CN111341382B - 赖氨酸生物制造中宏观动力学与细胞代谢通量耦合建模方法 - Google Patents

Abstract

赖氨酸生物制造中宏观动力学与细胞代谢通量耦合建模方法，属于工业微生物制造过程建模技术及应用领域，涉及一种将微分方程表述的发酵动力学与化学计量学描述的细胞代谢通量相结合的建模方法，通过对复杂赖氨酸代谢网络的约简，建立了关键代谢通量与外部可测变量的关联，实现代谢通量平衡方程与葡萄糖、赖氨酸、生物量的浓度变化动力学的耦合，给出了利用智能随机寻优算法的耦合模型参数辨识方法，不仅可以描述胞外宏观变量浓度的变化，还可以描述胞内代谢通量的动态变化，相比一般的动力学模型，不仅模型精度高，更提供手段探寻微生物细胞内微观机理信息和代谢特性。

Description

赖氨酸生物制造中宏观动力学与细胞代谢通量耦合建模方法

技术领域

本发明属于工业微生物制造过程建模技术及应用领域，涉及一种将微分方程表述的发酵动力学与化学计量学描述的细胞代谢通量相结合的建模方法，基于该方法构建的耦合模型可用于赖氨酸生物制造过程中对生物量浓度、产物浓度和底物浓度的预测，同时用于反映和预测细胞内代谢流的变化规律。

背景技术

赖氨酸是人体的必需氨基酸之一，可以促进机体的生长发育，是一种重要的营养物质，在食品、医药、饲料等行业有很广泛的需求，我国逐渐成为世界上赖氨酸产量最大的国家，研究赖氨酸的生物制造过程，利用技术手段对其进行优化和控制，对于提高发酵产物产量、减低物耗及提升质量具有重要意义。

微生物制造过程优化和控制的前提是建立合适的发酵过程模型，最早人们试图根据微生物生长机理进行发酵过程建模，但是生物反应过程复杂，难以建立精确的过程模型；其后主要根据大量的实验数据来建模，这类模型可以近似地反映过程状态变量的宏观变化趋势，比如Monod模型等，但是未能考虑发酵过程中很多内在复杂机理，更缺乏微观层面的规律描述。随着生物技术和基因工程的不断发展，对细胞内部的代谢过程有了更详细的了解，越来越多的微生物代谢网络得以精确的建立，基于代谢网络的建模方法得到了研究，代谢网络模型利用代谢反应的化学计量矩阵来分析细胞内的通量分布，主要研究方法有代谢通量分析，其不仅可以描述细胞内部的代谢途径，还可以求解细胞内不可测量的代谢通量的大小。由此，人们设想基于代谢网络来建立发酵过程的动力学模型，既可以通过代谢网络分析细胞内部的微观代谢特性，又能够反映细胞外部宏观动态特征，从而对发酵过程的动态变化进行更全面描述；例如，有文献基于化学计量矩阵平衡建立了骨髓瘤细胞培养的动力学模型，还有基于青霉素的代谢网络途径，建立了青霉素补料分批发酵的动力学模型。

已有的关于赖氨酸发酵过程建模技术主要集中在实验性的动力学模型研究，通常采用微分方程形式，主要用于描述赖氨酸生产过程中生物量浓度、产物浓度和底物浓度的变化，此类模型的参数在各类文献中有一些经验数据供选用，也可通过实验辨识出模型的参数。分析上述动力学建模方法，直接采用文献中的经验数据，模型简单但难以适应具体生产过程；而利用实验数据进行参数辨识，虽然有众多辨识算法供选用，但是单一化的关于生物量、产物和底物浓度变化的微分方程结构，从根本上限制了这类动力学模型的精度和应用范围。考虑到工业赖氨酸生产中最广泛的菌种是谷氨酸棒状杆菌，在一些文献中通过碳通量模型和核磁共振波谱法给出了谷氨酸棒杆菌的中心代谢网络，完整的赖氨酸发酵的代谢网络得到完善，但是完整的基因组规模的代谢网络十分复杂，包含大量的反应和代谢物，直接用来进行建模和应用的难度很大。

发明内容

本发明提出一种赖氨酸生物制造中宏观动力学与细胞代谢通量耦合建模方法，首先对已有的赖氨酸代谢网络进行约简，由约简网络的化学计量矩阵建立细胞内物质和能量平衡方程，描述细胞内各代谢流间的关系；再给出微分方程形式的赖氨酸动力学模型，描述生物量、产物浓度、底物浓度的宏观变化规律，微分方程的参数选择产物生成和底物消耗直接关联的代谢流。为保证建模方法的工程适用性，适当减少模型的复杂度，进一步将产物和底物关联的代谢通量通过经验公式与宏观可测变量进行耦合。由此构建包括代谢通量平衡方程和动力学方程的赖氨酸发酵新的模型结构，由于该结构的复杂性和非线性，采用智能搜索算法对模型中的参数进行估算和优化。最后由耦合模型中的微分方程可以计算生物量浓度、产物浓度和底物浓度，同时通过代谢通量平衡方程描述细胞内代谢通量的变化规律。

本发明的技术方案：

赖氨酸生物制造中宏观动力学与细胞代谢通量耦合建模方法，步骤包括：

第一步：对赖氨酸制造过程的代谢网络进行约简：

一般的赖氨酸发酵代谢网络包含大量代谢途径和代谢物，只将糖酵解途径作为碳源的主要途径，简化了磷酸戊糖途径，忽略糖酵解途径和磷酸戊糖途径之间的关联，并且不考虑乙醛酸循环，约简后代谢网络主要包含糖酵解、TCA循环、产物生成、氧化磷酸化等四个代谢路径，涉及到的主要代谢物有葡萄糖-6-磷酸、丙酮酸、赖氨酸、ATP、NADH等物质。

第二步：建立代谢通量平衡方程：

根据质量守恒且考虑细胞内代谢物的消耗速率很小，细胞内代谢物处于拟稳态，代谢物的通量平衡方程为S_mr＝0，式中S_m为胞内代谢物的化学计量矩阵，r表示各个反应的代谢通量向量。由第一步约简的代谢网络，含有10个细胞内代谢物，即萄糖-6-磷酸(G6P)、核酮糖-5-磷酸(R5P)、丙酮酸(Pyr),、乙酰辅酶A(AcCoA)、柠檬酸(Cit)、α-酮戊二酸(αKG)、草酰乙酸(Oxa)、赖氨酸(Lys)、ATP和NADH，其中14个代谢通量表示为：

r＝[r₁,r₂,r₃,r₄,r₅,r₆,r₇,r₈,r_S,r_P,r_B1,r_B2,r_B3,r_O2]^T

上式r中的各分量在约简的代谢网络中标出，其中，r₁,r₂,r₃,r₄,r₅,r₆,r₇,r₈分别表示内部一般代谢通量，r_O2表示氧化磷酸化的总通量，r_P,r_S分别是与产物和底物相关的内部代谢通，r_B1,r_B2,r_B3是不同的细胞物质合成通量，为减少未知通量的计算，考虑到发酵工程中常用细胞生长速率与细胞浓度的比值作为衡量细胞生长状况的重要指标，也即用比生长率μ来反映细胞生长的速率，因此考虑将不同的细胞物质合成速率换算成比生长率μ来统一表示，即r_B1＝b₁μ，r_B2＝b₂μ,r_B3＝b₃μ,其中b₁,b₂,b₃是待辨识的模型参数。

针对10个细胞内代谢物，将通量平衡方程S_mr＝0与约简的代谢路径中代谢反应相结合，再考虑氧化磷酸化合成ATP的过程，建立如下代谢通量平衡方程：

上式中P/O为合成ATP的分子系数，Y_ATP,m_ATP为ATP对细胞生长和维持代谢的比摄取速率参数，均为待辨识的模型参数；上式每一行表示细胞内的一种代谢物的平衡方程，物质平衡方程不仅包含了底物、产物的物质平衡，还包含了其他代谢副产物、中间代谢产物，如ATP、NADH的物质平衡。

第三步：建立质量动力学方程：

根据质量平衡原则，构建生物量浓度、产物生成浓度和底物消耗浓度的动力学方程：

式中，M_P是产物的相对分子质量，M_S是底物的相对分子质量，r_P是与产物相关的内部代谢通量，也称比产物生成速率，r_S是与底物相关的内部代谢通量，也称比底物消耗速率。由约简的代谢网络可知，细胞内的五个关键代谢通量r_B1,r_B1,r_B1,r_P,r_S与细胞外物质直接关联，进而可以对生物量浓度、产物浓度和底物浓度变化产生影响，由此在上式中被选择作为动力学方程的系数；考虑到r_B1,r_B2,r_B3是不同的细胞物质合成通量，上式统一用比生长率μ来综合反映细胞生长状况。

第四步：构建代谢通量与动力学变量的耦合关系：

在赖氨酸制造过程中，细胞内部的代谢通量不可直接测量，但是外部的物质的浓度变量可以测量，因此考虑将比生长率μ、比产物生成速率r_P、比底物消耗速率r_S与生物量浓度和底物浓度等易于测量的变量进行关联，从而借助浓度变化来描述代谢通量的变化。对于比产物生成速率，采用以下Luedeking-Piret经验公式：

r_P＝αμX+βX (5)

式中，α为生长偶联系数，β为非生偶联系数，对于赖氨酸发酵，α≠0，β≠0。

对于比底物消耗速率，考虑赖氨酸制造过程中存在产物抑制、底物抑制的作用，特别是在发酵过程初期，相关催化酶的活性比较低，此时虽然底物浓度高，实际上底物消耗速率却很低，从而出现消耗速率滞后现象，用单一的公式难以描述发酵全过程的消耗速率变化规律，为此采用以下双选机制：

r_S＝min{r_S,M,r_S,R} (6)

即比底物消耗速率r_S选择r_S,M和r_S,R中的最小值的通过，分别地：

上式是Monod经验形式，其中r_Smax为最大比底物消耗速率，K_s为半饱和参数，

式中，r_Smin为最小速率值，k₁和k₂表示滞后发生的瞬时状态。

第五步：重构代谢通量平衡方程：

利用通量平衡方程(1)，将内部代谢通量r₁,r₂,r₃,r₄,r₅,r₆,r₇,r₈和r_O2依次表示为比生长率μ、比产物生成速率r_P和比底物消耗速率r_S的线性组合：

r_O2＝r₁+r₂+0.5r₃+0.5r₆+1.5r₇-r₈

进一步将通量平衡方程(1)与比产物生成速率公式(5)结合得到：

第六步：耦合模型参数的辨识：

公式(2)-(10)给出了赖氨酸发酵动力学与细胞代谢流耦合模型，可用于描述动力学变量X,P,S和代谢通量r的变化规律，模型中有13个未知参数需要利用实验测量值来进行辨识，待辨识的参数集θ表示如下：

θ＝{α,β,r_Smax,r_Smin,K_s,k₁,k₂,b₁,b₂,b₃,Y_ATP,m_ATP,P/O}

利用赖氨酸发酵过程实验测得的生物量浓度X_E、产物浓度P_E和底物浓度S_E，对模型参数集θ进行辨识，步骤如下：

步骤1：采集N次实验测量值X_E(i),P_E(i),S_E(i)，测量方法可以采用实验室离线生化分析方法，此时采集次数N取值一般小于30，也可以采用在线糖分析仪、近红外光谱仪等测量仪器，N取值可以更大；

步骤2：给定初始参数θ；

步骤3：将θ代入公式(5)-(10)，通过变量μ,r_P,r_S联立动力学方程(2)-(4)；

步骤4：计算机数值解法求解方程，基于模型来计算生物量浓度、产物浓度和底物浓度在时刻i的仿真值X_M(i),P_M(i),S_M(i)，可采用龙格-库塔法、欧拉法或者线性化法等非线性微分方程组数值解法；

步骤5：设立目标函数，计算实验测量值X_E(i),P_E(i),S_E(i)与仿真值X_M(i),P_M(i),S_M(i)之间的偏差，判断是否满足期望的目标，如果不满足则通过智能寻优算法，选择新的一组参数θ，返回步骤3，不断循环逼近实验测量值，寻求期望的参数θ；

步骤6：如果满足期望的目标，则获得期望的参数θ。

利用遗传算法进行参数辨识，对于第六步中的步骤2，进行如下操作：

操作1：根据赖氨酸发酵的经验设置参数集θ中13个未知参数的各自取值范围，并将各参数在取值范围内分为k等分，每一等分称为一个基因，则一条染色体就有13k个基因。采用二进制进行编码，假设θ中某参数w的二进制编码为

该参数的取值范围为[w_min,w_max]，编码时该参数所占的序列长度为l。

操作2：随机生成由二进制编码表示的初始染色体种群Z个，用以下公式(11)进行解码：

解码后的各个染色体分别表示一组模型参数θ。种群数量Z的选择与计算精度、计算量、收敛时间有关。种群数量越大，得到最优结果的概率越大，但是计算量也随之增加，收敛时间变长；种群数量很小，计算量小，但是求解质量变差；

对于第六步中的步骤5，采用如下环节进行处理：

环节1：将Z组参数分别代入如下目标函数：

计算出每个染色体对应的J_j(θ)，j＝1,…,Z，用来评估各染色体个体的优劣程度，J_j(θ)越小的个体被选择的概率越大，选入下一代的染色体种群。对于目标函数的形式，只要能够衡量实验测量值X_E(i),P_E(i),S_E(i)与仿真值X_M(i),P_M(i),S_M(i)之间的偏差，其它形式的可以。

环节2：利用如下选择概率函数，按概率大小选择构成下一代的染色体种群：

如果目标函数(12)选取别的形式，相应的概率函数的表达式要重新调整，只要能够反映不同染色体种群对实验数据的拟合程度。

环节3：将染色体种群以一定概率两两交叉个体中部分基因，重新组合而成新的个体；同时以一定概率改变群体中染色体个体的某些基因进行变异，产生新的个体；通过这两种遗传算子对染色体个体进行重新组合，产生新的解集θ，转往环节1，不断进行迭代直到满足期望目标。

第七步：智能寻优算法的实现：

智能寻优算法可采用遗传算法、蚁群算法、粒子算法等智能化随机寻优算法。遗传算法来寻找模型参数，首先是通过染色体的形式把待辨识的参数进行编码，定义一个染色体为参数集θ的一组可行解，多个染色体则为种群，然后通过遗传、自然选择、交叉以及变异等方式来优化种群染色体所携带的信息，使得染色体朝着满足优化目标的方向进化；每一个染色体又由多个基因组成。

第八步：动力学与代谢流耦合模型的使用：

将辨识得到的参数集θ代入公式(2)-(10)；由(2)-(4)可以获得生物量浓度、产物生成浓度和底物消耗浓度的动力学描述；由公式(10)计算比生长率μ的变化，由公式(5)计算比产物生成速率r_P，由公式(6)-(8)计算比底物消耗速率r_S；最后通过公式(9)映射获得细胞内部代谢通量r。

本发明的有益效果：

数学模型是研究和实施生物制造过程的工艺设计、运行操作和过程优化的关键，对于提高发酵产物产量、减低物耗及提升质量具有实际应用价值。本发明通过分析，对复杂的赖氨酸代谢网络进行简化，将代谢通量平衡方程与葡萄糖、赖氨酸、生物量的浓度变化动力学进行耦合，给出了利用智能随机寻优算法的耦合模型参数辨识方法，不仅可以描述胞外宏观变量浓度的变化，还可以描述胞内代谢通量的动态变化，相比一般的动力学模型，不仅模型精度高，更提供手段探寻微生物细胞内微观机理信息和代谢特性。通过赖氨酸发酵实验数据验证了模型的有效性和优越性。

附图说明

图1约简的赖氨酸发酵代谢网络图。

图2动力学与代谢通量耦合模型的辨识及使用流程图。

图3生物量X、产物生成P和底物消S的浓度实验与计算结果对比图。其中，(a)为生物量浓度的变化，(b)为产物浓度的变化，(c)为底物浓度的变化。

图4细胞内代谢通量r₁,r₂,r₃,r₄变化仿真图。其中，(a)为r₁的变化规律；(b)为r₂的变化规律；(c)为r₃的变化规律；(d)为r₄的变化规律。

具体实施方式

下面参照附图2对本发明的建模方法的具体实施方式做进一步说明。

首先对赖氨酸发酵代谢网络进行约简，并且将细胞物质合成速率换算成比生长率μ来统一表示，获得易于工程应用的代谢通量平衡方程(1)。

构建生物量浓度、产物生成浓度和底物消耗浓度的动力学方程(2)-(4)，分别选择比生长率μ、比产物生成速率r_P以及比底物消耗速率r_S作为动力学方程的系数。

将代谢通量与动力学变量进行耦合，通过外部物质的浓度变量反映细胞内部的代谢通量，采用经验公式(5)-(8)将比生长率μ、内部代谢通量r_P、r_S与生物量浓度和底物浓度等易于测量的变量进行关联。

利用通量平衡方程(1)，将内部代谢通量r₁,r₂,r₃,r₄,r₅,r₆,r₇,r₈和r_O2依次表示为比生长率μ、比产物生成速率r_P和比底物消耗速率r_S的线性组合，构成代谢通量之间的映射关系。

采集生物量浓度X_E(i)、产物生成浓度P_E(i)和底物消耗浓度S_E(i)的N组实验数据。

采用遗传算法来寻找模型参数，首先参数初始化，通过染色体的形式把待辨识的参数进行编码，定义一个染色体为参数集θ的一组可行解，在参数取值范围内，每一等分参数为一个基因；选择初始染色体种群数量并利用(11)进行解码。

将参数集θ代入方程(5)-(10)，通过变量μ,r_P,r_S联立动力学方程(2)-(4)；计算机数值解法求解方程，获得生物量浓度、产物浓度和底物浓度在各个i的仿真值X_M(i),P_M(i),S_M(i)

将Z组染色体或参数θ下的仿真值X_M(i),P_M(i),S_M(i)和实验值X_E(i),P_E(i),S_E(i)分别比较偏差，代入目标函数(12)计算每个染色体对应的J_j(θ)，评估各染色体个体的优劣，判断是否满足期望目标，若满足则获得期望的参数。

若不满足则按概率函数大小选择构成下一代的染色体种群，通过交叉与变异两种遗传算子对染色体个体进行重新组合，产生新的解集θ，代入方程(5)-(10)并比较实验与计算的偏差，不断进行迭代直到满足期望目标。

一旦获得期望的参数θ，只要将其代入公式(2)-(10)；首先由(2)-(4)可以获得生物量浓度、产物生成浓度和底物消耗浓度的动力学描述；然后由公式(10)计算比生长率μ的变化，由公式(5)计算比产物生成速率r_P，由公式(6)-(8)计算比底物消耗速率r_S；最后通过公式(9)映射获得细胞内部代谢通量r。

实施效果分析

采用本发明提出的赖氨酸生物制造中宏观动力学与细胞代谢通量耦合建模方法，获得耦合模型参数θ中的13个参数见表1。

表1耦合模型参数辨识结果

图3给出了：(a)生物量浓度的变化，(b)产物浓度的变化，(c)底物浓度的变化的实验数据与模型计算数据的比较结果，在发酵过程的迟缓期(0到10小时内)，生物量缓慢增加，产物积累很少，底物消耗不明显，10小时后发酵进入对数生长期，生物量迅速增加，开始大量积累发酵产物，底物消耗明显，直到发酵的稳定期，生物量浓度逐渐趋于稳定，产物积累量逐渐达到最大。

利用已建立的代谢通量间的映射关系(9)，作为示例，图4给出了代谢通量r₁,r₂,r₃,r₄的变化规律，可以看出在发酵初期10小时左右，胞内各个代谢通量开始快速上升，10小时后大部分代谢通量均维持较高水平，说明产物赖氨酸在逐渐积累。但是代谢通量r₁处于较低水平，说明其所在的磷酸戊糖途径对赖氨酸发酵影响较小，而代谢通量r₂则一直处于较高水平，说明其糖酵解途径主要的碳源途径，与实验现象吻合。

Claims (8)

1.赖氨酸生物制造中宏观动力学与细胞代谢通量耦合建模方法，其特征在于，步骤包括：

第一步：对赖氨酸制造过程的代谢网络进行约简：

以糖酵解为碳源的主要途径，简化磷酸戊糖途径，忽略糖酵解途径和磷酸戊糖途径之间的关联，不考虑乙醛酸循环，约简后代谢网络包含糖酵解、TCA循环、产物生成、氧化磷酸化四个代谢路径，涉及到的代谢物有萄糖-6-磷酸G6P、核酮糖-5-磷酸R5P、丙酮酸Pyr、乙酰辅酶AAcCoA、柠檬酸Cit、α-酮戊二酸αKG、草酰乙酸Oxa、赖氨酸Lys、ATP和NADH；

第二步：建立代谢通量平衡方程：

拟稳态下代谢物的通量平衡方程为S_mr＝0，式中S_m为胞内代谢物的化学计量矩阵，r表示各个反应的代谢通量向量；由第一步约简的代谢网络，平衡方程含有10个细胞内代谢物，即萄糖-6-磷酸G6P、核酮糖-5-磷酸R5P、丙酮酸Pyr、乙酰辅酶AAcCoA、柠檬酸Cit、α-酮戊二酸αKG、草酰乙酸Oxa、赖氨酸Lys、ATP和NADH，其中14个代谢通量表示为：

r＝[r₁,r₂,r₃,r₄,r₅,r₆,r₇,r₈,r_S,r_P,r_B1,r_B2,r_B3,r_O2]^T

上式r中的各分量在约简的代谢网络中标出，其中，其中，r₁,r₂,r₃,r₄,r₅,r₆,r₇,r₈分别表示内部一般代谢通量，r_O2表示氧化磷酸化的总通量，r_P,r_S分别是比产物生成速率和比底物消耗速率，r_B1,r_B2,r_B3是不同的细胞物质合成通量，统一换算成比生长率μ来表示，即r_B1＝b₁μ，r_B2＝b₂μ,r_B3＝b₃μ,其中b₁,b₂,b₃是待辨识的模型参数；

针对10个细胞内代谢物，将通量平衡方程S_mr＝0与约简的代谢路径中代谢反应相结合，再考虑氧化磷酸化合成ATP的过程，建立如下代谢通量平衡方程：

其中，P/O为合成ATP的分子系数，Y_ATP,m_ATP为ATP对细胞生长和维持代谢的比摄取速率参数，均为待辨识的模型参数；

第三步：建立质量动力学方程：

构建生物量浓度、产物生成浓度和底物消耗浓度的动力学方程：

式中，M_P是产物的相对分子质量，M_S是底物的相对分子质量，r_P称为比产物生成速率，r_S称为比底物消耗速率；

第四步：构建代谢通量与动力学变量的耦合关系：

将比生长率μ、比产物生成速率r_P、比底物消耗速率r_S与生物量浓度和底物浓度进行关联，借助浓度变化来描述代谢通量的变化；对于比产物生成速率，采用以下Luedeking-Piret经验公式：

r_P＝αμX+βX (5)

式中，α为生长偶联系数，β为非生偶联系数，对于赖氨酸发酵，α≠0，β≠0；

对于比底物消耗速率，采用以下双选机制：

r_S＝min{r_S,M,r_S,R} (6)

即比底物消耗速率r_S选择r_S,M和r_S,R中的最小值的通过，分别地：

其中r_Smax为最大比底物消耗速率，K_s为半饱和参数，

式中，r_Smin为最小速率值，k₁和k₂表示滞后发生的瞬时状态；

第五步：重构代谢通量平衡方程：

利用通量平衡方程(1)，将内部代谢通量r₁,r₂,r₃,r₄,r₅,r₆,r₇,r₈和r_O2依次表示为比生长率μ、比产物生成速率r_P和比底物消耗速率r_S的线性组合：

进一步将通量平衡方程(1)与比产物生成速率公式(5)结合得到：

第六步：耦合模型参数的辨识：

公式(2)-(10)给出了赖氨酸发酵动力学与细胞代谢流耦合模型，用于描述动力学变量X,P,S和代谢通量r的变化规律，模型中有13个未知参数需要利用实验测量值来进行辨识，待辨识的参数集θ表示如下：

θ＝{α,β,r_Smax,r_Smin,K_s,k₁,k₂,b₁,b₂,b₃,Y_ATP,m_ATP,P/O}

利用赖氨酸发酵过程实验测得的生物量浓度X_E、产物浓度P_E和底物浓度S_E，对模型参数集θ进行辨识，步骤如下：

步骤1：采集N次实验测量值X_E(i),P_E(i),S_E(i)；

步骤2：给定初始参数θ；

步骤3：将θ代入公式(5)-(10)，通过变量μ,r_P,r_S联立动力学方程(2)-(4)；

步骤4：利用计算机数值解法计算生物量浓度、产物浓度和底物浓度在时刻i的仿真值X_M(i),P_M(i),S_M(i)；

步骤5：设立偏差目标函数，计算实验测量值X_E(i),P_E(i),S_E(i)与仿真值X_M(i),P_M(i),S_M(i)之间的偏差，判断是否满足期望的目标，当不满足时则通过智能寻优算法，选择新的一组参数θ，返回步骤3，不断循环逼近实验测量值，寻求期望的参数θ；

步骤6：当满足期望的目标时，则获得期望的参数θ；

第七步：智能寻优算法的实现：

用遗传算法来寻找模型参数，首先是通过染色体的形式把待辨识的参数进行编码，定义一个染色体为参数集θ的一组可行解，多个染色体则为种群；每一个染色体又由多个基因组成；

第八步：动力学与代谢流耦合模型的使用：

将辨识得到的参数集θ代入公式(2)-(10)；首先由公式(2)-(4)获得生物量浓度、产物生成浓度和底物消耗浓度的动力学描述；然后由公式(10)计算比生长率μ的变化，由公式(5)计算比产物生成速率r_P，由公式(6)-(8)计算比底物消耗速率r_S；最后通过公式(9)映射获得细胞内部代谢通量r。

2.根据权利要求1所述的赖氨酸生物制造中宏观动力学与细胞代谢通量耦合建模方法，其特征在于，对于第六步中的步骤2，进行如下操作：

操作1：根据赖氨酸发酵的经验设置参数集θ中13个未知参数的各自取值范围，并将各参数在取值范围内分为k等分，每一等分称为一个基因，则一条染色体就有13k个基因；采用二进制进行编码，假设θ中某参数w的二进制编码为

该参数的取值范围为[w_min,w_max]，编码时该参数所占的序列长度为l；

操作2：随机生成由二进制编码表示的初始染色体种群Z个，用以下公式(11)进行解码：

解码后的各个染色体分别表示一组模型参数θ。

3.根据权利要求1所述的赖氨酸生物制造中宏观动力学与细胞代谢通量耦合建模方法，其特征在于，对于第六步中的步骤5，采用如下环节进行处理：

环节1：将Z组参数分别代入如下目标函数：

计算出每个染色体对应的J_j(θ)，j＝1,…,Z，用来评估各染色体个体的优劣程度，J_j(θ)越小的个体被选择进入下一代染色体种群的概率越大；

环节2：利用如下选择概率函数，按概率大小选择构成下一代的染色体种群：

环节3：将染色体种群以一定概率两两交叉个体中部分基因，重新组合而成新的个体；同时以一定概率改变群体中染色体个体的某些基因进行变异，产生新的个体；通过这两种遗传算子对染色体个体进行重新组合，产生新的解集θ，转往环节1，不断进行迭代直到满足期望目标。

4.根据权利要求2所述的赖氨酸生物制造中宏观动力学与细胞代谢通量耦合建模方法，其特征在于，对于第六步中的步骤5，采用如下环节进行处理：

环节1：将Z组参数分别代入如下目标函数：

计算出每个染色体对应的J_j(θ)，j＝1,…,Z，用来评估各染色体个体的优劣程度，J_j(θ)越小的个体被选择进入下一代染色体种群的概率越大；

环节2：利用如下选择概率函数，按概率大小选择构成下一代的染色体种群：

环节3：将染色体种群以一定概率两两交叉个体中部分基因，重新组合而成新的个体；同时以一定概率改变群体中染色体个体的某些基因进行变异，产生新的个体；通过这两种遗传算子对染色体个体进行重新组合，产生新的解集θ，转往环节1，不断进行迭代直到满足期望目标。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的赖氨酸生物制造中宏观动力学与细胞代谢通量耦合建模方法，其特征在于，所述第六步耦合模型参数的辨识中步骤1，实验数据X_E(i),P_E(i),S_E(i)的测量方法采用实验室离线生化分析方法，此时采集次数N取值小于30；或者采用在线糖分析仪、近红外光谱仪，N取值大于30。

6.根据权利要求1、2、3或4所述的赖氨酸生物制造中宏观动力学与细胞代谢通量耦合建模方法，其特征在于，第六步耦合模型参数的辨识中步骤4，采用龙格-库塔法、欧拉法或者线性化法来求解方程在时刻i的仿真值X_M(i),P_M(i),S_M(i)。

7.根据权利要求1、2、3或4所述的赖氨酸生物制造中宏观动力学与细胞代谢通量耦合建模方法，其特征在于，第七步智能寻优算法的实现，采用遗传算法、蚁群算法或粒子算法。

8.根据权利要求1、2、3或4所述的赖氨酸生物制造中宏观动力学与细胞代谢通量耦合建模方法，其特征在于，第八步动力学与代谢流耦合模型的使用，辨识获得参数集θ并代入公式(2)-(10)；生物量浓度、产物生成浓度和底物消耗浓度的动力学描述，比生长率μ的变化、比产物生成速率r_P和比底物消耗速率r_S，以及细胞内部代谢通量r能够同时获得，没有次序先后关系。

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