CN111356916B - 核苷酸定序元件、芯片及定序分析方法 - Google Patents

Abstract

提供一种核苷酸定序元件，包含半导体基板、晶体管、介电层、环状电极组以及导体。另提供一种核苷酸定序芯片，包含前述核苷酸定序元件与感测放大器。另提供一种定序分析的方法，包含提供如前述核苷酸定序芯片，将待测核苷酸序列片段与已知核苷酸序列片段分别置于孔槽内进行聚合反应与电化学反应，将反应所产生的电信号进行分析以获得定序结果。

Description

核苷酸定序元件、芯片及定序分析方法

技术领域

本发明是有关于一种定序元件、芯片及定序分析方法，且特别是有关于一种核苷酸定序元件、芯片及定序分析方法。

背景技术

去氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)的定序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是分析腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)的排列方式。DNA定序已被广泛运用，范围大致分为六大项目：基础研究(基因结构，基因功能)、基因体研究、生命的起源、人种或物种的差异、特定基因变异与疾病、以及检验试剂与新药开发。

目前DNA定序已经改良至次世代定序，其中一种为以Ion Torrent公司为主的定序方法，采用集成电路芯片直接将化学信号转换为数字信号。Ion Torrent公司的设计是以累积电荷对场效晶体管(field-effect transistor，FET)截止电压(threshold voltage)变化为基础的感测。然而，因定序过程中产生电荷(氢离子)，纵使定时以缓冲液清洗芯片孔槽仍无法完全清除。由于芯片孔槽电荷累积造成噪声升高，最终使得DNA序列仅能读取约为200碱基对(base pair，bp)的长度。再者，当技术上面临当芯片制程微缩时，芯片孔槽若残留有电荷将更易产生噪声的影响。

有鉴于此，如何提供更快速且精准的DNA定序芯片与方法，现有技术实有待改善的必要。

发明内容

本揭示内容的目的在于提供一种核苷酸定序元件、芯片及定序分析方法，以清除定序时产生的电荷，避免电荷累积造成噪声升高。

本揭示内容提供了一种核苷酸定序元件，包含半导体基板、晶体管、介电层、环状电极组、以及导体。晶体管设于半导体基板上。介电层覆盖晶体管。环状电极组位于介电层上方，并具有开口露出介电层，且环状电极组与介电层形成孔槽。环状电极组包含至少一第一环状电极、第二环状电极以及第三环状电极。第二环状电极位于第一环状电极之上，第三环状电极位于第二环状电极之上。导体配置于介电层中，导体的一端连接晶体管的源极或漏极，导体的另一端连接环状电极组的第一环状电极或第二环状电极。

在一些实施方式中，各第一环状电极、第二环状电极及第三环状电极具有环形轮廓，且第一、第二及第三环状电极彼此对准。

在一些实施方式中，各第一环状电极、第二环状电极及第三环状电极具有多边形轮廓，且第一、第二及及第三环状电极彼此对准。

在一些实施方式中，环状电极组还包含至少一第一环状间隔层、第二环状间隔层及第三环状间隔层。第一环状间隔层位于介电层与第一环状电极之间，第二环状间隔层位于第一环状电极与第二环状电极之间，第三环状间隔层位于第二环状电极与第三环状电极之间。

在一些实施方式中，至少一第一环状电极包含复数个第一环状电极，至少一第一环状间隔层包含复数个第一环状间隔层，其中这些第一环状电极与这些第一环状间隔层彼此交错堆叠，且这些第一环状电极电性连接导体。

在一些实施方式中，核苷酸定序元件还包含至少一凸电极位于孔槽中，且凸电极具有凸出部凸出介电层，且电性连接导体。

在一些实施方式中，凸出部具有高宽比为约0.125至约7.5。

在一些实施方式中，凸出部凸出介电层的上表面约0.01微米至约0.5微米。

在一些实施方式中，至少一凸电极的数量为2-20个。

本揭示内容另提供了一种核苷酸定序芯片，包含多个如上所述的核苷酸定序元件以及感测放大器。感测放大器连接各晶体管的源极或漏极。

在一些实施方式中，复数核苷酸定序元件包含至少一第一核苷酸定序元件以及至少一第二核苷酸定序元件，第一核苷酸定序元件作为定序待测核苷酸，第二核苷酸定序元件作为定序已知核苷酸序列做为参考值。

本揭示内容另提供了一种定序分析的方法，包含提供如上所述的核苷酸定序芯片，核苷酸定序芯片包含至少一第一核苷酸定序元件以及至少一第二核苷酸定序元件。施加电流至第一及第二核苷酸定序元件的这些环状电极组。接着，混合至少一第一载体与至少一待测核苷酸序列片段，第一载体包含至少一第一引子，且进一步使待测核苷酸序列片段黏合于第一引子。然后，将黏合后的第一载体与待测核苷酸序列片段置于第一核苷酸定序元件的孔槽内。接着，将第二载体置于第二核苷酸定序元件的孔槽内，第二载体包含至少一第二引子。再者，加入含有聚合酶及去氧核糖核苷三磷酸的溶液于第一及第二核苷酸定序元件的这些孔槽内，其中去氧核糖核苷三磷酸与第一核苷酸定序元件的孔槽内的待测核苷酸序列片段聚合，而产生氢离子及第一电信号。同时，去氧核糖核苷三磷酸与第二核苷酸定序元件的孔槽内的第二引子聚合，而产生氢离子及第二电信号，其中通过这些环状电极组的电流使这些氢离子转变为氢分子。最后，利用第一及第二核苷酸定序元件的这些晶体管读取第一电信号及第二电信号，以获得定序结果。

在一些实施方式中，溶液还包含氢氧化钠、硫酸二钠、铁氰化钾或其组合。

在一些实施方式中，各第一载体包含磁珠及这些第一引子。

在一些实施方式中，各第二载体包含磁珠及这些第二引子，这些第二引子为已知的核苷酸序列。

附图说明

本发明上述和其他态样、特征及其他优点参照说明书内容并配合附加附图得到更清楚的了解，其中：

图1绘示本揭示内容的核苷酸定序元件的环状电极组的局部立体图；

图2绘示本揭示内容的核苷酸定序元件的环状电极组的剖面图；

图3绘示本揭示内容的核苷酸定序元件的另一实施例的环状电极组的剖面图；

图4绘示本揭示内容图2的核苷酸定序元件的部分电路图；

图5绘示本揭示内容的核苷酸定序芯片的局部电路图。

【符号说明】

100、100”核苷酸定序元件

100A第一核苷酸定序元件

100B第二核苷酸定序元件

100C第三核苷酸定序元件

110半导体基板

120、120A、120B、120C晶体管

121栅极

122源极

123漏极

130介电层

131上表面

132下表面

140、140A、140B、140C环状电极组

141、141A、141B、141C孔槽

142第一环状间隔层

143第一环状电极

144第二环状间隔层

145第二环状电极

146第三环状间隔层

147第三环状电极

150导体

160凸电极

210第一双电层电容

220第一环状电极电荷转移电阻

230第二环状电极电荷转移电阻

240第三双电层电容

250第三环状电极电荷转移电阻

260第一溶液电阻

270第二溶液电阻

280字符线

300感测放大器

310差动型感测放大器

320栓锁型感测放大器

400核苷酸定序芯片

A1第一引子

A2第一引子

B1第二引子

B2第二引子

D1宽度

D2宽度

E1第一电信号

E2第一电信号

F1第二电信号

F2第二电信号

H1高度

P1待测核苷酸序列片段

P2待测核苷酸序列片段

U1衔接子

U2衔接子

X1第一载体

X2第一载体

Y1第二载体

Y2第二载体

具体实施方式

为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文将参照附图来描述本发明的实施方式与具体实施例；但这并非实施或运用本揭示内容具体实施例的唯一形式。以下所揭示的各实施例，在有益的情形下可相互组合或取代，也可在一实施例中附加其他的实施例，而无须进一步的记载或说明。

另外，空间相对用语，如“下”、“上”等，是用以方便描述一元件或特征与其他元件或特征在附图中的相对关系。这些空间相对用语旨在包含除了附图中所示的方位以外，装置在使用或操作时的不同方位。装置可被另外定位(例如旋转90度或其他方位)，而本文所使用的空间相对叙述亦可相对应地进行解释。

于本文中，除非内文中对于冠词有所特别限定，否则“一”与“该”可泛指单一个或多个。将进一步理解的是，本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”及相似词汇，指明其所记载的特征、区域、整数、步骤、操作、元件与/或组件，但不排除其它的特征、区域、整数、步骤、操作、元件、组件，与/或其中的群组。

图1绘示本揭示内容的一实施方式的核苷酸定序元件100的局部立体图。图2绘示核苷酸定序元件100的剖面图，包含半导体基板110、晶体管120、介电层130、环状电极组140、导体150以及凸电极160。在一实施例中，核苷酸定序元件100用于次序分析。

半导体基板110可包含但不限于其他半导体材料，例如氮化镓(GaN)、碳化硅(SiC)、硅锗(SiGe)、锗或其组合。取决于技术领域中的设计需求，半导体基板110可包含各种不同的掺杂配置。

晶体管120设于半导体基板110上，晶体管120包含栅极121、源极122与漏极123。源极122与漏极123设于半导体基板110，栅极121介于源极122与漏极123之间。在一实施例中，源极122与漏极123的位置可互换。

介电层130覆盖晶体管120，介电层130具有相对的上表面131与下表面132。介电层130的材料包含，但不限于氧化物、氮化物、氮氧化物或其组合，例如氧化硅、氮化硅、氮氧化硅。介电层130选用低介电常数(low-K)的材料，使核苷酸定序元件100具有良好的绝缘性质。在一些实施例中，介电层130的高度为约0.02微米(μm)至约0.25微米，例如约0.10微米、约0.15微米或约0.20微米。

环状电极组140设于介电层130的上表面131，且具有开口露出介电层130。环状电极组140与介电层130形成孔槽141，孔槽141配置以容置待测样品溶液。在一实施例中，环状电极组140具有环形轮廓或多边形轮廓，环形轮廓例如圆形、椭圆形，多边形轮廓例如三边形、四边形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形、十一边形、十二边形、或是趋近于圆形的多边形等。在一实施例中，环状电极组140的宽度D1为约0.1微米至约0.5微米，例如约0.2微米、约0.3微米、约0.4微米；较佳为约0.2微米。

环状电极组140包含至少一第一环状间隔层142、至少一第一环状电极143、第二环状间隔层144、第二环状电极145、第三环状间隔层146、以及第三环状电极147。在一实施例中，环状电极组140依序由下而上分别为第一环状间隔层142、第一环状电极143、第二环状间隔层144、第二环状电极145、第三环状间隔层146、以及第三环状电极147。第一环状电极143、第二环状电极145及第三环状电极147彼此形状相同且彼此对准。第一环状间隔层142设于介电层130上。第一环状电极143的高度为小于0.1微米，较佳为约0.001微米至约0.1微米，例如约0.002微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.03微米、约0.05微米、约0.07微米、或约0.09微米。

在一实施例中，第一环状间隔层142、第二环状间隔层144、第三环状间隔层146的材料包含，但不限于氧化物、氮化物、氮氧化物或其组合，例如氧化硅、氮化硅、氮氧化硅；较佳的，为氮化硅。在一些实施例中，第一环状间隔层142、第二环状间隔层144、第三环状间隔层146的高度分别为约0.02微米(μm)至约1微米，例如约0.10微米、约0.15微米、约0.20微米、约0.50微米或约0.75微米。

在一实施例中，第一环状电极143、第二环状电极145、第三环状电极147的材料包含，但不限于钽(Ta)、氮化钽(TaN)、铜(Cu)、钛(Ti)、氮化钛(TiN)、钨(W)、钛(Ti)、镍(Ni)、银(Ag)、铝(Al)、铜铝合金(AlCu)、铜铝硅合金(AlSiCu)或其组合。在一较佳的实施例中，第一环状电极143、第二环状电极145、第三环状电极147的材料为氮化钛(TiN)。在一实施例中，第一环状电极143为工作电极(working electrode，WE)、第二环状电极145为参考电极(reference electrode，RE)、第三环状电极147为辅助电极(counter electrode，CE)。又一实施例中，第一环状电极143与第二环状电极145可彼此互换，亦即第一环状电极143为参考电极、第二环状电极145为工作电极。

图3绘示本揭示内容的另一实施方式的核苷酸定序元件100”的剖面图，第一环状间隔层142的数量为三个第一环状间隔层142，第一环状电极143的数量为三个第一环状电极143，其中以第一环状电极143与第一环状间隔层142彼此交错堆叠，最底下的第一环状间隔层142设于介电层130上，第二环状间隔层144设于最上层的第一环状电极143上，其中这些第一环状电极143电性连接导体150。在一实施例中，这些第一环状电极143为工作电极。

再请参照图2，导体150配置于介电层130中，导体150的一端连接晶体管120的源极122，导体150的另一端连接环状电极组140的第一环状电极143。图2仅绘示导体150的一端连接晶体管120的源极122，但在其他实施例中，导体150的一端连接晶体管120的漏极123。图2仅绘示导体150连接第一环状电极143，但在其他实施例中，导体150可连接第二环状电极145。在一实施例中，导体150的材质包含，但不限于钛(Ti)、镍(Ni)、银(Ag)、铝(Al)、铜铝合金(AlCu)、铜铝硅合金(AlSiCu)或其组合；较佳的，为铜铝合金。

凸电极160位于孔槽141中，且凸电极160具有凸出部凸出介电层130的上表面131，以形成立体电极。凸电极160等电位电性连接导体150和第一环状电极143，因此凸电极160与第一环状电极143可具有相同的电压。在一实施例中，第一环状电极143及凸电极160为工作电极。凸电极160具有凸出于介电层130的凸出部。在一些实施例中，凸出部的高度H1为约0.05微米至约0.6微米，例如为约0.05微米、0.1微米、0.2微米、约0.3微米或约0.4微米。在一些实施例中，凸出部的宽度D2为约0.08微米至约0.4微米，例如为约0.08微米、0.1微米、0.2微米或约0.3微米。再一实施例中，凸出部具有高宽比(aspect ratio)为约0.125至约7.5之间，例如为约0.2或约0.3。又一实施例中，凸出部的形状可为圆柱体、正三角柱体、正四角柱体、正五角柱体、正六角柱体或正八角柱体。在一些实施例中，凸电极160的材料包含，但不限于钽(Ta)、氮化钽(TaN)、铜(Cu)、钛(Ti)、氮化钛(TiN)、钨(W)、钛(Ti)、镍(Ni)、银(Ag)、铝(Al)、铜铝合金(AlCu)、铜铝硅合金(AlSiCu)或其组合。在一较佳的实施例中，凸电极160的材料为氮化钛(TiN)。在一些实施例中，凸电极160的数量为复数个凸电极160，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、20个、50个、或100个等；较佳的为6个凸电极160以环状且距离均等地排列。

具体而言，当一电压施加于凸电极160时，将使得凸电极160产生一电场围绕在凸电极160的凸出部。电场的包覆范围将不限于凸出部的顶面，而会延伸至凸出部的侧壁，使得电化学反应大幅度的增加，进而增加信号的强度。在施加相同的电压下，具有立体构造的凸电极160提供优于习知的平面工作电极的灵敏度。但须留意，凸出部的高宽比为约0.125至约7.5。当凸出部的高宽比大于7.5时，易使得工作电极于结构上产生缺陷，降低整体装置的可靠度。

图4绘示图2核苷酸定序元件100相应的部份电路图，请同时参阅图2与图4，第一环状电极143为工作电极、第二环状电极145为参考电极、第三环状电极147为辅助电极。施予定电流于第一环状电极143，第一环状电极143与孔槽141内的样品溶液之间形成第一双电层电容210与第一环状电极电荷转移电阻220，第三环状电极147与孔槽141内的样品溶液之间形成第三双电层电容240与第三环状电极电荷转移电阻250。第二环状电极145接地，且第二环状电极145与孔槽141内的样品溶液之间形成第二环状电极电荷转移电阻230。当电流从第一环状电极143经由孔槽141内的样品溶液朝第三环状电极147流动时，于靠近第一环状电极143处的样品溶液形成第一溶液电阻260，于靠近第三环状电极147处的溶液形成第二溶液电阻270。字符线280依需求提供电压控制晶体管120的导通与否，以控制电流信号流通至感测放大器300。

在一些实施方式中，本揭示内容的核苷酸定序元件100中，以介电层130与环状电极组140所围成的孔槽141大小依制程微缩可为任一大小不在此限。在一实施例中，孔槽141大小约0.5x 0.5x 1.6立方微米(μm³)至5.0x 5.0x 1.6立方微米，例如1.2x 1.2x 1.6立方微米、1.5x 1.5x 1.6立方微米、2.0x 2.0x 1.6立方微米、3.0x 3.0x 1.6立方微米。

本揭示内容另提供核苷酸定序芯片400。图5绘示核苷酸定序芯片400的局部电路图，核苷酸定序芯片400包含复数核苷酸定序元件及感测放大器300，感测放大器300连接晶体管120A、120B、120C，其中这些核苷酸定序元件可分为至少一第一核苷酸定序元件100A、至少一第二核苷酸定序元件100B以及至少一第三核苷酸定序元件100C。第一核苷酸定序元件100A用于待测核苷酸的定序，第二核苷酸定序元件100B与第三核苷酸定序元件100C为对照组，提供已知核苷酸序列做为定序时的参考电压值。请参阅图1及图2，在一实施例中，这些核苷酸定序元件100中的各第一环状电极143(工作电极)彼此不相导通，各第二环状电极145(参考电极)彼此相互导通，各第三环状电极147(辅助电极)彼此相互导通。请参阅图5，在一实施例中，核苷酸定序芯片400的多个核苷酸定序元件的排列及定址方式可使用现有的记忆体芯片的相关技术。定序聚合反应时仅需产生小信号(即少量的待测核苷酸)，经感测放大器300放大后就可获得足以判断的信号。

感测放大器300为电流模式，将电流信号放大。在一实施例中，核苷酸定序芯片400由复数个核苷酸定序元件100形成检测矩阵(detection matrix)，依照须检测基因数目的多寡调整检测矩阵的大小，在一实施例中，矩阵大小为0.1K x 0.1K至100K x 100K，例如1Kx 1K、3K x 3K、5K x 5K、8K x 8K、10K x 10K、或50K x 50K。在一实施例中，核苷酸定序元件100的地址信号是通过13列位、9栏位与16个输出装置来控制。列选择性暂存器(rowselect register)可同一时间读取一列的核苷酸定序元件100，以驱动信号电压至一栏位。栏选择性暂存器(column select register)选择其中一栏位以输出信号至感测放大器300，给予字符线280一脉冲以侦测栏位，在字符线280关闭前产生一ISO信号。

感测放大器300将各个核苷酸定序元件100所输出的信号进行放大，并比对不同核苷酸定序元件100内所进行电化学反应的电压差异。在一实施例中，生物感测芯片具有两个差动型感测放大器310(differential sense amplifier)、一个栓锁型感测放大器320(latch type sense amplifier)、三个p通道金属氧化物半导体均衡器(p-channel metal-oxide-semiconductor equalization，PMOS equalization)与第一核苷酸定序元件100A、第二核苷酸定序元件100B以及第三核苷酸定序元件100C。

本揭示内容另提供一定序分析的方法。

虽然下文中利用一系列的操作或步骤来说明在此揭露的方法，但是这些操作或步骤所示的顺序不应被解释为本发明的限制。例如，某些操作或步骤可以按不同顺序进行及/或与其它步骤同时进行。此外，并非必须执行所有绘示的操作、步骤及/或特征才能实现本发明的实施方式。此外，在此所述的每一个操作或步骤可以包含数个子步骤或动作。

本揭示内容另提供一定序分析的方法，包含以下操作步骤。

(1)提供核苷酸定序芯片400，核苷酸定序芯片400包含多个第一核苷酸定序元件100A以及多个第二核苷酸定序元件100B。

(2)施加电流至这些第一核苷酸定序元件100A的环状电极组140A以及这些第二核苷酸定序元件100B的环状电极组140B。

(3)提供多个第一载体与多个待测核苷酸序列片段。例如，所述多个第一载体包含第一载体X1、第一载体X2等，其中第一载体X1包含磁珠及多个第一引子A1，第一载体X2包含有磁珠及多个第一引子A2，其余依此类推。多个待测核苷酸序列片段从待测核苷酸序列经片段化处理成2000K bp以下，例如1900K bp、1700K bp、1600K bp、1500K bp、1300K bp、1000K bp、500K bp、100K bp、50K bp、10K bp、5K bp、3K bp、1K bp、0.1K bp、或0.01K bp。这些待测核苷酸序列片段可再分为例如：待测核苷酸序列片段P1、待测核苷酸序列片段P2等。待测核苷酸序列片段P1的两端接上衔接子U1(adaptor)，待测核苷酸序列片段P2的两端接上衔接子U2，其余依此类推。

(4)混合这些第一载体与这些待测核苷酸序列片段时，第一载体X1上的第一引子A1会专一性地辨认待测核苷酸序列片段P1两端的衔接子U1并进行黏合、第一载体X2上的第一引子A2会专一性地辨认待测核苷酸序列片段P2两端的衔接子U2并进行黏合。本文中“衔接子”指一特定核苷酸序列，大小约为10bp至100bp，可与第一引子互补对应而相连接。在一较佳的实施例中，第一引子A1与待测核苷酸序列片段P1黏合后，针对待测核苷酸序列片段P1进行聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)而扩增复制，获得多个待测核苷酸序列片段P1。再将各待测核苷酸序列片段P1黏合于第一载体X1上的其他第一引子A1，使第一载体x1上具有多个相同的待测核苷酸序列片段P1，其余依此类推。

(5)将黏合后的第一载体X1与待测核苷酸序列片段P1置于一个第一核苷酸定序元件100A的孔槽141A内。将黏合后的第一载体X2与待测核苷酸序列片段P2置于另一个第一核苷酸定序元件100A的孔槽141A内，其余依此类推。亦即一个第一核苷酸定序元件100A的孔槽141A内，只会有一个第一载体。

(6)提供多个第二载体，例如上述多个第二载体包含第二载体Y1、第二载体Y2等。第二载体Y1包含磁珠及多个第二引子B1，各第二引子B1包含单一个腺嘌呤。第二载体Y2包含有磁珠及多个第二引子B2，这些第二引子B2包含三个连续的腺嘌呤。亦即同一个第二载体上的这些第二引子序列皆相同。在一实施例中，第二引子为人工合成已知的核苷酸序列，包括但不限于单一个腺嘌呤(A)、单一个胸腺嘧啶(T)、单一个胞嘧啶(C)、单一个鸟嘌呤(G)、单一个尿嘧啶(U)，或是多个重复的腺嘌呤(A)、多个重复的胸腺嘧啶(T)、多个重复的胞嘧啶(C)、多个重复的鸟嘌呤(G)、多个重复的尿嘧啶(U)，例如AAA、TTT、CCC、GGG、UUU。

(7)将各第二载体置于各第二核苷酸定序元件100B的孔槽141B内，亦即一个第二载体置于一个第二核苷酸定序元件100B的孔槽141B内。

(8)加入含有聚合酶及去氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的溶液于各第一核苷酸定序元件100A的孔槽141A及各第二核苷酸定序元件100B的孔槽141B内。去氧核糖核苷三磷酸与第一核苷酸定序元件100A的孔槽141A内的待测核苷酸序列片段聚合，而产生氢离子及第一电信号。例如，装载有第一载体X1与待测核苷酸序列片段P1的第一核苷酸定序元件100A产生第一电信号E1，装载有第一载体X2与待测核苷酸序列片段P2的第一核苷酸定序元件100A产生第一电信号E2。另一方面，去氧核糖核苷三磷酸与第二核苷酸定序元件100B的孔槽141B内的第二引子聚合，而产生氢离子及第二电信号。例如，装载有第二载体Y1的第二核苷酸定序元件100B产生第二电信号F1，第二载体Y2的第二核苷酸定序元件100B产生第二电信号F2。在上述聚合反应中，通过施加至这些环状电极组140A、140B的电流使所产生的氢离子转变为氢分子。

在一实施例中，溶液包含纯水、氢氧化钠、聚合酶、镁盐、硫酸二钠及铁氰化钾，酸碱值(pH)为碱性，以提供聚合反应所需的物质。当中的硫酸二钠与铁氰化钾为协助电化学反应中氧化还原时的介质，增强电流变化量、使信号更易于侦测。

(9)利用这些第一核苷酸定序元件100A的晶体管120A及这些第二核苷酸定序元件100B的晶体管120B读取第一电信号及第二电信号，以获得定序结果。

在一实施例中，去氧核糖核苷三磷酸为依序添加，例如依序添加去氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate，dATP)、去氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate，dTTP)、去氧胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate，dCTP)、与去氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate，dGTP)至这些第一核苷酸定序元件100A的孔槽141A及这些第二核苷酸定序元件100B的孔槽141B内，且在添加下一种去氧核糖核苷三磷酸之前会先进行清洗。具体而言，当去氧核糖核苷三磷酸互补结合这些待测核苷酸序列片段或这些第二引子时，会释放出氢离子(H⁺)且酸碱值(pH)下降，进而导致阻抗值下降。由于阻抗值下降，流经这些环状电极组140A、140B的电流增加，流经晶体管120A、120B的电流下降，进而产生电信号。此时氢离子可快速地与工作电极所释出的电子中和形成氢气释出，使这些孔槽141A、141B中不会有残留的氢离子影响后续判读。请参阅图2，由于第三环状电极147(辅助电极)设于环状电极组140的最上方形成屏障，聚合时所产生的氢离子无法越过第三环状电极147至隔壁孔槽141中，使定序过程更为精准。

在一实施例中，请参阅图5，针对聚合反应过一次的这些第一核苷酸定序元件100A进行清洗，再次加入溶液混合并进行聚合反应，重复此步骤直到将这些待测核苷酸序列片段完成定序。在另一实施例中，针对聚合反应过一次的这些第一核苷酸定序元件100A可不进行清洗，再次加入溶液混合并进行聚合反应，重复此步骤直到将这些待测核苷酸序列片段完成定序。

请再参照图5，第一核苷酸定序元件100A的第一电信号分别与第二核苷酸定序元件100B的第二电信号及第三核苷酸定序元件100C的第三电信号经由两个差动型感测放大器310进行信号放大比对，两个差动型感测放大器310再将各自产生出的信号输出至栓锁型感测放大器320进行比对分析。

在一实施例中，第二核苷酸定序元件100B的环状电极组140B的孔槽141B内放置一个第二载体，第二载体的第二引子为包含单一个胸腺嘧啶(T)；第三核苷酸定序元件100C的环状电极组140C的孔槽141C内放置一个第三载体，第三载体的第三引子为包含三个胸腺嘧啶(TTT)。当所添加dATP于第一核苷酸定序元件100A的孔槽141A、第二核苷酸定序元件100B的孔槽141B及第三核苷酸定序元件100C的孔槽141C内时，第二核苷酸定序元件100B的孔槽141B内进行单一核苷酸聚合反应(A-T配对)，而产生一第二电信号(例如0.3V)。第三核苷酸定序元件100C的孔槽141C内进行三个核苷酸聚合反应(三个A-T配对)，而产生一第三电信号(例如1V)。第一核苷酸定序元件100A若出现电信号为0V表示未有聚合发生、电信号为0.3V表示有聚合单一核苷酸(A)发生、电信号为0.6V表示有聚合两个核苷酸(AA)发生、电信号为1V表示有聚合三个核苷酸(AAA)发生。具体而言，第二电信号与第三电信号皆为参考电压。

在一实施例中，多个核苷酸定序元件除了提供不同种核苷酸(A、T、C、G)的参考电压值之外，更进一步提供相同核苷酸但不同核苷酸数目的参考电压值，包括但不限于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个。在定序的一开始依照芯片的环境、温度等条件，从人工合成已知的核苷酸序列引子获得相对的参考电压。因此，不同批次但相同核苷酸与相同核苷酸数目的参考电压值，会因当下的环境略有不同，以更精准判断待测核苷酸的序列。

本揭示内容的优点在于：

通过工作电极于电化学反应中提供电子，中和聚合反应所产生的氢离子产生氢气，因而有效清除定序时产生的电荷，避免电荷累积造成噪声升高。

由于电化学反应速度快，当即时清除氢离子后即可在进行下一种核苷酸的定序，因此可缩短整体定序的时间。

由于孔槽内的氢离子可有效清除，使得同一孔槽中可以读取长达2000K bp的DNA片段。

通过金属氧化物半导体技术以降低定序设备成本，且大规模生产和制程微缩以获得更高密度和更大的阵列尺寸。

当制程微缩后核苷酸定序元件上的孔槽体积更小，一旦发生聚合反应与电化学反应将使酸碱值变化更大，以缩短检测时间、减少待测核苷酸序列片段数量、减少试剂消耗量、进而降低成本。

由于考虑到每批次的参考电压值会因当下的环境略有不同，通过从人工合成已知的核苷酸序列引子获得相对的参考电压，能更精准判断待测核苷酸序列片段的序列。

虽然本发明已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视所附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims (15)

1.一种核苷酸定序元件，包含：

一半导体基板；

一晶体管，设于该半导体基板上；

一介电层，覆盖该晶体管；

一环状电极组，位于该介电层上方，并具有一开口露出该介电层，且该环状电极组与该介电层形成一孔槽，其中该环状电极组包含：

至少一第一环状电极；

一第二环状电极，位于该第一环状电极之上；以及

一第三环状电极，位于该第二环状电极之上；以及

一导体，配置于该介电层中，该导体的一端连接该晶体管的一源极或一漏极，该导体的另一端连接该环状电极组的该第一环状电极或该第二环状电极。

2.根据权利要求1所述的核苷酸定序元件，其中各该第一环状电极、第二环状电极及第三环状电极具有一环形轮廓，且该第一、该第二、及该第三环状电极彼此对准。

3.根据权利要求1所述的核苷酸定序元件，其中各该第一环状电极、第二环状电极及第三环状电极具有一多边形轮廓，且该第一、该第二、及该第三环状电极彼此对准。

4.根据权利要求1所述的核苷酸定序元件，其中该环状电极组还包含：

至少一第一环状间隔层，位于该介电层与该第一环状电极之间；

一第二环状间隔层，位于该第一环状电极与该第二环状电极之间；以及

一第三环状间隔层，位于该第二环状电极与该第三环状电极之间。

5.根据权利要求4所述的核苷酸定序元件，其中该至少一第一环状电极包含复数个第一环状电极，该至少一第一环状间隔层包含复数个第一环状间隔层，

其中该些第一环状电极与该些第一环状间隔层彼此交错堆叠，且该些第一环状电极电性连接该导体。

6.根据权利要求1所述的核苷酸定序元件，还包含：

至少一凸电极，位于该孔槽中，且该凸电极具有一凸出部凸出该介电层，且电性连接该导体。

7.根据权利要求6所述的核苷酸定序元件，其中该凸出部具有高宽比为约0.125至约7.5。

8.根据权利要求6所述的核苷酸定序元件，其中该凸出部凸出该介电层的上表面约0.01微米至约0.5微米。

9.根据权利要求6所述的核苷酸定序元件，其中该至少一凸电极的数量为2-20个。

10.一种核苷酸定序芯片，包含：

多个如权利要求1所述的核苷酸定序元件：以及

一感测放大器，连接各该晶体管的该源极或该漏极。

11.根据权利要求10所述的核苷酸定序芯片，其中复数核苷酸定序元件包含至少一第一核苷酸定序元件以及至少一第二核苷酸定序元件，该第一核苷酸定序元件作为定序待测核苷酸，该第二核苷酸定序元件作为定序已知核苷酸序列。

12.一种定序分析的方法，包含：

提供如权利要求10所述的核苷酸定序芯片，该核苷酸定序芯片包含至少一第一核苷酸定序元件以及至少一第二核苷酸定序元件；

施加电流至该第一及该第二核苷酸定序元件的该些环状电极组；

混合至少一第一载体与至少一待测核苷酸序列片段，该第一载体包含至少一第一引子，且进一步使该待测核苷酸序列片段黏合于该第一引子；

将黏合后的该第一载体与该待测核苷酸序列片段置于该第一核苷酸定序元件的该孔槽内；

将一第二载体置于该第二核苷酸定序元件的该孔槽内，该第二载体包含至少一第二引子；

加入含有聚合酶及去氧核糖核苷三磷酸的一溶液于该第一及该第二核苷酸定序元件的该些孔槽内，其中该去氧核糖核苷三磷酸与该第一核苷酸定序元件的该孔槽内的该待测核苷酸序列片段聚合，而产生氢离子及一第一电信号，且该去氧核糖核苷三磷酸与该第二核苷酸定序元件的该孔槽内的该第二引子聚合，而产生氢离子及一第二电信号，其中通过该些环状电极组的该电流使该些氢离子转变为氢分子；以及

利用该第一及该第二核苷酸定序元件的该些晶体管读取该第一电信号及该第二电信号，以获得定序结果。

13.根据权利要求12所述的方法，其中该溶液还包含氢氧化钠、硫酸二钠、铁氰化钾或其组合。

14.根据权利要求12所述的方法，其中各该第一载体包含一磁珠及该些第一引子。

15.根据权利要求12所述的方法，其中各该第二载体包含一磁珠及该些第二引子，该些第二引子为已知的核苷酸序列。

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