CN111378663A - lncRNA SFR1及其应用、调控卵泡发育的产品和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种lncRNA SFR1及其应用、调控卵泡发育的产品和方法，涉及生物技术领域，本发明提供了一种新的长链非编码RNA SFR1，该lncRNA SFR1与颗粒细胞的凋亡相关，通过调控lncRNA SFR1的表达还可以对卵泡发育的相关通路、基因及激素起到相应的调控作用。因此，应用本发明提供的lncRNA SFR1及相应的产品，能够对卵泡发育进行有效的体内外调控，为卵泡的发育以及生理生化功能的研究提供了有力的保障。此外，还可以通过lncRNA SFR1对卵泡发育的调控作用，在保持哺乳动物尤其是绵羊种质资源的优良特性的同时，提高群体繁殖力，从而提高养殖经济效益。

Description

lncRNA SFR1及其应用、调控卵泡发育的产品和方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种lncRNA SFR1及其应用、调控卵泡发育的产品和方法。
背景技术
中国养羊业历史悠久，最早可追溯到夏商时期。至今在我国广大的农区、牧区养羊业仍是主要畜牧支柱产业之一，2017年仅绵羊年存栏量就在1.6亿只。为追求更高的生产效益，养殖户更加关注绵羊品种所带来的附加产值。而通过优良品种对原有地方资源进行杂交改良，是快速提高绵羊养殖生产效益的不二之选。
在杂交选育中，我国地方良种中具有高繁殖力特性的小尾寒羊、湖羊等品种脱颖而出，成为杂交改良的主力军。而其他具有肉质鲜美、被毛品质优异等特性的优良地方绵羊品种资源，却由于繁殖力相对较低受到极大的冲击。如何在保持绵羊种质资源的优良特性的同时，提高群体繁殖力成为整个行业关注的焦点。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种新的长链非编码RNA SFR1，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述lncRNA SFR1在制备调控卵泡发育的产品中的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种调控卵泡发育的方法。
本发明的第四个目的在于提供一种调控卵泡发育的产品。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
本发明提供的了lncRNA SFR1，具有：
(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或，
(b)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
本发明还提供了上述的lncRNA SFR1在制备调控卵泡发育的产品中的应用。
进一步地，通过如下(i)-(iv)中的任一种调控卵泡发育：
(i)调控颗粒细胞凋亡；
(ii)调控卵泡发育的信号通路，所述信号通路包括AKT通路和/或TGFβ通路；
(iii)调控卵泡发育相关基因，所述卵泡发育相关基因包括LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种；
(iv)调控卵泡发育相关激素，所述卵泡发育相关激素包括E2、P4、ACT、INH和FS。
进一步地，
(I)过表达lncRNA SFR1以促进颗粒细胞凋亡；
(II)过表达lncRNA SFR1以抑制AKT通路和/或促进TGF-β通路；沉默lncRNA SFR1以促进AKT通路和/或抑制TGF-β通路；
(III)过表达lncRNA SFR1以促进LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种的表达；沉默lncRNA SFR1以抑制LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种的表达；
(IV)过表达lncRNA SFR1以促进ACT、INH或FS中的一种或多种的分泌；沉默lncRNASFR1以促进E2和/或P4的分泌，抑制ACT和/或INH的分泌。
进一步地，通过lncRNA SFR1的重组载体实现过表达lncRNA SFR1。
进一步地，通过lncRNA SFR1的siRNA实现沉默lncRNA SFR1；
优选地，所述siRNA具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
进一步地，所述卵泡发育为绵羊的卵泡发育。
本发明还提供了一种调控卵泡发育的方法，所述方法包括调控lncRNA SFR1的表达。
进一步地，
(I)过表达lncRNA SFR1以促进颗粒细胞凋亡；
(II)过表达lncRNA SFR1以抑制AKT通路和/或促进TGF-β通路；沉默lncRNA SFR1以促进AKT通路和/或抑制TGF-β通路；
(III)过表达lncRNA SFR1以促进LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种的表达；沉默lncRNA SFR1以抑制LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种的表达；
(IV)过表达lncRNA SFR1以促进ACT、INH或FS中的一种或多种的分泌；沉默lncRNASFR1以促进E2和/或P4的分泌，抑制ACT和/或INH的分泌；
优选地，所述卵泡发育为绵羊的卵泡发育。
另外，本发明还提供了一种调控卵泡发育的产品，包括用于过表达lncRNA SFR1的物质和/或用于沉默lncRNA SFR1的物质。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种新的长链非编码RNA SFR1，该SFR1被发现在不同产羔数绵羊卵巢中差异表达。并且，本发明的发明人通过实验发现，lncRNA SFR1与颗粒细胞的凋亡相关，通过调控lncRNA SFR1的表达还可以对卵泡发育的相关通路、基因及激素起到相应的调控作用。因此，应用本发明提供的lncRNA SFR1及相应的产品，能够从不同角度对卵泡发育进行有效的体内外调控，为卵泡的发育以及生理生化功能的研究提供了有力的保障。此外，还可以通过lncRNA SFR1对卵泡发育的调控作用，进一步开展哺乳动物的超数排卵、胚胎体外生产以及多胎品种选育等工作，以期在保持哺乳动物尤其是绵羊种质资源的优良特性的同时，提高群体繁殖力，从而提高养殖经济效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的不同产羔数卵巢RNA-seq差异表达基因qRT-PCR表达量验证的结果图；
图2为本发明实施例提供的转染后颗粒细胞SFR1相对表达量的结果图；
图3为本发明实施例提供的SFR1对绵羊颗粒细胞活性的影响的结果图；
图4为本发明实施例提供的SFR1对绵羊颗粒细胞的蛋白表达的影响的结果图；
图5为本发明实施例提供的SFR1对绵羊颗粒细胞基因表达的影响的结果图；
图6为本发明实施例提供的SFR1对绵羊颗粒细胞E2、P4、ACT、INH和FS分泌的影响的结果图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
绵羊作为主要的畜禽品种，是主要的肉产品来源之一，也是畜牧业养殖的主要畜种。作为草地畜牧业的主要成员之一，其繁殖力的提高不仅有利于养殖效益的提升，还将极大程度的优化养殖群体结构，降低草地载畜量，减轻草场负担。对单胎绵羊品种进行多胎群体选育，以提高养羊经济效益是近年来养羊业研究的热点问题。基于此，本发明提供了一种新的长链非编码RNA lncRNA SFR1，所述lncRNA SFR1具有：
(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或，
(b)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
本发明提供的新发现的lncRNA SFR1被发现在不同产羔数绵羊卵巢中差异表达。并且，本发明的发明人通过实验发现，lncRNA SFR1与颗粒细胞的凋亡相关，通过调控lncRNA SFR1的表达还可以对卵泡发育的相关通路、基因及激素起到相应的调控作用。因此，应用本发明提供的lncRNA SFR1及相应的产品，能够从不同角度对卵泡发育进行有效的体内外调控，为卵泡的发育以及生理生化功能的研究提供了有力的保障。此外，还可以通过lncRNA SFR1对卵泡发育的调控作用，进一步开展哺乳动物的超数排卵、胚胎体外生产以及多胎品种选育等工作，以期在保持哺乳动物尤其是绵羊种质资源的优良特性的同时，提高群体繁殖力，从而提高养殖经济效益。
本发明中的术语“同一性”指的是序列之间的相似性。“同一性”包括与本发明所述的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％(例如可以为，但不限于85％、88％、90％、92％、95％或者更高)同一性的核苷酸序列。
基于本发明提供的lncRNA SFR1的对卵泡发育的相关调控特性，本发明还提供了上述lncRNA SFR1在制备调控卵泡发育的产品中的应用。
卵泡发育是一个复杂的调控过程，需要通过许多信号分子的调控，如内分泌激素、代谢信号以及来自颗粒细胞分泌的各种调控因子等。在一些优选的实施方式中，lncRNASFR1通过如下(i)-(iv)中的任一种调控卵泡发育：
(i)调控颗粒细胞凋亡；
成熟卵泡的颗粒细胞是组成卵泡的最大细胞群，在卵泡发育过程中，颗粒细胞的增殖、分化和凋亡对卵母细胞的发育成熟起重要作用。有研究显示，如果卵泡在发育时期颗粒细胞凋亡会导致卵泡闭锁，体外受精中颗粒细胞凋亡率低的胚胎移植后妊娠率更高。因此，通过对颗粒细胞凋亡进行有效的调控，能够间接调控卵泡的发育。
在具体的实施方式中，发明人发现过表达lncRNA SFR1可以促进颗粒细胞凋亡，基于此，通过抑制lncRNA SFR1的过量表达能够有效避免颗粒细胞的凋亡，从而有效避免卵泡闭锁，保证卵泡发育。
(ii)调控卵泡发育的信号通路，所述信号通路包括AKT通路和/或TGFβ通路；
AKT信号通路和TGFβ信号通路都是卵泡发育的主要信号通路，能够阶段性地调节卵泡的发育。例如生长分化因子9B属于TGFβ信号通路，其在卵母细胞中特异性表达，可促进颗粒细胞增殖，同时还能有效的刺激mRNA对卵母细胞早起发育所必须的kit配基的编码；卵母细胞激活过程中的差异基因显著富集于AKT信号通路，并参与细胞凋亡、卵母细胞减数分裂等多个生物过程。因此，通过对AKT信号通路进行逆向调控和/或对TGFβ信号通路进行正向调控，能够间接调控卵泡的发育。
在具体的实施方式中，发明人通过实验发现，过表达lncRNA SFR1能够抑制AKT通路和/或促进TGF-β通路；沉默lncRNA SFR1能够促进AKT通路和/或抑制TGF-β通路。基于此，通过调控lncRNA SFR1过量表达能够有效调控AKT信号通路和TGFβ信号通路，保证卵泡发育。
(iii)调控卵泡发育相关基因，所述卵泡发育相关基因包括LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种；
LHR(促黄体激素受体，Luteininzing hormone receptor，LHR)基因、FSHR(促卵泡激素受体，Follicle Stimulating Hormone Recepter，FSHR)基因和ERβ(雌激素受体β，estrogen receptor beta，ERβ)均为卵泡发育相关基因，通过对这些基因的研究和调控，可以加深对卵泡发育后期卵母细胞成熟机制的认识，进一步挖掘卵泡发育相关因子，完善卵泡发育相关信号通路，揭示卵泡发育的机制，优化绵羊卵母细胞体外培养体系。
在具体的实施方式中，发明人通过实验发现，过表达lncRNA SFR1能够促进LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种的表达；沉默lncRNA SFR1能够抑制LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种的表达。基于此，通过调控lncRNA SFR1的表达量能够有效调控LHR基因、FSHR基因或ERβ基因的表达，保证卵泡发育。
(iv)调控卵泡发育相关激素，所述卵泡发育相关激素包括E2、P4、ACT、INH和FS；
颗粒细胞分泌的激素在卵泡的生长发育也具有重要作用。典型的如颗粒细胞分泌的抑制素(INH)具有调节促卵泡素和刺激卵巢卵泡膜分泌雄激素的功能；激活素(ACT)即参与早期卵泡的发育，又与成熟卵泡的闭锁有关，具有促进卵泡成熟和增强颗粒细胞功能的作用；卵泡抑素(FS)与ACT结合后可阻止ACT的至卵泡闭锁作用，促进卵泡继续发育成熟。雌二醇(E2)能够促进卵泡生长、颗粒细胞增殖，并有效抑制颗粒细胞凋亡；孕酮(P4)作为妊娠维持的主要激素之一，则是颗粒细胞黄体化的标志性产物，同时也是绵羊生殖周期阶段主要的标志性激素之一。二者均为具有多种作用的生殖相关激素，对卵巢发育具有多种作用。因此，通过对ACT、INH、FS、E2或P4中的一种或多种进行有效的调控，能够间接调控卵泡的发育。
在具体的实施方式中，发明人发现过表达lncRNA SFR1以促进ACT、INH或FS中的一种或多种的分泌；沉默lncRNA SFR1以促进E2和/或P4的分泌，抑制ACT和/或INH的分泌。基于此，通过在相应的卵泡发育期调控lncRNA SFR1的表达量能够有效调控卵泡发育。
本发明对上述过表达或沉默lncRNA SFR1的方法不做具体的限定，凡是本领域常规的能够实现基因过表达或沉默的操作均可。在一些优选的实施方式中，通过lncRNA SFR1的重组载体实现过表达lncRNA SFR1；通过lncRNA SFR1的siRNA实现沉默lncRNA SFR1。其中，沉默lncRNA SFR1所用的siRNA优选具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
由于发明人是在不同产羔数差异表达基因的筛选过程中，检测到了差异表达的lncRNA SFR1，因此，卵泡发育优选为绵羊的卵泡发育。进一步地，SFR1在颗粒细胞中表达，并且在小尾寒羊卵巢颗粒细胞中的表达量与新吉细毛羊卵巢颗粒细胞中的表达量相比显著上调，因此进一步优选上述卵泡发育为小尾寒羊的卵泡发育。
基于本发明提供的lncRNA SFR1在调控卵泡发育中的应用的发明构思，本发明还提供了一种通过调控lncRNA SFR1的表达进而调控卵泡发育的方法。该方法通过调控lncRNA SFR1以对颗粒细胞的凋亡、卵泡发育相关通路、基因及激素进行调控，进而间接调控卵泡发育。
本实施例采用如下优选地方式对卵泡发育进行调控：
(I)过表达lncRNA SFR1以促进颗粒细胞凋亡；
(II)过表达lncRNA SFR1以抑制AKT通路和/或促进TGF-β通路；沉默lncRNA SFR1以促进AKT通路和/或抑制TGF-β通路；
(III)过表达lncRNA SFR1以促进LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种的表达；沉默lncRNA SFR1以抑制LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种的表达；
(IV)过表达lncRNA SFR1以促进ACT、INH或FS中的一种或多种的分泌；沉默lncRNASFR1以促进E2和/或P4的分泌，抑制ACT和/或INH的分泌。
此外，基于与lncRNA SFR1的应用及调控卵泡发育方法的相同发明构思，本发明还提供了一种调控卵泡发育的产品，包括用于过表达lncRNA SFR1的物质和/或用于沉默lncRNA SFR1的物质。
本发明提供的用于调控颗粒细胞的产品，例如可以为，但不限于试剂、试剂盒或药物等。该产品中用于过表达和/或沉默lncRNA SFR1的物质可以为本领域常规使用的过表达和/或沉默基因的生物材料，例如可以为，但不限于DNA、RNA、质粒、细胞或微生物等。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1lncRNA SFR1的定位
发明人在不同产羔数差异表达基因的筛选过程中，检测到一个新的差异表达lncRNA(MSTRG.28645)，将其命名为SFR1(Sheep Fedunty Related LncRNA1,SFR1)。
SFR1是在不同产羔数绵羊卵巢差异转录组分析中，使用cpc(http:// nar.oxfordjournals.org/content/35/suppl_2/W345.full)软件和cnci(https:// github.com/www-bioinfo-org/CNCI)软件首次预测到的lncRNA。经过与Ovis aries4.0(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/83？genome_assembly_id＝259810)参考基因组的比对，发现其位于绵羊6号染色体上，其比对上的位置在66449727-66452013。
为了确定新预测lncRNA SFR1是否在绵羊颗粒细胞表达，通过RNA-seq检测到的序列信息设计了SFR1的qRT-PCR引物(Forward：AGTCATT CCAAACTTCATCCTCC；Reverse：GGGACACTCTTCCGACTATTACAA)。发现SFR1在颗粒细胞中表达，并且在小尾寒羊卵巢颗粒细胞中的表达量与新吉细毛羊卵巢颗粒细胞中的表达量相比显著上调，如图1所示。
实施例2lncRNA SFR1的过表达
首先克隆了绵羊的lncRNA SFR1全长2,791bp的cDNA序列，而后构建了羊源SFR1的真核表达载体：pIRES2-ZsGreen1-SFR1，并在绵羊卵巢颗粒细胞中瞬时转染验证其功能，其转染后SFR1的相对表达量为150.88±13.13％，如图2所示。其中，“control”代表未经处理的对照组；“SFR1”代表SFR1经过表达处理或经干扰处理组。“OE”代表SFR1过表达处理组；“siRNA-1”代表SFR1 siRNA-1处理组；“siRNA-2”代表SFR1 siRNA-2处理组；“siRNA-3”代表SFR1 siRNA-3处理组。数据表示为平均值±SEM，使用t-test进行统计分析。*代表差异显著，p＜0.05。
实施例3lncRNA SFR1的siRNA干扰
为了达到更好的siRNA干扰效果，首先针对绵羊的SFR1设计了3对干扰片段(siRNA1(1987)：CCGAAUUCCUGACAUAUAUTT AUAUAU GUCAGGAAUUCGGTT；siRNA2(2498)：CCGCAAUAUGUAAGACAAA TT UUUGUCUUACAUAUUGCGGTT；siRNA3(2279)：GGACACCUACAGACUUGAATT UUCAAGUCUGUAGGUGUCCTT)，如图2所示，3对干扰片段干扰后SFR1相对空白组表达量分别为94.94±12.20％，89.48±4.19％和33.32±1.29％，因此，选择第3对干扰片段(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)进行后续的细胞转染试验。
实施例4lncRNA SFR1对绵羊颗粒细胞凋亡与增殖的影响
通过流式细胞凋亡检测，对SFR1过表达和干扰后的绵羊颗粒细胞凋亡情况进行了检测，如图3所示。发现SFR1过表达组颗粒细胞凋亡率9.50±0.34％，显著高于空白对照组(6.98±0.07％)，而SFR1干扰组颗粒细胞凋亡率无变化，说明SFR1对于绵羊颗粒细胞凋亡有促进作用。
通过MTT法对SFR1过表达和干扰后的绵羊颗粒细胞增殖率进行了检测，发现SFR1干扰组和过表达组都与空白组不存在显著差异，如图3所示。其中，A为SFR1干扰及过表达后流式细胞凋亡检测结果；B为SFR1干扰及过表达后颗粒细胞凋亡率；C为SFR1干扰及过表达后颗粒细胞增殖率。“control”代表未经处理的对照组；“SFR1”代表NUCB2基因经过表达处理或经干扰处理组。“si SFR1”代表SFR1 siRNA干扰处理组；“OE”代表SFR1过表达处理组。数据表示为平均值±SEM，使用t-test进行统计分析。*代表差异显著，p＜0.05。
实施例5lncRNA SFR1对绵羊颗粒细胞蛋白表达的影响
AKT信号通路和TGFβ信号通路都是卵泡发育的主要信号通路，为了探究SFR1发挥作用的信号通路，对这两个信号通路的标志性蛋白p-AKT和TGF-β在经过表达和干扰处理后绵羊颗粒细胞中的表达量进行了Western Blot检测。
发现SFR1干扰处理组绵羊颗粒细胞中p-AKT蛋白表达量显著上调，TGF-β蛋白表达量显著下调；SFR1过表达处理组绵羊颗粒细胞中p-AKT蛋白表达量显著下调，TGF-β蛋白表达量显著上调。实验结果表明，SFR1在绵羊颗粒细胞中对p-AKT蛋白表达发挥抑制作用，对TGF-β蛋白表达发挥促进作用，如图4所示。其中，A为Western Blot检测SFR1过表达和干扰处理后蛋白的表达水平，GAPDH为内参，使用Band Scan 5.0软件进行灰度扫描分析。B为Western Blot检测SFR1过表达和干扰处理后p-AKT蛋白的表达水平。“control”代表未经处理的对照组；“si-NC”代表干扰空载组；“si-SFR1”代表干扰处理组；“over-NC”代表过表达空载组；“OE”代表过表达处理组。C为Western Blot检测SFR1过表达和干扰处理后TGF-β蛋白的表达水平。“control”代表未经处理的对照组；“si-NC”代表干扰空载组；“si-SFR1”代表干扰处理组；“over-NC”代表过表达空载组；“OE”代表过表达处理组。数据表示为平均值±SEM，使用t-test进行统计分析。*代表差异显著，p＜0.05。
实施例6lncRNA SFR1对绵羊颗粒细胞基因表达的影响
为了探究SFR1对卵泡发育可能发挥作用的靶基因，对在绵羊颗粒细胞中表达的与卵泡发育相关的LHR基因、FSHR基因、ERβ基因、ESR基因和AMH基因的表达量进行了qPCR检测。发现SFR1干扰处理后绵羊颗粒细胞中LHR基因、FSHR基因和ERβ基因表达量显著降低，SFR1过表达处理后绵羊颗粒细胞中LHR基因、FSHR基因和ERβ基因表达量显著升高；而SFR1干扰和过表达处理对绵羊颗粒细胞中ESR基因和AMH基因的表达量无影响。
为了进一步验证SFR1在TGFβ信号通路的作用，还对SFR1过表达和干扰处理后绵羊颗粒细胞中TGFβ1基因和TGFβ2基因的表达量进行了qPCR检测，发现SFR1干扰处理组两个基因表达量显著上调，而在SFR1过表达处理组中两个基因的表达量显著下调。结果表明SFR1在绵羊颗粒细胞中对LHR基因、FSHR基因和ERβ基因表达发挥促进作用，对TGFβ1基因和TGFβ2基因的表达发挥抑制作用，而在绵羊颗粒细胞中对ESR基因和AMH基因不发挥作用，如图5所示。其中，“control”代表未经处理的对照组；“siSFR1”代表干扰处理组；“OE”代表过表达处理组。数据表示为平均值±SEM，使用t-test进行统计分析。*代表差异显著，p＜0.05。
实施例7lncRNA SFR1对绵羊颗粒细胞E2、P4、ACT、INH和FS分泌的调节作用
为了验证SFR1对绵羊颗粒细胞E2和其他卵泡生长相关激素的调节作用，通过ELISA方法对转染后颗粒细胞培养皿中的上清液进行了E2、P4、ACT、INH和FS检测，如图6所示。其中，“control”代表未经处理的对照组；“SFR1”代表SFR1经过表达处理或经干扰处理组。“si SFR1”代表si SFR1 siRNA干扰处理组；“OE”代表SFR1过表达处理组。数据表示为平均值±SEM，使用t-test进行统计分析。*代表差异显著，p＜0.05。发现干扰组中，颗粒细胞对E2和P4的分泌量显著上调，ACT和INH的分泌量显著下调，FS分泌量无变化；过表达组中E2、P4的分泌量无变化，而ACT、INH和FS的分泌量显著上调。说明SFR1能够在绵羊卵巢颗粒细胞中发挥功能，对细胞中的E2、P4的分泌具有抑制作用，而对绵羊颗粒细胞中ACT、INH和FS的分泌具有促进作用。
新发现的lncRNA SFR1位于绵羊6号染色体，但通过基因上下游关系分析并没有发现其与绵羊多胎基因BMPR1B基因存在较近的位置关系；通过皮尔森相关系数分析也没有发现两者存在显著的共表达关系，这可能与BMPR1B基因在两个绵羊品种中表达量并不存在显著差异，而是通过其SNP位点变异发挥作用有关。对SFR1在体外培养绵羊颗粒细胞中的过表达和敲降证实了其在绵羊颗粒细胞的凋亡、卵泡发育相关信号通路的激活、卵泡发育相关因子的表达量以及主要生殖激素的分泌上都发挥着作用。其中，检测到的SFR1在颗粒细胞中对p-AKT蛋白表达的抑制，对TGF-β蛋白表达的促进，都提示这可能是其发挥作用的信号通路，促进颗粒细胞的凋亡。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林省农业科学院
<120> lncRNA SFR1及其应用、调控卵泡发育的产品和方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2791
<212> DNA
<213> sheep
<400> 1
ttggaatctg aaaaataaat aaataaaaga caaaaaaaaa aaaattacat tttcaatttt 60
gttttctttt tgcacgcaac ttcctttgat gctctcttca taggttcctg tacaggcacg 120
aagtctgcta ttggcttcat caaagggaat tttcgcaaaa aaatctgaca cattattctt 180
tataccaatg tcagtaataa tattttcaaa tagcacattt gcctgaggat caaggccatt 240
ttgaaaaatt agaattatgt attgttcttc caaatttgtt aatttattta ctcctttaca 300
gtcattccaa acttcatcct ccatgttcat ctgcagctgc atgctcagct tctgataaac 360
tgccggttta gtctgaagaa acactgctgg taattttcgg acactacacc attcacattt 420
tgttagatca gaggtattta cagtaatccc tacaggatca ttttctggtt cttctagctg 480
tatcttgata aaatctaaac aaaaaattac aggttcttgt aatagtcgga agagtgtccc 540
tactcgtata cttcgacagt ttaaaactac agtatcagag gaactttggc agcttaaaga 600
tacaggatca actaaagttt cttgagaaat cactttgcga cgttttagag gtgtggtgat 660
aacagaatta ccaaactgaa aaagaaaaaa aaattttcac ttagtaagtt attaaaacaa 720
gacggcaaac taagtagaca tagcaaagat gacccaacag aagaaatgga actatcaaaa 780
cataaaattg attttacttc aacagtgcta catgagtaag tatttattga ttttataaca 840
gtaacggtaa actcttcctg ttccacttta cccagttatt aggtgaaact ccagtaacag 900
ctaagcagag aaatggtcct ttaggaatca gatagcctgg gttcaaaaaa cagttttact 960
acctttcaat gatctgatct tgtaaaactt ataataacaa cttctaaact gaaaatgcta 1020
gtttcctaaa ctaaaatgta acagtattta ctcaaatgag ctaatgcata tacgtagctt 1080
agcatggtgc ttcatgcatg gtaaaaggct ggataaaagt tatctagtaa cagtggtagt 1140
agttgctata tttggattaa attagcagct ctttagaaaa ctgataattt aggaaaattg 1200
ctatttacat tataaaatga tgcttcctta tatatcaaaa gctattaaat gacttgatct 1260
attgaattaa gatttcaatc attcccaaat gcaaattaat cataatagaa aagtatcttt 1320
ataagtatat attcaaatta aatgtaatta aaagtaaaga tgtcaaaatc cttatcacca 1380
aaaaaagaaa ataaaacaag atcctgattt aaacgaatat ttttccaggt tattaacaga 1440
tatctattag agaggtttaa aacgtttttt agttttagaa ttatttcttc aaatgagatt 1500
ttacttagct caatagttaa gttaggtaat ttccagcaat ctaacactta aaaatatatt 1560
tcttttttgg taccttactc taaaaagaaa caaaacaaaa accaaaaagc tcctcttatt 1620
tatatccttt attcattttt ctatagttgc ttctattttt gatttttaac aaatcaaaac 1680
tatgtaaggg accaacttat cctccgtcac atatttcgct attttttccc ctttgcatta 1740
cctattaaat tctgtggatg gtgttttggt tcactgcatt gtactttcca ctgaaacaaa 1800
tatattcagc tcttcattca ttacttttgc ttgcgctgaa atgtttggaa aggcatttcc 1860
taagattaca ccaaactatc aacctatatt ttttctatta ttatagttac ttttggtttt 1920
tcatttctta ctgatcccat cttaacaatc aaatatgtat gtttccatat tttaatctac 1980
aactttccga attcctgaca tatatacgaa ttcctgacat atgtacatac aactttttaa 2040
tatacaaatt tattttttag gttcttttta caaaaataag aaaatatgca cataatttct 2100
gcatctcagt attctcacta aacagtgcca tgtagaaaat cctgggatca tactcatcaa 2160
taattacctt aaacgtaaat gggttgaacg ccccaaccaa aagacagaga gtggccggat 2220
ggatacaaaa acaagacccc tctatatgct gcttacaaga gacccacctc aaaacaaggg 2280
acacctacag acttgaaagt gaagggctgg aaaaagatat ttcacgcaaa tagagaccaa 2340
aagagagcag gagtggcaat actcatatcc gataaaatag actttaaaaa caaaggctgt 2400
gaaaagagac aaagaaggcc actacataat gatcaaagga acaatccaag aagaagatat 2460
aacaattata aatatatatg cacccaatat aggagcaccg caatatgtaa gacaaatgct 2520
aacaagtatg aaaggggaaa tcaacaataa cacaataata gtgggagact ttaatacccc 2580
actcacacct atggacagat caactaaaca gaaaattaac aaagaaacgc aaactttaaa 2640
tgatacatta gatcagttag acctaattga tatctatagg acatttcacc ccaaaacaac 2700
gaatttcacc tttttttcaa gtgctcatgg aaccttctcc aggatagatc acatcctggg 2760
ccataaatct aaacttgata aattcaaaaa a 2791
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggacaccuac agacuugaat t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
uucaagucug uaggugucct t 21

Claims (10)

1.lncRNA SFR1，其特征在于，具有：
(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或，
(b)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的lncRNA SFR1在制备调控卵泡发育的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过如下(i)-(iv)中的任一种调控卵泡发育：
(i)调控颗粒细胞凋亡；
(ii)调控卵泡发育的信号通路，所述信号通路包括AKT通路和/或TGFβ通路；
(iii)调控卵泡发育相关基因，所述卵泡发育相关基因包括LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种；
(iv)调控卵泡发育相关激素，所述卵泡发育相关激素包括E2、P4、ACT、INH和FS。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
(I)过表达lncRNA SFR1以促进颗粒细胞凋亡；
(II)过表达lncRNA SFR1以抑制AKT通路和/或促进TGF-β通路；沉默lncRNA SFR1以促进AKT通路和/或抑制TGF-β通路；
(III)过表达lncRNA SFR1以促进LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种的表达；沉默lncRNA SFR1以抑制LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种的表达；
(IV)过表达lncRNA SFR1以促进ACT、INH或FS中的一种或多种的分泌；沉默lncRNASFR1以促进E2和/或P4的分泌，抑制ACT和/或INH的分泌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过lncRNA SFR1的重组载体实现过表达lncRNA SFR1。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过lncRNA SFR1的siRNA实现沉默lncRNASFR1；
优选地，所述siRNA具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求2-6任一项所述的应用，其特征在于，所述卵泡发育为绵羊的卵泡发育。
8.一种调控卵泡发育的方法，其特征在于，所述方法包括调控lncRNA SFR1的表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
(I)过表达lncRNA SFR1以促进颗粒细胞凋亡；
(II)过表达lncRNA SFR1以抑制AKT通路和/或促进TGF-β通路；沉默lncRNA SFR1以促进AKT通路和/或抑制TGF-β通路；
(III)过表达lncRNA SFR1以促进LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种的表达；沉默lncRNA SFR1以抑制LHR基因、FSHR基因或ERβ基因中的一种或多种的表达；
(IV)过表达lncRNA SFR1以促进ACT、INH或FS中的一种或多种的分泌；沉默lncRNASFR1以促进E2和/或P4的分泌，抑制ACT和/或INH的分泌；
优选地，所述卵泡发育为绵羊的卵泡发育。
10.一种调控卵泡发育的产品，其特征在于，包括用于过表达lncRNA SFR1的物质和/或用于沉默lncRNA SFR1的物质。
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