CN111411077A - 小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用 - Google Patents

小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111411077A
CN111411077A CN202010223012.6A CN202010223012A CN111411077A CN 111411077 A CN111411077 A CN 111411077A CN 202010223012 A CN202010223012 A CN 202010223012A CN 111411077 A CN111411077 A CN 111411077A
Authority
CN
China
Prior art keywords
azd2858
lecithin
cas number
scxgfp
tendon
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010223012.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111411077B (zh
Inventor
茵梓
张艳杰
陈晓
雷庭筠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN202010223012.6A priority Critical patent/CN111411077B/zh
Publication of CN111411077A publication Critical patent/CN111411077A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111411077B publication Critical patent/CN111411077B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用，属于细胞培养技术领域，所述小分子物质包括SB939、CP‑673451、卵磷脂、AZD2858、盐酸伊达比星、硫酸长春新碱和长春碱中的一种或几种。本发明中的小分子物质通过提高肌腱系特异基因和蛋白的表达水平，来体外维持肌腱干细胞表型。

Description

小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用。
背景技术
肌腱损伤为常见的运动系统损伤，外力引起的肌肉突然猛力的收缩，可造成肌腱起止点的完全或部分撕裂，称肌腱断裂。若肌腱长期反复经受轻微外伤，或肌腱本身有慢性磨损，日久引起肌腱断裂，称肌腱自发性断裂。肌腱损伤可造成疼痛、局部肿胀、与功能障碍。
目前，肌腱损伤或断裂尚未有理想的治疗方法，临床治疗通常是对症处理，包括药物治疗、物理治疗、手术治疗，如直接缝合、自体或异体移植、人工合成材料修补等。但由于修复愈合能力较差，并发症发病率高且长期疗效不稳定，容易出现肌腱粘连、钙化、强度降低，甚至再次断裂等问题。
组织工程技术的发展为提高肌腱的修复质量带来了广阔前景。肌腱干细胞作为组织工程理想的种子细胞来源之一，不仅具有像骨髓间充质干细胞一样的干细胞特性，而且高表达肌腱特异性的基因和蛋白质，如胶原I，粘蛋白C和纤连蛋白等。因此，肌腱干细胞是一种非常有潜力应用于肌腱组织工程中的种子细胞。
肌腱干细胞来源有限，需在体外扩增后应用于组织工程治疗。但是肌腱干细胞在体外扩增培养之后会逐渐丢失表型，肌腱相关基因表达显著下降。以肌腱干细胞作为种子细胞修复后的肌腱在力学性能上，特别是在微观结构上与正常肌腱仍有显著区别，修复组织的超微结构显示其由大量的小直径的胶原纤维构成，这些小直径胶原纤维正是导致愈后肌腱力学性能低下的直接因素。不仅如此，干细胞用在肌腱修复时易出现异位骨化现象，导致肌腱修复失败。因此，目前尚缺乏适合肌腱干细胞在体外扩增过程中维持表型的培养条件。
生物活性因子作为培养基的添加成分，由于可控、操作便捷，已经被广泛用于干细胞分化调控和组织工程领域。多种生长因子具有肌腱系诱导潜力，但是本领域目前没有达到共识和公认的培养基成分。利用生长因子进行分阶段诱导的策略仍具有一定的局限性，其低稳定性与高昂的价格一定程度限制了广泛使用，同时存在细胞向骨系、软骨系分化的风险趋势。
相较大分子，小分子药物不易降解，易于合成，易储存，易运输，易标准化，细胞通透性强，没有免疫原性，小分子作用于蛋白质层面，且未发现有致瘤性，有良好的临床应用前景。最重要的是，小分子在诱导细胞分化和转分化，改变细胞命运方面具有巨大潜力。因此，提供促进肌腱干细胞表型维持的小分子及小分子组合在肌腱干细胞体外培养应用中具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用，本发明的小分子物质能够在体外维持肌腱干细胞表型。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用，所述小分子物质包括SB939、CP-673451、卵磷脂、AZD2858、盐酸伊达比星、长春新碱磷酸盐和长春碱中的一种或几种；
所述SB939的CAS号为929016-96-6；
所述CP-673451的CAS号为343787-29-1；
所述卵磷脂的CAS号为8002-43-5；
所述AZD2858的CAS号为486424-20-8；
所述盐酸伊达比星的CAS号为57852-57-0；
所述硫酸长春新碱的CAS号为2068-78-2；
所述长春碱的CAS号为865-21-4。
优选的，当所述小分子物质包括SB939、CP-673451、卵磷脂和AZD2858时，所述SB939、CP-673451、卵磷脂和AZD2858的摩尔比为1:2:2:2。
优选的，当所述小分子物质包括SB939、CP-673451和卵磷脂时，所述SB939、CP-673451和卵磷脂的摩尔比为1:2:2。
优选的，当所述小分子物质包括SB939、CP-673451和AZD2858时，所述SB939、CP-673451和AZD2858的摩尔比为1:2:2。
优选的，当所述小分子物质包括SB939、卵磷脂和AZD2858时，所述SB939、卵磷脂和AZD2858的摩尔比为1:2:2。
优选的，当所述小分子物质包括CP-673451、卵磷脂和AZD2858时，所述CP-673451、卵磷脂和AZD2858的摩尔比为1:1:1。
优选的，所述小分子物质的溶剂包括二甲基亚砜。
本发明还提供了小分子物质在制备提高肌腱系特异基因表达水平的试剂中的应用，所述小分子物质包括SB939、CP-673451、卵磷脂、AZD2858、盐酸伊达比星、长春新碱磷酸盐和长春碱中的一种或几种；
所述SB939的CAS号为929016-96-6；
所述CP-673451的CAS号为343787-29-1；
所述卵磷脂的CAS号为8002-43-5；
所述AZD2858的CAS号为486424-20-8；
所述盐酸伊达比星的CAS号为57852-57-0；
所述硫酸长春新碱的CAS号为2068-78-2；
所述长春碱的CAS号为865-21-4。
优选的，所述肌腱系特异基因包括Scleraxis基因。
本发明提供了小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用，所述小分子物质包括SB939、CP-673451、卵磷脂、AZD2858、盐酸伊达比星、长春新碱磷酸盐和长春碱中的一种或几种；所述SB939的CAS号为929016-96-6；所述CP-673451的CAS号为343787-29-1；所述卵磷脂的CAS号为8002-43-5；所述AZD2858的CAS号为486424-20-8；所述盐酸伊达比星的CAS号为57852-57-0；所述硫酸长春新碱的CAS号为2068-78-2；所述长春碱的CAS号为865-21-4。本发明中的小分子物质通过提高肌腱系特异基因和蛋白的表达水平，来体外维持肌腱干细胞表型。
附图说明
图1示肌腱干细胞体外培养过程中表型丢失，其中A示ScxGFP转基因小鼠刚分离出的尾腱和体外传代培养过程中，不同代次细胞的荧光表达情况(绿色：ScxGFP；P：细胞代次；标尺200μm)；B示体外传代培养过程中肌腱系特异基因Scx、Tnmd和Thbs4的表达情况(n＝3，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001)；
图2示单个小分子SB939有效维持肌腱干细胞表型，提升ScxGFP表达水平，小分子浓度2μM，标尺200μm；
图3示单个小分子CP-673451有效维持肌腱干细胞表型，提升ScxGFP表达水平，小分子浓度2μM，标尺200μm；
图4示单个小分子卵磷脂有效维持肌腱干细胞表型，提升ScxGFP表达水平，小分子浓度2μM，标尺200μm；
图5示单个小分子AZD2858有效维持肌腱干细胞表型，提升ScxGFP表达水平，小分子浓度2μM，标尺200μm；
图6示单个小分子AZD2858有效维持肌腱干细胞表型，提升ScxGFP表达水平，小分子浓度10μM，标尺200μm；
图7示单个小分子盐酸伊达比星有效维持肌腱干细胞表型，提升ScxGFP表达水平，小分子浓度2μM，标尺200μm；
图8示单个小分子硫酸长春新碱有效维持肌腱干细胞表型，提升ScxGFP表达水平，小分子浓度2μM，标尺200μm；
图9示单个小分子长春碱有效维持肌腱干细胞表型，提升ScxGFP表达水平，小分子浓度2μM，标尺200μm；
图10示多种小分子组合有效维持肌腱干细胞表型，C1为CP-673451、卵磷脂和AZD2858三种小分子的组合；C2为SB939、卵磷脂和AZD2858三种小分子的组合；C3为SB939、CP-673451和AZD2858三种小分子的组合；C4为SB939、CP-673451和卵磷脂三种小分子的组合；C5为SB939、CP-673451、卵磷脂和AZD2858四种小分子的组合；标尺200μm，n＝2，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；
图11示CP-673451、卵磷脂和AZD2858三种小分子的组合(C1)可以在不同时间点(3天和7天)有效提升肌腱系特异基因Scx、Col1a1和Col14的表达水平(n＝3，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001)。
具体实施方式
本发明提供了小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用，所述小分子物质包括SB939、CP-673451、卵磷脂、AZD2858、盐酸伊达比星、长春新碱磷酸盐和长春碱中的一种或几种；所述SB939的CAS号为929016-96-6；所述CP-673451的CAS号为343787-29-1；所述卵磷脂的CAS号为8002-43-5；所述AZD2858的CAS号为486424-20-8；所述盐酸伊达比星的CAS号为57852-57-0；所述硫酸长春新碱的CAS号为2068-78-2；所述长春碱的CAS号为865-21-4。
在本发明中，所述SB939购买于Selleck品牌，货号为S1515，CAS号为929016-96-6；所述CP-673451购买于Selleck品牌，货号为S1536，CAS号为343787-29-1；所述卵磷脂购买于Selleck品牌，货号为S4788，CAS号为8002-43-5；所述AZD2858购买于Selleck品牌，货号为S7253，CAS号为486424-20-8；所述盐酸伊达比星购买于Selleck品牌，货号为S1228，CAS号为57852-57-0；所述硫酸长春新碱购买于Selleck品牌，货号为S1241，CAS号为2068-78-2；所述长春碱购买于Selleck品牌，货号为S1248，CAS号为865-21-4。
在本发明中，当所述小分子物质优选包括SB939、CP-673451、卵磷脂和AZD2858时，所述SB939、CP-673451、卵磷脂和AZD2858的摩尔比优选为1:2:2:2。在本发明中，当所述小分子物质优选包括SB939、CP-673451和卵磷脂时，所述SB939、CP-673451和卵磷脂的摩尔比优选为1:2:2。在本发明中，当所述小分子物质优选包括SB939、CP-673451和AZD2858时，所述SB939、CP-673451和AZD2858的摩尔比优选为1:2:2。在本发明中，当所述小分子物质优选包括SB939、卵磷脂和AZD2858时，所述SB939、卵磷脂和AZD2858的摩尔比优选为1:2:2。在本发明中，当所述小分子物质优选包括CP-673451、卵磷脂和AZD2858时，所述CP-673451、卵磷脂和AZD2858的摩尔比优选为1:1:1。
在本发明中，所述小分子物质的溶剂优选包括二甲基亚砜。
本发明还提供了小分子物质在制备提高肌腱系特异基因表达水平的试剂中的应用，所述小分子物质包括SB939、CP-673451、卵磷脂、AZD2858、盐酸伊达比星、长春新碱磷酸盐和长春碱中的一种或几种；所述SB939的CAS号为929016-96-6；所述CP-673451的CAS号为343787-29-1；所述卵磷脂的CAS号为8002-43-5；所述AZD2858的CAS号为486424-20-8；所述盐酸伊达比星的CAS号为57852-57-0；所述硫酸长春新碱的CAS号为2068-78-2；所述长春碱的CAS号为865-21-4。
在本发明中，所述肌腱系特异基因优选包括Scleraxis基因。
在本发明中，当所述小分子物质优选包括SB939、CP-673451、卵磷脂和AZD2858时，所述SB939、CP-673451、卵磷脂和AZD2858的摩尔比优选为1:2:2:2。在本发明中，当所述小分子物质优选包括SB939、CP-673451和卵磷脂时，所述SB939、CP-673451和卵磷脂的摩尔比优选为1:2:2。在本发明中，当所述小分子物质优选包括SB939、CP-673451和AZD2858时，所述SB939、CP-673451和AZD2858的摩尔比优选为1:2:2。在本发明中，当所述小分子物质优选包括SB939、卵磷脂和AZD2858时，所述SB939、卵磷脂和AZD2858的摩尔比优选为1:2:2。在本发明中，当所述小分子物质优选包括CP-673451、卵磷脂和AZD2858时，所述CP-673451、卵磷脂和AZD2858的摩尔比优选为1:1:1。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(一)肌腱干细胞体外培养过程中表型丢失
Scleraxis(Scx)是肌腱特异性的标记基因，在肌腱组织和细胞中特异表达。利用ScxGFP转基因小鼠，可以通过绿色荧光蛋白体外实时观测该基因的表达情况，从而对肌腱干细胞体外培养过程中的表型维持情况进行评估。
从ScxGFP转基因小鼠尾腱中提取原代细胞，通过胶原酶消化法从肌腱组织中获得肌腱细胞，通过克隆筛选获得肌腱干细胞。将肌腱干细胞种植于培养皿上，低糖DMEM，于37℃、5％CO2条件下培养。本实验用到的所有肌腱干细胞都是多克隆起源。当细胞融合时，用胰蛋白酶消化，1:3传代。
ScxGFP转基因小鼠刚分离出的尾腱中，ScxGFP高表达，体外传代培养过程中，荧光强度迅速减弱(图1中的A)(绿色：ScxGFP；标尺200μm)，肌腱特异性转录因子Scx、Tnmd、Thbs4表达水平降低(图1中的B)(n＝3，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001)。这说明目前体外培养体系导致肌腱干细胞表型丢失显著。图片见图1。
表1引物序列
基因 序号 上游引物(5‘-3’) 序号 下游引物(5‘-3’)
Scx SEQ ID No.1 CGAGAACACCCAGCCCAAAC SEQ ID No.2 CTCCGAATCGCAGTCTTTCTGTC
Tnmd SEQ ID No.3 GGGTGGTCCCGCAAGTGAAGGTG SEQ ID No.4 GCCTCGACGACAGTAAATACAACAGT
Thbs4 SEQ ID No.5 GCCACAAGCACAGGAGACTTT SEQ ID No.6 TGACCTGCTGCCTCAGAAGA
Gapdh SEQ ID No.7 ATACGGCTACAGCAACAGGG SEQ ID No.8 TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
Col1a1 SEQ ID No.9 TGGATGGCTGCACGAGT SEQ ID No.10 TTGGGATGGAGGGAGTTTA
Col14 SEQ ID No.11 CGTGCTCTGCTTATGGCGTTG SEQ ID No.12 ACGTGACAGCATTTGGTAAGTG
(二)单个小分子SB939可以有效维持肌腱干细胞表型
小分子SB939溶解在二甲基亚砜(DMSO)里，存储浓度为10mM，使用时用低糖培养液(L-DMEM+10％FBS+1％P/S)稀释至2μM。96孔板体外培养小鼠ScxGFP肌腱干细胞，每孔种植2000～3000个细胞，待细胞贴壁后换液，每孔加入100μl培养液，其中小分子SB939的浓度为2μM。转化生长因子TGF-β为阳性对照，使用浓度为10ng/ml，DMSO为阴性对照，使用浓度为0.02％。于37℃、5％CO2条件下培养，3～4天换一次液。1天、3天、5天和7天四个时间点，利用高内涵仪器进行ScxGFP荧光检测拍照。结果见图2，结果显示，与DMSO组相比，SB939能在不同时间点促进ScxGFP高表达。
实施例2
单个小分子CP-673451有效维持肌腱干细胞表型
小分子CP-673451溶解在DMSO里，存储浓度为10mM，使用时用低糖培养液(L-DMEM+10％FBS+1％P/S)稀释至2μM。96孔板体外培养小鼠ScxGFP肌腱干细胞，每孔种植2000～3000个细胞，待细胞贴壁后换液，每孔加入100μl培养液，其中小分子CP-673451的浓度为2μM。转化生长因子TGF-β为阳性对照，使用浓度为10ng/ml，DMSO为阴性对照，使用浓度为0.02％。于37℃、5％CO2条件下培养，3～4天换一次液。1天和3天两个时间点，利用高内涵仪器进行ScxGFP荧光检测拍照。结果见图3，结果显示，与DMSO组相比，CP-673451能在不同时间点促进ScxGFP高表达。
实施例3
单个小分子卵磷脂有效维持肌腱干细胞表型
小分子卵磷脂溶解在DMSO里，存储浓度为10mM，使用时用低糖培养液(L-DMEM+10％FBS+1％P/S)稀释至2μM。96孔板体外培养小鼠ScxGFP肌腱干细胞，每孔种植2000～3000个细胞，待细胞贴壁后换液，每孔加入100μl培养液，其中小分子卵磷脂的浓度为2μM。转化生长因子TGF-β为阳性对照，使用浓度为10ng/ml，DMSO为阴性对照，使用浓度为0.02％。于37℃、5％CO2条件下培养，3～4天换一次液。处理24h后，利用高内涵仪器进行ScxGFP荧光检测拍照。结果见图4，结果显示，与DMSO组相比，卵磷脂能促进ScxGFP高表达。
实施例4
单个小分子AZD2858有效维持肌腱干细胞表型
小分子AZD2858溶解在DMSO里，存储浓度为10mM，使用时用低糖培养液(L-DMEM+10％FBS+1％P/S)稀释至2μM。96孔板体外培养小鼠ScxGFP肌腱干细胞，每孔种植2000～3000个细胞，待细胞贴壁后换液，每孔加入100μl培养液，其中小分子AZD2858的浓度为2μM。转化生长因子TGF-β为阳性对照，使用浓度为10ng/ml，DMSO为阴性对照，使用浓度为0.02％。于37℃、5％CO2条件下培养，3～4天换一次液。1天、3天、5天和7天四个时间点，利用高内涵仪器进行ScxGFP荧光检测拍照。结果见图5，结果显示，与DMSO组相比，AZD2858能在不同时间点促进ScxGFP高表达。
实施例5
单个小分子AZD2858有效维持肌腱干细胞表型
小分子AZD2858溶解在DMSO里，存储浓度为10mM，使用时用低糖培养液(L-DMEM+10％FBS+1％P/S)稀释至10μM。96孔板体外培养小鼠ScxGFP肌腱干细胞，每孔种植2000～3000个细胞，待细胞贴壁后换液，每孔加入100μl培养液，其中小分子AZD2858的浓度为10μM。转化生长因子TGF-β为阳性对照，使用浓度为10ng/ml，DMSO为阴性对照，使用浓度为0.1％。于37℃、5％CO2条件下培养，3～4天换一次液。1天、3天和5天三个时间点，利用高内涵仪器进行ScxGFP荧光检测拍照。结果见图6，结果显示，与DMSO组相比，AZD2858能在不同时间点促进ScxGFP高表达。
实施例6
单个小分子盐酸伊达比星有效维持肌腱干细胞表型
小分子盐酸伊达比星溶解在DMSO里，存储浓度为10mM，使用时用低糖培养液(L-DMEM+10％FBS+1％P/S)稀释至2μM。96孔板体外培养小鼠ScxGFP肌腱干细胞，每孔种植2000～3000个细胞，待细胞贴壁后换液，每孔加入100μl培养液，其中小分子盐酸伊达比星的浓度为2μM。转化生长因子TGF-β为阳性对照，使用浓度为10ng/ml，DMSO为阴性对照，使用浓度为0.02％。于37℃、5％CO2条件下培养，3～4天换一次液。培养4天时，利用高内涵仪器进行ScxGFP荧光检测拍照。结果见图7，结果显示，与DMSO组相比，盐酸伊达比星能促进ScxGFP高表达。
实施例7
单个小分子硫酸长春新碱有效维持肌腱干细胞表型
小分子硫酸长春新碱溶解在DMSO里，存储浓度为10mM，使用时用低糖培养液(L-DMEM+10％FBS+1％P/S)稀释至2μM。96孔板体外培养小鼠ScxGFP肌腱干细胞，每孔种植2000～3000个细胞，待细胞贴壁后换液，每孔加入100μl培养液，其中小分子硫酸长春新碱的浓度为2μM。转化生长因子TGF-β为阳性对照，使用浓度为10ng/ml，DMSO为阴性对照，使用浓度为0.02％。于37℃、5％CO2条件下培养，3～4天换一次液。培养4天时，利用高内涵仪器进行ScxGFP荧光检测拍照。结果见图8，结果显示，与DMSO组相比，硫酸长春新碱能在促进ScxGFP高表达。
实施例8
单个小分子长春碱有效维持肌腱干细胞表型
小分子长春碱溶解在DMSO里，存储浓度为10mM，使用时用低糖培养液(L-DMEM+10％FBS+1％P/S)稀释至2μM。96孔板体外培养小鼠ScxGFP肌腱干细胞，每孔种植2000～3000个细胞，待细胞贴壁后换液，每孔加入100μl培养液，其中小分子长春碱的浓度为2μM。转化生长因子TGF-β为阳性对照，使用浓度为10ng/ml，DMSO为阴性对照，使用浓度为0.02％。于37℃、5％CO2条件下培养，3～4天换一次液。培养4天时，利用高内涵仪器进行ScxGFP荧光检测拍照。结果见图9，结果显示，与DMSO组相比，长春碱能在不同时间点促进ScxGFP高表达。
实施例9
SB939、CP-673451、卵磷脂和AZD2858四种小分子的组合(命名为C5)有效维持肌腱干细胞表型
96孔板培养小鼠ScxGFP肌腱干细胞，每孔种植2000～3000个细胞，待细胞贴壁后换液，每孔加入100μl低糖培养液(L-DMEM+10％FBS+1％P/S)，其中小分子SB939、CP-673451、卵磷脂和AZD2858的浓度分别为500nM、1μM、1μM、1μM。转化生长因子TGF-β为阳性对照，使用浓度为10ng/ml，DMSO为阴性对照，使用浓度为0.1％。于37℃、5％CO2条件下培养，3～4天换一次液。4天和7天两个时间点，利用高内涵仪器进行ScxGFP荧光检测拍照，利用分析软件对ScxGFP阳性的细胞数进行统计分析。结果见图10，结果显示，C5处理4d时，ScxGFP阳性率为77.5％，处理7天时，ScxGFP阳性率为92.8％。DMSO组4天时ScxGFP阳性率为3.8％，7天时阳性率为1.5％。TGF-β组4天时ScxGFP阳性率为42.5％，7天时阳性率为48.0％。与DMSO组相比，SB939、CP-673451、卵磷脂和AZD2858四种小分子的组合能在不同时间点促进ScxGFP高表达，且效果优于阳性对照组。
实施例10
SB939、CP-673451、卵磷脂三种小分子的组合(命名为C4)有效维持肌腱干细胞表型
96孔板培养小鼠ScxGFP肌腱干细胞，每孔种植2000～3000个细胞，待细胞贴壁后换液，每孔加入100μl低糖培养液(L-DMEM+10％FBS+1％P/S)，其中小分子SB939、CP-673451和卵磷脂的浓度分别为500nM、1μM、1μM。转化生长因子TGF-β为阳性对照，使用浓度为10ng/ml，DMSO为阴性对照，使用浓度为0.1％。于37℃、5％CO2条件下培养，3～4天换一次液。4天和7天两个时间点，利用高内涵仪器进行ScxGFP荧光检测拍照，利用分析软件对ScxGFP阳性的细胞数进行统计分析。结果显示，C4处理4天时，ScxGFP阳性率为76.8％，处理7天时，ScxGFP阳性率为90.8％。DMSO组4天时ScxGFP阳性率为3.8％，7天时阳性率为1.5％。TGF-β组4天时ScxGFP阳性率为42.5％，7天时阳性率为48.0％。结果见图10，与DMSO组相比，SB939、CP-673451和卵磷脂三种小分子的组合能在不同时间点促进ScxGFP高表达，且效果优于阳性对照组。
实施例11
SB939、CP-673451和AZD2858三种小分子的组合(命名为C3)有效维持肌腱干细胞表型
96孔板培养小鼠ScxGFP肌腱干细胞，每孔种植2000～3000个细胞，待细胞贴壁后换液，每孔加入100μl低糖培养液(L-DMEM+10％FBS+1％P/S)，其中小分子SB939、CP-673451和AZD2858的浓度分别为500nM、1μM、1μM。转化生长因子TGF-β为阳性对照，使用浓度为10ng/ml，DMSO为阴性对照，使用浓度为0.1％。于37℃、5％CO2条件下培养，3～4天换一次液。4天和7天两个时间点，利用高内涵仪器进行ScxGFP荧光检测拍照，利用分析软件对ScxGFP阳性的细胞数进行统计分析。结果显示，C3处理4天时，ScxGFP阳性率为54.0％，处理7天时，ScxGFP阳性率为72.0％。DMSO组4天时ScxGFP阳性率为3.8％，7天时阳性率为1.5％。TGF-β组4天时ScxGFP阳性率为42.5％，7天时阳性率为48.0％。结果见图10，与DMSO组相比，SB939、CP-673451和AZD2858三种小分子的组合能在不同时间点促进ScxGFP高表达，且效果优于阳性对照组。
实施例12
SB939、卵磷脂和AZD2858三种小分子的组合(命名为C2)有效维持肌腱干细胞表型
96孔板培养小鼠ScxGFP肌腱干细胞，每孔种植2000～3000个细胞，待细胞贴壁后换液，每孔加入100μl低糖培养液(L-DMEM+10％FBS+1％P/S)，其中小分子SB939、卵磷脂和AZD2858的浓度分别为500nM、1μM、1μM。转化生长因子TGF-β为阳性对照，使用浓度为10ng/ml，DMSO为阴性对照，使用浓度为0.1％。于37℃、5％CO2条件下培养，3～4天换一次液。4天和7天两个时间点，利用高内涵仪器进行ScxGFP荧光检测拍照，利用分析软件对ScxGFP阳性的细胞数进行统计分析。结果显示，C2处理4天时，ScxGFP阳性率为53.0％，处理7天时，ScxGFP阳性率为62.4％。DMSO组4天时ScxGFP阳性率为3.8％，7天时阳性率为1.5％。TGF-β组4天时ScxGFP阳性率为42.5％，7天时阳性率为48.0％。结果见图10，与DMSO组相比，SB939、卵磷脂和AZD2858三种小分子的组合能在不同时间点促进ScxGFP高表达，且效果优于阳性对照组。
实施例13
CP-673451、卵磷脂和AZD2858三种小分子的组合(命名为C1)有效维持肌腱干细胞表型
96孔板培养小鼠ScxGFP肌腱干细胞，每孔种植2000～3000个细胞，待细胞贴壁后换液，每孔加入100μl低糖培养液(L-DMEM+10％FBS+1％P/S)，其中小分子CP-673451、卵磷脂和AZD2858的浓度分别为1μM、1μM、1μM。转化生长因子TGF-β为阳性对照，使用浓度为10ng/ml，DMSO为阴性对照，使用浓度为0.1％。于37℃、5％CO2条件下培养，3～4天换一次液。4天和7天两个时间点，利用高内涵仪器进行ScxGFP荧光检测拍照，利用分析软件对ScxGFP阳性的细胞数进行统计分析。结果显示，C1处理4天时，ScxGFP阳性率为75.9％，处理7天时，ScxGFP阳性率为87.1％。DMSO组4天时ScxGFP阳性率为3.8％，7天时阳性率为1.5％。TGF-β组4天时ScxGFP阳性率为42.5％，7天时阳性率为48.0％。结果见图10，与DMSO组相比，CP-673451、卵磷脂和AZD2858三种小分子的组合能在不同时间点促进ScxGFP高表达，且效果优于阳性对照组。
实施例14
CP-673451、卵磷脂和AZD2858三种小分子的组合(命名为C1)有效提升肌腱系特异基因Scx、胶原Ⅰ(Col1a1)和胶原14(Col14)(引物见表1)的表达水平
24孔板培养小鼠肌腱干细胞，每孔种植25000～30000个细胞，待细胞贴壁后换液，每孔加入500μl高糖培养液(H-DMEM+10％FBS+1％P/S)，其中小分子CP-673451、卵磷脂和AZD2858的浓度分别为1μM、1μM、1μM。对照组(Ctrl)为仅高糖培养液培养的细胞。于37℃、5％CO2条件下培养，每3～4天换一次液。培养3天和7天后细胞用于抽提RNA，逆转录成cDNA，以此cDNA为模板，进行荧光定量PCR，其中Gapdh作为内参，检测肌腱系标记基因Scx、Col1a1、Col14的表达量。最后根据得到的Ct值，以诱导培养前细胞中基因的表达量为参照，计算小分子组合诱导培养后(C1)和高糖培养液培养后(Ctrl)的细胞中目的基因相对于诱导处理前的表达量。荧光定量PCR分析结果如表2。
表2荧光定量PCR分析结果
Scx相对表达量 Col1a1相对表达量 Col14相对表达量
C1(3d) 7.23*** 5.15* 45.99**
Ctrl(3d) 1.11 0.49 6.08
C1(7d) 10.84*** 5.86* 7.79
Ctrl(7d) 0.70 0.39 3.56
基因检测结果显示，CP-673451、卵磷脂和AZD2858三种小分子的组合(C1)在3天和7天两个时间点均有效提升肌腱系特异基因Scx、Col1a1和Col14的表达水平，与同时间点的对照组(Ctrl)相比，具有显著性差异(n＝3，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001)。图片见图11。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgagaacacc cagcccaaac 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctccgaatcg cagtctttct gtc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggtggtccc gcaagtgaag gtg 23
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcctcgacga cagtaaatac aacagt 26
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccacaagca caggagactt t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgacctgctg cctcagaaga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atacggctac agcaacaggg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtgagggag atgctcagtg 20
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggatggctg cacgagt 17
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttgggatgga gggagttta 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgtgctctgc ttatggcgtt g 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acgtgacagc atttggtaag tg 22

Claims (9)

1.小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用，所述小分子物质包括SB939、CP-673451、卵磷脂、AZD2858、盐酸伊达比星、硫酸长春新碱和长春碱中的一种或几种；
所述SB939的CAS号为929016-96-6；
所述CP-673451的CAS号为343787-29-1；
所述卵磷脂的CAS号为8002-43-5；
所述AZD2858的CAS号为486424-20-8；
所述盐酸伊达比星的CAS号为57852-57-0；
所述硫酸长春新碱的CAS号为2068-78-2；
所述长春碱的CAS号为865-21-4。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当所述小分子物质包括SB939、CP-673451、卵磷脂和AZD2858时，所述SB939、CP-673451、卵磷脂和AZD2858的摩尔比为1:2:2:2。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当所述小分子物质包括SB939、CP-673451和卵磷脂时，所述SB939、CP-673451和卵磷脂的摩尔比为1:2:2。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当所述小分子物质包括SB939、CP-673451和AZD2858时，所述SB939、CP-673451和AZD2858的摩尔比为1:2:2。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当所述小分子物质包括SB939、卵磷脂和AZD2858时，所述SB939、卵磷脂和AZD2858的摩尔比为1:2:2。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当所述小分子物质包括CP-673451、卵磷脂和AZD2858时，所述CP-673451、卵磷脂和AZD2858的摩尔比为1:1:1。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子物质的溶剂包括二甲基亚砜。
8.小分子物质在制备提高肌腱系特异基因表达水平的试剂中的应用，所述小分子物质包括SB939、CP-673451、卵磷脂、AZD2858、盐酸伊达比星、长春新碱磷酸盐和长春碱中的一种或几种；
所述SB939的CAS号为929016-96-6；
所述CP-673451的CAS号为343787-29-1；
所述卵磷脂的CAS号为8002-43-5；
所述AZD2858的CAS号为486424-20-8；
所述盐酸伊达比星的CAS号为57852-57-0；
所述硫酸长春新碱的CAS号为2068-78-2；
所述长春碱的CAS号为865-21-4。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肌腱系特异基因包括Scleraxis基因。
CN202010223012.6A 2020-03-26 2020-03-26 小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用 Active CN111411077B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010223012.6A CN111411077B (zh) 2020-03-26 2020-03-26 小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010223012.6A CN111411077B (zh) 2020-03-26 2020-03-26 小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111411077A true CN111411077A (zh) 2020-07-14
CN111411077B CN111411077B (zh) 2022-02-25

Family

ID=71489252

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010223012.6A Active CN111411077B (zh) 2020-03-26 2020-03-26 小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111411077B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102743797A (zh) * 2012-07-17 2012-10-24 广州医学院 制作肌腱吻合器的材料、使用该材料的肌腱吻合器及制作方法
CN108465125A (zh) * 2018-04-04 2018-08-31 浙江大学 天然组织来源的肌腱复合肌肉脱细胞材料的制备方法
US20190345451A1 (en) * 2016-11-07 2019-11-14 Yunnan Jici Institute for Regenerative Medicine Co., Ltd. Method for Inducing Differentiated Cell into Mesenchymal Stem Cell, and Combinations of Regulatory Targets Thereof
US20190365777A1 (en) * 2011-06-16 2019-12-05 President And Fellows Of Harvard University Small molecules for mouse satellite cell proliferation
US20200002680A1 (en) * 2017-02-20 2020-01-02 Public University Corporation Nagoya City University Maintenance culture of induced pluripotent stem cell-derived intestinal stem cells

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190365777A1 (en) * 2011-06-16 2019-12-05 President And Fellows Of Harvard University Small molecules for mouse satellite cell proliferation
CN102743797A (zh) * 2012-07-17 2012-10-24 广州医学院 制作肌腱吻合器的材料、使用该材料的肌腱吻合器及制作方法
US20190345451A1 (en) * 2016-11-07 2019-11-14 Yunnan Jici Institute for Regenerative Medicine Co., Ltd. Method for Inducing Differentiated Cell into Mesenchymal Stem Cell, and Combinations of Regulatory Targets Thereof
US20200002680A1 (en) * 2017-02-20 2020-01-02 Public University Corporation Nagoya City University Maintenance culture of induced pluripotent stem cell-derived intestinal stem cells
CN108465125A (zh) * 2018-04-04 2018-08-31 浙江大学 天然组织来源的肌腱复合肌肉脱细胞材料的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YANJIE ZHANG等: "Concise Review: Stem Cell Fate Guided By Bioactive Molecules for Tendon Regeneration", 《STEM CELLS TRANSLATIONAL MEDICINE》 *
张璨: "干细胞体外培养微环境对肌腱分化及修复作用的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111411077B (zh) 2022-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Izadpanahi et al. Nanotopographical cues of electrospun PLLA efficiently modulate non-coding RNA network to osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells during BMP signaling pathway
Pizzute et al. Impact of tissue-specific stem cells on lineage-specific differentiation: a focus on the musculoskeletal system
Choi et al. Adipogenic differentiation of adipose tissue derived adult stem cells in nude mouse
US9452185B2 (en) Mesenchymal stem cells and supports for tissue regeneration, repair and reconstruction
Sawatjui et al. Silk fibroin/gelatin–chondroitin sulfate–hyaluronic acid effectively enhances in vitro chondrogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells
Meesuk et al. Osteogenic differentiation and proliferation potentials of human bone marrow and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on the 3D-printed hydroxyapatite scaffolds
CN102844036A (zh) 用于体外和体内软骨发生的方法和组合物
Choi et al. Muscle-derived extracellular matrix on sinusoidal wavy surfaces synergistically promotes myogenic differentiation and maturation
Dahlin et al. Chondrogenic phenotype of articular chondrocytes in monoculture and co-culture with mesenchymal stem cells in flow perfusion
JP2019528682A (ja) がんの診断およびモデル化において使用するためのバイオマトリックス足場
Griffin et al. Argon plasma modification promotes adipose derived stem cells osteogenic and chondrogenic differentiation on nanocomposite polyurethane scaffolds; implications for skeletal tissue engineering
Ling et al. Three-dimensional (3D) hydrogel serves as a platform to identify potential markers of chondrocyte dedifferentiation by combining RNA sequencing
Alves da Silva et al. Electrospun nanofibrous meshes cultured with Wharton's jelly stem cell: an alternative for cartilage regeneration, without the need of growth factors
Alessio et al. Timely supplementation of hydrogels containing sulfated or unsulfated chondroitin and hyaluronic acid affects mesenchymal stromal cells commitment toward chondrogenic differentiation
CN111500578A (zh) 调控ADSCs成骨分化及组织再生Circ RNA-FTO及其应用
CN104726500B (zh) MicroRNA26b‑3p抑制剂在制备人脐带来源间充质干细胞中的应用
Lai et al. Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes loaded with miR-26a through the novel immunomodulatory peptide DP7-C can promote osteogenesis
Valarmathi et al. The influence of proepicardial cells on the osteogenic potential of marrow stromal cells in a three-dimensional tubular scaffold
CN112522187A (zh) 一种人软骨细胞培养基及其应用
CN111411077B (zh) 小分子物质在制备体外维持肌腱干细胞表型的试剂中的应用
Zeydari et al. Synthesis of bone biocompatible implants using human adipose-derived mesenchymal stem cells (hADMSCs) and PCL/laminin scaffold substrate
AU2017296175B2 (en) Cell compositions for tissue regeneration
CN103638558B (zh) 仿生化韧带-骨组织工程连接体的体外构建方法
Liu et al. Effect of electrohydrodynamic printing scaffold with different spacing on chondrocyte dedifferentiation
Li et al. Comparison of Proliferative and Multilineage Differentiation Potential of Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant