CN111417313B - 高等电点蛋白质与酪蛋白的络合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于制备高等电点蛋白质与酪蛋白的络合物的方法,该方法包括特定顺序的加热、冷却和保持步骤。还提供了通过此种方法获得的络合物及其用途,具体地讲是它们在治疗方法中的用途。
Description
技术领域
本发明提供了用于制备高等电点蛋白质与酪蛋白的络合物的方法,该方法包括特定顺序的加热、冷却和保持步骤。还提供了通过此种方法获得的络合物及其用途,具体地讲是它们在治疗方法中的用途。
背景技术
若干生物活性蛋白质诸如乳铁蛋白(lactoferrin)、溶菌酶或乳凝集素(lactadherin)已被识别为具有有益的健康益处,因此已尝试将此种蛋白质用于营养产品或药物产品中。然而,此种蛋白质对严苛的处理(诸如暴露于高热)非常敏感,并且已证实将此种蛋白质包括在工业产品中有困难。因此,需要开发此种蛋白质的稳定形式。
例如,乳铁蛋白是人乳的组分。它也存在于诸如婴儿配方食品的产品中,但含量远低于人母乳中的含量。因此,先前已描述用来自牛来源的乳铁蛋白来补充婴儿配方食品。牛乳铁蛋白(bLf)是约77kDa的铁结合糖蛋白,并且由约700个氨基酸的单多肽链组成。人乳铁蛋白是分子量为80kDa的糖蛋白,其对铁表现出高亲和力。人Lf与牛Lf之间的序列同源性为约70%,并且两者的3D结构非常相似但不相同。
Lf是具有约8.9的高等电点(pI)的强阳离子蛋白质。在中性pH(约pH7)下,已知Lf与其它阴离子蛋白质诸如β-乳球蛋白、酪蛋白和白蛋白结合。由于这个原因,在婴儿配方食品共混物的湿混合期间添加乳铁蛋白时,蛋白质将在温度和pH的影响下发生伸展变性和重折叠,从而导致蛋白质不稳定性和粘度增大。这种现象使得在诸如婴儿配方食品的产品中以湿态(即,在干燥之前)添加乳铁蛋白非常复杂。
因此,对于在制备好产品的基料粉末之后通过干混合以固体形式将乳铁蛋白添加到诸如婴儿配方食品的产品中已有描述。然而,此种方法具有挑战性,因为以固体形式添加的乳铁蛋白需要是无菌的。为了实现所需的无菌水平,乳铁蛋白需要经受灭菌技术。大多数灭菌技术涉及使用高热,这可导致乳铁蛋白的变性。可使用其它灭菌技术,诸如膜过滤,但这些灭菌技术可能成本高昂的并且需要特定设备。另外,在最终产品中添加无菌乳铁蛋白需要特定且精确的无菌定量给料设备。
因此,为了克服这些问题,非常希望开发乳铁蛋白的另选形式,从而允许在湿混合物中添加乳铁蛋白连同婴儿配方食品的其它成分,然后在婴儿配方食品组合物中进行无菌加工或喷雾干燥。
作为以天然形式添加的另选方案,对于将乳铁蛋白以络合物形式添加到可食用产品中已有描述。WO2012/045801描述了包含乳铁蛋白和至少一种等电点低于pH 7.0的其它蛋白质的络合物凝聚层,该络合物凝聚层可用于延缓蛋白质消化并且改善人的代谢响应、肠道炎症响应、饱腹感和食物摄入。然而,该文献未解决在如婴儿配方食品的产品的加工期间使乳铁蛋白稳定的问题,并且尤其是未指出所述凝聚层足够稳定到能够在婴儿配方食品的制造中添加到湿混合物中。
溶液中带相反电荷的蛋白质(其为胶体)在特定pH、离子强度和化学计量下自发地相互作用以形成络合物。此种络合物可在溶液中保持可溶或导致液-液相分离。在后一种情况下,形成络合物凝聚层。“在胶体组分中更浓缩的相为凝聚层,而另一个相为平衡溶液”。(IUPAC,1997年)两相保持平衡,因此称为不相容。可溶的络合物和凝聚层两者均对介质的特性非常敏感,并且在pH变化、离子强度或温度的影响下通常是可逆的,因此可能在食物产品加工期间被破坏。蛋白质-蛋白质络合物的此种可逆性在相关文献中有所描述。例如,Anema等人;(Coacervates of lysozyme and β-casein;Journal of Colloid andInterface Science 398(2013):255-261(溶菌酶和β-酪蛋白的凝聚层,《胶体与界面科学杂志》,第398卷,2013年,第255-261页))报道,乳铁蛋白或溶菌酶和β-酪蛋白的络合物是可逆的,即在pH变化和离子强度(例如添加NaCl)的影响下。
对于通过使用交联剂使络合物凝聚层更稳固已有描述。然而,在用于敏感消费者如婴儿和幼儿的产品中添加交联剂将是不可取的,其中可使用的成分受到非常严格法规的限制。
在WO2012/045801中,通过pH诱导产生乳铁蛋白和等电点低于7的蛋白质的络合物凝聚层。然而,诸如该文档中描述的络合物的稳定性不足以抵抗严苛的处理诸如高热,这将使得它们不适合与诸如婴儿配方食品的产品的其它成分一起加工。
另外,Anema等人;(Co-acervates of lactoferrin and caseins;Soft Matter 8(2012):4471-4478(乳铁蛋白和酪蛋白的凝聚层,《软物质》,第8卷,2012年,第4471-4478页))研究了通过在不同温度处将pH调节至6.55诱导形成乳铁蛋白和酪蛋白(即β-酪蛋白)的凝聚层。然而,该文献根本未解决所获得凝聚层的可逆性问题,该凝聚层在经受严苛加工诸如灭菌或干燥时可能被破坏。
Li Quanyang等人;(Formation of lactoferrin/sodium caseinate complexesand their adsorption behaviour at the air/water interface;Food Chemistry,232(2017);697-703(乳铁蛋白/酪蛋白酸钠络合物的形成及其在空气/水界面处的吸附行为,《食品化学》,第232卷,2017年,第697-703页))描述了涉及将酪蛋白酸钠和乳铁蛋白的溶液加热然后立即冷却的方法。该文献中描述的方法是不利的,因为该方法不适用于与胶束酪蛋白形成络合物。希望提供也允许与胶束酪蛋白形成络合物的方法。
Pan等人;(Self-assembly ofβ-casein and lysozyme;Journal of Colloid andInterface Science,316(2)(2007),405-412(β-酪蛋白和溶菌酶的自组装,《胶体与界面科学杂志》,第316卷第2期,2007年,第405-412页))描述了形成β-酪蛋白与溶菌酶的络合物的方法,该方法涉及在4.0和6.0之间或在9.0和12.0之间扩展的合适范围内进行pH调节,然后在80℃处热处理30分钟并冷却。该方法导致形成在pH 3.0和12.0下不稳定并且在0.15MNaCl的存在下聚集体的纳米粒子。仅通过美拉德反应将葡聚糖接枝到β-酪蛋白上才能使纳米粒子在中性pH和盐溶液中稳定。希望提供方法来获得更稳定的络合物,该络合物无需在络合物中添加其它组分诸如葡聚糖即能够抵抗此种条件。这在婴儿配方食品中尤其重要,其中希望保持成分列表尽可能短,并且其中法规约束非常严格。
希望以足够稳固以经受严苛处理诸如热灭菌或干燥的形式提供乳铁蛋白和/或其它敏感蛋白质诸如溶菌酶,因此不需要另选的灭菌和无菌定量给料方法,这些方法使得制造含有敏感蛋白质如乳铁蛋白的产品显著更复杂且成本更高。也希望能够与所有类型的酪蛋白(包括胶束酪蛋白)形成络合物。
本发明有利地解决了上述问题。
发明内容
在第一方面,本发明提供了用于制备等电点为至少7的蛋白质与酪蛋白的络合物的方法,该方法包括以下步骤:
a.提供处于6.5至7.5范围内的pH的等电点为至少7的蛋白质和酪蛋白的溶液;
b.将温度从等电点为7或更高的蛋白质的变性温度逐渐升高至在85℃至95℃范围内的温度;
c.将溶液在85℃至95℃的温度处保持至少30秒;以及
d.在至少30分钟的时间段内将温度从85℃至95℃逐渐降至低于5℃的温度
e.将溶液在低于5℃的温度处保持至少15分钟。
在第二方面,本发明提供了等电点为至少7的蛋白质与酪蛋白的络合物,其通过本发明的方法是可获得的或通过本发明的方法获得。
在第三方面,本发明提供了产品,其包含本发明的络合物。
在第四方面,本发明提供了用于制备本发明的产品的方法。
在第五方面,本发明提供了本发明的络合物,其用在治疗中。
在第五方面,本发明涉及本发明的络合物,其用在下列方法中
a)预防、减少和/或治疗感染;
b)调节、促进和/或支持免疫应答;
c)促进和/或支持有益肠道菌群的生长;
d)促进和/或支持认知功能;
e)促进和/或支持婴儿或幼儿的健康成长;或
f)促进婴儿粪便变软。
附图说明
图1:在实施例1中获得的凝聚层的CLSM图像。使用63倍物镜拍摄的样品的Z堆叠的静态图像。凝聚层显示为具有多孔结构的均匀球形颗粒。
图2:A:在实施例1中获得的凝聚层在离心之后的CLSM图像。离心处理之后粒料的图像,使用20倍物镜拍摄。B:离心处理之后凝聚层溶液的图片。凝聚层沉淀清晰可见。
图3:在实施例1中获得的凝聚层在冷藏24小时之前(A)和之后(B)的CLSM图像,使用20倍物镜拍摄。在这两幅图像上均清楚地看到凝聚层,但冷藏一夜之后的凝聚层较小。
图4:在实施例2(比较例)中获得的组合物的CLSM图像,使用20倍物镜拍摄。在上清液(A)和沉淀(B)中未见凝聚层。
图5:在实施例3(比较例)中获得的组合物的CLSM图像,使用20倍物镜拍摄。在上清液(A)和沉淀(B)中未见凝聚层。
图6:在实施例4(比较例)中获得的组合物的CLSM图像,使用20倍物镜拍摄。在上清液(A)和沉淀(B)中未见凝聚层。
图7:实施例5的凝聚层在SDS中稀释凝聚层之后的光学显微图像。仍可看到凝聚层为均匀球形颗粒。凝聚层被放大10倍。
图8:实施例5的凝聚层在经受高速离心之后的光学显微图像。仍可看到凝聚层为均匀球形颗粒。凝聚层被放大10倍。
图9:实施例5的凝聚层在用水稀释并将pH调节至3.5之后的光学显微图像。仍可看到凝聚层为均匀球形颗粒。凝聚层被放大10倍。
图10:实施例5的凝聚层在用水稀释并将pH调节至3.5并随后在70℃处加热15分钟之后的光学显微图像。仍可看到凝聚层为均匀球形颗粒。凝聚层被放大10倍。
图11:实施例5的凝聚层在用水稀释并将pH调节至11之后的光学显微图像。仍可看到凝聚层为均匀球形颗粒。凝聚层被放大10倍。
图12:实施例5的凝聚层在用水稀释并将pH调节至10并随后在70℃处加热15分钟之后的光学显微图像。仍可看到凝聚层为均匀球形颗粒。凝聚层被放大10倍。
图13:实施例5的凝聚层在用100mM NaCl稀释之后的光学显微图像。仍可看到凝聚层为均匀球形颗粒。凝聚层分别被放大10倍(A)和20倍(B)。
图14:实施例6的凝聚层的光学显微图像。可看到凝聚层为均匀球形颗粒。凝聚层在较大图片上被放大10倍,并且在较小图片中被缩放4倍。
具体实施方式
定义
如本文所用,下列术语具有下列含义。
术语“婴儿”是指年龄在12个月以下的儿童。
表述“幼儿”是指年龄介于一岁和七岁之间的儿童。
表述“营养组合物”是指供给个体养分的组合物。这种营养组合物通常为口服或静脉内施用,并且其通常包括脂质或脂肪源以及蛋白质源。
在一个具体实施方案中,本发明的组合物是低变应原营养组合物。表述“低变应原营养组合物”是指不大可能引起过敏反应的营养组合物。
在一个具体实施方案中,本发明的组合物是“合成的营养组合物”。表述“合成的营养组合物”是指通过化学和/或生物方法所获得的混合物,该混合物的化学性质可能与哺乳动物乳汁中天然存在的混合物相同(也就是说,合成的组合物不是母乳)。
如本文所用,表述“婴儿配方食品”是指旨在专用于供给在生命的头几个月期间的婴儿营养,而且本身满足这类人的多种营养需求的食料(符合欧盟委员会2006年12月22日颁发的针对婴儿配方食品和较大婴儿配方食品的第91/321/EEC 2006/141/EC号指令中第2(c)条的规定)。也是指旨在用于婴儿的营养组合物,并且如在食品法典委员会(法典STAN72-1981)和婴儿特殊品(包括针对特殊医学目的的食物)中所定义。表述“婴儿配方食品”既涵盖“1段婴儿配方食品”,也涵盖“2段婴儿配方食品”或“较大婴儿配方食品”。
“2段婴儿配方食品”或“较大婴儿配方食品”从第6个月开始给予。婴儿配方食品构成了这类人逐渐多样化饮食中的主要液体元素。
表述“婴孩食物”是指旨在专用于供给在生命的头一年期间的婴儿或幼儿营养的食料。
表述“婴儿谷物组合物”是指旨在专用于供给在生命的头一年期间的婴儿或幼儿营养的食料。
术语“强化剂”是指适于与母乳或婴儿配方食品混合的液体或固体营养组合物。
表述“天龄/周龄/月龄/年龄”和“出生天数/周数/月数/年数”可互换使用。
“母乳”应理解为母亲的乳汁或初乳。
“低聚糖”为含有少量(通常三份至十份)普通糖(单糖)的糖类聚合物。
术语“益生元”是指由赋予健康益处的宿主微生物选择性地利用的底物(专家共有文献:The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics(ISAPP)consensus statement on the definition and scope of prebiotics,NatureReviews Gastroenterology&Hepatology,2017,14,491–502(益生菌和益生元国际科学协会(ISAPP)关于益生元定义和范围的共识声明,《自然评论:胃肠病学与肝脏病学》,2017年,第14期,第491-502页))。
术语“益生菌”是指当以足够的量施用时向宿主赋予健康益处的活微生物(FAO/WHO,2002年)。微生物细胞一般为细菌或酵母。
除非另外指明,否则所有百分比均按重量计。
用于制备络合物的方法
本发明提供了用于制备酪蛋白与等电点为至少7的蛋白质的络合物的具体方法。所获得的络合物可以是可溶的络合物或凝聚层。优选,络合物为凝聚层。
该方法包括特定顺序的加热、保持和冷却步骤。通过该特定方法获得的络合物是特别稳固的,并且可在环境变化的情况下保持,并且可经受严苛的条件,诸如pH变化、加热、施加机械应力、离子强度变化和添加表面活性剂,如将在实施例中所示。
使用本发明的方法,等电点为至少7的任何蛋白质均可与酪蛋白形成络合物。在本发明的一个优选的方面,蛋白质具有至少8、优选至少8.5、最优选8.9的等电点。此种蛋白质是优选的,因为等电点越高,它们在中性pH处将为越强的阳离子,因此它们在中性pH处越容易与酪蛋白相互作用。
等电点为至少7的特别有利的蛋白质包括乳铁蛋白、乳凝集素和溶菌酶。此种蛋白质是特别优选的,这是由于与其食用相关联的健康益处。例如,乳铁蛋白已被描述为在以下方面具有有益作用:预防、减少和/或治疗感染;调节、促进和/或支持免疫应答;促进和/或支持有益肠道菌群的生长;促进和/或支持认知功能;促进和/或支持婴儿或幼儿的健康成长;或促进婴儿粪便变软。
所有类型的酪蛋白都适用于本发明的目的。然而,β-酪蛋白、κ-酪蛋白和α-s1酪蛋白优选添加在用于婴儿和幼儿的产品中,诸如婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、婴儿谷物、婴孩食物和成长乳,因为它们天然存在于人母乳中,而α-s2酪蛋白存在于牛乳中但不存在于母乳中。
酪蛋白并且尤其是β-酪蛋白表现出允许络合物形成的独特特性。具体地讲,β-酪蛋白序列的强亲水性N端结构域和强疏水性C端结构域允许其形成表面活性剂样聚集体。β-酪蛋白序列中的该特定对比赋予该蛋白质尤其可用于本发明目的的特性。由于在蛋白质的N端处的氨基酸的十分之一包含总电荷的三分之一,并且pI为5,因此在中性pH处在N端处形成高密度负电荷,从而使得该蛋白质可以与在该pH处为阳离子的蛋白质强结合。
在一个优选的方面,酪蛋白为胶束酪蛋白的形式。在诸如婴儿配方食品、成长乳的营养组合物中,胶束酪蛋白尤其优于酪蛋白酸盐。胶束酪蛋白与酪蛋白酸盐诸如例如酪蛋白酸钠相比具有不同的行为。本发明的方法尤其有利,因为它允许与如上定义的所有类型的酪蛋白(包括胶束酪蛋白)形成络合物。
在本发明的一个优选的方面,等电点高于7的蛋白质是乳铁蛋白并且酪蛋白是β-酪蛋白。
在本发明方法的第一步骤(步骤(a))中,提供等电点为至少7的蛋白质和酪蛋白的溶液。以本领域技术人员已知的方式,通过将两种蛋白质溶解于水性介质中来制备该溶液。在本发明的一个优选的方面,在步骤a)中提供的溶液以大于1:10至小于10:1的重量比包含等电点为至少7的蛋白质和酪蛋白。在本发明的一个优选的方面,等电点为至少7的蛋白质与酪蛋白的重量比为至少1:9,优选至少1:8,更优选至少1:7,甚至更优选至少1:6,并且最优选至少1:5。在本发明的另一个优选的方面,等电点为至少7的蛋白质与酪蛋白的重量比为至多9:1,优选至多8:1,更优选至多7:1,甚至更优选至多6:1,并且最优选至多5:1。例如,等电点为至少7的蛋白质与酪蛋白的重量比可有利地为1:9至9:1,优选为1:8至8:1,更优选为1:7至7:1,甚至更优选为1:5至5:1。在一个特别优选的实施方案中,等电点为至少7的蛋白质与酪蛋白的重量比为1:5至4:1,优选1:5至3:1,更优选1:5至2:1,最优选1:5至1:1。
优选将蛋白质溶液的pH调节至在6.5至7.5范围内的值。优选pH为6.5至7.3,优选pH为6.5至7.2,优选pH为6.6至7.1,更优选pH为6.7至7.0,更优选为6.7至6.9,最优选6.8。
在本发明的一个优选的方面,基于溶液的总重量,溶液具有3重量%至10重量%的总蛋白质含量。
在任选的步骤中,在进一步加工溶液之前,可在等电点为至少7的蛋白质的变性温度处调理蛋白质。此种任选的调理步骤通过在等电点为至少7的蛋白质的变性温度处加热蛋白质溶液并将该溶液在该温度处保持至少2分钟、优选至少3分钟进行。虽然该步骤不是形成络合物所必需的,但在该调理阶段期间实现的等电点为至少7的蛋白质的部分变性促进了络合物的形成。在该步骤期间,蛋白质结构的伸展具有暴露不同基团以与酪蛋白相互作用的效果。在一个优选的方面,此种调理步骤在60℃至70℃的温度处进行。此种温度范围尤其适于乳铁蛋白。用于调理乳铁蛋白的最优选的温度为65℃。
在本发明方法的第二基本步骤中,将溶液加热至在85℃至95℃范围内的温度,优选在86℃至94℃范围内,更优选在87℃至93℃范围内,更优选在88℃至92℃范围内,甚至更优选在89℃至91℃范围内,并且最优选为90℃。将溶液加热至此种温度所需的时间对于成功形成络合物并不重要。原则上,升温时间越长,络合物形成越好。因此,温度逐渐升高的步骤的最长时间由最佳成本/性能比确定。升温时间的此种最佳持续时间可例如取决于加工的体积而变化,并且可由本领域的技术人员通过基本试误法来确定。然而,当温度在1分钟至1小时、优选1至30分钟的时间段内逐渐升高时,获得最佳结果。
然后使溶液在此种温度处保持至少30秒、优选至少1分钟的时间段。优选,溶液在此种温度处保持不超过10分钟,更优选也不超过5分钟。
在此种保持时间段之后,温度逐渐降至低于5℃的温度。重要的是,温度在足够长的时间段内逐渐降低以允许络合物形成。至少30分钟的时间段是合适的。优选,温度在1小时的时间段内逐渐降低。优选,温度在至多10小时的时间段内、更优选在至多5小时的时间段内、甚至更优选在至多3小时的时间段内逐渐降低。由于降温步骤的持续时间的此种限制,本发明方法旨在保持方法的经济可行性。温度逐渐降至5℃或更低的温度,优选低于5℃,更优选降至4℃或更低的温度。然而,在此种保持步骤期间零下温度是不合适的,因为蛋白质的水性溶液将结冰并且形成络合物的过程将停止。结冰也将浓缩蛋白质周围的离子环境,从而导致不期望的进一步蛋白质变性或结构变化。因此,温度优选逐渐降至5℃至1℃,优选低于5℃至1℃,更优选低于5℃至2℃,最优选4℃至2℃的温度。
如上所述,温度在较长时间段内逐渐降低尤其有利,因为这可以由所有形式的酪蛋白、并且具体地也由胶束酪蛋白制备络合物。缓慢冷却对于分解胶束是必需的,并且使得蛋白质可与等电点为至少7的蛋白质相互作用。涉及骤冷的方法不如本发明的方法有利,因为该方法不适合由胶束酪蛋白形成络合物并且仅对酪蛋白酸盐有效。
在温度逐渐降至上述值之后,然后将溶液保持在此种温度处以留出时间来完成络合物的形成。优选使溶液在该温度处保持至少20分钟,优选30分钟。此种最短持续时间是成功形成络合物所必需的。溶液在此种温度保持的时间不受特别限制。如将在实施例中证实的那样,溶液可冷藏保存数天。然而,在实施过程中,保持时间的持续时间受到经济考虑的限制。保持步骤的持续时间过长将使得该方法在经济上不可行。因此,优选的是使溶液在此种温度处保持至多1天,优选至多10小时,更优选至多5小时,最优选至多3小时。
络合物
由本发明的方法获得或由本发明的方法可获得的络合物、优选为凝聚层不同于通过标准方法获得的络合物,标准方法包括仅在特定温度、离子强度和化学计量比下调节蛋白质溶液的pH。如上所述,将蛋白质组合物加热、冷却并在特定温度处保持特定时间段的连续步骤导致络合物结构显著变化,这使得络合物比现有技术络合物更稳固,即,对加热、pH改变、机械应力和表面活性剂的存在更稳固。因此,通过根据上述实施方案中任一项所述的方法获得或通过根据上述实施方案中任一项所述的方法可获得的络合物也是本发明的目的。
根据本发明的优选的络合物是乳铁蛋白和酪蛋白的络合物,优选为凝聚层,甚至更优选为乳铁蛋白与β-酪蛋白的络合物,最优选为乳铁蛋白与β-酪蛋白的凝聚层。
包含络合物的产品
可将本发明的络合物有利地添加到希望添加酪蛋白和/或等电点为至少7的蛋白质(诸如例如乳铁蛋白、乳凝集素和/或溶菌酶)的所有类型的产品中。
产品可为可掺入络合物的任何类型的产品,诸如食物或饮料产品、动物饲料产品、人或动物的营养补充剂、药物组合物或化妆品组合物形式的产品。产品可为固体、液体或半液体形式。
出于提供营养和/或愉悦的目的,食物和饮料产品包括旨在由人类口服食用的所有产品。它可以例如是营养组合物,诸如用于婴儿和/或幼儿,用于孕妇或哺乳期妇女或希望怀孕的妇女,用于因健康状况不佳而需要特殊营养的个体,或用于老年人。更优选,营养组合物选自婴儿配方食品、婴儿谷物、2段婴儿配方食品、成长乳以及用于孕妇和哺乳期妇女或希望怀孕的妇女的乳产品。食物和饮料产品的其它示例包括乳制品诸如乳产品或酸奶、汤、酱汁、甜零食和咸零食、粉状饮料和谷物产品。通常,乳制品有利地包含本发明的络合物,因为酪蛋白天然存在于此种成分中。
该产品还可以呈动物食物产品或用于动物的营养补充剂的形式。优选,该动物是哺乳动物。动物的示例包括灵长类(例如人类)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。
营养补充剂通常以液体、凝胶、粉末或片剂或胶囊的形式存在。粉末补充剂通常涵盖待溶解于水中或喷洒在食物或饮料中的补充剂。此种补充剂旨在为食用它的个体提供额外的营养物质和/或健康益处,以及其它有益成分,诸如例如乳铁蛋白、乳凝集素和/或溶菌酶。根据本发明的补充剂可用于为人类以及动物提供营养物质和/或健康益处,如上所定义。营养补充剂包括例如添加到母乳中的粉末补充剂,例如用于早产或低出生体重婴儿。它还包括用于孕妇或哺乳期妇女或希望怀孕的妇女的补充剂。
药物产品包括例如旨在治疗或预防对其有需要的个体的不良医疗状况的滴剂、糖浆、粉末、片剂或胶囊产品。
化妆品组合物通常旨在对身体具有美观效果,并且可用于局部用途或可通过口服途径施用。
本发明的产品优选包含治疗有效量的本发明的络合物。
在一个优选的实施方案中,本发明的产品是婴儿配方食品、婴儿谷物组合物、2段婴儿配方食品或成长乳,其包含乳铁蛋白和酪蛋白的络合物,优选为凝聚层,更优选乳铁蛋白与β-酪蛋白的络合物,最优选乳铁蛋白与β-酪蛋白的凝聚层。在此种产品中,络合物优选以提供每升产品0.5g至10g、优选1g至10g、更优选2g至7g乳铁蛋白的量存在。
根据本发明的所有类型的产品可根据本领域技术人员的知识来配制和制造。本发明的络合物有利地足够稳固,以便与产品的其它成分一起加工。
例如,在制造喷雾干燥的产品时,诸如粉末形式的婴儿配方食品、成长乳或2段婴儿配方食品,络合物足够稳固,以便与产品的其它成分一起添加在湿混合物中并喷雾干燥。这从方法经济性的角度来看是有利的,因为不需要对敏感蛋白质如乳铁蛋白、乳凝集素和或溶菌酶进行无菌定量给料和干混合。此外,从产品结构的角度来看,将络合物掺入湿混合物中是有利的。具体地讲,络合物将以均匀的方式与其它成分混合。相比之下,由于混合粉末的特性不同,诸如例如密度或粒度的差异,干混粉末可导致不均匀的产品。不均匀性可导致蛋白质的剂量不准确。
因此,制备粉末形式的选自婴儿配方食品、2段婴儿配方食品或成长乳的产品的方法也是本发明的目的,该方法包括制备包含根据本发明的络合物的产品浓缩物以及对所述产品浓缩物进行喷雾干燥。根据本领域技术人员的一般知识进行湿混合物的制备和喷雾干燥。
在另一方面,本发明提供了用于制备选自液体婴儿配方食品、2段婴儿配方食品或成长乳的产品的方法,该方法包括将本发明的络合物与液体产品基料混合以及以无菌方式加工包含络合物的产品基料。根据本领域技术人员的一般知识进行液体产品基料的制备和无菌加工。
第一医疗用途
如上所述的络合物、优选凝聚层或包含络合物、优选包含凝聚层的产品可有利地用于治疗中。因此,本发明还提供了此种络合物和此种产品,其用在治疗中。在一个特别优选的方面,本发明提供了乳铁蛋白、乳凝集素或溶菌酶和酪蛋白的络合物、优选为凝聚层以及包含此种络合物或凝聚层的产品,其用在治疗中。甚至更优选,此种络合物为乳铁蛋白和酪蛋白,优选乳铁蛋白和β-酪蛋白的络合物,优选为凝聚层。
本文中的治疗旨在治愈或预防身体疾病或失调,并且还涵盖预防性治疗,即预防不良医疗状况。治疗在本文中也旨在包括人和动物治疗。
换句话讲,本发明涉及用于治疗个体的方法,该方法包括向个体施用治疗有效量的根据本发明的络合物或产品。
在另一个实施方案中,本发明涉及根据本发明的络合物或产品用于药物制造的用途。
其它医疗用途
本发明提供了如上所述的乳铁蛋白和酪蛋白的络合物、优选为凝聚层或包含此种络合物的产品,其用在以下特定治疗方法中:
a)预防、减少和/或治疗感染;
b)调节、促进和/或支持免疫应答;
c)促进和/或支持有益肠道菌群的生长;
d)促进和/或支持认知功能;
e)促进和/或支持婴儿或幼儿的健康成长;或
f)促进婴儿粪便变软。
在一个优选的实施方案中,本发明提供了如上所述的乳铁蛋白与β-酪蛋白的络合物、优选为凝聚层或包含此种络合物的产品,其用在以下特定治疗方法中:
a)预防、减少和/或治疗感染;
b)调节、促进和/或支持免疫应答;
c)促进和/或支持有益肠道菌群的生长;
d)促进和/或支持认知功能;
e)促进和/或支持婴儿或幼儿的健康成长;或
f)促进婴儿粪便变软。
在一个优选的实施方案中,本发明提供了包含如上所述的乳铁蛋白与β-酪蛋白的络合物、优选凝聚层的婴儿配方食品、较大婴儿配方食品或成长乳,其用在以下特定治疗方法中:
a)预防、减少和/或治疗感染;
b)调节、促进和/或支持免疫应答;
c)促进和/或支持有益肠道菌群的生长;
d)促进和/或支持认知功能;
e)促进和/或支持婴儿或幼儿的健康成长;或
f)促进婴儿粪便变软。
现在将通过以下实施例更详细地描述本发明。
实施例1:根据本发明的络合物的制备和检测
制备蛋白质浓度为5.5%重量/重量的乳铁蛋白(来源:威士兰乳业(WestlandMilk Products)(HY03;98.9%蛋白质;来自Westand))和胶束β-酪蛋白(来源:UltranorBeta(Y044;75%蛋白质;来自凯爱瑞公司(Kerry)))的原液,并在Stuart多位搅拌器SB162-3上使用磁力搅拌器以速度3溶解2小时。为了制备1:1(β-cn:Lf)重量比的混合物,随后称量适当体积的每种原液并使用巴斯德吸管混合在一起,混合2分钟。然后使用0.1M HCl/NaOH将pH调节至6.8,并将溶液直接吸取至流变仪(AR2000ex,购自TA仪器公司(TAInstruments))进行热处理。将28g(±0.05g)量的混合物称量到流变仪的样品杯中。然后使样品经受如下表1所述的加热-冷却-保持SPC处理。
表1:加热-冷却-保持SPC处理记录
使用Leica TCS SP5共焦激光扫描显微镜(德国曼海姆的徕卡显微系统海德尔堡公司(Leica Microsystems,Heildelberg GmbH,Mannheim,Germany)),通过共焦激光扫描显微镜法(CLSM)分析所获得的溶液。将少量样品置于玻片上。通过将10μL尼罗绿染料(0.001g/100mL)吸移到样品表面上来将样品染色。将盖玻片置于顶部。提供络合物的Z堆叠的3D投影。Z堆叠涉及样品的多个平面的成像,其中可呈现3D图像。
CLSM分析表明形成了β-酪蛋白与乳铁蛋白的络合物。图1描绘了使用63倍物镜通过样品的Z堆叠拍摄的静态图像。凝聚层形成具有均匀形状的球形颗粒。凝聚层的特征也在于具有多个空腔的多孔结构,空腔在图中由白色箭头突出显示。
然后将样品在20℃处以8000RCF离心5分钟。可看到沉淀层(凝聚层)与上清液层(稀释平衡相)之间的明显分离,如图2B所示。沉淀(粒料)和上清液均通过如上所述的CLSM分析进行分析。图2A示出了用20倍物镜得到的粒料的CLSM图像。可再次清楚地看到凝聚层为球形颗粒。
然后使组合物经受4℃处的24小时冷藏。在冷藏日之前(图3A)和之后(图3B),通过CLSM分析包含凝聚层的沉淀层。虽然这两个图像均包括明显且清晰形成的凝聚层,但具有明显的尺寸差异,这表明随着在低温下的保持时间延长,凝聚层的尺寸减小。此种尺寸减小与凝聚层结构内空腔的出现减少相关联。
如将在以下比较例中所示,凝聚层的形成是加热、缓慢冷却和低温保持的后续步骤组合的结果。使β-酪蛋白和乳铁蛋白组合物单独经受缓慢冷却和4℃处的保持以及单独经受热处理均不能成功获得凝聚层。
实施例2:未经加热或冷却处理的乳铁蛋白和β-酪蛋白组合物(比较例)
通过将蛋白质溶解于水中来制备蛋白质浓度为5.5%重量/重量的乳铁蛋白(来源:威士兰乳业(Westland Milk Products)(HY03;98.9%蛋白质))和胶束β-酪蛋白(来源:Ultranor Beta(Y044;75%蛋白质))的原液。通过混合这两种原液来制备乳铁蛋白和β-酪蛋白的重量比为1:1的溶液。将pH调节至6.8。将此种溶液在65℃处调理约3分钟。
通过共焦激光扫描显微镜法(CLSM)分析所获得的溶液。将少量样品置于玻片上。通过将10μL尼罗绿染料(0.001g/100mL)吸移到样品表面上来将样品染色。将盖玻片置于顶部。
未形成乳铁蛋白与β-酪蛋白的络合物。具体地讲,如在图4中可见,样品中不存在凝聚层。
实施例3:乳铁蛋白和β-酪蛋白组合物的缓慢冷却(比较例)
通过将蛋白质溶解于水中来制备蛋白质浓度为5.5%重量/重量的乳铁蛋白(来源:威士兰乳业(Westland Milk Products)(HY03;98.9%蛋白质))和胶束β-酪蛋白(来源:Ultranor Beta(Y044;75%蛋白质))的原液。通过混合这两种原液来制备乳铁蛋白和β-酪蛋白的重量比为1:1的溶液。将pH调节至6.8。将此种溶液在65℃处调理约3分钟。
然后使温度在1小时内从65℃逐渐降至4℃。然后将溶液在4℃处保持30分钟。通过共焦激光扫描显微镜法(CLSM)分析所获得的溶液。将少量样品置于玻片上。通过将10μL尼罗绿染料(0.001g/100mL)吸移到样品表面上来将样品染色。将盖玻片置于顶部。
未形成乳铁蛋白与β-酪蛋白的络合物。具体地讲,如在图5中可见,样品中不存在凝聚层。
实施例4:乳铁蛋白和β-酪蛋白组合物的热处理(比较例)
通过将蛋白质溶解于水中来制备蛋白质浓度为5.5%重量/重量的乳铁蛋白(来源:威士兰乳业(Westland Milk Products)(HY03;98.9%蛋白质))和胶束β-酪蛋白(来源:Ultranor Beta(Y044;75%蛋白质))的原液。通过混合这两种原液来制备乳铁蛋白和β-酪蛋白的重量比为1:1的溶液。将pH调节至6.8。将此种溶液在65℃处调理约3分钟。
然后使温度从65℃逐渐升至90℃。然后将溶液在90℃处保持1分钟,然后使温度在5分钟内从90℃逐渐降至10℃。然后将溶液在10℃处保持5分钟。通过共焦激光扫描显微镜法(CLSM)分析所获得的溶液。将少量样品置于玻片上。通过将10μL尼罗绿染料(0.001g/100mL)吸移到样品表面上来将样品染色。将盖玻片置于顶部。
未形成乳铁蛋白与β-酪蛋白的络合物。具体地讲,如在图6中可见,样品中不存在凝聚层。
实施例5:络合物的稳固性评估
通过使此种凝聚层经受不同的处理,并且随后评估凝聚层是否仍存在于光学显微图像上,由此评估如实施例1中所述那样制备的凝聚层的稳固性。
在第一试验中,将在实施例1中获得的凝聚层粒料稀释于0.1%的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中。图7显示出即使在与该离子表面活性剂接触之后凝聚层保持稳定。
在第二实验中,将在实施例1中获得的凝聚层粒料用0.02N HCL稀释,然后在4℃处以20,000RCF离心20分钟。尽管经受酸性处理和离心,凝聚层仍保持稳定,如从图8可见,该图绘制了存在于粒料中的凝聚层。
在第三实验中,通过将在实施例1中获得的凝聚层粒料稀释于水中并且将pH调节至3.5来评估凝聚层在酸性介质中的稳定性。图9示出凝聚层仍然存在。图10还示出,在pH3.5下,在70℃处后续热处理15分钟之后,凝聚层也保留下来。
在第四实验中,研究了碱性pH的影响。将在实施例1中获得的凝聚层粒料稀释于水中,并且将pH调节至10。图11示出凝聚层保持稳定。图12示出,当凝聚层在调节pH之后被加热至70℃并持续15分钟时仍然是这种情况。
在第五实验中,通过将在实施例1中获得的凝聚层粒料稀释于100mM NaCl中评估离子强度对凝聚层稳定性的影响。凝聚层在此种条件下也保持稳定,如图13所示。凝聚层在图13A中被放大10倍,并且在图13B中被放大20倍。
这些实验的结果示出,用本发明的方法制备的凝聚层比如现有技术所述方法形成的凝聚层明显更稳定。实际上,已有描述显示通过调节乳铁蛋白和β-酪蛋白溶液的pH而形成的此种现有技术凝聚层是不稳定的,即当受热时或当经受pH变化时是不稳定的。在本实施例中,我们示出,本发明的凝聚层令人惊讶地在宽泛的pH范围内保持稳定,并且可承受加热、严苛的机械应力,在表面活性剂的存在下不溶解。
实施例6:乳铁蛋白和β-酪蛋白的重量比对形成络合物的影响
重复实施例1,从乳铁蛋白和β-酪蛋白的重量比为1:5的溶液开始,直至乳铁蛋白和β-酪蛋白的重量比为1:10的溶液。除改变此种比率之外,本过程与实施例1中所述的过程相同。
在图14中可以看出,凝聚层是用重量比为1:5的乳铁蛋白和β-酪蛋白形成的,虽然它们的尺寸小于以1:1的重量比获得的凝聚层的尺寸。在图14上,小图片示出由黑色箭头指定的区域的4倍缩放。
相反,在乳铁蛋白和β-酪蛋白的重量比为1:10的情况下,未形成凝聚层。
Claims (16)
1.用于制备等电点为至少7的蛋白质与酪蛋白的络合物的方法,其中所述等电点为至少7的蛋白质选自乳铁蛋白、乳凝集素和溶菌酶,所述方法包括以下步骤:
a.提供处于6.5至7.5范围内的pH的等电点为至少7的蛋白质和酪蛋白的溶液,其中在步骤a)中提供的所述溶液以大于1:10且小于10:1的重量比包含所述等电点为至少7的蛋白质和酪蛋白;
b.将步骤a)中提供的所述溶液的温度从所述等电点为至少7的蛋白质的变性温度逐渐升高至在85℃至95℃范围内的温度;
c.将步骤b)的所述溶液在85℃至95℃的温度处保持至少30秒;以及
d.在至少30分钟的时间段内将步骤c)的所述溶液的所述温度从85℃至95℃逐渐降至低于5℃的温度;
e.将步骤d)的所述溶液在低于5℃的温度处保持至少15分钟。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法是制备等电点为至少7的蛋白质与酪蛋白的凝聚层的方法。
3.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤b)的所述温度升高之前,进行将步骤a)的所述溶液在所述等电点为至少7的蛋白质的变性温度处调理至少2分钟的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述蛋白质具有至少8的等电点。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述蛋白质具有至少8.5的等电点。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述蛋白质具有8.9的等电点。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述酪蛋白为α-酪蛋白或β-酪蛋白。
8.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤a)中提供的所述溶液以1:5至5:1的重量比包含所述等电点为至少7的蛋白质和酪蛋白。
9.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤a)中提供的所述溶液具有6.6至7.4的pH。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中所述步骤e)是将步骤d)的所述溶液在所述温度降低之后保持在2℃至5℃的温度处。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述等电点为至少7的蛋白质为乳铁蛋白。
12.等电点为至少7的蛋白质与β-酪蛋白的络合物,其通过权利要求1至11中任一项所述的方法获得。
13.根据权利要求12所述的络合物,其中此种络合物为凝聚层。
14.产品,其包含权利要求12或13所述的络合物。
15.通过权利要求1或11所述的方法获得的络合物或包含此种络合物的产品的用途,用于制备药物。
16.通过权利要求11所述的方法获得的络合物或包含此种络合物的产品的用途,用于制备
a)预防、减少和/或治疗感染;
b)调节、促进和/或支持免疫应答;
c)促进和/或支持有益肠道菌群的生长;
d)促进和/或支持认知功能;
e)促进和/或支持婴儿或幼儿的健康成长;或
f)促进婴儿粪便变软的药物。
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