CN111373974A - 一种植物激素诱导白木香结香的方法 - Google Patents

一种植物激素诱导白木香结香的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111373974A
CN111373974A CN202010387346.7A CN202010387346A CN111373974A CN 111373974 A CN111373974 A CN 111373974A CN 202010387346 A CN202010387346 A CN 202010387346A CN 111373974 A CN111373974 A CN 111373974A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phytohormone
aquilaria sinensis
wood
sample
steps
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010387346.7A
Other languages
English (en)
Inventor
潘质洪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhongshan Polytechnic
Original Assignee
Zhongshan Polytechnic
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhongshan Polytechnic filed Critical Zhongshan Polytechnic
Priority to CN202010387346.7A priority Critical patent/CN111373974A/zh
Publication of CN111373974A publication Critical patent/CN111373974A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G17/00—Cultivation of hops, vines, fruit trees, or like trees
    • A01G17/005—Cultivation methods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N27/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing hydrocarbons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/42—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing within the same carbon skeleton a carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a carbon atom having only two bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. keto-carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
    • A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/18—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-carbon bonds
    • A01N57/20—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-carbon bonds containing acyclic or cycloaliphatic radicals

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Forests & Forestry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种植物激素诱导白木香结香的方法，包括如下步骤：A、在树干表面较平整的区域涂布植物激素剂，并于60天后、120天后用再次涂布植物激素剂；B、在涂布植物激素剂后的第180天，采用双线法将涂覆有植物激素剂的区域取下，形成结香样本。本发明植物激素诱导白木香结香的方法操作方便，采用的植物激素剂能有效诱导白木香形成深色次生代谢产物，且诱导白木香所形成的总倍半萜类化合物类型多、含量多，诱导结香效果佳。

Description

一种植物激素诱导白木香结香的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种植物激素诱导白木香结香的方法。
背景技术
白木香(Aquilaria sinensis)为瑞香科沉香属植物，是我国特有的结香的树种，主要产于海南、广东、广西、福建、台湾、云南等省区，而野生白木香主要分布于海拔1000米以下的山地、丘陵、平原或常绿雨林。我国的白木香资源十分丰富，有“冠绝天下”的美称，并被列为国家珍稀濒危三级保护植物，1999年被国务院批准为国家二级重点保护野生植物。但因沉香自然结香周期长，结香机率低，自然形成的沉香一直供不应求
近年来，愈来愈多的实验证明植物激素能够激活植物的信号传递，激发生物积累次生代谢产物，调节植物次生代谢途径。植物激素是指植物细胞接受特定环境信号诱导产生的、低浓度时可调节植物生理反应的活性物质；植物激素在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面起到调控作用。这种调节的灵活性和多样性，可通过使用外源激素或人工合成植物生长调节剂的浓度与配比变化，进而改变内源激素水平与平衡来实现。但目前对于植物激素诱导白木香树结香的报道较少。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种植物激素诱导白木香结香的方法，该方法操作方便，采用的植物激素剂能有效诱导白木香形成深色次生代谢产物，且诱导白木香所形成的总倍半萜类化合物类型多、含量多，诱导结香效果佳。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种植物激素诱导白木香结香的方法，包括如下步骤：
A、在树干表面较平整的区域涂布植物激素剂，并于60天后、120天后用再次涂布植物激素剂；
B、在涂布植物激素剂后的第180天，采用双线法将涂覆有植物激素剂的区域取下，形成结香样本。
本发明植物激素诱导白木香结香的方法操作方便，采用的植物激素剂能有效诱导白木香形成深色次生代谢产物，且诱导白木香所形成的总倍半萜类化合物类型多、含量多，诱导结香效果佳。
优选的，所述步骤B中，采用双线法将涂覆有植物激素剂的区域取下的具体操作如下所示：
先轻轻刮去处理部位表面覆盖的羊毛脂，避免对树皮造成破坏，后用美工刀在树皮上划出两种边长约为3cm和4cm正方形，深度约1.5cm，深达到木质部，用镊子将两种正方形间的树皮及木质部去掉，再使用锤子、劈刀将中间含树皮和木质部的木块取下，迅速放入FAA固定液中。
优选的，所述FAA固定液的质量浓度为50％，包括5％福尔马林、5％乙酸和90％乙醇。进一步优选的，选购自中国上海桑康生物科技有限公司
优选的，该方法还包括步骤C结香样本的包埋处理，具体步骤如下：
C1、将步骤B获取的样本切削成约1cm边长大小的木样，然后保存于蒸馏水中，放入水循环式真空泵内抽真空，直至小木块完全沉入水中，之后保存于蒸馏水2h，稀释小木块中的FAA固定液，换水浸泡冲洗2次；
C2、利用分子量为1500的聚乙二醇分对步骤C1处理后的木样进行梯度脱水；
C3、准备2cm边长的方形木材作为底座，用小型手工曲线锯在其中一面锯出网状凹槽，用以增加PEG和底座的接触面积，将网状凹槽的一面朝上，用透明胶包裹木材底座；
C4、将质量浓度为100％、分子量为1500的聚乙二醇倒入透明胶包裹好的木材底座的凹槽面上，冷凝至聚乙二醇下部呈凝胶状，上部仍为液态的半凝固状态，将聚乙二醇包埋好的木样放在聚乙二醇半凝固状态的木材底座凹槽面上，用镊子将木块摆正，利用聚乙二醇半凝固状态的粘性将要切片的面放平，再倒入质量浓度为100％、分子量为1500的聚乙二醇淹没木样，在低温干燥环境条件下冷却至聚乙二醇凝固。
所述步骤C2中，聚乙二醇分梯度脱水包括如下梯度：20％、40％、60％、80％、100％，每梯度环境温度为60℃，保存12h。
本发明通过采用上述的步骤对结香样品进行包埋处理，提高了结香样品的储存时间，并便于后续进行切片、显微观察、GC-MS测定、RNA提取检测的检测试验。
优选的，该方法还包括步骤D结香样本的切片制片处理，具体步骤如下：
D1、对步骤C包埋处理后的结香样品，利用滑走式切片机切片，切片刀的侧面与木块表面成10°的夹角，刀子移动的方向与形成层垂直，刀片先接触韧皮部，后接触木质部，切片厚度为20μm-30μm；
D2、切出的切片置于载玻片上，以蒸馏水洗净切片中的聚乙二醇，滴加2-3滴甘油，盖上盖玻片，并压出气泡，制得结香样品制片。
本发明通过采用上述的步骤对结香样品进行切片、制片处理，能便于后续进行显微观察等检测试验。
优选的，所述步骤A中，植物激素剂包括如下重量份的原料：
Figure BDA0002484541340000031
本发明通过采用上述的物料组分复配作用植物激素剂诱导白木香结香，能有效诱导白木香形成深色次生代谢产物，且诱导白木香所形成的总倍半萜类化合物类型多、含量多，诱导结香效果佳。其中，采用的茉莉酸甲酯和乙烯利作为基础诱导物料，而葡聚六糖则诱导白木香启动防御反应，产生与植物防御有关的药用次生代谢产物，如倍半萜类等具有抑菌活性的防御物质；而氨基寡糖素同样作为植物免疫诱导剂，激活植物免疫系统提高植物抗逆性，还能够诱导植物产生防御类次生代谢产物；而采用的6-苄氨基嘌呤作为细胞分裂素，促进细胞分裂、促进非分化组织分化、促进细胞增大增肥，诱导形成结香。
优选的，所述6-苄氨基嘌呤由如下步骤制得：
步骤S1：往20份的腺嘌呤核苷中加入200份N,N-二甲基甲酰胺，升温至75℃，搅拌分散，然后加入50份的醋酸酐，升温至128℃搅拌反应6h，然后蒸馏去除N,N-二甲基甲酰胺，降温至室温，再加入50份的甲醇，搅拌均匀，再冷却过滤，并用甲醇洗涤滤渣，最后将滤渣烘干，制得中间体Ⅰ；
步骤S2：取20份步骤S1制得的中间体Ⅰ加入至100份的冰醋酸中，一边搅拌一遍升温至120℃，保温搅拌5h，然后加入0.5份三氟甲磺酸，继续反应8h，然后降温至室温，过滤，并用醋酸洗涤滤渣，将滤渣烘干，制得中间体Ⅱ；
步骤S3：取5份步骤S2制得的中间体Ⅱ加入至15份苯二醇中，边搅拌边加加入2份质量分数为40％的KOH溶液，升温至178℃，搅拌分散，再加入0.3份苄基三乙基氯化铵，搅拌反应5h，然后蒸馏除去苯二醇，过滤，用质量分数为10％的稀盐酸调节滤液的pH值为7.0，析出沉淀，抽滤后对滤渣用去离子水冲洗，最后烘干滤渣，制得6-苄氨基嘌呤。
本发明采用腺嘌呤核苷作为原料，经过步骤S1的酰化、步骤S2的水解和步骤S3的相转移催化缩合制备6-苄氨基嘌呤，制得的6-苄氨基嘌呤收率高，稳定性高，不易分解，添加至植物激素剂中能提高植物激素剂对植物细胞的诱导生长作用。
优选的，所述植物激素剂由如下步骤制得：
按照重量份，将茉莉酸甲酯和乙烯利混合，超声分散，然后依次加入氨基寡糖素和6-苄氨基嘌呤，每加入一物料则搅拌均匀后再加入下一物料，最后加入葡聚六糖，搅拌分散均匀，制得植物激素剂。
优选的，所述超声分散的超声频率为15000-18000Hz，超声时间为20-30s；每一物料加入后的搅拌分散转速为800-1200rpm。
本发明通过采用上述的步骤制备植物激素剂，能促进物料之间的分散，严格控制超声分散的频率和时间，能促进茉莉酸甲酯和乙烯利的分散，而氨基寡糖素、6-苄氨基嘌呤和葡聚六糖的加入，采用搅拌分散的方式，避免上述物料的基团链和结构在超声的条件下受损，使制得的植物激素剂质量稳定。
本发明的有益效果在于：本发明的植物激素诱导白木香结香方法操作方便，采用的植物激素剂能有效诱导白木香形成深色次生代谢产物，且诱导白木香所形成的总倍半萜类化合物类型多、含量多，诱导结香效果佳。
附图说明
图1是本发明实施例1试剂在树木上的处理位置示意图；
图2是本发明实施例1试剂在树木上的实地处理图；
图3是本发明实施例1试剂在树木上的另一实地处理图；
图4是本发明实施例2试剂处理中间位置划出双线的示意图；
图5是本发明实施例2取下周围树皮和木质部的示意图；
图6是本发明实施例2取下中部试样的示意图；
图7是本发明实施例2在FAA固定后的试样示意图；
图8是本发明实施例3锯出纹路的底座结构示意图；
图9是本发明实施例3透明胶布包裹所述底座的示意图；
图10是本发明实施例3抽真空、稀释后的试样结构示意图；
图11是本发明实施例3采用聚乙二醇对试样分梯度脱水示意图；
图12是本发明实施例3试样包于固化的聚乙二醇内的示意图；
图13是本发明实施例3试样粘结在底座上的示意图；
图14是本发明实施例4中2％B组试剂诱导处理后，弦向位置为宽度1.3mm、径向深度1.75mm的切片显微图；
图15是本发明实施例4中2％B组试剂诱导处理后，弦向位置为宽度1.3mm、径向深度1.75mm的另一切片显微图；
图16是本发明实施例4中2％B组试剂诱导处理后，弦向位置相同的图15及图16的切片显微组合图；
图17是本发明实施例4切除切片图片中外皮部分的横切面示意图；
图18是本发明实施例4设置测量参数并导出数据的示意图；
图19是本发明实施例4不同试剂处理1mm弦向宽度内产生的深色次生代谢产物物质面积对比柱状图；
图20是本发明实施例4中2％A组试剂涂覆白木香树表面后深色次生代谢产物产生的位置示意图；
图21是本发明实施例4中2％B组试剂涂覆白木香树表面后深色次生代谢产物产生的位置示意图；
图22是本发明实施例4中2％C组试剂涂覆白木香树表面后深色次生代谢产物产生的位置示意图。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1～22对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
本实施例的白木香选自广东中山西南林业大学研究生创新实训基地的白木香林，地理位置为北纬22°11′～22°47′，东经113°09′～113°46′，海拔11米，树龄为7年的白木香树，胸径为7.6～10.8cm不等。
选取18棵树，分三个处理组，分别记为A、B、C组。A组为茉莉酸甲酯和乙烯利按照重量比为1:1混合作为复合激素剂，B组为本发明的植物激素剂，C组为茉莉酸甲酯、乙烯利和葡聚六糖按照重量比为1：1:1:混合作为复合激素剂处理，三组实验中的试剂均包含0％(对照)、1％、2％和5％浓度，每组试剂处理6棵树，每棵树处理方法如附图1-3所示。
初次涂覆：根据试剂涂布所需尺寸(长4cm*宽4cm*厚3mm)、试剂相应浓度分别计算载药量如下表1所示，配制相应试剂，并按上述尺寸自制涂布用厚度规。其中，采用羊毛脂作为涂敷植物激素试剂的载体(生工生物工程股份有限公司)。
Figure BDA0002484541340000071
表1各组载药量表格
二次涂覆：60天后，轻轻刮去双数编号树实验组试剂，防止对白木香表皮造成刮伤，在相同部位补充相同浓度、成分和尺寸的试剂。即：编号2、4、6树干，更换较高位置的1％、2％、5％的A组试剂；编号8、10、12树干，更换较高位置的1％、2％、5％的B组试剂；编号14、16、18树干，更换较高位置的1％、2％、5％的C组试剂。
三次涂覆：再次60天后，重复上述更换试剂步骤。
其中，所述6-苄氨基嘌呤由如下步骤制得：
步骤S1：往20份的腺嘌呤核苷中加入200份N,N-二甲基甲酰胺，升温至75℃，搅拌分散，然后加入50份的醋酸酐，升温至128℃搅拌反应6h，然后蒸馏去除N,N-二甲基甲酰胺，降温至室温，再加入50份的甲醇，搅拌均匀，再冷却过滤，并用甲醇洗涤滤渣，最后将滤渣烘干，制得中间体Ⅰ；
步骤S2：取20份步骤S1制得的中间体Ⅰ加入至100份的冰醋酸中，一边搅拌一遍升温至120℃，保温搅拌5h，然后加入0.5份三氟甲磺酸，继续反应8h，然后降温至室温，过滤，并用醋酸洗涤滤渣，将滤渣烘干，制得中间体Ⅱ；
步骤S3：取5份步骤S2制得的中间体Ⅱ加入至15份苯二醇中，边搅拌边加加入2份质量分数为40％的KOH溶液，升温至178℃，搅拌分散，再加入0.3份苄基三乙基氯化铵，搅拌反应5h，然后蒸馏除去苯二醇，过滤，用质量分数为10％的稀盐酸调节滤液的pH值为7.0，析出沉淀，抽滤后对滤渣用去离子水冲洗，最后烘干滤渣，制得6-苄氨基嘌呤。
实施例2
对实施例1于试剂处理180天后采用双线法取样采集编号1-18样树的各个试剂浓度的结香试样：
每棵树的每个试剂浓度采集试验过程均如附图3至附图7所示，先轻轻刮去处理部位表面覆盖的羊毛脂，避免对树皮造成破坏，后用美工刀在树皮上划出两种边长约为3cm和4cm正方形，深度约1.5cm，深达到木质部，用镊子将两种正方形间的树皮及木质部去掉，再使用锤子、劈刀将中间的木块(含树皮和木质部)取下，迅速放入FAA固定液中。
所述FAA固定液的质量浓度为50％，包括5％福尔马林、5％乙酸和90％乙醇，优选的，选购自中国上海桑康生物科技有限公司。
实施例3
对实施例2采集得到的各个浓度的试样进行包埋处理，包埋处理的具体操作包括如下步骤：
(1)将实施例2的各个试样切削成约1cm边长大小的木样；
(2)如附图8至附图9所示，准备2cm边长的方形木材作为底座，用小型手工曲线锯在其中一面锯出网状凹槽，用以增加PEG和底座的接触面积，将网状凹槽的一面朝上，用透明胶包裹木材底座；
(3)将步骤(1)切削好的木样保存在蒸馏水中，放入水循环式真空泵内抽真空，直至小木块完全沉入水中，之后保存于蒸馏水2h，稀释小木块中的FAA固定液，换水浸泡冲洗2次；如附图10所示为抽真空、稀释后的试样；
(4)如附图11所示，以浓度为20％、40％、60％、80％、100％的聚乙二醇(分子量为1500)梯度逐级脱水，每梯度环境温度为60℃，保存12小时；
(5)如附图12至图13所示，将100％的PEG 1500倒入透明胶包裹好的木质底座的凹槽面上，冷凝至PEG 1500下部呈凝胶状，上部仍为液态的半凝固状态，将PEG 1500包埋好的木样放在PEG 1500半凝固状态的木质底座凹槽面上，用镊子将木块摆正，利用PEG 1500半凝固状态的粘性将要切片的面放平，再倒入100％的PEG 1500淹没木样，在低温干燥环境条件下冷却至PEG 1500凝固。
实施例4
对实施例3得到的各个浓度的试样进行切片处理，并观察深色次生代谢产物分布，以及测量深色次生代谢产物物质面积，具体操作包括如下步骤：
步骤A、制片：使用滑走式切片机(Leica 2000)切片，刀的侧面与木块表面约成10度角，使刀子移动的方向与形成层垂直，为了保护柔软的树皮和形成层部分，刀片先接触韧皮部，后接触木质部，切片厚度为20μm-30μm。切出的切片置于载玻片上，以蒸馏水洗净切片中的PEG，滴加2-3滴甘油，用镊子夹住盖玻片的一边，轻轻自一端盖上，在其上缓缓施加压力，压出气泡，平置，即完成制片；
步骤B、使用尼康80i型生物显微镜对切片进行观察，以尼康80i自带软件对切片进行拍照，测量并计算白木香树所产生的深色次生代谢产物面积总量；
步骤C、使用尼康80i型生物显微镜观察切片中韧皮部深色次生代谢产物产生的位置。
其中，所述步骤B中，1mm弦向宽度、3.5mm径向深度，所有试样深色次生代谢产物产生位置距外皮最大距离约为3.5mm；白木香树所产生的深色次生代谢产物面积总量即1mm弦向宽度内深色次生代谢产物总面积。具体测量和计算步骤包括如下：
步骤B-1：利用生物显微镜观察切片，目镜为10倍，物镜为10倍，此时视野内所见切片实际宽度约为1.3mm。拍摄的图像要求：清晰，并在径向上同时包括树皮、木质部内所有深色次生代谢产物；若一张图片无法包括切片径向上所有深色次生代谢产物，采用确定弦向位置，不断改变径向位置，拍摄多张图片，最后整理，拼接；如附图14-16所示；
步骤B-2：利用Photoshop剪切功能切除切片图片中外皮部分，保留韧皮部、形成层、木质部；用Image-Pro Plus打开已处理的图片，设定测量标尺、面积参数，根据深色次生代谢产物物质为棕黄色这一明显特征，测量深色次生代谢产物物质总面积b；如附图17-18所示；
步骤B-3：根据a＝b/1.3计算结果；a为1mm弦向宽度、3.5mm径向深度白木香树所产生的深色次生代谢产物物质面积总量；b为切片图片范围中深色次生代谢产物物质总面积。
对于上述步骤B的具体操作，针对不同试剂处理1mm弦向宽度内产生的深色次生代谢产物物质面积，如附图19所示。且由附图19可知，对照组试样都无明显深色次生代谢产物产生，1％A组试剂、1％C组试剂分别诱导白木香树，实验组试样产生少量零星的深色次生代谢产物；1％A组试剂、1％C组试剂分别诱导白木香树，较1％浓度的A组试剂及1％C组试剂诱导白木香树形成深色次生代谢产物面积明显增加，但5％A组试剂、5％C组试剂分别诱导白木香树，较2％浓度的A组试剂及2％C组试剂诱导白木香树形成深色次生代谢产物面积明显减少。且1％、2％、5％的B组试剂诱导白木香树，均较相同浓度的A组试剂、C组试剂激素诱导白木香树形成深色次生代谢产物面积明显增加。
所有浓度及试剂处理条件中，诱导期间每60天更换诱导试剂诱导白木香树，均较相同浓度相同试剂处理所诱导白木香树形成深色次生代谢产物面积明显增加，能有效提升深色次生代谢产物物质产生面积，增加诱导效果。推测原因为诱导剂在诱导期间暴露于环境中，由于植物激素诱导剂有效成分不断挥发、流失等原因导致有效成分过低不能有效诱导深色次生代谢产物生产，当提高诱导剂浓度或诱导期间更新诱导剂，诱导剂有效成分得以保存，从而提升诱导效果。
由上述总结，B组混合试剂诱导出现大量深色次生代谢产物，而A组试剂、C组试剂诱导未有明显深色次生代谢产物物质产生，可见本发明采用茉莉酸甲酯、乙烯利、氨基寡糖素、葡聚六糖和6-苄氨基嘌呤复合作为植物激素剂，对诱导深色次生代谢产物产生有明显协同作用，提高混合试剂浓度至2％或间隔60天更换试剂，深色次生代谢产物产生面积明显增加。因此在所有处理方案中，优选2％为诱导剂浓度、诱导期间隔60天更换诱导剂为白木香结香较优诱导方案。
其中，所述步骤C中，利用光学显微镜观察切片，目镜为10倍，物镜为10倍，此时视野内所见切片实际宽度约为1.3mm。拍摄的图像要求：清晰，并能在径向上包括整个韧皮部。详见附图20为2％A组试剂涂覆白木香树表面后深色次生代谢产物产生的位置，附图21为2％B组试剂涂覆白木香树表面后深色次生代谢产物产生的位置，附图22为2％C组试剂涂覆白木香树表面后深色次生代谢产物产生的位置。
可见，A组试剂涂覆白木香树表面，180天后产生深色次生代谢产物的细胞为：木栓层细胞、韧皮射线细胞、韧皮薄壁细胞、个别试样形成层细胞。C组试剂涂覆白木香树表面，180天后产生深色次生代谢产物的细胞为木栓层细胞、韧皮射线细胞。B组试剂涂覆白木香树表面，180天后产生深色次生代谢产物的细胞为：木栓层细胞、韧皮射线细胞、韧皮薄壁细胞、形成层细胞、木射线细胞、内含韧皮部细胞和导管。结果表明B组试剂诱导白木香产生深色次生代谢产物的细胞类型最多。
C组试剂诱导在韧皮部产生深色次生代谢产物物质，A组试剂诱导在韧皮部和形成层产生深色次生代谢产物物质，B组试剂诱导在韧皮部、形成层和木质部产生深色次生代谢产物。可见植物激素可以从树皮进入白木香活立木后，从外到内影响白木香细胞，产生深色次生代谢产物细胞的先后顺序为：木栓层细胞、韧皮射线细胞、韧皮薄壁细胞、形成层细胞、木射线细胞、内含韧皮部细胞和导管。
实施例5
对实施例2采集得到的各个浓度的结香样品进行GC-MS分析，具体操作步骤和条件如下所示：
操作步骤：取各组2％浓度激素诱导结香及未结香的对照样品分别粉碎，过60目筛，以无水乙醇常温浸泡至沉底，以超声波震荡30min，以离心机离心，取上清液，经气相色谱分离后，质谱测定，全扫描方式记录总离子流色谱图(TIC)，以质谱鉴定各色谱峰的化学成分，用峰面积归一化法确定相对含量。
采用石英毛细管气相色谱质谱联用仪Thermo Fisher Trace GC 1300(上海迈隆科技有限公司)分析。
色谱柱：TR-1MS型毛细管柱(30.0m×0.25mm×0.25μm)。
GC-MS分析条件如下：
1、色谱条件：进样口温度260℃；载气为高纯氦气，流量为1mL·min-1。升温程序条件：初始温度60℃，以10℃·min-1升至180℃，保持10min，再以10℃·min-1升至310℃，保持20min；分流比50:1。
2、质谱条件：电子轰击(EI)离子源为电子能70eV；离子源温度230℃；四极杆温度250℃：接口温度280℃；发射电流34.6A；倍增器电1434V；质量扫描范围40～500m/z。
然后经自动质谱解卷积系统(AMDIS)结合保留指数(RI)校正检索沉香特征性化合物，具体成分如下表2所示：
Figure BDA0002484541340000131
表2激素诱导白木香形成的倍半萜类化合物
对照样品(羊毛脂处理)中未检出倍半萜化合物或色酮类化合物，也无其他沉香特征性化合物出现，说明羊毛脂处理不能诱导白木香结香。
而上述三组共检出13个倍半萜类化合物，分别为环氧异香橙烯(1号)、香橙烯氧化物-(1)(2号)、沉香螺醇(3号)、愈创木醇(4号)、2-(4a,8-dimethyl-1，2，3，4，4a，5，6，7-octahydronaph-thalen-2-yl)–prop-2-en-l-ol(5号)、长叶松香芹酮(6号)、吉马酮(7号)、白千层醇(8号)、白木香醛(9号)、长叶醛(10号)、桉叶油二烯-5，11(13)-内酯-8，12、绒白乳菇醛(11号)、6-(1-hydroxymethylvinyl)-4(12号)，8a-dimethyl-3，5，6，7，8，8a-hexahydro-1H-naphthalen-2-one(13号)。
其中，A组试剂、B组试剂、C组试剂分别诱导白木香结香样品乙醇抽出物总倍半萜相对百分含量分别为26.81％，41.06％和24.95％。说明本发明的B组试剂较A组试剂以及C组试剂诱导白木香所形成的总倍半萜类化合物含量及类型多。
实施例6
对实施例2采集得到的各个浓度的结香样品进行RNA提取纯度检测分析，具体操作步骤和条件如下所示：
操作方法为：Qiagen试剂盒提取法取本品1.0g，液氮研磨成细粉状，依据Qiagen公司(杜塞尔多夫，德国)RNeasy Plant Mini Kit(50)RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，-80℃保存备用；使用琼脂糖凝胶电泳仪(DYCP-31CN琼脂糖水平电泳仪，北京六一仪器厂)检测RNA完整性，NanoDrop DN-10000微量紫外可见分光光度计(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))检测RNA纯度。每种测试样品数量为五个，测试结果取平均值。
使用NanoDrop ND-1000微量紫外可见分光光度计测量各种检测条件所提取的RNA样品OD260/OD280和OD260/OD230比值，具体检测结果如下所示：
Figure BDA0002484541340000141
Figure BDA0002484541340000151
研究结果表明，采用B组试剂所获得的RNA的OD260/OD280比值均能在1.8～2.0的范围内，说明B组试剂为诱导剂诱导白木香结香所提取的RNA纯度较高，没有蛋白质和其他干扰物质的污染。A组试剂诱导白木香结香所提取RNA的OD260/OD280比值为2.13，C组试剂诱导白木香结香所提取RNA的OD260/OD280比值为1.67，这两者均大于或小于1.8～2.0的范围，RNA的OD260/OD230比值可以看出，RNA纯度降低，与B组试剂诱导白木香结香所提取的RNA纯度相比，A组试剂和C组试剂的诱导效果分别降低了52.87％和37.34％。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种植物激素诱导白木香结香的方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、在树干表面较平整的区域涂布植物激素剂，并于60天后、120天后用再次涂布植物激素剂；
B、在涂布植物激素剂后的第180天，采用双线法将涂覆有植物激素剂的区域取下，形成结香样本。
2.根据权利要求1所述的一种植物激素诱导白木香结香的方法，其特征在于：所述步骤B中，采用双线法将涂覆有植物激素剂的区域取下的具体操作如下所示：
先轻轻刮去处理部位表面覆盖的羊毛脂，后用美工刀在树皮上划出两种边长约为3cm和4cm正方形，深度约1.5cm，深达到木质部，用镊子将两种正方形间的树皮及木质部去掉，再使用锤子、劈刀将中间含树皮和木质部的木块取下，迅速放入FAA固定液中。
3.根据权利要求2所述的一种植物激素诱导白木香结香的方法，其特征在于：所述FAA固定液的质量浓度为50％，包括5％福尔马林、5％乙酸和90％乙醇。
4.根据权利要求1所述的一种植物激素诱导白木香结香的方法，其特征在于：该方法还包括步骤C结香样本的包埋处理，具体步骤如下：
C1、将步骤B获取的样本切削成约1cm边长大小的木样，然后保存于蒸馏水中，放入水循环式真空泵内抽真空，直至小木块完全沉入水中，之后保存于蒸馏水2h，稀释小木块中的FAA固定液，换水浸泡冲洗2次；
C2、利用分子量为1500的聚乙二醇分对步骤C1处理后的木样进行梯度脱水；
C3、准备2cm边长的方形木材作为底座，用小型手工曲线锯在其中一面锯出网状凹槽，将网状凹槽的一面朝上，用透明胶包裹木材底座；
C4、将质量浓度为100％、分子量为1500的聚乙二醇倒入透明胶包裹好的木材底座的凹槽面上，冷凝至聚乙二醇下部呈凝胶状，上部仍为液态的半凝固状态，将聚乙二醇包埋好的木样放在聚乙二醇半凝固状态的木材底座凹槽面上，用镊子将木块摆正，利用聚乙二醇半凝固状态的粘性将要切片的面放平，再倒入质量浓度为100％、分子量为1500的聚乙二醇淹没木样，在低温干燥环境条件下冷却至聚乙二醇凝固。
5.根据权利要求4所述的一种植物激素诱导白木香结香的方法，其特征在于：所述步骤C2中，聚乙二醇分梯度脱水包括如下梯度：20％、40％、60％、80％、100％，每梯度环境温度为60℃，保存12h。
6.根据权利要求4所述的一种植物激素诱导白木香结香的方法，其特征在于：该方法还包括步骤D结香样本的切片制片处理，具体步骤如下：
D1、对步骤C包埋处理后的结香样品，利用滑走式切片机切片，切片刀的侧面与木块表面成10°的夹角，刀子移动的方向与形成层垂直，刀片先接触韧皮部，后接触木质部，切片厚度为20μm-30μm；
D2、切出的切片置于载玻片上，以蒸馏水洗净切片中的聚乙二醇，滴加2-3滴甘油，盖上盖玻片，并压出气泡，制得结香样品制片。
7.根据权利要求1所述的一种植物激素诱导白木香结香的方法，其特征在于：所述步骤A中，植物激素剂包括如下重量份的原料：
Figure FDA0002484541330000021
8.根据权利要求7所述的一种植物激素诱导白木香结香的方法，其特征在于：所述6-苄氨基嘌呤由如下步骤制得：
步骤S1：往20份的腺嘌呤核苷中加入200份N,N-二甲基甲酰胺，升温至75℃，搅拌分散，然后加入50份的醋酸酐，升温至128℃搅拌反应6h，然后蒸馏去除N,N-二甲基甲酰胺，降温至室温，再加入50份的甲醇，搅拌均匀，再冷却过滤，并用甲醇洗涤滤渣，最后将滤渣烘干，制得中间体Ⅰ；
步骤S2：取20份步骤S1制得的中间体Ⅰ加入至100份的冰醋酸中，一边搅拌一遍升温至120℃，保温搅拌5h，然后加入0.5份三氟甲磺酸，继续反应8h，然后降温至室温，过滤，并用醋酸洗涤滤渣，将滤渣烘干，制得中间体Ⅱ；
步骤S3：取5份步骤S2制得的中间体Ⅱ加入至15份苯二醇中，边搅拌边加加入2份质量分数为40％的KOH溶液，升温至178℃，搅拌分散，再加入0.3份苄基三乙基氯化铵，搅拌反应5h，然后蒸馏除去苯二醇，过滤，用质量分数为10％的稀盐酸调节滤液的pH值为7.0，析出沉淀，抽滤后对滤渣用去离子水冲洗，最后烘干滤渣，制得6-苄氨基嘌呤。
9.根据权利要求7所述的一种植物激素诱导白木香结香的方法，其特征在于：所述植物激素剂由如下步骤制得：
按照重量份，将茉莉酸甲酯和乙烯利混合，超声分散，然后依次加入氨基寡糖素和6-苄氨基嘌呤，每加入一物料则搅拌均匀后再加入下一物料，最后加入葡聚六糖，搅拌分散均匀，制得植物激素剂。
10.根据权利要求9所述的一种植物激素诱导白木香结香的方法，其特征在于：所述超声分散的超声频率为15000-18000Hz，超声时间为20-30s；每一物料加入后的搅拌分散转速为800-1200rpm。
CN202010387346.7A 2020-05-09 2020-05-09 一种植物激素诱导白木香结香的方法 Pending CN111373974A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010387346.7A CN111373974A (zh) 2020-05-09 2020-05-09 一种植物激素诱导白木香结香的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010387346.7A CN111373974A (zh) 2020-05-09 2020-05-09 一种植物激素诱导白木香结香的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111373974A true CN111373974A (zh) 2020-07-07

Family

ID=71214443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010387346.7A Pending CN111373974A (zh) 2020-05-09 2020-05-09 一种植物激素诱导白木香结香的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111373974A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111802154A (zh) * 2020-07-09 2020-10-23 南京林业大学 一种新型人工诱导白木香树木结香的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103229677A (zh) * 2013-04-26 2013-08-07 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种生产沉香的方法
CN104738081A (zh) * 2015-02-17 2015-07-01 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种促进沉香树或白木香树生产沉香的微胶囊及其制备方法和应用
CN105165536A (zh) * 2015-09-25 2015-12-23 海南香树沉香产业股份有限公司 一种促进白木香树生产沉香的方法及其沉香形成促进剂
CN106070325A (zh) * 2016-05-31 2016-11-09 国森天香（北京）生物科技有限公司 一种天然沉香诱导剂以及生产沉香的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103229677A (zh) * 2013-04-26 2013-08-07 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种生产沉香的方法
CN104738081A (zh) * 2015-02-17 2015-07-01 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种促进沉香树或白木香树生产沉香的微胶囊及其制备方法和应用
CN105165536A (zh) * 2015-09-25 2015-12-23 海南香树沉香产业股份有限公司 一种促进白木香树生产沉香的方法及其沉香形成促进剂
CN106070325A (zh) * 2016-05-31 2016-11-09 国森天香（北京）生物科技有限公司 一种天然沉香诱导剂以及生产沉香的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘学良等: "一种合成 6- 苄氨基嘌呤的新方法", 《农药》 *
曾贵玉等: "《中国工程物理研究院科技丛书 微纳米含能材料》", 31 May 2015, 北京：国防工业出版社 *
王之胤: "白木香树木中脂类物质形成的激素诱导研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111802154A (zh) * 2020-07-09 2020-10-23 南京林业大学 一种新型人工诱导白木香树木结香的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fernández et al. New insights into the properties of pubescent surfaces: peach fruit as a model
Sofo et al. Trichoderma harzianum strain T-22 induces changes in phytohormone levels in cherry rootstocks (Prunus cerasus× P. canescens)
CN109855936B (zh) 一种组织完整、利于显微观察的植物组织切片的制备方法
Ramsey et al. Ultrastructure of early stages of cotton fiber differentiation
CN109738249A (zh) 一种观察花芽分化过程的石蜡切片的制作方法
CN105284388A (zh) 一种蓝莓绿枝扦插育苗方法
CN111373974A (zh) 一种植物激素诱导白木香结香的方法
Srivastava et al. Microscopical and chemical study of Cannabis sativa
Baales et al. Analysis of extracellular cell wall lipids: wax, cutin, and suberin in leaves, roots, fruits, and seeds
Woods et al. An ice-solvent method of drying frozen tissue for plant cytology
CN111247989A (zh) 一种诱导沉香形成的剥皮方法
Płachno et al. Flower palate structure of the aquatic bladderworts Utricularia bremii Heer and U. minor L. from section Utricularia (Lentibulariaceae)
CN107389411A (zh) 一种葡萄根尖染色体常规压片的方法
Kausch et al. Changes in starch distribution in the overwintering organs of Typha latifolia (Typhaceae)
Delgado et al. Comparative anatomy of Calolisianthus species (Gentianaceae–Helieae) from Brazil: taxonomic aspects
CN110412263B (zh) 一种快速高效的茶树质体型谷氨酰胺合成酶基因定位方法
Khan et al. Morpho-physiological and phytohormonal changes during the induction of adventitious root development stimulated by exogenous IBA application in Magnolia biondii Pamp
Bilir Ekbic et al. Determination of the tolerance of fox Grapes (Vitis labrusca L.) to drought stress by PEG application in vitro
Venegas-González et al. What tree rings can tell us about the competition between trees and lianas? A case study based on growth, anatomy, density, and carbon accumulation
Su et al. Leaf-level plasticity of Salix gordejevii in fixed dunes compared with lowlands in Hunshandake Sandland, North China
Simoes et al. New approaches for shoot production and establishment of in vitro root cultures of Cleome rosea Vahl.
Barker et al. Growth and development of the lowbush blueberry: apical abortion
CN109724976B (zh) 基于纸层析的树木雌雄鉴别方法
CN115281192B (zh) 一种提高蔬菜作物光合效率和/或抗旱性的制剂和方法
CN113295490A (zh) 一种香椿愈伤组织的石蜡切片制作方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200707

RJ01 Rejection of invention patent application after publication