CN111407892A - Acsl4及其在nash中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及ACSL4在筛选NASH药物、制备NASH药物、制备NASH诊断药物中的应用以及ACSL4抑制剂在制备治疗或预防NASH药物中的应用，ACSL4抑制剂为降低肝细胞中ACSL4表达水平的分子或制剂、酶活抑制剂或者阻断肝细胞中ACSL4作用通路的分子或制剂。本发明阐明了ACSL4在NASH治疗中的临床意义，为开发ACSL4作为NASH治疗、检测、诊断、药物筛选靶点提供了广阔的应用前景。

Description

ACSL4及其在NASH中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种ACSL4及其在NASH中的应用。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，疾病谱包括非酒精性肝脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化和肝细胞癌。目前NAFLD呈全球流行趋势，是日益增长的肝硬化和肝癌的原因之一，已成为全球公认的第一大慢性肝病。有文献报道，NAFLD全球患病率为25.24%，且患病率逐年增加。来自上海、北京等地区的流行病学调查结果显示，普通成人B型超声诊断的NAFLD患病率10年期间从15％增加到31％以上。心血管疾病、恶性肿瘤和肝硬化失代偿是引起NAFLD患者死亡的常见原因。NASH是导致肝硬化的主要原因之一，NASH患者10-15 年内肝硬化发生率高达15%-25%。尽管存在迫切的医疗需求，但迄今为止尚未有药物获批用于NASH的治疗，NASH药物研发迫在眉睫。

NAFLD是一种进展性疾病，目前为止其发病机制仍然不十分明确。现阶段NASH被广泛接受的病理解释是二次打击假说，其中肝内脂质堆积以及由此带来的胰岛素抵抗是第一次打击，在此基础上由多种细胞因子、炎症因子介导的脂肪酸过度氧化所导致的炎症和氧化应激反应是第二次打击。虽然二次打击假说对人们观察到的NASH病理现象做出了比较有说服力的解释，但与人们得到的临床统计学结果仍有不少相互矛盾的地方。对于NASH发病机制认识的不完全，导致NASH药物研发是一个摸着石头过河的过程。目前研发企业在选取靶点时基本是从代谢、炎症、纤维化三个方面入手，其中代谢类靶点又可细分为脂类、葡萄糖、胆酸类三个靶点，炎症靶点包括氧化应激、炎症和免疫系统多方面的靶点。虽然NASH药物可供选择的靶点多，众多研发企业也一直在努力，但目前仍没有任何一个靶点在临床试验中取得令人振奋的结果。即便进展最快的奥贝胆酸（Obeticholic acid）虽然目前已经推进到III期临床阶段，但是该药高剂量组仅对23%的患者肝纤维化具有改善作用，仅较安慰剂组提高了10%，且副作用明显，如瘙痒反应较为严重，部分患者还出现严重的心血管事件。奥贝胆酸究竟能多大程度上缓解NASH无药可用的局面仍然有待时间的检验。阐明NASH发病机制，确定针对NASH有效的治疗靶标和治疗策略仍然是当前NASH药物研发的首要任务。

脂质在肝脏中的过度积累以及脂质过氧化是NAFLD的典型特征，肪酸代谢异常被认为是NAFLD 形成的重要因素。长链脂肪酸必须首先被长链脂肪酸酰基辅酶A合成酶（long-chain acyl-CoA synthetases,ACSLs）活化形成脂酰CoA才能通过细胞膜进而完成脂肪酸的氧化。目前发现的ACSLs主要包含5个成员，即ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5、ACSL6。尽管这些亚型催化相似的酶促反应，但是由于其组织特异性表达、亚细胞定位、底物以及上游信号通路等的特异性，不同的亚型呈现出其特有的细胞生物学功能和代谢特征。人体肝脏中生理状态下仅表达少量ACSL4，而在肝癌、NAFLD等病理状态下ACSL4表达量显著上调。尽管已有研究表明在人平滑肌细胞中，ACSL4调控前列腺素E2的释放；在果蝇中，它调节突触小泡的轴突运输，是突触发育和功能所必需；此外，多项研究表明ACSL4具有显著的促增值作用，能够促进肿瘤的生长和肝癌细胞的存活。但是对于病理及生理状态下ACSL4的上游表达调控机制及其介导的脂质代谢调控仍然知之甚少。ACSL4偏好花生四烯酸作为底物，其可催化花生四烯酸形成花生四烯酰CoA以使其参与磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇等带负电膜磷脂的合成。多项体内外研究表明ACSL4的表达改变与磷脂重构密切相关，磷脂重构酶LPCAT3催化花生四烯酸进入细胞膜，影响活细胞的膜脂流动性，是决定甘油三脂（TG）分泌的关键因素。小鼠肝脏特异性敲除LPCAT3显著降低血浆VLDL-TG水平改善脂肪肝。

大量研究表明，NASH伴肝纤维化的患者中TGF-β表达显著上调，TGF-β调控多种脂质生成和氧化相关基因的表达，促进甘油三酯的形成和脂质堆积。此外，已有研究证实TGF-β与肝脂肪变分级以及肝纤维化分期有显著相关性，以TGF-β为靶标的抗纤维化治疗在临床肝脏纤维化治疗中具有重要意义。值得注意的是TGF-β作用广泛，效应复杂，在疾病进展的不同阶段发挥不同的作用。单纯抑制TGF-β会导致多种全身性不良反应，限制了以TGF-β为靶标的慢性肝病治疗方法的开发。因此，干预TGF-β下游信号通路以及其诱导的细胞应答为包括NASH在内的慢性肝病的治疗提供了新的思路。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的一方面，提供ACSL4在筛选NASH药物、制备NASH药物、制备NASH诊断药物中的应用。

根据本发明的实施方案，所述药物为小分子化合物、抗体药、蛋白、核酸分子、多肽、脂类、碳水化合物或及其组合物。

本发明的另一方面，提供 ACSL4抑制剂在制备治疗或预防NASH药物中的应用。

根据本发明的实施方案，ACSL4抑制剂为降低肝细胞中ACSL4表达水平的分子或制剂、酶活抑制剂或者阻断肝细胞中ACSL4作用通路的分子或制剂。

根据本发明的实施方案，降低肝细胞中ACSL4表达水平的分子或制剂为包括基因干扰体系。所述基因干扰体系包括干扰RNA, 所述干扰RNA为shRNA。

根据本发明的实施方案，治疗或预防NASH药物为ACSL4抑制剂或药学上可接受的盐作为单一药物施用。

根据本发明的实施方案，治疗或预防NASH药物为ACSL4抑制剂或药学上可接受的盐与治疗或预防有效量的一种或多种另外的治疗剂联合施用。

有益效果

1）本发明的研究首次证明TGF-β1可以与ACSL4启动子区结合，进而调控ACSL4的转录和翻译，阐明了ACSL4在筛选、制备、诊断和预防NASH上的临床意义。

2）本发明进一步证实小鼠肝脏特异性敲除ACSL4改善饮食诱导的NASH小鼠肝脏脂质堆积、炎症和肝纤维化。

3）本发明的体外研究进一步证实肝细胞特异性敲低ACSL4显著下调脂肪酸摄取及脂肪酸氧化相关基因的表达，降低多不饱和脂肪酸和H₂O₂诱导的氧化损伤。

4）本发明证实TGF-β1-Smad3-ACSL4轴介导肝脏脂质代谢平衡及脂质代谢紊乱导致的肝细胞损伤调控NASH进展。我们的研究为肝脏脂质稳态平衡中的分子机制提供了新的理论基础，深入探讨TGF-β1-Smad3-ACSL4信号通路，能够为治疗非酒精性脂肪肝等代谢性疾病提供新的治疗靶点和思路。

附图说明

图1为实施例1中的 ACSL4在临床NASH样本以及饮食诱导的小鼠NASH模型中高表达水平。

图2为实施例2中的小鼠肝脏特异性敲除ACSL4改善肝脏纤维化和脂质堆积的实验结果。

图3为实施例3中的小鼠肝脏特异性敲除ACSL4改善血脂及肝功能的实验结果。

图4为ACSL4介导脂质代谢稳态的实验结果。

图5为敲低ACSL4抑制脂质过氧化作用及其导致的细胞死亡的实验结果。

图6为Smad3与ACSL4启动子区结合上调ACSL4的表达的实验结果。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

发明人发现， TGF-β1可以与ACSL4启动子区结合，进而调控ACSL4的转录和翻译，而在NASH伴肝纤维化的患者中TGF-β表达显著上调。

在MCD饲料喂养的小鼠中，Western blot检测ACSL4的表达，发现与对照组相比饮食诱导的NASH小鼠模型中ACSL4的表达显著上调。

进一步的研究显示，小鼠的肝脏在特异性敲除ACSL4后，结果显示，与对照组相比，小鼠肝脏内脂质堆积和肝纤维化明显改善，而且还可以明显改善NASH进展过程中通常伴随的血脂和肝功能异常。

进一步的研究显示，小鼠的肝脏特异性敲除ACSL4显著下调脂肪酸氧化相关基因的同时也会导致脂肪酸摄取相关基因的下调，以上结果提示脂肪酸代谢稳态可能是解决NASH进展中脂质堆积的有效策略。

进一步的研究显示，小鼠的肝脏在敲低ACSL4可以降低细胞内脂质过氧化作用。

本发明证实TGF-β1-Smad3-ACSL4轴介导肝脏脂质代谢平衡及脂质代谢紊乱导致的肝细胞损伤调控NASH进展。我们的研究为肝脏脂质稳态平衡中的分子机制提供了新的理论基础，深入探讨TGF-β1-Smad3-ACSL4信号通路，能够为治疗非酒精性脂肪肝等代谢性疾病提供新的治疗靶点和思路。

实施例1：

如图1所示为GEO数据库（GSE48452、GSE63067、GSE89632）分析显示ACSL4在NASH患者中表达显著高于对照组（图A-C）。针对以上数据库分析结果，采用饮食诱导的NASH小鼠模型进行验证。小鼠给予MCD饲料饲喂8周，Western blot检测ACSL4的表达，发现与对照组相比饮食诱导的NASH小鼠模型中ACSL4的表达显著上调，与数据库分析结果一致（图D）。

实施例2：

如图2所示，我们构建了ACSL4肝脏特异性敲除小鼠（ACSL4^f/f; AlbCre⁺），MCD饲料饲喂8周，利用HE染色和Masson染色检测肝脏组织病理改变和纤维化情况。结果显示，与对照组相比ACSL4^f/f; AlbCre⁺小鼠肝脏内脂质堆积和肝纤维化明显改善（图A）。接着采用qPCR方法检测纤维化和炎症相关基因的表达，发现对照组相比ACSL4^f/f; AlbCre⁺小鼠肝脏内纤维化和炎症相关基因显著下调（图B-F）。

实施例3：

如图3所示，血清生化指标检测结果显示在MCD饲料饲喂8周诱导的NASH模型中，与对照组相比ACSL4^f/f; AlbCre⁺小鼠血液甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、AST明显改善（图A-F），减轻肝脏肿大（图G）。由于MCD饲料本身导致小鼠体重和血糖降低，因此未检测到体重和血糖相关指标的明显变化（图H-I）。以上结果提示肝脏特异性敲除ACSL4可以明显改善NASH进展过程中通常伴随的血脂和肝功能异常。

实施例4：

ACSLs家族是脂肪酸活化所必须的关键基因，经过ACSLs活化的脂肪酸才能够进入线粒体进行β-氧化进而参与脂肪酸代谢。如图4所示，肝脏转录组数据提示，肝脏特应性敲除ACSL4显著下调脂肪酸氧化相关基因的同时也会导致脂肪酸摄取相关基因的下调（图A）。同时，我们利用ACSL4稳定敲低细胞株L02以及ACSL4^f/f; AlbCre⁺小鼠肝原代细胞对以上测序结果中的部分基因进行了验证（图B-E）。以上结果提示脂肪酸代谢稳态可能是解决NASH进展中脂质堆积的有效策略。

实施例5：

NAFLD形成初期，肝脏中脂质代谢紊乱导致过量的脂质沉积在肝细胞内，肝细胞内脂肪酸氧化反馈性加快以缓解脂质沉积带来的压力，然而过度的脂肪酸氧化必然导致大量ROS的产生，加速肝细胞氧化损伤，在各种细胞因子的作用下引起炎症、纤维化加速NASH进程。如图5所示，我们体外构建ACSL4稳定敲低细胞株，分别给予强氧化剂H₂O₂和多不饱和脂肪酸DHA作用48 h，CCK8检测细胞活力。试验结果显示，在氧化应激压力下，与对照组相比敲低ACSL4可以显著提高细胞活力（图A-B）。接着我们用流式细胞术分别检测了不同氧化应激压力下细胞内脂质ROS的含量，发现敲低ACSL4可以降低细胞内脂质过氧化作用（图C-D）。

实施例6：

已有研究表明，NASH伴肝纤维化的患者中TGF-β表达显著上调，TGF-β调控多种脂质生成和氧化相关基因的表达，促进甘油三酯的形成和脂质堆积，TGF-β与肝脂肪变分级以及肝纤维化分期有显著相关性。如图6所示，实验结果显示，TGF-β1 通过激活Smad3显著上调ACSL4 mRNA和蛋白的表达（图A、图C），给予Smad3抑制剂SIS3可以有效抑制Smad3的活化和ACSL4的表达（图B）。基于TGF-β1对ACSL4的转录调控作用以及Jaspar软件分析，我们推测Smad3可能结合于ACSL4的启动子区进而调控ACSL4的表达。因此，我们构建了Smad3过表达载体pCMV5B-Smad3以及ACSL4启动子区Luciferase表达载体pGL3-ACSL4 promoter并将其共转染HEK293细胞和L02细胞（图D、图E）。试验结果显示，ACSL4启动子对于荧光素酶的激活作用显著高于对照组，提示Smad3结合于ACSL4的启动子区调控其转录。以上研究结果提示，深入探索TGF-β1-Smad3-ACSL4信号通路，可能为治疗非酒精性脂肪肝等代谢性疾病提供新的治疗靶点和思路。

以上，对本发明示例性的实施方式进行了说明。但是，本发明的保护范围不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1. ACSL4在筛选NASH药物、制备NASH药物、制备NASH诊断药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，所述药物为小分子化合物、抗体药、蛋白、核酸分子、多肽、脂类、碳水化合物或及其组合物。

3. ACSL4抑制剂在制备治疗或预防NASH药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，所述ACSL4抑制剂为降低肝细胞中ACSL4表达水平的分子或制剂、酶活抑制剂或者阻断肝细胞中ACSL4作用通路的分子或制剂。

5.根据权利要求4所述的应用，所述降低肝细胞中ACSL4表达水平的分子或制剂为包括基因干扰体系。

6.根据权利要求5所述的应用，所述基因干扰体系包括干扰RNA，所述干扰RNA为shRNA。

7.根据权利要求3所述的应用，所述药物为ACSL4抑制剂或药学上可接受的盐作为单一药物施用。

8.根据权利要求3所述的应用，所述药物为ACSL4抑制剂或药学上可接受的盐与治疗或预防有效量的一种或多种另外的治疗剂联合施用。

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