CN111337675A - 一种骨质疏松筛查试剂盒 - Google Patents

一种骨质疏松筛查试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种骨质疏松筛查试剂盒，包括任选的用于检测组织蛋白酶K活性的试剂。本发明试剂盒通过检测组织蛋白酶K活性来预测待测人群患骨质疏松的风险；若组织蛋白酶K活性高，则患骨质疏松的风险高；若组织蛋白酶K活性低，则患骨质疏松的风险低。本发明试剂盒可用于临床骨质疏松的辅助诊断，临床应用前景良好。

Description

一种骨质疏松筛查试剂盒
技术领域
本发明涉及骨质疏松筛查技术领域，尤其涉及一种骨质疏松筛查试剂盒。
背景技术
骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少、骨的微结构破坏为特征的全身性骨骼疾病。目前，全世界大约有2亿人患骨质疏松症，由于世界人口老龄化的加剧，骨质疏松症已经成为困扰老年人，特别是中老年妇女健康的主要疾病之一。骨质疏松治疗的关键是预防和早期干预，因此其早期诊断具有重要意义。
WHO建议采用骨密度(bone mineral density，BMD)测量结果诊断骨质疏松。常见的骨密度检测方法包括，x线、单光子吸收骨密度仪、双光子吸收骨密度仪、双能骨密度仪、定量CT和PET CT等。双能x线吸收(DXA)是目前世界上被公认为BMD测定的首选方法，被认为是诊断骨质疏松的“金标准”，具有重复性好、测量方法简单等优点，被广泛应用于骨质疏松的诊断中。但由于DXA检测仪器成本较高、检测具有辐射性、且只能卧位操作，一定程度限制了该方法的临床广泛应用。临床上需要更安全、便利、且便宜的骨质疏松的检验方法。
组织蛋白酶K是一种半胱氨酸蛋白酶，主要表达于破骨细胞。组织蛋白酶K可降解骨组织中的Ⅰ型胶原，对骨组织中非胶原蛋白，如骨钙素、骨桥蛋白、骨黏连蛋白、蛋白多糖及相关生长因子等也有促进其失活和加速其降解的作用。组织蛋白酶K的功能对骨骼正常生理结构及功能的维持有重要意义。但多数研究仅局限于组织蛋白酶K在破骨细胞中酶活性基础生化机制以及组织蛋白酶K小分子抑制剂靶向药物的研发，组织蛋白酶K在骨质疏松早期诊断方面的研究尚未得到研究者的重视。
发明内容
为了解决骨质疏松症的诊断方法存在诸多不便的问题，本发明的目的是提供一种骨质疏松筛查试剂盒，通过检测血清中组织蛋白酶K的活性，以预测待测人群患骨质疏松的风险。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种骨质疏松筛查试剂盒，包括任选的用于检测组织蛋白酶K活性的试剂。
其中，所述用于检测组织蛋白酶K活性的试剂为比色法用试剂或荧光法用试剂。
优选的是，所述用于检测组织蛋白酶K活性的试剂包括Good’s缓冲液和
Boc-Ala-R1-R2-Arg-MCA。
更为优选的是，所述MES缓冲液的pH值为5.0～8.0，浓度为5～500mM，所述
Boc-Ala-R1-R2-Arg-MCA的浓度为150μM～1000μM。
优选的是，所述用于检测组织蛋白酶K活性的试剂包括Good’s缓冲液和
Boc-Ala-R1-R2-Arg-PNA。
更为优选的是，所述Good’s缓冲液的pH值为5.0～8.0，浓度为5～500mM，所述
Boc-Ala-R1-R2-Arg-PNA的浓度为150μM～1000μM。
本发明的第二方面，提供检测组织蛋白酶K活性的试剂在制备骨质疏松筛查用试剂中的用途。
其中于，所述检测组织蛋白酶K活性的试剂为比色法用试剂或荧光法用试剂。
优选的是，所述检测组织蛋白酶K活性的试剂包括MES缓冲液和
Boc-Ala-R1-R2-Arg-MCA，所述Good’s缓冲液的pH值为5.0～8.0，浓度为5～500mM，所述Boc-Ala-R1-R2-Arg-MCA的浓度为150μM～1000μM。
优选的是，所述检测组织蛋白酶K活性的试剂包括Good’s缓冲液和
Boc-Ala-R1-R2-Arg-PNA，所述Good’s缓冲液的pH值为5.0～8.0，浓度为5～500mM，所述Boc-Ala-R1-R2-Arg-PNA的浓度为150μM～1000μM。
其中，Good’s缓冲液选自PIPES缓冲液，HEPES缓冲液，MES缓冲液，磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明试剂盒通过检测组织蛋白酶K活性来预测待测人群患骨质疏松的风险；若组织蛋白酶K活性高，则患骨质疏松的风险高；若组织蛋白酶K活性低，则患骨质疏松的风险低。本发明试剂盒可用于临床骨质疏松的辅助诊断，临床应用前景良好。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：
图1为比色法测定时反应速度随缓冲体系的变化曲线；
图2为比色法测定时吸光度随反应时间的变化曲线；
图3为比色法测定时吸光度随放置天数的变化曲线；
图4为荧光法测定时反应速度随缓冲体系的变化曲线；
图5为荧光法测定时反应速度随荧光底物浓度的变化曲线；
图6为荧光法测定时吸光度反应时间的变化曲线；
图7为荧光法测定时吸光度随放置天数的变化曲线；
图8为荧光法测定时冻融次数对血清吸光度的影响；
图9为荧光法测定时反应速度在不同激活剂加入时的柱状图。
具体实施方式
实施例1组织蛋白酶K(cathK)活性水平与骨质疏松症的关系
一、临床资料
选取骨质疏松症早期患者血清标本34例，平均年龄为50.5岁，男性占50％；健康对照达184例，平均年龄为47.1岁，男性占50％。
二、组织蛋白酶K活性的检测
1、比色法测定
1)缓冲液的配制：
取4.26g MES(200mM)、0.134g EDTA(2mM)加入50ml蒸馏水中，逐滴加入0.1mM/LNaOH溶液，利用PH计调至6.5，转移至100ml容量瓶中，定容。
2)比色底物的配制：取0.175g Boc-Ala-R1-R2-Arg-PNA加入100ml 200mM MES(pH6.5)溶液中，配制成1mM Boc-Ala-R1-R2-Arg-PNA的混合液。
3)检测仪器：全自动酶标仪
4)检测方法
S1，在96孔微孔板中依次加入20μL血清，150μM Boc-Ala-R1-R2-Arg-PNA的混合液200μL；
S2，利用全自动酶标仪，在波长405nm下读取吸光度值A1；
S3，将96孔微孔板置于37℃空气浴振荡器中孵育40分钟；
S4，利用全自动酶标仪，在相同波长下再次读取吸光度值A2；
S5，计算ΔA＝A2-A1。
cathK的活性＝ΔA/min×K(2-1)
K＝V反应体系×106/(ε×反应时间×V样本)
其中cathK的活性单位为U/L；
V反应体系＝220uL；
ε＝405nm；
反应时间＝40min；
V样本＝20uL。
2、荧光法测定
1)缓冲液的配制：
取2.13g MES(100mM)、0.134gEDTA(2mM)加入50ml蒸馏水中，逐滴加入0.1mM/LNaOH溶液，利用pH计调节至6.5,转移至100ml容量瓶中，定容。
2)底物的配制：
取0.138g Boc-Ala-R1-R2-Arg-MCA加入100ml 100mM MES(pH6.5)溶液中，配制成1mM荧光底物，按照一定比例稀释成150mM的荧光底物。
3)检测仪器：荧光微孔板读数仪
4)检测方法
S1，在96孔微孔板中依次加入20μL血清，150μM Boc-Ala-R1-R2-Arg-MCA混合液200μL；
S2，利用荧光微孔板读数仪，在激发波长为360nm,检测波长为460nm下读取吸光度值A1；
S3，将微孔板置于37℃空气浴振荡器中孵育40分钟；
S4，利用荧光微孔板读数仪，在相同波长下再次读取吸光度值A2；
S5，计算ΔA＝A2-A1。
cathK的活性＝ΔA/min×1μmol MCA所对应吸光度值(2-2)
其中，cathK的活性单位为μmol/L；
骨质疏松症患者与与健康对照血清中组织蛋白酶K活性检测结果如表1。
表1
健康对照 骨质疏松症早期患者
研究人数(人) 184 34
年龄(岁) 47.1±20.44 50.5±11.27
男性(％) 50 50
荧光法中组织蛋白酶K活性(μmol/L) 29.79±3.68 34.76±2.48
比色法中组织蛋白酶K活性(U/L) 6.41±0.65 8.32±0.49
由表1可知，通过荧光法检测骨质疏松患者的血清中组织蛋白酶K活性为34.76±2.48μmol/L，健康对照的血清中组织蛋白酶K活性为29.79±3.68μmol/L；通过比色法检测骨质疏松患者的血清中组织蛋白酶K活性为8.32±0.49U/L，健康对照的血清中组织蛋白酶K活性为6.41±0.65U/L，组织蛋白酶K活性在早期骨质疏松患者中显著升高，与健康对照组相比，组织蛋白酶K活性差异具有统计学意义(p＜0.001)。
由以上结果可以看出，与正常人群相比，早期骨质疏松患者的组织蛋白酶K活性显著升高(p＜0.001)，说明骨质疏松与组织蛋白酶K活性呈正相关，组织蛋白酶K高活性会显著提高患骨质疏松的可能性，因此，可以通过检测待测人群的组织蛋白酶K活性，将骨质疏松的易感人群筛查出来。
实施例2、本发明检测血液中组织蛋白酶K活性的试剂盒的组成及其使用方法
1、比色法用试剂盒
300μM Boc-Ala-R1-R2-Arg-PNA混合液(其中加入20mM、pH值为6.0的PIPES缓冲液)
使用方法：
S1，在96孔微孔板中依次加入20μL血清，300μM Boc-Ala-R1-R2-Arg-PNA的混合液200μL；
S2，利用全自动酶标仪，在波长405nm下读取吸光度值A1；
S3，将96孔微孔板置于37℃空气浴振荡器中孵育40分钟；
S4，利用全自动酶标仪，在相同波长下再次读取吸光度值A2；
S5，计算ΔA＝A2-A1，根据公式2-1进行组织蛋白酶K活性的计算。
2、荧光法用试剂盒
150μM Boc-Ala-R1-R2-Arg-MCA混合液(其中加入100mM、pH值为6.0的MES缓冲液)使用方法：
S1，在96孔微孔板中依次加入20μL血清，150μM Boc-Ala-R1-R2-Arg-MCA混合液200μL；
S2，利用荧光微孔板读数仪，在激发波长为360nm,检测波长为460nm下读取吸光度值A1；
S3，将微孔板置于37℃空气浴振荡器中孵育40分钟；
S4，利用荧光微孔板读数仪，在相同波长下再次读取吸光度值A2；
S5，计算ΔA＝A2-A1，根据公式2-2进行组织蛋白酶K活性的计算。
实施例3、采用比色法进行组织蛋白酶K活性检测时，各参数的选择
在37℃条件下，组织蛋白酶K作用于比色底物Boc-Ala-R1-R2-Arg-PNA中Arg-PNA之间的化学键，使之产生游离PNA，PNA在405nm处具有特征吸收峰，通过测定反应结束后吸光度的增加来反映组织蛋白酶K活性的高低。而组织蛋白酶K活性较高时，组织蛋白酶K与比色底物反应生成PNA的反应速度较快，分析误差较小。
1)缓冲体系的选择
分别配制50mmol/L的Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、PIPES缓冲液和HEPES缓冲液，分别调整pH依次为5.0、5.5、6、6.5、7、7.5、8，构成不同的缓冲体系，用大学生混合血清进行检测，检测不同缓冲体系在不同pH值下的每分钟吸光度变化(ΔA/T)。以反应速度(ΔA/T)为纵坐标，缓冲液pH值为横坐标作图，见图1。
由图1可知，HEPES缓冲液、PIPES缓冲液和MES缓冲液反应速率近似，在各个pH值下的反应速度均略大于Tris-HCl缓冲液和磷酸盐缓冲液下的反应速率，因此，选择pH为5.0～8.0的Good’s缓冲液为反应体系，其中PIPES、HEPES和MES缓冲液为较优缓冲体系，MES为最优缓冲体系；另外，酶反应在pH＝6.5～7.5时反应速度最快，故为较优pH值，其中pH＝7.0为最优pH值。
2)反应时间的选择
将96孔微孔板置于37℃空气浴振荡器中，测试不同时间点时的吸光度，以吸光度为纵坐标，反应时间为横坐标作图，如图2。
由图2可知，在反应的前40min，吸光度随着反应时间的延长而迅速上升，在40min时几乎达到峰值，在40min后，随着反应时间的延长，吸光度仍有所上升，但幅度较小，故选择40min为较优反应时间。
(3)试剂盒的稳定性
将本发明的试剂盒储存于37℃恒温箱中7天，考察试剂盒中酶自然失活情况，每天测试1次吸光度，一共记录7天，测试结果如图3。
由图3可知，本发明的试剂盒储存7天后，测得血清样本中的吸光度仅有小幅上升，说明稳定性较好，可用于临床试验。
实施例4采用荧光法进行组织蛋白酶K活性检测时，各参数的选择
在37℃条件下，组织蛋白酶K作用于荧光底物Boc-Ala-R1-R2-Arg-MCA中Arg-MCA之间的化学键，使之产生游离MCA，MCA在460nm处具有特征吸收峰，通过测定反应结束后吸光度的增加来反映组织蛋白酶K活性的高低。而组织蛋白酶K活性较高时，组织蛋白酶K与荧光底物反应生成MCA的反应速度较快，分析误差较小。
1)缓冲体系的选择
分别配制50mmol/L的Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、PIPES缓冲液和HEPES缓冲液，分别调整pH依次为5.0、5.5、6、6.5、7、7.5、8，构成不同的缓冲体系，用大学生混合血清进行检测，检测不同缓冲体系在不同pH值下的每分钟吸光度变化(ΔA/T)。以反应速度(ΔA/T)为纵坐标，缓冲液pH值为横坐标作图，见图4。
由图4可知，HEPES缓冲液、PIPES缓冲液和MES缓冲液反应速率近似，在各个pH值下的反应速度均略大于Tris-HCl缓冲液和磷酸盐缓冲液下的反应速度，因此，选择pH为5.0～8.0的Good’s缓冲液为反应体系，其中PIPES、HEPES和MES缓冲液为较优缓冲体系，MES为最优缓冲体系；另外，酶反应在pH＝6.5～7.5时反应速度最快，故为较优pH值，其中pH＝7.0为最优pH值。
2)底物浓度的选择
选取荧光底物浓度分别为10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、300μM、400μM、500μM、1000μM，在其他条件不变的情况下，分别测定混合血清中组织蛋白酶K活性，获得不同浓度下每分钟吸光度变化值(ΔA/T)，以反应速度(ΔA/T)为纵坐标，荧光底物浓度值为横坐标作图，见图5。
由图5可知，底物浓度小于100μM时，反应速度随底物浓度的升高而升高；当底物浓度达到150μM时，反应速度随底物浓度的继续上升而趋于平缓。故，为确保反应完全，底物浓度范围为150μM～1000μM。
3)反应时间的选择
将96孔微孔板置于37℃空气浴振荡器中，测试不同时间点时的吸光度，以吸光度为纵坐标，反应时间为横坐标作图，如图6。
由图6可知，在反应的前40min，吸光度随着反应时间的延长而迅速上升，在40min时几乎达到峰值，在40min后，随着反应时间的延长，吸光度仍有所上升，但幅度较小，故选择40min为较优反应时间。
4)底物在缓冲体系中的稳定性
将本发明的试剂盒储存于37℃恒温箱中7天，考察试剂盒中酶自然失活情况，每天测试1次吸光度，一共记录7天，测试结果如图7。
由图7可知，本发明的试剂盒储存7天后，测得血清样本中的吸光度仅有小幅上升，稳定性较好，可用于临床试验。
5)组织蛋白酶K酶活性的稳定性
将本发明的试剂盒封口后放置于-80℃冰箱中，冷冻30min后，置于25℃下融解，检测血清的吸光度。重复上述操作，反复冻融2次，分别进行吸光度测定，测定结果以吸光度为纵坐标，冻融次数为横坐标作图，测试结果如图8。
由图8可知，反复冻融对血清的吸光度变化较小，表明反复冻融对组织蛋白酶K的活性没有明显影响，说明本发明的试剂盒较为稳定。
6)激活剂
在本发明的试剂盒中加入不同种类、不同浓度的激活剂，激活剂为二价金属氯化物，如CaCl2，CdCl2，CuCl2和MgCl2，以未加激活剂作为对照，测得每分钟吸光度变化值(ΔA/T)如图9。从图9可知，加入不同种类、不同浓度的激活剂后，相较于无激活剂，组织蛋白酶K活性未有明显升高或降低，激活剂无明显作用。
上述的具体实施方式只是示例性的，是为了更好地使本领域技术人员能够理解本专利，不能理解为是对本专利包括范围的限制；只要是根据本专利所揭示精神的所作的任何等同变更或修饰，均落入本专利包括的范围。

Claims (10)

1.一种骨质疏松筛查试剂盒，其特征在于，包括任选的用于检测组织蛋白酶K活性的试剂。
2.如权利要求1所述的骨质疏松筛查试剂盒，其特征在于，所述用于检测组织蛋白酶K活性的试剂为比色法用试剂或荧光法用试剂。
3.如权利要求2所述的骨质疏松筛查试剂盒，其特征在于，所述用于检测组织蛋白酶K活性的试剂包括Good’s缓冲液和Boc-Ala-R1-R2-Arg-MCA。
4.如权利要求3所述的骨质疏松筛查试剂盒，其特征在于，所述Good’s缓冲液的pH值为5-8，浓度为5-500mM，所述Boc-Ala-R1-R2-Arg-MCA的浓度为150μM～1000μM。
5.如权利要求2所述的骨质疏松筛查试剂盒，其特征在于，所述用于检测组织蛋白酶K活性的试剂包括Good’s缓冲液和Boc-Ala-R1-R2-Arg-PNA。
6.如权利要求5所述的骨质疏松筛查试剂盒，其特征在于，所述Good’s缓冲液的pH值为5-8，浓度为5-500mM，所述Boc-Ala-R1-R2-Arg-PNA的浓度为150μM～1000μM。
7.检测组织蛋白酶K活性的试剂在制备骨质疏松筛查用试剂中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述检测组织蛋白酶K活性的试剂为比色法用试剂或荧光法用试剂。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述检测组织蛋白酶K活性的试剂包括Good’s缓冲液和Boc-Ala-R1-R2-Arg-MCA，所述Good’s缓冲液的pH值为5-8，浓度为5-500mM，所述Boc-Ala-R1-R2-Arg-MCA的浓度为150μM～1000μM。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述检测组织蛋白酶K活性的试剂包括Good’s缓冲液和Boc-Ala-R1-R2-Arg-PNA，所述Good’s缓冲液的pH值为5-8，浓度为5-500mM，所述Boc-Ala-R1-R2-Arg-PNA的浓度为150μM～1000μM。
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