C16亚烃基胺、C1–C16亚烃基酯基、C1–C16亚烃基酰胺基、C1–C16亚烃基磺酰胺基；T+为吡咯烷阳离子、哌啶阳离子、哌嗪阳离子、吗啡啉阳离子、咪唑阳离子、二氮嗪阳离子、三氮嗪阳离子、恶嗪阳离子、三环己基膦阳离子、三苯基膦阳离子、吡啶阳离子、肽对应的阳离子中的一种，式I中L与T+所选基团中“N”或“P”连接；Q–为一价阴离子。
2.根据权利要求1所述具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的探针，其特征在于：X为氢；Y为连接键；Z为O；R为氢；W不存在；L为C1–C16亚烷基醚基；Q–为卤素或OTs–阴离子中的一种；
T+为三环己基膦盐阳离子、三苯基膦盐阳离子和吡啶阳离子中的一种；
此时探针的结构式为式II；其结构为：
3.根据权利要求2所述具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的探针，其特征在于：L为C1～C12亚烷基醚基，该基团中O与式II中苯环连接；T+为三环己基膦阳离子或三苯基膦盐阳离子中的一种；Q–为卤素离子。
4.根据权利要求3所述具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的探针，其特征在于：L为C2～C6亚烷基醚基；T+为三苯基膦阳离子；Q–为I–、Br–、Cl–。
5.根据权利要求4所述具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的探针，其特征在于：L为C6亚烷基醚基；Q–为Br–；此时探针的结构式为式III；其结构为：
6.根据权利要求1～5任一项所述具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将式IV化合物与式V化合物反应，获得荧光探针；
所述荧光探针的结构为式II时，
所述式IV化合物的结构为式IV：
所述VI化合物为水合肼，其结构为式VI：H2N-NH2 H2O；
式IV中L，T+，Q–如式II中所定义。
7.根据权利要求1～5任一项所述具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的探针，其特征在于：为细菌靶向和/或癌细胞线粒体靶向的分子探针。
8.根据权利要求1～5任一项所述具有细菌和癌细胞逐次成像与杀灭功能的探针在制备抗菌和/或抗癌药物以及制备荧光成像剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述荧光成像剂为细菌靶向和/或癌细胞线粒体靶向荧光成像剂；所述抗菌和/或抗癌药物为具有化疗活性的药物，通过增加细菌细胞膜的通透性和破坏癌细胞中线粒体的功能实现抗菌和抗癌的药物。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述荧光成像剂为在细菌和癌细胞共存的体系中实现细菌与癌细胞逐次成像的成像剂；所述抗菌和/或抗癌药物为在细菌和癌细胞共存的体系中实现逐次抗菌抗癌的药物；
所述细菌包括野生型革兰氏阳性菌，耐药型革兰氏阳性菌，野生型革兰氏阴性菌或耐药型革兰氏阴性菌微生物菌群；
所述癌症包括胃癌，结直肠癌，肺癌或胆囊癌。
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