CN111374977B - 阿西替尼及其类似物在制备血脑屏障渗透性调控剂中的应用 - Google Patents

阿西替尼及其类似物在制备血脑屏障渗透性调控剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及阿西替尼及其类似物在制备血脑屏障渗透性调控剂中的应用。所述血脑屏障渗透性调控剂能够降低血脑屏障渗透性，促进血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态。阿西替尼及其类似物通过抑制血管内皮细胞生长因子‑磷脂酰肌醇激酶‑蛋白激酶B信号通路，减少病理性血脑屏障紧密连接蛋白Claudin‑5/Occludin下调的程度，降低血脑屏障渗透性。所述血脑屏障渗透性调控剂能够用于引起血脑屏障渗透性改变的相关疾病的治疗。

Description

阿西替尼及其类似物在制备血脑屏障渗透性调控剂中的应用
技术领域
本发明属于制药领域，涉及阿西替尼及其类似物的新的治疗用途，尤其涉及阿西替尼及其类似物在制备血脑屏障渗透性调控剂中的应用。该血脑屏障渗透性调控剂能够用于治疗引起血脑屏障渗透性改变的相关疾病。
背景技术
血脑屏障是保护、维持中枢神经系统功能的特殊系统，主要由脑微血管内皮细胞、内皮细胞之间的紧密连接、基膜以及毛细血管周围的胶质细胞足突构成，其中内皮细胞及其紧密连接是血脑屏障的重要形态学基础。大部分的大分子物质和超过98％小分子药物都不能渗漏通过血脑屏障，只有少部分分子量小于500Da的营养物质可以被动扩散或者选择性跨过血脑屏障以维持中枢神经系统的生理平衡。
血脑屏障完整性缺失是脑部疾病发生、发展过程中的一个显著的病理学特性。脑毛细血管内皮细胞及细胞间表达的紧密连接构成血脑屏障的低渗和高电阻特性。其中，Claudin-5、Occludin等是构成紧密连接的关键蛋白，在维持血脑屏障完整性特性中扮演重要的角色。血脑屏障结构病理性破坏主要是指其紧密连接结构完整性缺失及屏障功能异常，伴随着紧密连接蛋白下调表达、血脑屏障渗透性增加、中枢神经系统内环境平衡被破坏，是许多中枢神经系统疾病突出的病理性特征，包括脑胶质瘤、帕金森氏病、脑缺血、阿尔兹海默症、多发性硬化等。
阿西替尼(Axitinib)是由美国Pfizer公司研发的一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，可阻断血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)的自磷酸化作用、血管内皮生长因子(VEGF)调节内皮细胞的活力、微管形成及下游信号。该药于2012年1月27日获美国FDA批准上市，商品名为Inlyta。该药为片剂，主要用于治疗对药物没有应答的晚期肾癌。阿西替尼的中文化学名称为：N-甲基-2-((2-((1E)-2-(吡啶-2-基)乙烯)-1H-吲哚-6-基)硫)苯甲酰胺；英文化学名称：N-methyl-2-((3-((1E)-2-(pyridine-2-yl)ethenyl)-1H-indazol-6-yl)sulfanyl)benzamide；分子式：C22H18N4OS；分子量：386.47；CAS登记号：319460-85-0。
阿西替尼类似物主要是指作用机制与阿西替尼类似，能作用于血管内皮生长因子-磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B(VEGF-PI3K-AKT)信号通路的抑制剂，包括但不限于VEGF、PI3K、AKT等3个位点的抑制剂，如磷脂酰肌醇激酶(PI3K)位点抑制剂LY294002。
近年来研究发现阿西替尼具有治疗非小细胞肺癌、白血病的作用，此外，还发现了阿西替尼可通过促进白色脂肪细胞褐色化抵抗高脂饲料诱导的肥胖和胰岛素不敏感症状，同时具有治疗脂肪肝的作用。但是，阿西替尼及其类似物具有调控血脑屏障渗透性的作用尚未报道。
发明内容
本发明的目的在于提供阿西替尼及其类似物在制备血脑屏障渗透性调控剂中的应用。
本发明的发明人经过深入的研究发现，阿西替尼及其类似物对血脑屏障渗透性具有调控作用，其能够降低血脑屏障渗透性，促进血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态，从而实现针对引起血脑屏障渗透性改变的相关疾病的治疗，本发明正是基于上述发现而完成的发明。具体而言，本发明涉及以下发明内容。
1.阿西替尼及其类似物在制备血脑屏障渗透性调控剂中的应用。
2.如上述1所述的应用，其特征在于，上述血脑屏障渗透性调控剂能够降低血脑屏障渗透性，促进血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态。
3.如上述1或2所述的应用，其特征在于，阿西替尼及其类似物通过减少病理性血脑屏障紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin下调的程度，降低血脑屏障渗透性。
4.如上述1或2所述的应用，其特征在于，阿西替尼及其类似物通过抑制血管内皮细胞生长因子-磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B信号通路，减少病理性血脑屏障紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin下调的程度，降低血脑屏障渗透性。
5.如上述1或2所述的应用，其特征在于，所述阿西替尼类似物是能够在血管内皮生长因子-磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B信号通路中对血管内皮生长因子、磷脂酰肌醇激酶或蛋白激酶B的任意位点发挥抑制作用的抑制剂。
6.如上述5所述的应用，其特征在于，所述阿西替尼类似物是磷脂酰肌醇激酶抑制剂。
7.如上述1或2所述的应用，其特征在于，上述血脑屏障渗透性调控剂是用于治疗引起血脑屏障渗透性改变的相关疾病的药物。发明的效果
本发明涉及的血脑屏障渗透性调控剂，通过阿西替尼及其类似物对血脑屏障渗透性的调控作用，能够降低血脑屏障渗透性，促进血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态，从而达到对引起血脑屏障渗透性改变的相关疾病的治疗作用，具有显著优越的技术效果。
附图说明
图1：体外生理性血脑屏障和病理性血脑屏障跨膜电阻值测定。脑微血管内皮细胞bEnd.3的Transwell模型模拟生理性血脑屏障，脑微血管内皮细胞bEnd.3和脑胶质瘤细胞U87MG共孵育的Transwell模型模拟病理性血脑屏障，图中所示结果为细胞电阻仪检测的生理性血脑屏障和病理性血脑屏障细胞跨膜电阻值(n＝5)。
图2：体外FITC-右旋糖酐跨生理性血脑屏障和病理性血脑屏障转运效率。选用分子量为10kDa的FITC-右旋糖酐评价血脑屏障的渗透性，将FITC-右旋糖酐的HBSS溶液加于Transwell小室，作用4小时，图中所示结果为荧光分光光度计检测的Transwell外室FITC-右旋糖酐浓度(n＝3)。
图3：体外生理性血脑屏障和病理性血脑屏障紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin表达。脑微血管内皮细胞bEnd.3的Transwell模型模拟生理性血脑屏障，脑微血管内皮细胞bEnd.3和脑胶质瘤细胞U87MG共孵育的Transwell模型模拟病理性血脑屏障。对Transwell小室膜上的bEnd.3细胞进行免疫荧光染色，图A所示为共聚焦观察紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin表达结果，图B是Image J对Claudin-5/Occludin表达的荧光半定量分析结果(n＝3)。
图4：体内FITC-右旋糖酐于生理性血脑屏障和病理性血脑屏障渗透性评价。模型动物尾静脉注射FITC-右旋糖酐溶液，4小时后，心脏灌流获取正常脑组织和荷瘤脑组织，冠状面冰冻切片厚度为5微米，CD31(红色)特异性标记脑组织血管，图中所示为激光共聚焦显微镜观察FITC-右旋糖酐(绿色)在血管的渗漏结果。
图5：组织水平透射电镜观察生理性血脑屏障和病理性血脑屏障紧密连接结构。心脏灌流取模型动物正常脑组织和荷瘤脑组织，图中所示为透射电镜观察正常脑组织切片血脑屏障紧密连接结构(左图)及荷瘤脑组织切片血脑屏障紧密连接结构(右图)。
图6：体内生理性血脑屏障和病理性血脑屏障紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin表达。心脏灌流取模型动物正常脑组织和荷瘤脑组织，冠状面冰冻切片厚度为5微米，对脑组织紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin进行免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察密连接蛋白Claudin-5/Occludin表达。
图7：体外阿西替尼呈剂量依赖性阻断血管内皮生长因子(VEGF)与血管内皮生长因子受体(VEGFR)结合。脑微血管内皮细胞bEnd.3的Transwell模型模拟生理性血脑屏障，Transwell小室中加入外源性血管内皮生长因子(VEGF)刺激，另外用不同浓度阿西替尼(0、2μg/mL、4μg/mL)协同作用24小时后，对Transwell小室膜上的bEnd.3细胞进行免疫荧光染色，图A所示为共聚焦观察紧密连接蛋白Claudin-5表达结果，图B是Image J对Claudin-5表达的荧光半定量分析结果(n＝3)。
图8：体外阿西替尼降低紧密连接蛋白Claudin-5下调的程度，降低病理性血脑屏障破坏程度。脑微血管内皮细胞bEnd.3和脑胶质瘤细胞U87MG共孵育Transwell模型模拟病理性血脑屏障，阿西替尼作用于Transwell小室，24小时后，对Transwell小室膜上的bEnd.3细胞进行免疫荧光染色，以脑微血管内皮细胞bEnd.3的Transwell模型模拟的生理性血脑屏障作为阳性对照组，图A所示为共聚焦观察紧密连接蛋白Claudin-5表达结果，图B是Image J对Claudin-5表达的荧光半定量分析结果(n＝3)。
图9：体外阿西替尼呈剂量依赖性促进病理性血脑屏障功能恢复至接近生理性屏障状态。脑微血管内皮细胞bEnd.3和脑胶质瘤细胞U87MG共孵育Transwell模型模拟病理性血脑屏障，不同浓度的阿西替尼(0、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)作用于Transwell小室，24小时后，细胞电阻仪检测细胞跨膜电阻值，以脑微血管内皮细胞bEnd.3的Transwell模型模拟的生理性血脑屏障作为阳性对照(n＝5)。
图10：体外U87MG脑胶质瘤细胞与bEnd.3细胞共孵育，阿西替尼及其类似物调控血脑屏障渗透性，细胞跨膜电阻值测定。脑微血管内皮细胞bEnd.3和脑胶质瘤细胞U87MG共孵育Transwell模型模拟病理性血脑屏障，Transwell小室中加入阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)、蛋白激酶B(AKT)激动剂SC79(10μM)，24小时后，细胞电阻仪检测细胞跨膜电阻值，以脑微血管内皮细胞bEnd.3的Transwell模型模拟的生理性血脑屏障作为阳性对照(n＝5)。
图11：体外U87MG脑胶质瘤细胞与bEnd.3细胞共孵育，FITC-右旋糖酐跨膜转运效率。脑微血管内皮细胞bEnd.3和脑胶质瘤细胞U87MG共孵育Transwell模型模拟病理性血脑屏障，Transwell小室中加入阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)、蛋白激酶B(AKT)激动剂SC79(10μM)，24小时后，PBS清洗Transwell小室和外室，将FITC-右旋糖酐的HBSS溶液加于Transwell小室，作用4小时，图中所示结果即为荧光分光光度计检测Transwell外室的FITC-右旋糖酐浓度，以脑微血管内皮细胞bEnd.3的Transwell模型模拟的生理性血脑屏障作为阳性对照(n＝3)。
图12：体外U87MG脑胶质瘤细胞与bEnd.3细胞共孵育，血脑屏障紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin免疫荧光染色。脑微血管内皮细胞bEnd.3和脑胶质瘤细胞U87MG共孵育Transwell模型模拟病理性血脑屏障，Transwell小室中加入阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)、蛋白激酶B(AKT)激动剂SC79(10μM)，24小时后，对Transwell小室膜上的bEnd.3细胞进行免疫荧光染色，以脑微血管内皮细胞bEnd.3的Transwell模型模拟的生理性血脑屏障作为阳性对照，图中所示为共聚焦观察紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin表达结果。
图13：Transwell模型中细胞存活率评价。脑微血管内皮细胞bEnd.3和脑胶质瘤细胞U87MG共孵育Transwell模型模拟病理性血脑屏障，Transwell小室中加入阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)，24小时后，四唑蓝比色法检测Transwell小室中bEnd.3细胞(图A)及Transwell外室中U87MG细胞(图B)的存活率(n＝3)。
图14：阿西替尼及其类似物细胞毒性评价。以1×104个/孔的密度，取200μL生长良好的bEnd.3细胞、U87MG脑胶质瘤细胞悬液接种于96孔板中。细胞贴壁生长后，加入不同浓度(0～10μg/mL)的阿西替尼、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002，以未处理组作为空白对照。四唑蓝比色法检测细胞存活率，其中图A、图B分别是阿西替尼对bEnd.3细胞、U87MG脑胶质瘤细胞的细胞毒性，图C、图D分别是阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002对bEnd.3细胞、U87MG脑胶质瘤细胞的细胞毒性(n＝3)。
图15：体外肿瘤细胞培养液与bEnd.3细胞共孵育，阿西替尼及其类似物调控血脑屏障渗透性，细胞跨膜电阻值测定。脑微血管内皮细胞bEnd.3和脑胶质瘤细胞U87MG共孵育Transwell模型模拟病理性血脑屏障，待病理性血脑屏障模型形成，撤除Transwell外室的U87MG脑胶质瘤细胞，但保留肿瘤细胞培养液。Transwell小室中加入阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)，24小时后，细胞电阻仪检测细胞跨膜电阻值，以脑微血管内皮细胞bEnd.3的Transwell模型模拟的生理性血脑屏障作为阳性对照(n＝5)。
图16：体外肿瘤细胞培养液与bEnd.3细胞共孵育，FITC-右旋糖酐跨膜转运效率。脑微血管内皮细胞bEnd.3和脑胶质瘤细胞U87MG共孵育Transwell模型模拟病理性血脑屏障，待病理性血脑屏障模型形成，撤除Transwell外室的U87MG脑胶质瘤细胞，但保留肿瘤细胞培养液。Transwell小室中加入阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)，24小时后，PBS清洗Transwell小室和外室，将FITC-右旋糖酐的HBSS溶液加于Transwell小室，作用4小时，图中所示结果即为荧光分光光度计检测Transwell外室的FITC-右旋糖酐浓度，以脑微血管内皮细胞bEnd.3的Transwell模型模拟的生理性血脑屏障作为阳性对照(n＝3)。
图17：体外肿瘤细胞培养液与bEnd.3细胞共孵育，体外血脑屏障紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin免疫荧光染色。脑微血管内皮细胞bEnd.3和脑胶质瘤细胞U87MG共孵育Transwell模型模拟病理性血脑屏障，待病理性血脑屏障模型形成，撤除Transwell外室的U87MG脑胶质瘤细胞，但保留肿瘤细胞培养液。Transwell小室中加入阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)，24小时后，对Transwell小室膜上的bEnd.3细胞进行免疫荧光染色，以脑微血管内皮细胞bEnd.3的Transwell模型模拟的生理性血脑屏障作为阳性对照，共聚焦观察紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin表达结果。
图18：脑胶质瘤模型中，阿西替尼调控病理性血脑屏障渗透性降低。按照10mg/kg阿西替尼给药剂量尾静脉注射于荷瘤动物，24小时后，按照5mg/kg给药剂量尾静脉注射依文思蓝溶液，4小时后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，图A所示为小动物活体成像仪定性观察脑组织中依文思蓝分布强度结果，图B所示为依文思蓝荧光信号半定量结果(n＝3)。
图19：脑胶质瘤模型中，阿西替尼调控病理性血脑屏障渗透性降低，依文思蓝入脑渗透含量减少。按照10mg/kg阿西替尼给药剂量尾静脉注射于荷瘤动物，24小时后，按照5mg/kg给药剂量尾静脉注射依文思蓝溶液，4小时后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，机溶剂N，N-二甲基甲酰胺萃取脑组织中依文思蓝，图中所示结果为紫外分光光度法定量检测的依文思蓝渗透至脑内量(n＝3)。
图20：阿西替尼调控病理性血脑屏障渗透性降低，治疗脑胶质瘤。荷瘤第4天开始给药，以0.2％注射级吐温80溶液稀释阿西替尼，按照10mg/kg阿西替尼给药剂量尾静脉注射于荷瘤动物，连续给药7天，生物发光成像技术监测原位脑胶质瘤生长，图A定性反映荷瘤第4天、第16天脑肿瘤大小，图B是脑胶质瘤实时(第4、7、10、13、16天)生长的定量监测曲线(n＝5)。以生理盐水组为对照。
图21：脑胶质瘤模型动物生存曲线。阿西替尼给药治疗结束后，记录生理盐水组、阿西替尼治疗组动物的生存周期(n＝6)。
图22：帕金森氏病发生引起血脑屏障病理性破坏，渗透性增加。选择雄性C57/BL6(6-8w)为模型动物，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶溶给药刺激构建帕金森氏病模型。按照5mg/kg给药剂量尾静脉注射依文思蓝溶液，4小时后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，图A所示为小动物活体成像仪定性观察脑组织中依文思蓝分布强度结果，图B所示为依文思蓝荧光信号半定量结果(n＝3)。
图23：帕金森氏病发生伴随着血脑屏障渗透性增加，依文思蓝渗透入脑含量增加。选择雄性C57/BL6(6-8w)为模型动物，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶溶给药刺激构建帕金森氏病模型。按照5mg/kg给药剂量尾静脉注射依文思蓝溶液，4小时后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，机溶剂N，N-二甲基甲酰胺萃取脑组织中依文思蓝，图中所示结果为紫外分光光度法定量检测的依文思蓝渗透至脑内量(n＝3)。
图24：帕金森氏病模型中，阿西替尼调控病理性血脑屏障渗透性降低。选择雄性C57/BL6(6-8w)为模型动物，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶溶给药刺激构建帕金森氏病模型。按照10mg/kg阿西替尼给药剂量尾静脉注射于帕金森氏病模型动物，24小时后，按照5mg/kg给药剂量尾静脉注射依文思蓝溶液，4小时后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，图A所示为小动物活体成像仪定性观察脑组织中依文思蓝分布强度结果，图B所示为依文思蓝荧光信号半定量结果如(n＝3)。
图25：帕金森氏病模型中，阿西替尼调控病理性血脑屏障渗透性降低，依文思蓝入脑含量减少。按照10mg/kg阿西替尼给药剂量尾静脉注射于帕金森氏病模型动物，24小时后，按照5mg/kg给药剂量尾静脉注射依文思蓝溶液，4小时后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，有机溶剂N，N-二甲基甲酰胺萃取脑组织中依文思蓝，图中所示结果为紫外分光光度法定量检测的依文思蓝渗透至脑内量(n＝3)。
图26：阿西替尼调控病理性血脑屏障渗透性降低，治疗帕金森氏病。选择雄性C57/BL6(6-8w)为模型动物，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶溶给药刺激构建帕金森氏病模型。按照10mg/kg阿西替尼给药剂量尾静脉注射于帕金森氏病模型动物，连续给药7天。左旋多巴溶于生理盐水，按照20mg/kg给药剂量腹腔注射，连续给药10天。治疗结束后，按照5mg/kg给药剂量尾静脉注射依文思蓝溶液，4小时后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，图A所示为小动物活体成像仪定性观察脑组织中依文思蓝分布强度结果，图B所示为依文思蓝荧光信号半定量结果(n＝3)。
图27：阿西替尼调控病理性血脑屏障渗透性降低，治疗帕金森氏病，依文思蓝脑内含量减少。选择雄性C57/BL6(6-8w)为模型动物，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶溶给药刺激构建帕金森氏病模型。按照10mg/kg阿西替尼给药剂量尾静脉注射于帕金森氏病模型动物，连续给药7天。左旋多巴溶于生理盐水，按照20mg/kg给药剂量腹腔注射，连续给药10天。治疗结束后，按照5mg/kg给药剂量尾静脉注射依文思蓝溶液，4小时后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，有机溶剂N，N-二甲基甲酰胺萃取脑组织中依文思蓝，图中所示结果为紫外分光光度法定量检测的依文思蓝渗透至脑内量(n＝3)。
图28：阿西替尼调控血脑屏障渗透性治疗帕金森氏病，模型动物运动时间记录。选择雄性C57/BL6(6-8w)为模型动物，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶溶给药刺激构建帕金森氏病模型。按照10mg/kg阿西替尼给药剂量尾静脉注射于帕金森氏病模型动物，连续给药7天。左旋多巴溶于生理盐水，按照20mg/kg给药剂量腹腔注射，连续给药10天。治疗结束后，记录各实验组动物2分钟内的运动时间(走动、双前肢向上抬举、洗脸、理毛等)(n＝5)。
图29：阿西替尼调控血脑屏障渗透性治疗帕金森氏病，模型动物脑组织酪氨酸羟化酶表达。选择雄性C57/BL6(6-8w)为模型动物，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶溶给药刺激构建帕金森氏病模型。按照10mg/kg阿西替尼给药剂量尾静脉注射于帕金森氏病模型动物，连续给药7天。左旋多巴溶于生理盐水，按照20mg/kg给药剂量腹腔注射，连续给药10天。治疗结束后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，4％多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋后对脑组织纹状体部位冠状面切片，并且进行酪氨酸羟化酶免疫组化染色，图A所示为光学显微镜观察各实验组脑组织酪氨酸羟化酶表达结果，图B是Image J对酪氨酸羟化酶表达的半定量分析结果(n＝3)。
具体实施方式
本发明涉及的阿西替尼(Axitinib)是一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂，其中文化学名称为N-甲基-2-((2-((1E)-2-(吡啶-2-基)乙烯)-1H-吲哚-6-基)硫)苯甲酰胺；英文化学名称为N-methyl-2-((3-((1E)-2-(pyridine-2-yl)ethenyl)-1H-indazol-6-yl)sulfanyl)benzamide；分子式为C22H18N4OS；分子量为386.47；CAS登记号为319460-85-0。
本发明涉及的阿西替尼类似物是指作用机制与阿西替尼类似，能作用于血管内皮生长因子-磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B(VEGF-PI3K-AKT)信号通路的抑制剂，如磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002等。
本发明的发明人发现，阿西替尼及其类似物对血脑屏障渗透性具有调控作用，其能够降低血脑屏障渗透性，促进血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态，从而实现针对血脑屏障渗透剂及屏障功能改变引起的相关疾病的治疗。
作为血脑屏障功能相关疾病，可以列举脑胶质瘤、帕金森氏病、脑缺血、阿尔兹海默症、多发性硬化等。这些脑部疾病的发生都会引起血脑屏障紧密连接结构完整性缺失及屏障功能异常，伴随着紧密连接蛋白下调表达、血脑屏障渗透性增加、中枢神经系统内环境平衡被破坏。
根据下文中所记载的实施例可以明确，阿西替尼及其类似物能够通过其对血脑屏障渗透性的调控作用发挥对脑胶质瘤和帕金森氏病的治疗作用。
进一步的研究发现，阿西替尼及其类似物在体外能够阻断血管内皮生长因子受体(VEGFR)，抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)与血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)结合，抑制VEGF下游磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)蛋白信号通路、减少Claudin-5/Occludin蛋白下调表达，降低血脑屏障渗透性，使血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态，该作用具有剂量依赖性。研究还发现，阿西替尼及其类似物在体内能够促进血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态，显著抑制脑胶质瘤生长，显著缓解帕金森氏病的运动障碍，有效治疗脑胶质瘤和帕金森氏病。研究还发现，阿西替尼及其类似物在调控血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态的药物浓度条件下，对脑胶质瘤细胞及脑内皮细胞无明显细胞毒性，说明阿西替尼及其类似物对脑胶质瘤及帕金森氏病的治疗作用是通过调控病理性血脑屏障渗透性降低、促进血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态实现的。
在下文中，结合实施例和附图对本发明进行详细说明。需要说明的是，以下的实施例仅为例示，下述实施例对本发明的保护范围并无限定作用。
实施例
实施例一脑胶质瘤生长引起血脑屏障病理性破坏，渗透性增加
1.生理性血脑屏障细胞模型构建
以脑微血管内皮细胞bEnd.3作为血脑屏障模型细胞，以1×105个/孔的细胞密度，取0.5mL生长良好的bEnd.3细胞悬液接种于孔径0.4μm的12孔Transwell板小室中，外室补加1.5mL新鲜培养液。隔天更换新鲜培养液，在37℃，5％二氧化碳条件下持续孵育15天。当细胞跨膜电阻值大于150欧姆·平方厘米(Ω·cm2)时，得到评价用生理性血脑屏障细胞模型。
2.病理性血脑屏障细胞模型构建
以U87MG脑胶质瘤细胞作为脑肿瘤模型细胞，以2×105个/孔的细胞密度，取1.5mL生长良好的U87MG细胞悬液接种于12孔板中，在37℃，5％二氧化碳条件下孵育至细胞贴壁。然后将实施例一中方法1构建的生理性血脑屏障即生长有bEnd.3细胞的Transwell小室转移至长有U87MG细胞的12孔板中，继续共培养24小时，得到病理性血脑屏障细胞模型。
3.脑胶质瘤生长引起模型细胞紧密连接蛋白下调，血脑屏障渗透性增加
以实施例一中方法1和方法2分别构建的生理性血脑屏障和病理性血脑屏障为模型，将生长有bEnd.3细胞的Transwell小室转移至另一12孔板中，PBS清洗3次，在小室中加入0.5mL HBSS营养液，外室补加1.5mL HBSS营养液，细胞于37℃平衡15分钟，跨膜电阻仪检测细胞跨膜电阻值，结果如图1所示。以实施例一中方法1和方法2分别构建的生理性血脑屏障和病理性血脑屏障为模型，将生长有bEnd.3细胞的Transwell小室转移至另一12孔板中，PBS清洗3次，在小室中加入含有FITC标记荧光标记的分子量为10kDa右旋糖酐HBSS溶液，外室补加1.5mL HBSS营养液，细胞于37℃避光孵育4小时后，荧光分光光度计检测经Transwell小室转移至外室的FITC-右旋糖酐的浓度，结果如图2所示。以实施例一中方法1和方法2分别构建的生理性血脑屏障和病理性血脑屏障为模型，将生长有bEnd.3细胞的Transwell小室取出，用PBS清洗3次，4％甲醛固定，10％的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入Claudin-5/Occludin一抗并于4℃孵育过夜，最后用荧光标记的二抗孵育1小时，DAPI复染细胞核。激光共聚焦显微镜观察紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin的表达，Image J半定量分析Claudin-5/Occludin表达水平，结果如图3所示。
根据图1～3所示的结果可知，病理性血脑屏障细胞模型中，肿瘤细胞U87MG和bEnd.3细胞共孵育之后，细胞跨膜电阻值降低，紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin蛋白表达较正常的血脑屏障模型明显下调，血脑屏障渗透性增加，FITC-右旋糖酐跨膜转运增加。
4.脑胶质瘤生长引起模型动物紧密连接蛋白下调，血脑屏障渗透性增加
选择雄性BABL/c裸鼠(20±2g)为模型动物，借助脑立体定位仪，将表达虫荧光素酶的U87-luci胶质瘤细胞以5×105个细胞/5微升浓度接种于裸鼠纹状体(接种坐标于前囟前侧0.8毫米，右侧2毫米，深度为3毫米)区域，构建原位脑胶质瘤模型。待脑胶质瘤生长到适宜体积，尾静脉注射FITC-右旋糖酐溶液，4小时后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，将组织冷冻切片，并于激光共聚焦显微镜观察FITC-右旋糖酐在脑血管的渗透性，CD31特异性荧光标记脑血管，结果如图4所示。
根据图4所示的结果可知，脑肿瘤的生长会严重破坏脑血管结构，血脑屏障渗透性增加，对比正常脑组织，脑胶质瘤模型中，FITC-右旋糖酐从血管渗出量显著增加。
心脏灌流取正常裸鼠和原位脑胶质瘤荷瘤裸鼠完整大脑，组织透射电镜观察血脑屏障紧密连接蛋白结构变化，结果如图5所示。对脑组织紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin进行免疫荧光染色，激光共聚焦观察紧密连接蛋白表达水平，结果如图6所示。
根据图5和图6所示的结果可知，脑胶质瘤的生长明显破坏血脑屏障紧密连接结构，正常脑组织的紧密连接蛋白表达完整且连续，脑肿瘤组织的紧密连接蛋白表达离散且不连续。此外，脑胶质瘤生长显著下调紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin表达，血脑屏障渗透性增加。
实施例二阿西替尼作用于血管内皮生长因子受体(VEGFR)，呈剂量依赖性阻断血管内皮细胞生长因子(VEGF)与受体结合
以实施例一中方法1构建的生理性血脑屏障为模型，在Transwell小室中加入外源性血管内皮细胞生长因子(VEGF)和不同浓度阿西替尼，药物作用24小时后，将生长有bEnd.3细胞的Transwell小室取出，用PBS清洗3次，4％甲醛固定，10％的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入Claudin-5一抗并于4℃孵育过夜，最后用荧光标记的二抗孵育1小时，DAPI复染细胞核。激光共聚焦显微镜观察紧密连接蛋白Claudin-5表达情况，结果如图7所示。
根据图7所示的结果可知，阿西替尼作用于血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)，可以阻断血管内皮细胞生长因子(VEGF)与血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)结合，减少Claudin-5下调的程度，该作用呈剂量依赖性。
实施例三阿西替尼阻断血管内皮细胞生长因子受体作用位点，减少紧密连接蛋白下调，显著降低血脑屏障病理性破坏程度
以实施例一中方法2构建的病理性血脑屏障为模型，在Transwell小室中加入阿西替尼，药物作用24小时后，将生长有bEnd.3细胞的Transwell小室转移至另一12孔板中，PBS清洗3次，4％甲醛固定，10％的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入Claudin-5一抗并于4℃孵育过夜，最后用荧光标记的二抗孵育1小时，DAPI复染细胞核。激光共聚焦显微镜观察紧密连接蛋白Claudin-5表达情况，结果如图8所示。
根据图8所示的结果可知，阿西替尼可以阻断血管内皮细胞生长因子(VEGF)与血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)结合，减少血脑屏障紧密连接蛋白Claudin-5下调表达，显著降低血脑屏障病理性破坏程度。
以实施例一中方法2构建的病理性血脑屏障为模型，在Transwell小室中加入不同浓度阿西替尼刺激，作用24小时后，测定细胞跨膜电阻值，结果如图9所示。
根据图9所示的结果可知，阿西替尼调控血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态的作用呈剂量依赖性，当阿西替尼浓度为0.5～20μg/mL(1.29-51.75μM)时，可有效降低血脑屏障渗透性，促进血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态。
实施例四阿西替尼及其类似物抑制血管内皮细胞生长因子-磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B(VEGF-PI3K-AKT)信号通路，减少病理性血脑屏障紧密连接蛋白下调的程度，降低血脑屏障渗透性
以实施例一中方法1和方法2分别构建的生理性血脑屏障和病理性血脑屏障为模型，在实施例一中方法2构建的病理性血脑屏障模型的Transwell小室中加入阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)、蛋白激酶B(AKT)激动剂SC79(10μM)，药物作用24小时后，将生长有bEnd.3细胞的Transwell小室转移至另一12孔板中，PBS清洗3次，在小室中加入0.5mL HBSS营养液，外室补加1.5mL HBSS营养液，细胞于37℃平衡15分钟，跨膜电阻仪检测细胞跨膜电阻值，结果如图10所示。
以实施例一中方法1和方法2分别构建的生理性血脑屏障和病理性血脑屏障为模型，在实施例一中方法2构建的病理性血脑屏障模型的Transwell小室中加入阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)、蛋白激酶B(AKT)激动剂SC79(10μM)，药物作用24小时后，将生长有bEnd.3细胞的Transwell小室转移至另一12孔板中，PBS清洗3次，在小室中加入含有FITC标记荧光标记的分子量为10kDa右旋糖酐HBSS溶液，外室补加1.5mL HBSS营养液，细胞于37℃避光孵育4小时后，荧光分光光度计检测经Transwell小室转移至外室的FITC-右旋糖酐的浓度，结果如图11所示。
以实施例一中方法1和方法2分别构建的生理性血脑屏障和病理性血脑屏障为模型，在实施例一中方法2构建的病理性血脑屏障模型的Transwell小室中加入阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)、蛋白激酶B(AKT)激动剂SC79(10μM)，药物作用24小时后，将生长有bEnd.3细胞的Transwell小室取出，用PBS清洗3次，4％甲醛固定，10％的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入Claudin-5/Occludin一抗并于4℃孵育过夜，最后用荧光标记的二抗孵育1小时，DAPI复染细胞核。激光共聚焦显微镜观察紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin表达情况，结果如图12所示。
根据图10、图11和图12所示的结果可知，阿西替尼作用于血管内皮生长因子受体(VEGFR)，可以阻断血管内皮细胞生长因子(VEGF)与血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)结合，抑制血管内皮细胞生长因子-磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B(VEGF-PI3K-AKT)信号通路，减少病理性血脑屏障紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin下调的程度，降低血脑屏障渗透性，促进血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态。
另外，根据图10、图11和图12所示的结果可知，阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002，作用于磷脂酰肌醇激酶(PI3K)位点，可以抑制血管内皮细胞生长因子-磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B(VEGF-PI3K-AKT)信号通路，减少血脑屏障紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin下调的程度，降低血脑屏障渗透性，促进血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态。
实施例五阿西替尼及其类似物调控病理性血脑屏障渗透性降低，治疗浓度下不产生抗脑胶质瘤药效
以实施例一中方法1和方法2分别构建的生理性血脑屏障和病理性血脑屏障为模型，在实施例一中方法2构建的病理性血脑屏障模型的Transwell小室中加入阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)。药物作用24小时后，将生长有bEnd.3细胞的Transwell小室转移至另一12孔板中，加入5mg/mL的噻唑蓝50μL；另外，向生长有U87MG细胞的Transwell外室加入5mg/mL的噻唑蓝150μL，继续孵育4小时。弃去培养基，将每孔中的紫色甲臜溶于2000μL二甲基亚砜，置于恒温振荡箱中振荡15分钟，以200μL/孔转移至96孔板。用酶标仪测量570nm处吸光度值。根据以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(实验组的吸光度/对照组的吸光度值)×100％bEnd.3细胞和U87MG细胞存活率结果如图13所示。
另外，以bEnd.3细胞、U87MG脑胶质瘤细胞作为模型细胞，采用四唑蓝比色法评价阿西替尼、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002的细胞毒性。以1×104个/孔的密度，取200μL生长良好的bEnd.3细胞、U87MG脑胶质瘤细胞悬液接种于96孔板中。在37℃，5％二氧化碳条件下孵育至贴壁。然后向其中加入不同浓度(0～10μg/mL)的阿西替尼、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002，以未处理组作为空白对照，每组重复3次。继续孵育48小时，然后向每孔加入5mg/mL的噻唑蓝20μL，继续孵育4小时，弃去培养基，向每孔中加入200μL二甲基亚砜，将96孔板置于恒温振荡箱中振荡15分钟，用酶标仪测量570nm处吸光度值。bEnd.3细胞和U87MG细胞存活率结果如图14所示。
以实施例一中方法1和方法2分别构建的生理性血脑屏障和病理性血脑屏障为模型。待病理性血脑屏障模型形成，撤除Transwell外室的U87MG脑胶质瘤细胞，但保留肿瘤细胞培养液。在Transwell小室中加入阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)，药物作用24小时后，将生长有bEnd.3细胞的Transwell小室转移至另一12孔板中，PBS清洗3次，在小室中加入0.5mL HBSS营养液，外室补加1.5mL HBSS营养液，细胞于37℃平衡15分钟，跨膜电阻仪检测细胞跨膜电阻值，结果如图15所示。
以实施例一中方法1和方法2分别构建的生理性血脑屏障和病理性血脑屏障为模型。待病理性血脑屏障模型形成，撤除Transwell外室的U87MG脑胶质瘤细胞，但保留肿瘤细胞培养液。在Transwell小室中加入阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)，药物作用24小时后，将生长有bEnd.3细胞的Transwell小室转移至另一12孔板中，PBS清洗3次，在小室中加入含有FITC标记荧光标记的分子量为10kDa右旋糖酐HBSS溶液，外室补加1.5mL HBSS营养液，细胞于37℃避光孵育4小时后，荧光分光光度计检测经Transwell小室转移至外室的FITC-右旋糖酐的浓度，结果如图16所示。
以实施例一中方法1和方法2分别构建的生理性血脑屏障和病理性血脑屏障为模型。待病理性血脑屏障模型形成，撤除Transwell外室的U87MG脑胶质瘤细胞，但保留肿瘤细胞培养液。在Transwell小室中加入阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)，药物作用24小时后，将生长有bEnd.3细胞的Transwell小室取出，用PBS清洗3次，4％甲醛固定，10％的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入Claudin-5/Occludin一抗并于4℃孵育过夜，最后用荧光标记的二抗孵育1小时，DAPI复染细胞核。激光共聚焦显微镜观察紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin表达情况，结果如图17所示。
根据图13、图14所示的结果可知，阿西替尼(10μM)、阿西替尼类似物磷脂酰肌醇激酶(PI3K)抑制剂LY294002(10μM)在治疗剂量下对bEnd.3细胞和U87MG细胞不产生明显的细胞毒性，细胞存活率均大于80％。另外，根据图15、图16和图17所示的结果可知，在维持血脑屏障功能破坏的病理条件下，阿西替尼及其类似物作用后，病理性血脑屏障紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin下调的程度降低，血脑屏障渗透性减少，屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态。上述结果说明阿西替尼及其类似物在治疗剂量下只起调控病理性血脑屏障渗透性的作用，对U87MG脑胶质瘤细胞不产生抗肿瘤药效。
实施例六阿西替尼促进脑胶质瘤模型动物血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态
选择雄性BABL/c裸鼠(20±2g)为模型动物，借助脑立体定位仪，将表达虫荧光素酶的U87-luci脑胶质瘤细胞以5×105个细胞/5微升浓度接种于裸鼠纹状体(接种坐标于前囟前侧0.8毫米，右侧2毫米，深度为3毫米)区域，构建原位脑胶质瘤模型。以0.2％注射级吐温80溶液稀释阿西替尼，按照10mg/kg阿西替尼给药剂量尾静脉注射，24小时后，按照5mg/kg给药剂量尾静脉注射依文思蓝溶液，4小时后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，小动物活体成像仪定性观察脑组织中依文思蓝分布强度，结果如图18所示。有机溶剂N，N-二甲基甲酰胺萃取脑组织中依文思蓝，紫外分光光度法定量检测依文思蓝渗透至脑内量，结果如图19所示。
根据图18、图19所示的结果可知，较荷瘤对照组，阿西替尼作用后，依文思蓝渗透入脑含量减少，显示血脑屏障渗透性显著降低，表明阿西替尼可降低血脑屏障渗透性，促进脑胶质瘤模型动物血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态。
实施例七阿西替尼调控脑胶质瘤模型动物血脑屏障渗透性，治疗脑胶质瘤
选择雄性BABL/c裸鼠(20±2g)为模型动物，借助脑立体定位仪，将表达虫荧光素酶的U87-luci脑胶质瘤细胞以5×105个细胞/5微升浓度接种于裸鼠纹状体(接种坐标于前囟前侧0.8毫米，右侧2毫米，深度为3毫米)区域，构建原位脑胶质瘤模型。荷瘤第4天开始给药，以0.2％注射级吐温80溶液稀释阿西替尼，按照10mg/kg阿西替尼给药剂量尾静脉注射，连续给药7天，生物发光成像技术实时监测原位脑胶质瘤生长，结果如图20所示。阿西替尼治疗后，脑胶质瘤模型动物的生存周期结果记录如图21所示。
根据图20所示的结果可知，较生理盐水对照组，阿西替尼给药治疗后，原位脑胶质瘤生长明显被抑制。根据图21所示的结果可知，阿西替尼治疗后，动物的生存周期显著延长。
实施例八帕金森氏病引起血脑屏障病理性破坏，渗透性增加
选择雄性C57/BL6(6-8w)为模型动物，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶溶于生理盐水，按照20mg/kg的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶给药剂量腹腔注射，连续给药7天，构建帕金森氏病模型。按照5mg/kg给药剂量尾静脉注射依文思蓝溶液，4小时后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，小动物活体成像仪定性观察脑组织中依文思蓝分布强度，结果如图22所示。有机溶剂N，N-二甲基甲酰胺萃取脑组织中依文思蓝，紫外分光光度法定量检测依文思蓝渗透至脑内量，结果如图23所示。
根据图22、图23所示的结果可知，帕金森氏病会显著增加血脑屏障渗透性，对比正常脑组织，帕金森氏病模型中，依文思蓝渗透入脑含量显著增加。
实施例九阿西替尼促进帕金森氏病模型动物血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态
选择雄性C57/BL6(6-8w)为模型动物，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶溶于生理盐水，按照20mg/kg的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶给药剂量腹腔注射，连续给药7天，构建帕金森氏病模型。以0.2％注射级吐温80溶液稀释阿西替尼，按照10mg/kg阿西替尼给药剂量尾静脉注射，24小时后，按照5mg/kg给药剂量尾静脉注射依文思蓝溶液，4小时后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，小动物活体成像仪定性观察脑组织中依文思蓝分布强度，结果如图24所示。有机溶剂N，N-二甲基甲酰胺萃取脑组织中依文思蓝，紫外分光光度法定量检测依文思蓝渗透至脑内量，结果如图25所示。
根据图24、图25所示的结果可知，较帕金森氏病对照组，阿西替尼作用后，依文思蓝渗透入脑含量减少，显示血脑屏障渗透性显著降低，表明阿西替尼可降低血脑屏障渗透性，促进血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态。
实施例十阿西替尼调控帕金森氏病模型动物血脑屏障渗透性，治疗帕金森氏病
1.帕金森氏病模型动物的构建
选择雄性C57/BL6(6-8w)为模型动物，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶溶于生理盐水，按照20mg/kg的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶给药剂量腹腔注射，连续给药7天，构建帕金森氏病模型。
2.阿西替尼治疗帕金森氏病
2-1阿西替尼治疗后，依文思蓝脑内渗透性显著下降
以0.2％注射级吐温80溶液稀释阿西替尼，按照10mg/kg阿西替尼给药剂量尾静脉注射，连续给药7天。左旋多巴溶于生理盐水，按照20mg/kg给药剂量腹腔注射，连续给药10天。治疗结束后，按照5mg/kg给药剂量尾静脉注射依文思蓝溶液，4小时后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，小动物活体成像仪定性观察脑组织中依文思蓝分布强度，结果如图26所示。有机溶剂N，N-二甲基甲酰胺萃取脑组织中依文思蓝，紫外分光光度法定量检测依文思蓝渗透至脑内量，结果如图27所示。
根据图26、图27所示的结果可知，较帕金森氏病对照组，阿西替尼和左旋多巴给药治疗后，依文思蓝渗透入脑含量均有不同程度减少，但阿西替尼给药组的依文思蓝渗透入脑含量明显低于左旋多巴给药组，表明阿西替尼可降低血脑屏障渗透性，促进帕金森氏病的血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态，且效果优于左旋多巴。
2-2阿西替尼治疗后，帕金森氏病运动性障碍明显被改善
阿西替尼和左旋多巴治疗结束后，记录各实验组动物2分钟内的运动时间(走动、双前肢向上抬举、洗脸、理毛等)，结果如图28所示。
根据图28所示的结果可知，较帕金森氏病对照组，阿西替尼和左旋多巴给药治疗后，均可显著缓解帕金森氏病模型动物的运动障碍，二者效果无差异。
2-3阿西替尼治疗后，酪氨酸羟化酶表达水平显著提高
治疗结束后，心脏灌流取裸鼠完整大脑，4％多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋后对脑组织纹状体部位冠状面切片，厚度为3微米。抗坏血酸缓冲液修复组织表面抗原，将切片与酪氨酸羟化酶一抗(1:1000稀释)于4℃孵育24小时，然后将切片与生物素标记的二抗(1:200稀释)于37℃孵育45分钟，随后用链亲和素-辣根过氧化物酶37℃孵育30分钟，DAB工作液显色。光学显微镜观察切片组织酪氨酸羟化酶表达，结果如图29所示。
根据图29所示的结果可知，帕金森氏病会引起脑组织纹状体酪氨酸羟化酶表达显著下调，阿西替尼和左旋多巴给药治疗后，均可显著上调帕金森氏症模型动物的纹状体酪氨酸羟化酶表达，且阿西替尼治疗组效果优于左旋多巴治疗组。
工业实用性
根据本发明，能够提供一种血脑屏障渗透性调控剂，该血脑屏障渗透性调控剂通过阿西替尼及其类似物对血脑屏障渗透性的调控作用，能够降低血脑屏障渗透性，促进血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态，从而达到对引起血脑屏障渗透性改变的相关疾病的治疗作用。因此，本发明在医药领域中具有很大的实用性。

Claims (3)

1.阿西替尼或其类似物在制备帕金森氏病治疗剂中的应用，其特征在于：
所述帕金森氏病治疗剂含有阿西替尼或其类似物作为有效成分，阿西替尼或其类似物以不产生细胞毒性的剂量，通过降低血脑屏障渗透性，促进血脑屏障功能由病理性破坏状态恢复至接近生理性屏障状态，
所述阿西替尼或其类似物为阿西替尼或LY294002。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述帕金森氏病治疗剂通过减少病理性血脑屏障紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin下调的程度，降低血脑屏障渗透性。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述帕金森氏病治疗剂通过抑制血管内皮细胞生长因子-磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B信号通路，减少血脑屏障紧密连接蛋白Claudin-5/Occludin下调的程度，降低血脑屏障渗透性。
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