CN111436397B - 一种模拟蚊虫叮咬症状的动物模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动物模型技术领域，公开了一种模拟蚊虫叮咬症状的动物模型的构建方法。本发明中直接使用雌性成蚊对豚鼠进行叮咬或免疫唾液蛋白混合物导致豚鼠产生痒觉，并且该模型可以通过抓挠次数量化评估痒觉程度，相对于其他痒觉模型更加直接有效。同时，本发明中联合使用免疫唾液蛋白混合物和雌性成蚊叮咬导致豚鼠的痒觉效应，表现为更显著的皮肤红肿和皮疹症状；本发明动物实验模型有助于高效地筛选和研发防蚊止痒药物。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型技术领域，具体涉及一种模拟蚊虫叮咬症状的动物模型的构建方法。
背景技术
蚊虫在全世界各地广泛分布，随着全球一体化发展和气候变暖，蚊虫分布和危害范围不断扩大。白纹伊蚊又称亚洲虎蚊，其身体呈黑色带银白色斑纹，行动敏捷，擅长飞翔，对环境的适应力强，叮咬人后产生的皮肤反应较为严重。白纹伊蚊原本活跃于我国中部及东南沿海一带，主要在温度高、雨量大的地区孳生。近二十年白纹伊蚊开始在全球范围内迅速扩散，成为危害较大的侵入物种。
蚊虫叮咬导致包括瘙痒、红疹风团、红肿和灼热等局部皮肤症状。严重时患者在蚊虫叮咬后2-6小时内叮咬处局部皮肤产生水肿、出血性坏死等剧烈炎症反应或阿瑟氏反应。蚊虫叮咬导致的红斑丘疹伴瘙痒症状严重影响人们的生活质量，干扰人类的正常工作和休息。因此，建立合理的动物实验模型对于研发专门针对蚊虫叮咬导致的红斑丘疹伴瘙痒症具有重要意义。
目前用于蚊虫叮咬止痒消肿药物研发的动物模型包括：1.二甲苯诱导小鼠耳肿胀的动物模型。二甲苯是一种具有致癌作用的化学物质，接触可以导致皮肤干燥、皲裂和皮炎，应用于小鼠耳肿胀模型的诱导剂。二甲苯引发的皮炎的机理是介导炎症介质释放，引起局部血管扩张，毛细血管通透性增加，炎症细胞浸润，从而产生皮肤渗出性炎症水肿。而蚊虫叮咬导致的红斑丘疹伴瘙痒症状是一种IgE-、IgG-和T淋巴细胞参与的超敏反应，因此二甲苯不适合用于评估蚊虫止痒药物的有效性；2.外源性组胺诱导的皮肤致痒模型。即在健康小鼠皮肤注射组胺诱导其产生痒觉(出自专利：雌激素易化组胺诱发小鼠瘙痒的外周受体机制研究)。虽然蚊虫叮咬可以诱导人体产生组胺并由此产生痒觉反应，但是组胺受体的拮抗剂不能有效抑制蚊虫叮咬导致的痒觉，说明叮咬引发的痒觉是由组胺在内的多种成分协同诱导的复合应答。因此，组胺可诱导最接近蚊虫叮咬的表型，但并不是最理想的蚊虫止痒药物研发评估模型；3.中药组合花露水直接应用于人体受试者(出自专利：一种用于蚊虫叮咬后止痒消肿的中药组合物及其制备方法)。直接招募人体受试者可以最为直接和真实的评估药物的效果，然而目前人体实验的伦理审查管理日趋严格。这种药物研发方式常用于祖方中草药物配方的改良，并不适用于大规模筛选有效的单一蚊虫止痒消肿新药；4.低浓度甲酸诱导小鼠疼痛伴丘疹模型(出自专利：一种用于蚊虫叮咬的消疱止痒液)。将小白鼠背部去毛，用注射器将小量低浓度甲酸注于表皮，观察小白鼠去毛背部状况及其活动情况。甲酸是蚁科昆虫毒液的主要有效成分，主要使脊椎动物产生痛觉从而达到防御的效果。低浓度甲酸导致的疼痛与蚊虫叮咬导致的痒觉具有完全不同的信号传导通路与分子机制，因此低浓度甲酸诱导的小鼠痛觉模型并非合适的蚊虫止痒药物研发模型。
综上所述，为了缓解夏季蚊虫叮咬导致的红斑丘疹伴瘙痒症，亟需建立有效的动物实验模型，以便高效地筛选和研发防蚊止痒药物。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种模拟蚊虫叮咬症状的动物模型的构建方法，使得所述构建方法能够构建出蚊虫叮咬人类皮肤引发红疹风团伴瘙痒症状高度相似的动物模型，并通过动物抓挠次数和回数进行客观量化，有助于高效地筛选和研发防蚊止痒药物。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种模拟蚊虫叮咬症状的动物模型的构建方法，包括：
将豚鼠麻醉后每两天用雌性成蚊叮咬，叮咬次数在3-6次，获得所述动物模型；
或从雌性成蚊头、胸部提取唾液蛋白混合物首免豚鼠，然后每一周加强免疫一次，共两次，获得所述动物模型；
或从雌性成蚊头、胸部提取唾液蛋白混合物首免豚鼠，然后每一周加强免疫一次，共1-2次，末次加强免疫后间隔1周，将豚鼠麻醉后每两天用雌性成蚊叮咬，叮咬次数在7-12次，获得所述动物模型。
作为优选，所述叮咬的时间每次为1小时。
作为优选，所述唾液蛋白混合物为用缓冲液或水研磨后的雌性成蚊头和胸部的上清液，所述缓冲液优选为PBS；在本发明具体实施方式中，所述唾液蛋白呼混合物提取方法如下：
使用30只未饲过血的雌性成蚊，取其头和胸部(含有唾液腺)置于500ulPBS中研磨碎。4℃，1000g离心10min，收集上清，即蚊虫头部唾液蛋白混合物。取5ul唾液蛋白混合物上清使用试剂盒测蛋白浓度。
作为优选，所述唾液蛋白混合物在免疫时的蛋白浓度为0.4mg/mL。在进行首免时，采用弗氏完全佐剂混合唾液蛋白混合物首免，两者比例优选为1:1；在进行加强免疫时，用弗氏不完全佐剂混合唾液蛋白混合物加强免疫，两者比例优选为1:1。
作为优选，所述豚鼠叮咬前将需要叮咬的部位暴露，其他部位包裹。在本发明具体实施方式中，所述豚鼠叮咬前将脸部和耳朵暴露，其他部位包裹。
作为优选，本发明所述雌性成蚊为雌性白纹伊蚊和/或雌性埃及伊蚊；在对豚鼠叮咬时，所述雌性成蚊的数量为至少为80只，所述雌性成蚊叮咬前进行饥饿处理(实验前一晚先提前取出饲喂雌性成蚊的葡萄干进行饥饿处理)。
通过对本发明动物模型的实验验证，本发明可以根据实验动物抓挠频率量化评估痒觉程度；而且本发明建立的豚鼠痒觉评估模型明显优于小鼠模型，小鼠模型在相同的构建方法下，其在被叮咬7次后仍无任何抓挠现象，而本发明模型随着叮咬次数的增加，抓挠次数和抓挠回数持续上升，并在叮咬6次后达到最高，并且本发明动物模型可以在一定程度上模拟蚊虫叮咬导致的人类皮肤红疹、风团等症状。
此外，在蚊虫叮咬前使用蚊虫唾液相关抗原混合佐剂注射豚鼠可以增强蚊虫叮咬导致的痒觉效应，表现为更显著的皮肤红肿和皮疹症状。
由以上技术方案可知，本发明建立的蚊虫叮咬豚鼠实验模型与蚊虫叮咬人类皮肤引发红疹风团伴瘙痒症状高度相似，发明中直接使用雌性成蚊对豚鼠进行叮咬或免疫唾液蛋白混合物导致豚鼠产生痒觉，并且该模型可以通过抓挠次数量化评估痒觉程度，相对于其他痒觉模型更加直接有效。同时，本发明中联合使用免疫唾液蛋白混合物和雌性成蚊叮咬导致豚鼠的痒觉效应，表现为更显著的皮肤红肿和皮疹症状；本发明动物实验模型有助于高效地筛选和研发防蚊止痒药物。
附图说明
图1所示为3组白纹伊蚊叮咬豚鼠后的抓挠次数结果；
图2所示为3组白纹伊蚊叮咬豚鼠后的抓挠回数结果；
图3所示为白纹伊蚊叮咬小鼠后的抓挠次数、回数结果；
图4所示为埃及伊蚊叮咬豚鼠后的抓挠次数、回数结果；
图5所示为豚鼠注射埃及伊蚊蛋白唾液混合物的抓挠次数、回数结果；
图6所示为注射白纹伊蚊唾液蛋白混合物+叮咬的豚鼠的抓挠次数、回数结果；
图7所示为豚鼠叮咬组和豚鼠注射+叮咬组的面部红斑、丘疹和风团现象；其中A为豚鼠叮咬组，B和C为豚鼠注射+叮咬组。
具体实施方式
本发明公开了一种模拟蚊虫叮咬症状的动物模型的构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述构建方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的构建方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种模拟蚊虫叮咬症状的动物模型的构建方法做进一步说明。
实施例1：本发明动物模型的构建方法
方法一：
(1)对蚊虫提前进行饥饿处理
将白纹伊蚊和/埃及伊蚊成蚊饲养在长宽高分别为45*45*45cm的蚊笼里，每笼吸血的雌性蚊虫控制在80-100只左右(实验前一晚提前取出蚊笼中的葡萄干，对蚊笼中的蚊虫进行饥饿处理)；
(2)实验用6周龄白色豚鼠在放入蚊笼叮咬前一天，将其脸部一侧的毛发用剃毛器脱毛；
(3)豚鼠麻醉
使用1％的戊巴比妥钠对豚鼠进行麻醉；
(4)蚊虫叮咬
将豚鼠其他部位全都用密封带封住，只露出豚鼠的脸和耳朵放入蚊笼，蚊虫叮咬其一个小时。豚鼠被蚊虫叮咬从第一次开始，之后每隔一天进行一次蚊虫叮咬(每两天叮咬)，次数在3-6次。
方法二：
使用30只未饲过血的雌性白纹伊蚊或30只未饲过血的雌性埃及伊蚊，取其头和胸部(含有唾液腺)置于500ul PBS中研磨碎。4℃，1000g离心10min，收集上清，即蚊虫头部唾液蛋白混合物于另一干净的1.5ml无菌无酶的离心管，做好标记，放入离心机4℃，1000g，再次离心2min。取5ul蛋白上清使用试剂盒测蛋白浓度。将白纹伊蚊唾液蛋白混合物和埃及伊蚊唾液蛋白混合物分别稀释到0.8mg/ml，随后将蚊虫唾液蛋白混合物与弗氏完全佐剂1：1的比例进行混合均匀形成乳白色乳滴，唾液蛋白混合物终浓度为0.4mg/ml，测试时将乳液滴到盐水的表面不会散开。取0.5ml混合物皮内注射进行首免。
首次注射唾液一周之后，再次取唾液蛋白混合物(与首免相同浓度)与不完全佐剂1:1的体积比例进行混合，充分混合均匀，直至混合物形成乳液，所得到的乳液应该非常稠，测试时将乳液滴到盐水的表面不会散开，取0.5ml混合物对豚鼠进行皮内注射，进行加强免疫。加强免疫之后一周，再次皮内注射相同浓度的蚊虫唾液蛋白与不完全佐剂的混合物0.5ml进行第二次加强免疫。
完全佐剂与不完全佐剂的主要区别在于是否在佐剂中加入灭活的结核分枝杆菌，弗式完全佐剂中的分枝杆菌可吸引巨噬细胞和其他细胞到注射部位。因此增强免疫应答能力更强。为减少副作用，弗氏完全佐剂一般用于初次免疫，弗氏不完全佐剂一般用于初次免疫后的加强免疫。
方法三：
在方法二的基础上只加强免疫1次，末次加强免疫后，间隔1周，进行方法一的操作，但叮咬次数增加至7-12次。
实施例2：本发明动物模型的构建方法的相关验证
1、方法一的验证
(2)白纹伊蚊叮咬验证
按照实施例1中方法一构建动物模型(采用白纹伊蚊)，豚鼠被蚊虫叮咬实验从第一次开始，之后每隔一天进行一次蚊虫叮咬实验，将豚鼠置于长宽高分别60*40*21cm的豚鼠笼中进行录像观察，观察记录第1天、第3天、第7天、第11天和第15天的抓挠行为(即叮咬1次、2次、4次、6次、8次)。试验重复3次。
记录与观察标准：
豚鼠抬起一只后腿靠近脸颊，在一秒钟或者几秒钟内抓挠数次，然后再把后腿放下，这一系列动作记为豚鼠的一回抓挠，而豚鼠在这几秒钟内，后腿抓挠脸颊的次数，被记为豚鼠在这个时间点的抓挠次数。但是豚鼠抓挠身体的其他部位，或者豚鼠用前腿擦拭脸部，或两只前腿都用了来梳理脸部两侧的毛发等这一系列行为动作，都不能算作豚鼠被蚊虫叮咬之后，导致痒觉产生的相关行为。全程录像(有利于后期视频回放和数据整理)，每次观察时间为豚鼠麻醉醒后两个小时，观察并且记录其抓挠情况。(每次实验豚鼠被蚊虫叮咬的时间和观察的时间需一致)。
结果：
结果见图1和图2，图1为三次重复试验的抓挠次数结果，从这图1三个结果中可以看出在前面六次叮咬中随着叮咬次数的增加，三组实验豚鼠的抓挠次数都呈现明显的上升趋势，第七次叮咬时，前两组实验豚鼠抓挠次数有明显的下降，产生了免疫耐受反应。因此，本发明建议豚鼠模型(单纯叮咬模型)叮咬次数最好控制在3-6次，在第6次时模型处于最佳过敏状态，抓挠现象最明显，更有利于有效地筛选蚊虫止痒药物。
图2为三次重复试验的抓挠回数结果，从这图2三个结果中可以看出，在前面六次叮咬中随着叮咬次数的增加，三组实验豚鼠的抓挠回数都呈现明显的上升趋势，第七次叮咬时，第二组豚鼠抓挠回数有明显的下降，因此本发明建议在筛选蚊虫止痒药物时，豚鼠模型的叮咬次数最好控制在六次，痒觉效应最佳。
与小鼠模型的对比：
按照方法一构建动物模型(采用白纹伊蚊)，实验动物更换为6周龄未被叮咬C57品系的小鼠，叮咬次数为8次，其他完全参照实施例1中的方法一，记录和观察标准参照前述。图3结果显示，在8次叮咬过程中，小鼠虽出现了抓挠行为，但是无论从抓挠回数还是抓挠次数看都较少，无法表现出明显的痒觉效应。
(2)埃及伊蚊叮咬验证
按照实施例1中方法一构建动物模型(采用埃及伊蚊)，豚鼠被蚊虫叮咬实验从第一次开始，之后每隔一天进行一次蚊虫叮咬实验，将豚鼠置于长宽高分别60*40*21cm的豚鼠笼中进行录像观察，观察记录第1天、第3天、第7天、第11天和第15天的抓挠行为(即叮咬1次、2次、4次、6次、8次)。记录与观察标准同前述。
结果：
结果见图4，图4结果同样显示出与白纹伊蚊叮咬豚鼠的相同结果，即在前面六次叮咬中随着叮咬次数的增加，实验豚鼠的抓挠次数、回数都呈现明显的上升趋势，第七次叮咬时，实验豚鼠抓挠次数、回数有明显的下降，产生了免疫耐受反应。因此，本发明建议豚鼠模型(单纯叮咬模型)叮咬次数最好控制在3-6次，在第6次时模型处于最佳过敏状态，抓挠现象最明显，更有利于有效地筛选蚊虫止痒药物。
2、方法二的验证
按照实施例1方法二构建动物模型(采用埃及伊蚊提取唾液蛋白混合物首免和三次加强免疫)，三次加强免疫后均将其放置在长宽高分别为60*40*21cm的豚鼠笼中进行观察记录抓挠情况，全程录像，观察时间为注射唾液混合物之后两小时。记录与观察标准同前述。
结果：
结果见图5，第二次加强免疫时，实验豚鼠的抓挠次数和抓挠回数最多，第三次抓挠次数和回数极速下降，产生了免疫耐受，因此，本发明建议豚鼠模型(单纯注射模型)加强免疫次数最好控制在两次，模型处于最佳过敏状态，抓挠现象最明显，更有利于有效地筛选蚊虫止痒药物。
3、方法三的验证
参照实施例1方法二先进行唾液蛋白混合物的免疫(采用白纹伊蚊)，然后再按照方法一进行叮咬(采用白纹伊蚊，叮咬13次)，构建动物模型，记为豚鼠注射+叮咬组；
仅按照方法一进行叮咬(采用白纹伊蚊，叮咬6次)，构建动物模型，记为豚鼠叮咬组；
仅按照方法一进行叮咬(采用白纹伊蚊，叮咬6次，更换6周龄未被叮咬C57品系的小鼠)，构建动物模型，记为小鼠叮咬组；
观察方式和标准同前述，同时按照下表1的评分标准进行评分：
表1
第六阶段中红斑丘疹和风团数量最多，过敏症状最严重，故给予最高分6分。第一阶段，无任何抓挠和红斑丘疹等过敏现象的出现，故给予0分，第二阶段仅出现1-2个瘙痒性红斑丘疹，没有出现抓挠现象，故记为1分，第三阶段，出现了1-2个红斑丘疹还出现了1-2回抓挠，故记为2分，第四阶段蚊虫叮咬后出现2-3个瘙痒性红斑丘疹，且有抓挠现象，故给予3分，第五阶段蚊虫叮咬后出现3-4个红斑丘疹和风团，记为4分，第七阶段出现风团，每个风团大约3-5mm并持续数小时，计为5分(该阶段可能出现免疫耐受或症状消退情形，故降低分值)。
豚鼠注射+叮咬组抓挠现象结果见图6，图6结果显示，在辅助注射唾液蛋白混合物后，白纹伊蚊叮咬豚鼠随着叮咬次数的增加，抓挠次数和回数整体均表现出一个先上升再下降的趋势，中间略有波动，在叮咬第10次后达到最高值，在叮咬第12次后直线下降，因此，本发明建议豚鼠模型(注射+叮咬模型)叮咬次数最好控制在7-12次，在第10次时模型处于最佳过敏状态，抓挠现象最明显，更有利于有效地筛选蚊虫止痒药物。
图7和表2结果显示，与豚鼠叮咬组相比，豚鼠注射+叮咬组出现更加明显的红斑丘疹和风团现象。
表2结果显示，随着叮咬次数的增加，豚鼠注射+叮咬组比豚鼠叮咬组的红斑丘疹和风团更多，痒觉效应更强。同时也说明了豚鼠模型能够很好地模拟蚊虫叮咬的症状。而通过对豚鼠组与小鼠组痒觉效应强度的比较，能够看出豚鼠组在被蚊虫叮咬后过敏症状要比小鼠组要更明显。
表2
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种模拟蚊虫叮咬症状的动物模型的构建方法，其特征在于，包括：
从雌性成蚊头、胸部提取唾液蛋白混合物首免豚鼠，然后每一周加强免疫一次，共两次，获得所述动物模型；
或从雌性成蚊头、胸部提取唾液蛋白混合物首免豚鼠，然后每一周加强免疫一次，共1-2次，末次加强免疫后间隔1周，将豚鼠麻醉后每两天用雌性成蚊叮咬，叮咬次数在7-12次，获得所述动物模型；
所述雌性成蚊为雌性白纹伊蚊和/或雌性埃及伊蚊，数量至少为80只，同时叮咬前进行饥饿处理，所述唾液蛋白混合物为用缓冲液或水研磨后的雌性成蚊头和胸部的上清液，所述首免为用弗氏完全佐剂混合唾液蛋白混合物首免；所述加强免疫用弗氏不完全佐剂混合唾液蛋白混合物加强免疫。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS。
3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述豚鼠叮咬前将需要叮咬的部位暴露，其他部位包裹。
4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，所述豚鼠叮咬前将脸部和耳朵暴露，其他部位包裹。
5.权利要求1-4任意一项所述构建方法在止痒药物筛选和蚊虫叮咬致瘙痒的基础研究中的应用。
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