CN111323407A - 一种快速测定中药多糖含量的拉曼光谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药检测领域,具体涉及一种快速测定中药党参和黄精中多糖含量及其制药过程中多糖含量的拉曼光谱检测方法,具体包括如下步骤:1)分别制备不同多糖含量的中药样品作为校正集;2)采集校正集的拉曼光谱并去除其中的异常样品;3)利用CARS算法选择建模波段并建立PLS模型;4)采集待测样品的拉曼光谱,将得到的光谱对所述模型进行拟合,即可得到待测样品中多糖含量。本发明方法不需要任何样品预处理,操作简便,绿色环保,不仅大大缩短了中药中多糖含量的检测时间,还实现了药物生产过程中多糖含量的实时监测,大大提高了检测效率和产品质量。
Description
技术领域
本发明属于中药检测领域,具体涉及一种快速测定中药党参和黄精及其制药过程中多糖含量的拉曼光谱检测方法。
背景技术
多糖是植物的主要成分,许多多糖具有重要的药理活性,因此多糖被作为许多中药的质量指标。因此急需一种用于中药制药过程中多糖含量监测方法。
党参和黄精是两种重要的中药,其中,党参是传统的滋补用药,健脾益肺,养血生津;而黄精是传统名贵滋补中药,补气养阴,健脾,润肺,益肾。党参和黄精中均含有较高含量的多糖,党参多糖和黄精多糖具有抗氧化、心肌保护、神经保护和免疫调节等作用,是党参和黄精的药效成分。
党参和黄精可用于制备多种复方中药,如稳心颗粒。稳心颗粒用于治疗气阴两虚,心脉瘀阻所致的心悸不宁,气短乏力,胸闷胸痛等。党参和黄精分别是稳心颗粒的君药和臣药,其药效成分党参多糖和黄精多糖与稳心颗粒的质量密切相关。
目前,多糖的测定通常是采用基于苯酚硫酸法或蒽酮硫酸法的紫外分光光度法进行测定,该方法繁琐费时,不能满足制药过程监测中快速分析的需求。而且,该方法需要使用大量强腐蚀性的浓硫酸,有潜在的安全隐患。
2004年FDA发布的关于过程分析技术(PAT指南),推动了PAT技术在中药制药过程中应用。基于光谱分析方法的PAT技术,如近红外光谱分析方法和拉曼光谱分析方法,可以对制造过程中的关键质量参数提供实时、经济、非破坏性的测定。但近红外光谱中水的信号很强,因此使用近红外光谱测定水溶液中的化学成分时,水的近红外吸收信号会掩盖其它成分信号,而不利于这些成分的测定。而拉曼光谱中水的信号较弱,因此拉曼光谱适合于水溶液中化学成分含量的测定。目前文献中已有蜂蜜、饮料等产品中单糖和二糖的拉曼光谱测定方法,但尚无多糖测定的拉曼光谱分析方法报道。
而本发明提供了一种基于竞争性自适应重加权算法-偏最小二乘法(CARS-PLS)模型的拉曼光谱分析方法用于测定党参提取物、黄精提取物多糖含量以及监测党参-黄精的提取过程中的多糖含量,大大提高了检测效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拉曼光谱结合CARS-PLS算法快速测定中药党参和黄精及其提取过程中多糖含量的方法,大大提高了检测效率。
为了实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
第一方面,本发明提供了一种快速测定党参或黄精中多糖含量的拉曼光谱检测方法,包括如下步骤:
(1)分别制备不同多糖含量的党参提取液或黄精提取液作为校正集样品;
(2)利用拉曼光谱仪采集所述校正集样品的拉曼光谱并去除其中的异常样品;
(3)采用CARS算法选择校正集样品的拉曼光谱特征波段,建立多糖含量与所述特征波段对应的拉曼强度之间的PLS模型;
(4)采集待测党参或黄精提取液样品的拉曼光谱,将其特征波段对应的拉曼强度代入所述PLS模型中,即可得到待测集样品中多糖含量。
第二方面,本发明还提供了一种快速测定党参-黄精提取过程中多糖含量的拉曼光谱检测方法,包括如下步骤:
(1)采集党参-黄精提取过程中的样品作为校正集样品,再利用苯酚-硫酸法测定所述样品中的多糖含量;
(2)利用拉曼光谱仪采集所述校正集样品的拉曼光谱并去除其中的异常样品;
(3)采用CARS算法选择校正集样品的拉曼光谱特征波段,建立多糖含量与所述特征波段对应的拉曼强度之间的PLS模型;
(4)采集待测党参或黄精提取液样品的拉曼光谱,将其特征波段对应的拉曼强度代入所述PLS模型中,即可得到待测集样品中多糖含量。
步骤(2)中,利用便携式拉曼光谱仪采集样品光谱,具体参数为:拉曼光谱的激发波长为785nm,最大输出功率为300mW,曝光时间为4.5s,曝光次数3次,扫描范围为173-3200cm-1。
步骤(2)中,运用PCA-Mahalanobis算法去除拉曼光谱中的异常样本。
所述的PCA-Mahalanobis算法的具体计算步骤包括:
①通过主成分分析提取拉曼光谱Ri,j的前n个主成分,使累积主成分贡献率>85%,得到新矩阵Rn,j,其中,Ri,j为拉曼强度值,i表示第i个拉曼位移,j为第j个提取物样品;
③计算Dj的标准差σ以及平均值M,设置置信限为:L=M+p*σ,p为常数;
④比较Dj与L的大小,若Dj≥L,则判断该拉曼光谱为异常值而舍去。
进一步地,所述的PCA-Mahalanobis算法中,采用的PCA主成分数n=3,常数p=2.5。
步骤(3)中,采用CARS算法提取特征波段之间,拉曼光谱不需要作任何预处理。此外,所述的特征波段根据检测对象的不同而不同,但同一对象校正集样品和待测集样品的特征波段一样。
步骤(3)中,所述的PLS模型所采用的主成分因子数,不同对象会不同,但是同一对象的校正集和待测集所采用PLS模型的主成分因子数一样。
步骤(3)中,利用校正集的拟合系数Rc 2和校正集的预测均方根误差RMSEC优化所述PLS模型的校正性能。其中,Rc 2值越接近于1,RMSEC值越小,表明模型的预测效果越好,Rc和RMSEC的计算公式如下:
步骤(4)中,利用待测集的拟合系数Rp 2和待测集的预测均方根误差RMSEC考察所述PLS模型的预测性能。其中,Rp 2值越接近于1,RMSEP值越小,表明模型的预测效果越好,其中Rp和RMSEP的计算公式为:
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
(1)现有技术中的多糖测定方法,如苯酚-硫酸法、蒽酮硫酸法需要对样品预处理,且需要消耗大量化学试剂(如乙醇、浓硫酸等),操作十分繁琐;而本发明方法不需要任何样品预处理,也不需要任何化学试剂,绿色环保;
(2)本发明方法测定时间短,每个样品在30s内即可完成测定;
(3)本发明方法在便携式拉曼仪上即可完成,操作简便,适合大规模生产应用;
(4)本发明方法可实现药物生产过程中多糖含量的实时监测,大大提高了检测效率和产品质量。
附图说明
图1为拉曼光谱测定中药提取液多糖含量或监测中药提取过程多糖含量方法示意图;
图2为党参提取液的原始拉曼光谱图;
图3为验证集中党参多糖含量参考真实值与预测值的散点图;
图4为黄精提取液的原始拉曼光谱;
图5为验证集中黄精多糖含量参考真实值与预测值的散点图;
图6为党参-黄精提取过程中样品的原始拉曼光谱;
图7为验证集中党参-黄精提取液样品多糖含量真实值与预测值的散点图。
具体实例方式
下面结合附图对本发明的测定方法作进一步说明,本发明利用拉曼光谱测定中药(党参、黄精)提取液样品中多糖含量或监测党参-黄精提取过程中多糖含量的方法示意图如图1所示。
实施例1:
本实施例提供的是党参提取物中多糖的含量测定,具体按照以下步骤进行:
(1)制备党参提取液样品
准确称取1g党参多糖(含70%多糖,通过苯酚-硫酸法测定)提取物用50mL水超声溶解,作为党参多糖储备液。用水连续稀释储备液得到0.070mg/mL-7.350mg/mL的党参多糖溶液(每个浓度间隔0.070mg/mL),7.420mg/mL-9.380mg/mL的党参多糖溶液(每个浓度间隔0.140mg/mL)总共得到120个党参多糖溶液,这些溶液作为校正集样本。另外配制1.540mg/mL、3.080mg/mL、4.620mg/mL、6.160mg/mL和7.700mg/mL的党参多糖溶液,每个溶液平行6份,共30个党参多糖溶液,作为验证集样本。
(2)采集党参提取液拉曼光谱
运用便携式拉曼光谱仪器采集党参提取液样本的拉曼光谱,得到的原始拉曼光谱图如图2所示,具体检测参数为:拉曼光谱的激发波长为785nm,最大输出功率为300mW,曝光时间为4.5s,曝光次数3次,扫描范围是173-3200cm-1。
(3)异常光谱选择
采用PCA-Mahalanobis(主成分分析-马氏距离法)算法,去除光谱异常样品,其中PCA主成分数为3,置信限为2.5σ。通过计算,一共去除校正集中3个拉曼光谱异常样本。
(4)特征波长选取
拉曼光谱不需要任何预处理步骤,同时分别运用SPA(连续投影算法)、UVE(无信息变量消除算法)、Si-PLS(间隔最小二乘法)、CARS算法提取拉曼特征光谱,表1是不同波长选择方法所建立的PLS模型对党参提取液多糖含量的预测结果。从表1中可以得到,最佳预测模型的波段选择方法是CARS,选择的用于建模的特征波段见表2,一共97个。
(5)建立PLS校正模型
建立党参提取物多糖含量与特征拉曼波段所对应拉曼强度值之间的的PLS预测校正模型。PLS模型的主成分因子数为4,且采用交叉验证法(交叉验证数目为10),比较模型所得预测值与参考真值差异,以验证校正模型的性能,结果显示,Rc 2和RMSEC分别为:0.9955和0.1667mg/mL,校正模型准确度高。
(6)模型验证
采集30个验证集样品的拉曼光谱,将特征拉曼波段所对应拉曼强度值输入至已建立的PLS模型中,得出验证集样品的多糖含量,并与参考真值进行比较。图3为验证集中党参多糖含量参考真实值与预测值的散点图,由图3可得,党参提取物多糖含量参考真值与拉曼光谱的预测值相符较好,其Rp 2和RMSEP分别为:0.9977和0.1176mg/mL。结果表明,拉曼光谱结合CARS-PLS可以用于预测党参提取液待测样品多糖含量。
实施例2:
本实施例提供的是黄精提取物中多糖的含量测定,具体按照以下步骤进行:
(1)制备黄精提取液样本
准确称取1g黄精多糖提取物(含70%多糖,通过苯酚-硫酸法测定)用50mL水超声溶解,作为黄精多糖储备液。用水连续稀释储备液得到0.070mg/mL-7.350mg/mL的黄精多糖溶液(每个浓度间隔0.070mg/mL),7.420mg/mL-9.380mg/mL的黄精多糖溶液(每个浓度间隔0.140mg/mL)总共得到120个黄精多糖溶液,这些溶液作为校正集样本。另外配制1.400mg/mL、2.800mg/mL、4.200mg/mL和7.000mg/mL的黄精多糖溶液,每个溶液平行6份,共24个黄精多糖溶液,作为验证集样本。
(2)采集黄精提取液拉曼光谱
运用便携式拉曼光谱仪器采集黄精提取液的拉曼光谱,得到的原始拉曼光谱图如图4所示,具体检测参数为:拉曼光谱的激发波长为785nm,最大输出功率为300mW,曝光时间为4.5s,曝光次数3次,扫描范围是173-3200cm-1。
(3)异常光谱选择
采用PCA-Mahalanobis算法,去除光谱异常样品,其中PCA主成分数为3,置信限为2.5σ。通过计算,一共去除校正集中3个拉曼光谱异常样本。
(4)特征波长选取
拉曼光谱不需要任何预处理步骤,同时分别运用SPA(连续投影算法)、UVE(无信息变量消除算法)、Si-PLS(间隔最小二乘法)、CARS算法提取拉曼特征光谱,表1是不同波长选择方法所建立的PLS模型。从表中可以得到,黄精提取物多糖含量最佳预测模型的波段选择方法是CARS,选择的用于建模的特征波段见表2。
(5)建立PLS校正模型
建立黄精提取物多糖含量与特征拉曼波段所对应拉曼强度值之间的的PLS预测校正模型。PLS模型的主成分因子数为4,且采用交叉验证法(交叉验证数目为10),比较模型所得预测值与参考真值差异,以验证校正模型的性能,结果显示,Rc 2和RMSEC分别为:0.9970和0.1366mg/mL,校正模型准确度高。
(6)模型验证
采集24个验证集样品的拉曼光谱,将特征拉曼波段所对应拉曼强度值输入至已建立的定量校正模型中,得出验证集样品的多糖含量,并与参考真值进行比较。图5为验证集中黄精多糖含量参考真实值与预测值的散点图,由图5可得,黄精提取物多糖含量参考真值与拉曼光谱的预测值相符较好,其Rp 2和RMSEP分别为:0.9963和0.1255mg/mL。结果表明,拉曼光谱结合CARS-PLS可以用于预测黄精提取液待测样品多糖含量。
实施例3:
本实施例提供的是党参-黄精提取过程样品多糖的含量测定,具体按照以下步骤进行:
(1)采集党参-黄精提取过程样品
0.75kg党参和1.0kg黄精加到30L提取罐中,用14L水于100℃下提取120min,收集提取液,然后再用10.5L水进行第二次提取,提取时间为90min。第一次提取时,0-60min之间每隔5min采集一次样本,60min–120min之间,每隔10min采集一次样本。第二次提取时0–45min时每隔5min采集一次样本,45–90min时每隔10min采集一次样本。每批次药材提取采集33个样本,共有5批药材。其中前4批药材提取采集的样本共132个,用于校正集,第五批药材提取采集的33个样本作为验证集样品。
(2)苯酚-硫酸法测定提取样本多糖含量
对照品溶液和标准曲线的制备:精密称取葡萄糖对照品适量,用水溶解,使其浓度为100μg/mL,用水依次稀释,得到80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL和10μg/mL的葡萄糖溶液。取200μL葡萄糖溶液,加入100μL 5%苯酚水溶液、和500μL浓硫酸,混匀,于90℃水浴中加热30min后,冷却至室温,以相应试剂为空白,在490nm波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。
多糖提取液测定:取适量提取液,用水稀释400倍,然后取200μL稀释后的提取液,加入100μL 5%苯酚水溶液、和500μL浓硫酸,混匀,于90℃水浴中加热30min,冷却至室温,于490nm波长处测定吸光度,计算提取液中以葡萄糖计的多糖浓度。
(3)采集党参-黄精提取过程样品
运用便携式拉曼光谱仪器采集党参-黄精提取过程样品的拉曼光谱,得到的原始拉曼光谱图如图6所示,具体检测参数为:拉曼光谱的激发波长为785nm,最大输出功率为300mW,曝光时间为4.5s,曝光次数3次,扫描范围是173-3200cm-1。
(4)异常光谱选择
采用PCA-Mahalanobis算法,去除光谱异常样品,其中PCA主成分数为3,置信限为2.5σ。通过计算,一共去除校正集中4个拉曼光谱异常样本。
(5)特征波长选取
拉曼光谱不需要任何预处理步骤,同时分别运用SPA(连续投影算法)、UVE(无信息变量消除算法)、Si-PLS(间隔最小二乘法)、CARS算法提取拉曼特征光谱,表1是不同波长选择方法所建立的PLS模型。从表1中可以得到,党参-黄精提取过程样品中多糖含量最佳预测模型的波段选择方法是CARS,选择的用于建模的波段见表2。
(6)建立PLS校正模型
建立黄精提取物多糖含量与特征拉曼波段所对应拉曼强度值之间的的PLS预测校正模型。PLS模型的主成分因子数为8,且采用交叉验证法(交叉验证数目为10),比较模型所得预测值与参考真值差异,以验证校正模型的性能,结果显示,Rc 2和RMSEC分别为::0.9825和1.0439mg/mL,校正模型准确度高。
(7)模型验证
采集33个验证集样品的拉曼光谱,将所对应拉曼强度值输入至已建立的定量校正模型中,得出验证集样品的多糖含量,并与参考真值进行比较。图7为验证集中党参-黄精提取液样品多糖含量真实值与预测值的散点图,由图7可得,党参-黄精提取过程多糖含量参考真值与拉曼光谱的预测值相符较好,其Rp 2和RMSEP分别为:0.9743和1.4931mg/mL。结果表明,拉曼光谱结合CARS-PLS可以用于预测党参-黄精提取液待测样品多糖含量。
表1不同波段选择方法建立的PLS模型对党参提取物(CRE)、黄精提取物(PRE)和党参-黄精提取过程(EPCP)中多糖含量的预测结果
表2采用CARS算法选择的CRE、PRE和EPCP样品拉曼光谱特征波段汇总
总之,本发明以党参多糖、黄精多糖和党参-黄精提取过程样品为研究对象,运用拉曼光谱结合CARS-PLS算法测定中药多糖含量以及监测中药提取过程中多糖的含量,是一种快速、无损和准确的多糖含量检测方法。此外,本方法还可以推广至其它中药多糖含量的测定以及监测制药过程中多糖含量的变化,具有潜在的研究价值和意义。
Claims (8)
1.一种快速测定党参或黄精中多糖含量的拉曼光谱检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)分别制备不同多糖含量的党参提取液或黄精提取液作为校正集样品;
(2)利用拉曼光谱仪采集所述校正集样品的拉曼光谱并去除其中的异常样品;
(3)采用CARS算法选择校正集样品的拉曼光谱特征波段,建立多糖含量与所述特征波段对应的拉曼强度之间的PLS模型;
(4)采集待测党参或黄精提取液样品的拉曼光谱,将其特征波段对应的拉曼强度代入所述PLS模型中,即可得到待测集样品中多糖含量。
2.一种快速测定党参-黄精提取过程中多糖含量的拉曼光谱检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)采集党参-黄精提取过程中的样品作为校正集样品,再利用苯酚-硫酸法测定所述样品
集样品的拉曼光谱并去除其中的异常样品;中的多糖含量;
(2)利用拉曼光谱仪采集所述校正
(3)采用CARS算法选择校正集样品的拉曼光谱特征波段,建立多糖含量与所述特征波段对应的拉曼强度之间的PLS模型;
(4)采集待测党参或黄精提取液样品的拉曼光谱,将其特征波段对应的拉曼强度代入所述PLS模型中,即可得到待测集样品中多糖含量。
3.根据权利要求1或2所述的拉曼光谱检测方法,其特征在于,步骤(2)中,利用便携式拉曼光谱仪采集样品光谱,具体参数为:拉曼光谱的激发波长为785nm,最大输出功率为300mW,曝光时间为4.5s,曝光次数3次,扫描范围为173-3200cm-1。
4.根据权利要求1或2所述的拉曼光谱检测方法,其特征在于,步骤(2)中,运用PCA-Mahalanobis算法去除拉曼光谱中的异常样本。
6.根据权利要求5所述的拉曼光谱检测方法,其特征在于,所述的PCA-Mahalanobis算法中,采用的PCA主成分数n=3,常数p=2.5。
7.根据权利要求1或2所述的拉曼光谱检测方法,其特征在于,步骤(3)中,利用校正集的拟合系数Rc 2和校正集的预测均方根误差RMSEC优化所述PLS模型的校正性能。
8.根据权利要求1或2所述的拉曼光谱检测方法,其特征在于,步骤(4)中,利用待测集的拟合系数Rp2和待测集的预测均方根误差RMSEP考察所述PLS模型的预测性能。
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