CN111424052A - 改造的hek293t细胞及制备方法、载药外泌体及制备方法 - Google Patents

改造的hek293t细胞及制备方法、载药外泌体及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备改造HEK293T细胞的方法、经过改造的HEK293T细胞、制备载药外泌体的方法及载药外泌体。该制备改造HEK293T细胞的方法包括以下步骤：S1：构建质粒：利用pcDNA3.1表达载体作为质粒骨架，分别构建3个质粒：pcDNA3.1‑STEAP3，pcDNA3.1‑SDC4，pcDNA3.1‑NadB片段；S2：将S1中3种质粒按照1‑3：1‑3：1‑3的比例转染到HEK293T细胞中，筛选稳定细胞株，获得改造后的HEK293T细胞株。通过采用上述技术方案，由于这三种质粒的协同作用，能够对自身外泌体分泌量较大的HEK293T细胞进行改造，从而进一步提高其外泌体分泌量，为临床试验提供更多的选择。

Description

改造的HEK293T细胞及制备方法、载药外泌体及制备方法
技术领域
本发明涉及药物载体制备领域，具体涉及改造的HEK293T细胞及制备方法、载药外泌体及制备方法。
背景技术
向各种特定类型的细胞靶向递送药物分子是精准医学中的主要面临的主要挑战，天然外泌体具备生物功能化纳米囊泡，该囊泡可通过基因工程的手段展示多种靶向蛋白或者多肽的配体并直接包装药物以行使药物靶向递送能力。
外泌体是一种活细胞在生理或病理状态下主动分泌到细胞外的膜性囊泡，其携带蛋白，运送RNA，其内容物包括蛋白质、短链肽、DNA片段、lncRNA、磷脂以及miRNA。研究发现肥大细胞、树突状细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、间充质干细胞及肿瘤细胞等都可以产生并释放外泌体。外泌体可递送化学药物、蛋白质及肽配基和基因药物等多种药物，以外泌体为基础的治疗方法已被广泛研究用于药物递送，以获得更好的结果。最近的研究表明，它们具有低免疫原性、高耐受性、可生物降解性和无毒等特性，因此它们是理想的药物递送载体，与现有的合成递送系统相比具有各种优势。此外，它们有助于提供保护性屏障，可以延长药物的血浆半衰期并提高血液中的药物水平。因此，各种报告表明，外泌体可以用作有效的纳米载体，以提供小的干扰RNA和微小RNA、蛋白质或化学药物来改善癌症的治疗。
外泌体装载的药物类型有小分子化学药物、蛋白质和肽、核酸药物等。首要考虑的就是外泌体的供体细胞选用,现在通常选用的是未成熟的树突状细胞(DC细胞)、MSC来源的外泌体或者细胞(如HEK293细胞)来源的外泌体。其中,未成熟DC细胞来源的外泌体引起机体免疫反应的能力较弱、毒性较低，但是外泌体收集量相对较小，很难制备出大量的外泌体以满足临床试验的需要。
因此，本领域仍然需要一种能够制备大量外泌体的方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一是提供一种本发明的目的是提供一种制备改造的HEK293T细胞的方法。利用该方法，能够对HEK293T细胞进行改造，从而将外泌体的产量提高一倍或甚至更多，以便满足临床试验的需要。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
在第一方面，提供了一种制备改造HEK293T细胞的方法，所述包括以下步骤：
S1：构建质粒：利用pcDNA3.1表达载体作为质粒骨架，分别构建3个质粒：pcDNA3.1-STEAP3， pcDNA3.1-SDC4，pcDNA3.1-NadB片段；
S2：将S1中3种质粒按照1-3：1-3：1-3的比例转染到HEK293T细胞中，筛选稳定细胞株，获得改造后的HEK293T细胞株。
通过采用上述技术方案，由于这三种质粒的协同作用，能够对自身外泌体分泌量较大的HEK293T细胞进行改造，从而进一步提高其外泌体分泌量，为临床试验提供更多的选择。
在一较佳示例中，根据第一方面所述的技术方案可以进一步配置为：所述比例为1:1:1。
在第二方面，提供了一种经过改造的HEK293T细胞，所述细胞能够通过根据第一方面所述的方法获得。
在第三方面，提供了一种利用第二方面所述的经过改造的HEK293T细胞制备载药外泌体的方法：所述方法包括以下步骤：
S3:构建质粒：利用可与肿瘤表面αv整合蛋白特异结合的肽iRGD(CRGDK\GPDC)融合表达于外泌体膜蛋白(lamp2b)上以获得质粒iRGD-lamp2b；
S4:在根据第一方面所述的方法中获得的HEK293T细胞中表达质粒iRGD-lamp2b，筛选稳定细胞株；
S5：利用无外泌体的培养基培养步骤S4获得的HEK293T细胞，收集细胞上清液，进行超速离心分离获取靶向αv整合蛋白阳性癌细胞外泌体；
S6:通过电穿孔仪把药物电转到步骤S5获得的靶向外泌体中，使外泌体包裹上药物。
通过该技术方案，通过在HEK293T细胞中表达质粒iRGD-lamp2b，能够使细胞能够与肿瘤表面αv整合蛋白进行特异性结合，然后利用药物对αv整合蛋白阳性癌细胞进行杀伤，从而提高癌症治疗的靶向性，提高药物效率。
在一较佳示例中，根据第一方面所述的技术方案可以进一步配置为：在步骤S6中，所述药物选自小分子化学药物、蛋白质、肽和核酸药物中的一种或多种。
利用该技术方案，能够将多种不同的药物高效地包裹于根据本发明制备的外泌体载体中，从而实现对αv整合蛋白阳性癌细胞的靶向治疗或杀伤。
技术效果
本发明改造的HEK293T细胞与其他细胞相比，可以产出大量、均一的外泌体作为药物载体，大大低了成本。另一方面通过电击法充分发挥外泌体保护药物和生物相容的特性，使外泌体表面负载多肽和基因药物，同时还能增加负载物的稳定性，降低了被免疫系统清除可能；此外，外泌体可以对肿瘤同时进行靶向成像与携带基因药物进入肿瘤细胞，促进表达，利于及时评估肿瘤诊断和治疗的协同性和一致性，在生物医学领域中有着广阔的应用前景，该发明已具有完善的实验流程体系，且实验步骤简便、易于实施。
与现有技术相比，利用根据本发明方法制备的外泌体，能够实现药物的治疗潜力，高效、组织特异性的递送药物用于治疗癌症；尤其是利用靶向外泌体包裹药物来治疗αv 整合素阳性癌细胞。
附图说明
图1是利用NTA检测本发明方法改造的HEK293T细胞分泌的颗粒数量分布图；
图2是利用NTA检测未经改造的HEK293T细胞分泌的颗粒数量分布图；
图3是利用NTA检测DC细胞分泌的颗粒数量分布图；
图4是DC细胞、未经改造的HEK293T细胞和利用本发明方法改造的HEK293T细胞的外泌体分泌量的对比图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
作为药物载体，细胞外泌体具有诸多优点，例如低免疫原性、高耐受性、可生物降解性和无毒等特性。然而，尤其受限于其分泌量的限制，其应用一直受到严重阻碍。因此，本发明人对此进行了研究，并且通过对自身外泌体分泌量较大的HEK293T细胞进行了进一步的改造，即将质粒pcDNA3.1-STEAP3、pcDNA3.1-SDC4和pcDNA3.1-NadB整合到HEK293T 细胞中。出乎意料地，本发明人发现，通过该改造，使得HEK293T细胞的外泌体分泌量大幅提高，增加了1倍甚至更多，从而使其更方便地应用于临床试验，这对于开拓其作为药物载体的用途具有重要的意义。
在一个实施方案中，前述改造是通过以下方法实现的：所述方法包括以下步骤：
S1：构建质粒：利用pcDNA3.1表达载体作为质粒骨架，分别构建3个质粒，即pcDNA3.1-STEAP3，pcDNA3.1-SDC4，pcDNA3.1-NadB片段；
S2：将S1中3种质粒按照1-3：1-3：1-3的比例转染到HEK293T细胞中，筛选稳定细胞株，获得改造后的HEK293T细胞株。
经此改造，HEK293T细胞能够大幅提高外泌体分泌量，从而加载更多的药物，包括但不限于小分子化学药物、蛋白质和肽、核酸药物。在一个实施方案中，利用该改造的HEK293T细胞负载抗癌药物，其制备方法包括以下步骤：
S3:构建质粒：利用可与肿瘤表面αv整合蛋白特异结合的肽iRGD(CRGDK\GPDC)融合表达于外泌体膜蛋白(lamp2b)上作为靶向的基因工程化外泌体可靶向αv整合蛋白阳性癌细胞；其中iRGD的氨基酸序列为：CRGDKGPDC；
S4:在S2中获得的HEK293T细胞中表达质粒iRGD-lamp2b，筛选稳定细胞株；
S5：利用无外泌体的培养基培养S4获得的HEK293T细胞，收集细胞上清液，进行超速离心分离获取靶向外泌体；
S6:通过电穿孔仪把药物电转到S5获得的靶向外泌体中，使外泌体包裹上药物，即可获得靶向杀伤αv整合蛋白阳性癌细胞的载药外泌体。
以下将参考具体实施例来对本发明进行进一步的说明。本领域的普通技术人员会理解，列举这些实施例的目的仅仅是为了使本领域的普通技术人员更好地理解本发明，而无意于以任何方式限制本发明。
实施例1HEK293T细胞的改造
质粒骨架：pcDNA3.1表达载体，分别构建3个质粒，pcDNA3.1-STEAP3，pcDNA3.1-SDC4， pcDNA3.1-NadB fragment；
质粒骨架 质粒包含基因
pcDNA3.1 STEAP3 Species:Homo sapiens,Gene ID:55240
pcDNA3.1 SDC4 Species:Homo sapiens,Gene ID:6385
pcDNA3.1 NadBfragment Species:Homo sapiens,Gene ID:8027
将上述3种质粒按照1：1：1的比例转染到HEK293T细胞中，筛选稳定细胞株，获得改造后的HEK293T细胞株；
实施例2靶向外泌体的制备
构建质粒：利用可与肿瘤表面αv整合蛋白特异结合的肽iRGD(CRGDK\GPDC)融合表达于外泌体膜蛋白(lamp2b)上作为靶向的基因工程化外泌体可靶向αv整合蛋白阳性癌细胞；在第一步中获得的HEK293T细胞中表达质粒iRGD-lamp2b，筛选稳定细胞株；
利用无外泌体的培养基培养改造后的携带iRGD-lamp2b表达质粒的HEK293T细胞，收集细胞上清液，分离获取HEK293T细胞外泌体；提取步骤如下：
(1)收集样本约150mL，置于4度保存(不超过一周)；
(2)300×g，4度离心10min，取上清；
(3)16500×g，4度离心20min，取上清；
(4)用超滤管(100kDa)以<3000×g的转速浓缩样本，至体积为25ml左右
(5)120000×g，4度离心60min，弃上清；
(6)加15mL1×PBS重悬沉淀，120000×g，4度离心60min，弃上清；
(7)用300μL1×PBS重悬沉淀后进行后续实验。
实施例3外泌体通过电击法负载基因药物
在无菌PBS溶液中按一定比例加入100ug的靶向外泌体和50ug的药物doxorubicin(Dox)，混匀后，加入电穿孔皿中，放入电穿孔仪，按照一定的反应条件：电压350v，电容150μF，放电时间1-5ms，放电次数1-2次；进行电穿孔，电穿孔后室温反应1h，经100000g 超速离心90min，收集沉淀，用PBS溶液重悬后，即可得到同时负载基因药物并具有靶向αv整合蛋白阳性癌细胞功能外泌体。
实施例4外泌体数量的检测
收集50mL经改造的HEK293T细胞上清、未经改造的HEK293T细胞上清、DC细胞上清，提取外泌体进行Nanoparticle Tracking Analysis(NTA)分析(具体技术参数参照Zhang Jing,Lu Shaohua,Zhou Ye et al.Motile hepatocellular carcinoma cells preferentiallysecret sugar metabolism regulatory proteins via exosomes.[J].Proteomics,2017,17)比较，结果分别示于图1 至图3中。从图1可见，经改造的HEK293T细胞具有非常均一的粒径分布，从而有利于用于进行良好的载药用途。从图2可见，未经改造的HEK293T细胞的分泌量较少，且粒径分布范围较宽。从图3可见，DC细胞的外泌体分泌量非常少，且分泌的外泌体的粒径范围较宽，即所得外泌体粒径非常不均匀。同时对外泌体数量进行数据分析比较，得到的结果显示于图4中，图4结果可见，经改造的HEK293T细胞提取的外泌体数量远高于未经改造的 HEK293T细胞和DC细胞细胞所提取的外泌体数量，其证明了经过改造后的HEK293T细胞确实具有大幅提高外泌体分泌量的效果。

Claims (6)

1.一种制备改造HEK293T细胞的方法，所述包括以下步骤：
S1：构建质粒：利用pcDNA3.1表达载体作为质粒骨架，分别构建3个质粒：pcDNA3.1-STEAP3，pcDNA3.1- SDC4，pcDNA3.1- NadB片段；
S2：将S1中3种质粒按照1-3：1-3：1-3的比例转染到HEK293T细胞中，筛选稳定细胞株，获得改造后的HEK293T细胞株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2中，所述比例为1:1:1。
3.一种经过改造的HEK293T细胞，其能够通过根据权利要求1或2所述的方法获得。
4.一种利用权利要求3所述的经过改造的HEK293T细胞制备载药外泌体的方法：所述方法包括以下步骤：
S3: 构建质粒：利用可与肿瘤表面αv整合蛋白特异结合的肽iRGD(CRGDK\GPDC)融合表达于外泌体膜蛋白(lamp2b)上以获得质粒iRGD-lamp2b；
S4: 在根据第一方面所述的方法中获得的HEK293T细胞中表达质粒iRGD-lamp2b，筛选稳定细胞株；
S5：利用无外泌体的培养基培养步骤S4获得的HEK293T细胞，收集细胞上清液，进行超速离心分离获取靶向外泌体；
S6: 通过电穿孔仪把药物电转到步骤S5获得的靶向外泌体中，使外泌体包裹上药物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述药物选自小分子化学药物、蛋白质、肽和核酸药物中的一种或多种。
6.一种载药外泌体，其能够通过权利要求4或5所述的方法制得。
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