CN111393377A - 具有抗癌作用的氘代嘧啶衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有抗癌作用的氘代嘧啶衍生物，属于医药领域。本发明所要解决的是抗癌药物WZ4002体内半衰期过短、血药浓度不高、抗癌作用有待提高的问题，其技术方案是提供了式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐。生物学实验证明，本发明通过在WZ4002的合适位点上进行氘代，不仅显著提高了药物抑制癌细胞增殖的作用，而且延长了半衰期，在体内的血药浓度远高于WZ4002，能够更好地发挥抗癌效果。

Description

具有抗癌作用的氘代嘧啶衍生物

技术领域

本发明涉及具有抗癌作用的氘代嘧啶衍生物，属于医药领域。

背景技术

WZ4002是一种肺癌靶向药，主要用于对易瑞沙、特罗凯耐药的肺癌的治疗，其结构式如下：

WZ4002是一种新型的、突变选择性EGFR抑制剂，作用于EGFR(L858R)/(T790M)，其抑制重组L858R/T790M蛋白EGFR激酶活性的作用比抑制野生型EGFR激酶活性的作用强很多。WZ4002也能够抑制其它EGFR基因型，例如，其作用于E746_A750和E746_A750/T790M的IC50分别为2和6nM。研究表明，WZ4002作用于非小细胞肺癌(NSCLC)细胞时，通过抑制EGFR,AKT和ERK1/2的磷酸化而发挥作用；WZ4002作用于表达不同EGFRT790M突变等位基因的NIH-3T3细胞时，可抑制EGFR的磷酸化。经测定，WZ4002作用下实验组激酶的解离常数比DMSO作用下的对照组高95％。与同系列的EGFR抑制剂相比，WZ4002具有显著的优势：WZ4002由于在C2苯胺取代时获得一个正甲氧基团，因而作用于EGFR时比WZ3146效果更好。

基于WZ4002的上述优点，对其进行结构修饰，以提供药代动力学性质更优、抗癌作用更强的候选药物，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供药代动力学性质、抗癌效果较WZ4002更优的氘代嘧啶衍生物。

本发明提供了式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R₁、R₂独立选自C1～C6烷基，所述烷基中的H未被取代或者被一个以上D取代；

R₃～R₁₀独立选自H或D；

R₁～R₁₀至少含有一个D。

进一步地，R₁、R₂独立选自C1～C3烷基，所述烷基中的H未被取代或者被一个以上D取代。

优选地，R₁、R₂均为甲基，所述甲基中的H未被取代或者被一个以上D取代。

优选地，R₁、R₂独立选自-CH₃或-CD₃。

优选地，R₁为-CD₃，R₂为-CH₃。

进一步地，R₃～R₁₀均为H或均为D。

优选地，R₃～R₁₀均为H。

进一步地，所述化合物选自：

本发明提供了所述的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，包括如下步骤：

方法一：

a、化合物A与化合物B反应得到中间体C：

b、中间体C经还原得到中间体D：

c、中间体D与丙烯酰卤或丙烯酸缩合，即得式Ⅰ化合物；优选地，中间体D与丙烯酰氯缩合；

方法二：化合物E与化合物F反应，即得式Ⅰ化合物：

进一步地，所述的制备方法满足以下至少一项：

步骤a的反应溶剂为2-叔丁醇、正丁醇、THF中一种或两种以上的混合溶剂；

步骤a于80～110℃反应；

步骤a中化合物A：化合物B摩尔比为(1～3)：1；

步骤a向反应体系中加入TFA；

步骤b的反应溶剂为THF、乙醇、水中一种或两种以上的混合溶剂；

步骤b于65～110℃反应；

步骤b以铁粉为还原剂；

步骤c的反应溶剂为THF、二氯甲烷或其混合溶剂；

步骤c于0～40℃反应；

步骤c向反应体系中加入碱，所述碱为碳酸钾、碳酸钠、DIEA中一种或两种以上；

方法二的反应溶剂为2-叔丁醇、正丁醇、THF中一种或两种以上的混合溶剂；

方法二于80～110℃反应；

方法二向反应体系中加入TFA。

本发明提供了所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。

优选地，所述癌症为肺癌。

优选地，所述癌症为非小细胞肺癌。

本发明提供了所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备EGFR抑制剂类药物中的用途。

优选地，所述药物是L858R突变型和/或L858R/T790M双突变型EGFR抑制剂类药物。

本发明提供了药物组合物，它是以所述的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，加入辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

优选地，所述的制剂为口服制剂或注射制剂。

术语定义：

本发明提供的化合物和衍生物可以根据IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)或CAS(化学文摘服务社，Columbus，OH)命名系统命名。

术语“烷基”是直链或支链的饱和烃基的基团。C₁～C₆烷基的实例包括但不限于甲基(C₁)、乙基(C₂)、正丙基(C₃)、异丙基(C₃)、正丁基(C₄)、叔丁基(C₄)、仲丁基(C₄)、异丁基(C₄)、正戊基(C₅)、3-戊基(C₅)、戊基(C₅)、新戊基(C₅)、3-甲基-2-丁基(C₅)、叔戊基(C₅)和正己基(C₆)。

术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。

本发明所述的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。

本发明所述的辅助性成分，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。

本发明提供了具有抗癌作用的氘代嘧啶衍生物，该系列化合物通过在WZ4002的合适位点上进行氘代，不仅显著提高了药物抑制癌细胞增殖的作用，而且延长了半衰期，在体内的血药浓度远高于WZ4002，能够更好地发挥抗癌效果。

具体实施方式

本发明提供了式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R₁、R₂独立选自C1～C6烷基，所述烷基中的H未被取代或者被一个以上D取代；

R₃～R₁₀独立选自H或D；

R₁～R₁₀至少含有一个D。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

WZ4002是一种已在临床上使用的抗癌药物，其主要通过抑制EGFR激酶的活性发挥作用。然而，WZ4002仍然存在着半衰期短、血药浓度低、抗癌作用有待提高等缺陷。针对上述问题，发明人尝试对WZ4002进行结构修饰，以期得到药代动力学性质更优、抗癌作用更强的候选药物。经过大量实验优化筛选，发明人发现，对WZ4002进行氘代有助于克服其存在的缺陷。

氘为氢在自然界中的一种稳定形态的非放射性同位素，由于具有比氢更大的原子质量使得C-D键比C-H键更加稳定(键能高6-9倍)。将药物分子中的氢用氘取代后，可能封闭代谢位点、减少有毒代谢物的生成。此外，氘代可能减缓系统清除速率，延长药物在体内的半衰期，从而通过降低单次给药剂量，同时在不影响药物的药理活性情况下实现降低药物毒副作用的目标。

虽然氘代化合物具有上述优点，但是并非所有的氘代化合物都有比原本化合物更好的效果，氘代位置的不同直接影响药物的疗效和药物的半衰期。由于到目前为止，尚没有对WZ4002进行氘代的相关报道，因此发明人通过大量筛选实验对其氘代位点进行了考察。结果发现，将R₁和/或R₂代表的C1～C6烷基进行氘代，或者在R₃～R₁₀的任意位点氘代，能够显著改善WZ4002的药代动力学性质、增强其抗癌活性。

根据本发明的实施例，式Ⅰ所示化合物优选的结构为：

生物学实验表明，该化合物抑制人非小细胞肺癌细胞增殖的IC₅₀值显著低于WZ4002，而且，其在体内的半衰期明显更长，血药浓度更高，能够更好地发挥抗癌作用。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例11-7产物N-(3-((5-氯-2-((2-甲氧基-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基)苯基)胺基)嘧啶-4-基)氧)苯基)丙烯酰胺的制备

合成路线一：

步骤1：1-1中间体1-(3-甲氧基-4-硝基)哌嗪的制备

将5-氟-2-硝基苯甲醚(1.71g,10mmol)，哌嗪(2.6g,30mmol)加到二氧六环(30ml)溶液，回流过夜。TLC检测反应完全后，柱层析纯化得到固体1-1，产率为92％。

步骤2：1-2中间体1-(3-甲氧基-4-硝基)-4-(甲基-d3)哌嗪的制备

在冰浴条件下，将氘代碘甲烷(2.1g，15mmol)滴加到中间体1-1(2.37g，10mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中，搅拌3小时，TLC检测反应完全后，柱层析纯化得到固体1-2，产率为85％。

步骤3：1-3中间体2-甲氧基-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基)胺基的制备

将中间体1-2(0.43g，1.68mmol)溶解于THF(50ml)和水(50ml)的溶液中。铁粉(0.47g，8.4mmol)和氯化铵(0.45g，8.4mmol)加入其中，将反应液加热到65℃，搅拌3小时。将反应混合物冷却后，硅藻土过滤。真空浓缩反应液后，用碳酸钠中和，并用EA(20ml)萃取三次。有机层分离，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗产品1-3无需进一步处理直接用于下一步，产率90％。

步骤4：1-4中间体2,5-二氯-4-(3-硝基苯)嘧啶的制备

将2,4,5-三氯嘧啶(1.82g,10mmol)和间硝基苯酚(1.39g，10mmol)溶于DMF(30ml)中，加入碳酸钾(1.38g，10mmol)，常温搅拌2小时，真空浓缩反应液后，并用EA(20ml)萃取三次。有机层分离，无水硫酸钠干燥，浓缩，通过柱层析，得到中间体1-4，产率90％。

步骤5：1-5a中间体5-氯-N-(2-甲氧基-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基)苯基)-4-(3-硝基苯氧基)嘧啶-2-胺的制备

将中间体1-3(1.57g，0.7mmol)和中间体1-4(1.99g，0.7mmol)，TFA(0.08ml，1.05mmol)，和2-叔丁醇(30ml)置于反应瓶中，加热到100℃，维持3小时。将反应液冷却到室温，饱和碳酸钠中和，水相用二氯甲烷(20ml)萃取三次。用柱层析的方法纯化得到产物1-5a，产率74％。

步骤6：1-6a中间体4-(3-胺基苯氧基)-5-氯-N-(2-甲氧基-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基)苯基)嘧啶-2-胺基的制备

将中间体1-5a(0.79g，1.68mmol)溶解于THF(50ml)和水(50ml)的溶液中。铁粉(0.47g，8.4mmol)和氯化铵(0.45g，8.4mmol)加入其中，将反应液加热到65℃，搅拌3小时。将反应混合物冷却后，硅藻土过滤。真空浓缩反应液后，用碳酸钠中和，并用EA(20ml)萃取三次。有机层分离，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析得到产物1-6a，产率80％。

步骤7：1-7产物N-(3-((5-氯-2-((2-甲氧基-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基)苯基)胺基)嘧啶-4-基)氧)苯基)丙烯酰胺的制备

冰浴下，将丙烯酰氯(0.257ml，3.18mmol)滴加到中间体1-6a(1.41g，3.18mmol)和DIEA(0.56ml，3.18mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液中。搅拌1小时。通过柱层析纯化得到产物1-7，产率85％。

¹HNMR(400MHz,DMSO)δ10.33(s,1H),8.36(s,1H),8.10(s,1H),7.63(t,J＝2.0Hz,1H),7.57(d,J＝8.3Hz,1H),7.42(t,J＝8.1Hz,1H),7.24(d,J＝8.8Hz,1H),6.97(dd,J＝8.1,1.7Hz,1H),6.52(d,J＝2.4Hz,1H),6.50–6.35(m,1H),6.27(dd,J＝16.9,1.9Hz,1H),6.19(s,1H),5.79(dd,J＝10.0,1.9Hz,1H),3.74(s,3H),3.09–2.95(m,4H),2.42(s,4H).

HRMS：497.2180。

合成路线二：

中间体1-1、1-2、1-3和1-4的合成步骤与方法一相同。

步骤1：1-5b中间体3-((2,5-二氯嘧啶-4基)氧)胺基)的制备

将中间体1-4(0.48g，1.68mmol)溶解于THF(50ml)和水(50ml)的溶液中。铁粉(0.47g，8.4mmol)和氯化铵(0.45g，8.4mmol)加入其中，将反应液加热到65℃，搅拌3小时。将反应混合物冷却后，硅藻土过滤。真空浓缩反应液后，用碳酸钠中和，并用EA(20ml)萃取三次。有机层分离，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析得到产物1-5b，产率78％。

步骤2：1-6b中间体的制备N-(3-((2,5-二氯嘧啶-4基)氧)苯基)丙烯酰胺的制备

冰浴下，将丙烯酰氯(0.257ml，3.18mmol)滴加到中间体1-5b(0.81g，3.18mmol)和DIEA(0.56ml，3.18mmol)的二氯甲烷(30ml)溶液中。搅拌1小时。通过柱层析纯化得到产物1-6b，产率75％。

步骤3：1-7产物N-(3-((5-氯-2-((2-甲氧基-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基)苯基)胺基)嘧啶-4-基)氧)苯基)丙烯酰胺的制备

将中间体1-3(1.57g，0.7mmol)和中间体1-6b(0.22g，0.7mmol)，TFA(0.08ml，1.05mmol)，和2-叔丁醇(30ml)置于反应瓶中，加热到100℃，维持3小时。将反应液冷却到室温，饱和碳酸钠中和，水相用二氯甲烷(20ml)萃取三次。用柱层析的方法纯化得到产物1-7，产率64％。

实施例2N-(4-((5-氯-2-((2-(甲氧基-d3)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)胺基)嘧啶-4-基)氧)苯基)丙烯酰胺的制备

合成步骤按照实施例1中所述的方法，不同点在于，用2-(甲氧基-d3)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)胺替换原料2-甲氧基-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基)胺，总收率75％。其中，4-氟-2-(甲氧基-d3)-1-硝基苯的合成方法参考文献CN106146406：

在碳酸钾条件下，60℃温度，丙酮溶剂，产率90％。

实施例3N-(4-((5-氯-2-((2-(甲氧基-d3)-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基)苯基)胺基)嘧啶-4-基)氧)苯基)丙烯酰胺的制备

合成步骤按照实施例1中所述的方法，不同点在于，用2-(甲氧基-d3)-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基)胺替换原料2-甲氧基-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基)胺，总收率79％。其中，4-氟-2-(甲氧基-d3)-1-硝基苯的合成方法参考实施例2。

实施例4N-(4-((5-氯-2-((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8)苯基)胺基)嘧啶-4-基)氧)苯基)丙烯酰胺的制备

合成步骤按照实施例1中所述的方法，不同点在于，用2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8)胺替换原料2-甲氧基-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基)胺，总收率74％。其中，哌嗪-d10的合成参考OrganicLetters,2016,vol.18,#22,p.5892–5895；在1,4-二氧六环溶剂条件下，150℃温度，哌嗪与氘水反应24小时，产率54％。

实施例5N-(4-((5-氯-2-((2-甲氧基-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8)苯基)胺基)嘧啶-4-基)氧)苯基)丙烯酰胺的制备

合成步骤按照实施例1中所述的方法，不同点在于，用2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8)胺替换原料2-甲氧基-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基)胺，总收率72％。其中，哌嗪-d10的合成参考实施例4。

实施例6N-(4-((5-氯-2-((2-(甲氧基-d3)-4-(4-甲基哌嗪-1-基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8)苯基)胺基)嘧啶-4-基)氧)苯基)丙烯酰胺的制备

合成步骤按照实施例1中所述的方法，不同点在于，用2-(甲氧基-d3)-4-(4-甲基哌嗪-1-基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8)胺替换原料2-甲氧基-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基)胺，总收率67％。其中，4-氟-2-(甲氧基-d3)-1-硝基苯的合成参考实施例2，哌嗪-d10的合成参考实施例4。

实施例7N-(4-((5-氯-2-((2-(甲氧基-d3)-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8)苯基)胺基)嘧啶-4-基)氧)苯基)丙烯酰胺的制备

合成步骤按照实施例1中所述的方法，不同点在于，用2-(甲氧基-d3)-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基-2,2,3,3,5,5,6,6-d8)胺替换原料2-甲氧基-4-(4-(甲基-d3)哌嗪-1-基)胺，总收率63％。其中，4-氟-2-(甲氧基-d3)-1-硝基苯的合成参考实施例2，哌嗪-d10的合成参考实施例4。

以下通过试验例证明本发明的有益效果。

试验例1本发明化合物对EGFR激酶(野生型、L858R突变型和L858R/T790M双突变型)的抑制作用

本实验的目的是检测本发明化合物在体外对激酶的抑制作用，采用的方法为同位素标记法。本实验分别对EGFR(包括野生型、L858R突变型和L858R/T790M双突变的EGFR)激酶进行体外活性抑制测试。WZ4002为阳性对照。受试化合物的激酶抑制活性用IC₅₀(半数抑制浓度)表示。IC₅₀值可通过受试化合物在一系列不同浓度下对激酶活性的抑制率计算而获得。

1实验材料

20mM3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)；1mM乙二胺四乙酸(EDTA)；0.01％布里杰35(Brij-35)；5％甘油(Glycerol)；0.1％巯基乙醇(mercptoethanol)；1mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)；l0mM的二氯化锰溶液(MnC1₂)；0.1mg/ml的谷氨酸/酪氨酸(4:1)聚合多肽(poly(Glu,Tyr)4:1)(野生型和L858R单突变EGFR,c-KIT和PDGFRa的底物)；250μM多肤GGMEDIYFEFMGGKKK(L858R/T790M双突变EGFR的底物)；10mM的醋酸镁和y-³³p-ATP溶液；终止缓冲液(3％磷酸盐缓冲液)；洗涤缓冲液(75mM的磷酸盐溶液)；甲醇(methanol)；FiltermatA膜；EGFR(包括野生型、L858R单突变和L858R/T790M双突变的EGFR)激酶，受试化合物。

2实验方法

在一个反应管中，依次加入缓冲液(8mMMOPS,pH7.0,0.2mMEDTA,10mMMnC1₂)，待测激酶(5-10mU)(EGFR)，待测激酶的底物(参考实验材料)，以及10mM的醋酸镁和γ³³P-ATP溶液，不同浓度的受试化合物。反应以加入MgATP为起始((ATP的终浓度为对应激酶的Km值，即：EGFR野生型为10μM,EGFRL858R为200μM,EGFRL858R/T790M为45μM)，并在室温下孵育40分钟。最终用5μL的3％磷酸盐缓冲液终止反应，并把10μL的反应液滴定到FiltermatA膜上，用75mM的磷酸盐溶液洗三次，每次5分钟，再用甲醇洗一次。最后干燥FiltermatA膜并对其进行闪烁计数，闪烁计数值的大小反映了底物被磷酸化的程度，从而可以表征激酶活性被抑制情况。

3实验结果

通过以上实验方法，测试了本发明化合物针对EGFR(含野生型、L858R突变型和L858R/T790M双突变型)激酶的抑制活性。表1给出了本发明化合物抑制EGFR(含野生型、L858R突变型和L858R/T790M双突变型)激酶活性的IC₅₀值。

表1本发明化合物抑制EGFR激酶活性的IC₅₀值

实验结果表明，本发明化合物对野生型、L858R突变型和L858R/T790M双突变型EGFR激酶活性均具有很强的抑制作用，其中，部分化合物的IC₅₀值比阳性药物WZ4002更低。

试验例2本发明化合物在体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用

本实验的目的是检测本发明化合物在体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用，以WZ4002为为阳性对照。采用的方法为MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法。

1实验材料

1.1主要试剂

RPMI-1640、胎牛血清、胰酶等购自GibcoBRL公司(InvitrogenCorporation，USA)，IMDM培养基购自ATCC(AmericanTypeCultureCollection)。四甲基偶氮唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司(USA)产品。受试化合物由发明人合成，体外实验时用100％DMSO配制成10mM储存液，置-20℃冰箱避光保存备用，测试时用培养液稀释至所需浓度。

1.2细胞系及培养

本实验所用的人非小细胞肺癌细胞株HCC827(EGFRde1E746-A750缺失突变)和H1975(EGFRL858R/T790M双突变)以及人肝癌细胞株HepG2购于美国ATCC公司，由四川大学生物治疗国家重点实验室保存。以上所有癌细胞株均用10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI-1640完全培养基在5％CO₂、370℃条件下培养。

2实验方法

用完全细胞培养液调整细胞浓度为1～2×10⁴个/ml的细胞悬液(HCC827细胞浓度为6×10⁴个/ml,H1975细胞为4×10³个/ml)，接种于96孔板，每孔200μL细胞悬液，培养过夜。次日，吸弃上清，然后分别用梯度浓度的受试化合物处理细胞。同时设不含药物的阴性对照组和等体积的溶剂对照组，DMSO浓度为0.1％，每个剂量组设3个复孔，在37℃,5％CO₂条件下培养。72小时后，每孔加入浓度为5mg/ml的MTT试剂20μL,再培养2-4h后，弃上清，每孔再加入DMSO150μL，振荡混匀15min，用酶标仪(λ＝570nm)测定吸光度(A)值(A值与活细胞数成正比)，取其平均值。相对细胞增殖抑制率＝(对照组A570-实验组A570)/对照组A570×100％。实验至少重复3次。实验数据用均数表示，数据统计资料采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。以下各化合物对细胞增殖抑制作用均用IC₅₀表示。

3实验结果

采用以上方法，对人非小细胞肺癌细胞株HCC827(EGFRde1E746-A750缺失突变)、H1975(EGFRL858R/T790M双突变)和人肝癌细胞株HepG2进行了细胞增殖的抑制作用测试。表2给出了本发明化合物抑制上述细胞增殖的IC₅₀值。

表2本发明化合物抑制肿瘤细胞增殖的IC₅₀值

*E:<100nM,F:100-1000nM,G:1001-5000nM,H:>5000nM

结果表明，本发明化合物对Gefitinib(吉非替尼)敏感细胞株HCC827以及Gefitinib耐药细胞株H1975均具有较强的抑制作用，部分化合物的IC₅₀值甚至低于阳性药物WZ4002。

试验例3本发明化合物(根据实施例1制备得到)的药代动力学实验

1)实验所需设备及试剂

设备：超高效液相色谱系统(Waters公司，ACQUITYUPLC)，包括二元溶剂管理器(ACQUITYUPLCBinarySolventManager)、样品管理器(ACQUITYUPLCAutosamplerMod.)、高通量样品组织管理器(ACQUTIYUPLCSampleOrganizer)、高温柱温箱(ACQUITYUPLCColumnHeaterHT)。质谱仪(API4000，美国应用生物系统公司)，电喷雾离子源(ESI)，串联四极杆质量分析器。数据处理系统为Analyst软件(美国应用生物系统公司，软件版本号1.5.1)。微量分析天平(XP26，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；涡旋振荡器(SI-A256，ScientificIndustries，Inc.；MULTI-TUBEVORTEXER，FisherScientific)；小型台式高速冷冻离心机(5417R，Eppendorf)；超纯水机(Millipore)；移液器(Eppendorf)。

试剂：甲醇(Burdick&Jackson，HPLC)，乙腈(Burdick&Jackson，HPLC)，甲酸(J&K)，超纯水等。

2)实验动物

实验动物采用SPF级的SD大鼠，体重在210～240g，主要购于北京华阜康实验动物有限公司。试验环境为16～26℃相对湿度40～70％，12小时明暗交替人工照明。试验结束后均按照SOP进行安乐处死。

3)动物分组及给药方案

根据实验目的及实验设计的要求，将大鼠分为口服给药组和静脉给药组。静脉组和口服组均给药1次，静脉2mg/kg，口服5mg/kg。静脉：5％DMSO+40％PEG400+55％生理盐水；口服：0.5％CMCNa+0.2％吐温80。给药前禁食12小时，不禁水。给药结束4小时后给食。

4)药代样品采集及血样处理

经颈静脉穿刺采血约0.2mL，肝素钠抗凝，采血时间点如下：静脉采血时间：给药前、给药后0.083h，0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，24h。口服采血时间：给药前、给药后0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h。血液样本收集经肝素钠抗凝处理后置于冰上，离心分离血浆(离心条件：6000转/分钟，10分钟，4℃)。收集的血浆分析前存放于–80℃处理待测。

5)参数分析

根据受试物单个动物的血药浓度数据，使用药代动力学计算软件WinNonlinV6.2.1非房室模型计算药代动力学参数，分析的参数包含达峰时间(Tmax)、达峰浓度(Cmax)、药时曲线下面积(AUC)、消除半衰期(t1/2)、表观分布容积(Vd/F)和清除率(CL/F)等。根据下述公式计算绝对生物利用度(F)：

6)统计分析

利用统计方法对在有效计量范围内的药动学参数进行判断，主要包括：①不同给药量下的AUC和Cmax进行线性分析；②相同剂量下组内进行方差分析；③各组间AUC(0-t)、AUC(0-∞)、t1/2、CLz/F、Cmax进行组间方差分析，根据P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著进行判断。

7)实验结果

表3药动学参数

Claims (9)

1.式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R₁、R₂独立选自C1～C6烷基，所述烷基中的H未被取代或者被一个以上D取代；

R₃～R₁₀独立选自H或D；

R₁～R₁₀至少含有一个D。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征是：R₁、R₂独立选自C1～C3烷基，所述烷基中的H未被取代或者被一个以上D取代；优选地，R₁、R₂均为甲基，所述甲基中的H未被取代或者被一个以上D取代；优选地，R₁、R₂独立选自-CH₃或-CD₃；优选地，R₁为-CD₃，R₂为-CH₃。

3.如权利要求1所述的化合物，其特征是：R₃～R₁₀均为H或均为D；优选地，R₃～R₁₀均为H。

4.如权利要求1～3任意一项所述的化合物，其特征是：所述化合物选自：

5.权利要求1～4任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征是：包括如下步骤：

方法一：

a、化合物A与化合物B反应得到中间体C：

b、中间体C经还原得到中间体D：

c、中间体D与丙烯酰卤或丙烯酸缩合，即得式Ⅰ化合物；优选地，中间体D与丙烯酰氯缩合；

方法二：化合物E与化合物F反应，即得式Ⅰ化合物：

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是：满足以下至少一项：

步骤a的反应溶剂为2-叔丁醇、正丁醇、THF中一种或两种以上的混合溶剂；

步骤a于80～110℃反应；

步骤a中化合物A：化合物B摩尔比为(1～3)：1；

步骤a向反应体系中加入TFA；

步骤b的反应溶剂为THF、乙醇、水中一种或两种以上的混合溶剂；

步骤b于65～110℃反应；

步骤b以铁粉为还原剂；

步骤c的反应溶剂为THF、二氯甲烷或其混合溶剂；

步骤c于0～40℃反应；

步骤c向反应体系中加入碱，所述碱为碳酸钾、碳酸钠、DIEA中一种或两种以上；

方法二的反应溶剂为2-叔丁醇、正丁醇、THF中一种或两种以上的混合溶剂；

方法二于80～110℃反应；

方法二向反应体系中加入TFA。

7.权利要求1～4任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途；优选地，所述癌症为肺癌；优选地，所述癌症为非小细胞肺癌。

8.权利要求1～4任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备EGFR抑制剂类药物中的用途；优选地，所述药物是L858R突变型和/或L858R/T790M双突变型EGFR抑制剂类药物。

9.药物组合物，其特征是：它是以权利要求1～4任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，加入辅料或者辅助性成分制备而成的制剂；优选地，所述的制剂为口服制剂或注射制剂。