CN111317869A - 一种用于治疗支气管胸膜瘘的新型可注射水凝胶 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗支气管胸膜瘘的新型可注射水凝胶，其合成方法包括以下步骤：A、维生素K3‑肌肽(VKCP)的合成：分别取甲萘醌和硫代乳酸置于双颈圆底烧瓶中，然后加入甲醇，在冰浴条件下进行巯基‑迈克尔加成反应2小时，并在室温下过夜，从而得到新的硫代甲萘醌。本发明能促进细胞增殖，且增殖后的细胞活力达95％以上，无细胞毒性，安全性高，同时VCFP具有强大的抗菌特性，可以通过杀灭瘘口周围有害细菌，创造相对无菌环境，加快组织修复，此外，水凝胶所具有的靶向输送性、机械稳定性和持续释放性等特点，将有助于生长因子的持续释放，促进细胞增殖、分化和组织再生，加强新生组织的机械强度，并延长这种效应持续时间。

Description

一种用于治疗支气管胸膜瘘的新型可注射水凝胶
技术领域
本发明涉及新型生物材料技术领域，具体为一种用于治疗支气管胸膜瘘的新型可注射水凝胶。
背景技术
支气管胸膜瘘是气管、各级支气管或者肺泡与胸膜腔之间形成的病理性通道，常由肺或者肺叶切除术后残端过长、吻合口张力过大、病灶切除不彻底等因素导致，在肺叶切除术后发病率为0.5％～3％，全肺切除术后发病率为2％～20％，病死率高达18％-50％，是胸外科手术最严重的并发症之一，此外，多种呼吸系统疾病可导致BPF的发生，如结核、霉菌等肺部感染导致肺组织变性、坏死、穿孔，肺癌病人放化疗后引起的组织坏死、穿孔，以及成人呼吸窘迫综合症、营养不良、低蛋白血症、糖尿病及类固醇药物的应用等，由于瘘口的长期不愈合、支气管疤痕的收缩以及开放性瘘管的形成可导致肺组织膨胀不全，肺功能受损，并有可能导致脓胸、脓毒血症等严重并发症，是临床工作中亟待解决的难题。
目前，BPF的治疗方案包括外科手术、内镜下治疗及内科保守治疗，其中瘘口的闭合是关键，外科手术治疗作为首选的瘘口闭合手段，主要方法包括残端的直接关闭、带血管蒂的软组织瓣(如心包和胸肌等)覆盖支气管残端、外科胸腔镜治疗及胸廓改形术等，但是对于全身情况差、无法耐受手术的患者，则需选择其他非手术治疗方法，近年来，随着支气管镜介入治疗技术的发展与普及，支气管镜下封堵BPF瘘口也开始逐渐应用于临床，主要包括两种封堵方式，封堵剂(如生物胶、自体血、OB胶等)和封堵器(如封堵支架、支气管塞、房间隔封堵器等)，但这些封堵材料或多或少存在着适形性差、价格昂贵、伤口愈合慢等缺点，尚缺乏标准的统一治疗方案，因此有关BPF封堵治疗的研究中，选择有效的封堵材料，使其符合所需的形状、尺寸、生物相容性、组织再生性和机械稳定性等要求仍然是生物材料研究中的一个重要挑战，探索合适的封堵材料对于BPF的内镜下介入治疗至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于治疗支气管胸膜瘘的新型可注射水凝胶，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于治疗支气管胸膜瘘的新型可注射水凝胶，其合成方法包括以下步骤：
A、维生素K3-肌肽(VKCP)的合成：分别取甲萘醌和硫代乳酸置于双颈圆底烧瓶中，然后加入甲醇，在冰浴条件下进行巯基-迈克尔加成反应2小时，并在室温下过夜，从而得到新的硫代甲萘醌，对该粗品进行重结晶，随后，在水作为溶剂的情况下，利用EDC/NHS交联剂(0-10℃过夜)，使硫代甲萘醌与左旋肌肽反应，反应结束后，将反应混合物在旋转蒸发器中浓缩以去除溶剂(用乙酸乙酯和水进行处理)，用正己烷多次洗涤得到粗样品，最后将该样品制成冻干剂型，就是维生素K3-肌肽(VKCP)；
B、从家蚕中提取丝素蛋白：将从家蚕中获得的蚕蛹和丝胶在0.02M纯碱中煮沸30min后，用超纯水多次漂洗，所得的丝线干燥过夜，随后，将10g丝线溶解9.3M溴化锂溶液中60℃过夜，从而得到丝素蛋白溶液，然后用去离子水对丝素蛋白溶液透析2天，所得的溶液4℃环境下储存以供下一步使用；
C、蛋壳膜的制备：收集新鲜破碎的蛋壳膜，用纯冷水洗净，将洗净后的蛋壳膜在醋酸(70％体积比)中溶解2天，随后在90℃，存在醋酸(10％体积比)的条件下，将该溶液转移至3-巯基丙酸(3-MPA)水溶液中，反应4小时后，所制备的蛋壳膜溶液贮存备用；
D、维生素K3-肌肽共轭纤维蛋白水凝胶(VCFP)的制备：在制备好的15ml蛋壳膜和丝素蛋白溶液中加入VKCP，将该混合溶液超声震荡15分钟，随后，加入多巴胺(2mmol/ml)和EDC/NHS(1.5mmol/ml)并再次超声震荡30分钟，将反应后的混合物在室温下搅拌过夜，反应结束后，将所获得的水凝胶混合物以12000rpm离心10min，并用超纯水洗涤3-4次，将该样品制成冻干粉，最后所得的为维生素K3-肌肽共轭纤维蛋白水凝胶(VCFP)于室温下保存；
E、干细胞负载制备成SVCFP：将干细胞用0.2％胰蛋白酶消化，离心后在培养基中重新悬浮，然后再次离心。将上一步骤制备的VCFP以适当浓度加入干细胞中，并将两者混合，通过对该水凝胶的粘度和可注射情况进行检测从而得到SVCFP。
优选的，所述步骤A中，甲萘醌和硫代乳酸均为1mmol，重结晶方式为：采用薄层色谱法，以乙酸乙酯和石油醚(两者按10：90配比)为展开剂，观察反应的完成，EDC/NHS为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺。
优选的，所述还包括利用电喷雾质谱(ESI-MS)、质子和碳核磁共振波谱(1H&13CNMR)明确VKCP的结构：使用电喷雾质谱测得VKCP的结构质量约为ESI-MS：m/z 483.15[M-1]，在质子核磁共振波谱中(1H NMR)，VKCP在δ1.38ppm和2.36ppm处分别出现一个峰，对应于甲基质子的硫代乳酸和醌，芳香族质子波谱出现在δ8.11ppm-6.97ppm之间。
优选的，所述还包括应用红外光谱(FT-IR)验证所制备的新型VKCP、SF、ESM和VCFP水凝胶的官能团：在VKCP的红外光谱中，1743cm-1、1629cm-1和1535cm-1处的谱带分别对应于醌羰基和酰胺羰基伸缩频率。
优选的，所述还包括维生素K3-肌肽(VKCP)体外细胞毒性试验：将VKCP稀释为0.5μmol/L和1μmol/L两种浓度，分别处理小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)和人包皮成纤维细胞(HFF1)12小时、24小时和36小时，然后用CCK8法检测上述两种细胞在VKCP稀释液中的细胞活力。
优选的，所述还包括检测VKCP的抗菌活性：将合成的VKCP分别放置于金黄色葡萄球菌(革兰阳性细菌)和大肠杆菌(革兰阴性细菌)培养平板中。
优选的，所述还包括检测VCFP的体外生物相容性、细胞黏附和增殖能力：在体外，使用人包皮成纤维细胞(HFF1)、小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)和人支气管上皮样细胞(16HBE)细胞系进行生物相容性和细胞增殖能力测定，在VCFP水凝胶培养上述三种细胞4天，每隔2天测定细胞计数。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明能促进细胞增殖，且增殖后的细胞活力达95％以上，无细胞毒性，安全性高，同时VCFP具有强大的抗菌特性，可以通过杀灭瘘口周围有害细菌，创造相对无菌环境，加快组织修复，此外，水凝胶所具有的靶向输送性、机械稳定性和持续释放性等特点，将有助于生长因子的持续释放，促进细胞增殖、分化和组织再生，加强新生组织的机械强度，并延长这种效应持续时间。
附图说明
图1为本发明维生素K3-肌肽(VKCP)的合成过程示意图；
图2为本发明维生素K3-肌肽共轭纤维蛋白可注射水凝胶(VCFP)的制备过程示意图；
图3为本发明维生素K3-肌肽(VKCP)的质谱结果示意图；
图4为本发明合成的维生素K3-肌肽(VKCP)的质子(A)和碳(B)核磁共振波谱结果示意图；
图5为本发明合成的维生素K3-肌肽(VKCP)、丝素蛋白(SF)、蛋壳膜(ESM)、维生素K3-肌肽共轭纤维蛋白水凝胶(VCFP)的红外光谱(FT-IR)结果示意图；
图6为本发明用CCK8法测定不同浓度、不同时间维生素K3-肌肽(VKCP)对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)和人包皮成纤维细胞(HFF1)增殖的影响示意图；
图7为本发明素K3-肌肽(VKCP)对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性细菌)和大肠杆菌(革兰氏阴性细菌)的抗菌活性示意图；
图8为本发明维生素K3-肌肽共轭纤维蛋白水凝(VCFP)胶对人包皮成纤维细胞(HFF1)、小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)和人支气管上皮样细胞(16HBE)细胞增殖的影响示意图；
图9为本发明含有干细胞的新型维生素K3-肌肽共轭纤维蛋白可注射水凝胶(SVCFP)治疗支气管胸膜瘘(BPF)示意图；
图10为本发明实际合成的可注射粘附水凝胶示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-10(其中，图10中(A)为：所合成的水凝胶形态；(B)为：两个玻璃板相互粘接时水凝胶的粘着性；(C)为：水凝胶的延伸性，同时，VCFP为：维生素K3-肌肽共轭纤维蛋白的可注射水凝胶)，一种用于治疗支气管胸膜瘘的新型可注射水凝胶，其合成方法包括以下步骤：
A、维生素K3-肌肽(VKCP)的合成：分别取甲萘醌和硫代乳酸置于双颈圆底烧瓶中，然后加入甲醇，在冰浴条件下进行巯基-迈克尔加成反应2小时，并在室温下过夜，从而得到新的硫代甲萘醌，对该粗品进行重结晶，随后，在水作为溶剂的情况下，利用EDC/NHS交联剂(0-10℃过夜)，使硫代甲萘醌与左旋肌肽反应，反应结束后，将反应混合物在旋转蒸发器中浓缩以去除溶剂(用乙酸乙酯和水进行处理)，用正己烷多次洗涤得到粗样品，最后将该样品制成冻干剂型，就是维生素K3-肌肽(VKCP)；
B、从家蚕中提取丝素蛋白：将从家蚕中获得的蚕蛹和丝胶在0.02M纯碱中煮沸30min后，用超纯水多次漂洗，所得的丝线干燥过夜，随后，将10g丝线溶解9.3M溴化锂溶液中60℃过夜，从而得到丝素蛋白溶液，然后用去离子水对丝素蛋白溶液透析2天，所得的溶液4℃环境下储存以供下一步使用；
C、蛋壳膜的制备：收集新鲜破碎的蛋壳膜，用纯冷水洗净，将洗净后的蛋壳膜在醋酸(70％体积比)中溶解2天，随后在90℃，存在醋酸(10％体积比)的条件下，将该溶液转移至3-巯基丙酸(3-MPA)水溶液中，反应4小时后，所制备的蛋壳膜溶液贮存备用；
D、维生素K3-肌肽共轭纤维蛋白水凝胶(VCFP)的制备：在制备好的15ml蛋壳膜和丝素蛋白溶液中加入VKCP，将该混合溶液超声震荡15分钟，随后，加入多巴胺(2mmol/ml)和EDC/NHS(1.5mmol/ml)并再次超声震荡30分钟，将反应后的混合物在室温下搅拌过夜，反应结束后，将所获得的水凝胶混合物以12000rpm离心10min，并用超纯水洗涤3-4次，将该样品制成冻干粉，最后所得的为维生素K3-肌肽共轭纤维蛋白水凝胶(VCFP)于室温下保存；
E、干细胞负载制备成SVCFP：将干细胞用0.2％胰蛋白酶消化，离心后在培养基中重新悬浮，然后再次离心。将上一步骤制备的VCFP以适当浓度加入干细胞中，并将两者混合，通过对该水凝胶的粘度和可注射情况进行检测从而得到SVCFP。
能促进细胞增殖，且增殖后的细胞活力达95％以上，无细胞毒性，安全性高，同时VCFP具有强大的抗菌特性，可以通过杀灭瘘口周围有害细菌，创造相对无菌环境，加快组织修复，此外，水凝胶所具有的靶向输送性、机械稳定性和持续释放性等特点，将有助于生长因子的持续释放，促进细胞增殖、分化和组织再生，加强新生组织的机械强度，并延长这种效应持续时间。
步骤A中，甲萘醌和硫代乳酸均为1mmol，重结晶方式为：采用薄层色谱法，以乙酸乙酯和石油醚(两者按10：90配比)为展开剂，观察反应的完成，EDC/NHS为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺。
还包括利用电喷雾质谱(ESI-MS)、质子和碳核磁共振波谱(1H&13C NMR)明确VKCP的结构：使用电喷雾质谱测得VKCP的结构质量约为ESI-MS：m/z 483.15[M-1]，在质子核磁共振波谱中(1H NMR)，VKCP在δ1.38ppm和2.36ppm处分别出现一个峰，对应于甲基质子的硫代乳酸和醌，芳香族质子波谱出现在δ8.11ppm-6.97ppm之间，在碳核磁共振波谱中(13CNMR)，VKCP在δ175.75ppm和170.29ppm也各出现一个峰，相对应于VKCP中存在的羰基碳，分别在14.25ppm和15.58ppm处出现的峰代表两个甲基的存在(上述的质谱和波谱分析证实了所合成的产物符合VKCP的结构)。
还包括应用红外光谱(FT-IR)验证所制备的新型VKCP、SF、ESM和VCFP水凝胶的官能团：在VKCP的红外光谱中，1743cm-1、1629cm-1和1535cm-1处的谱带分别对应于醌羰基和酰胺羰基伸缩频率，在1317cm-1和1519cm-1处出现的吸收峰证实了硫代醌(C-S)和肌肽咪唑(C＝N)官能团的存在，VKCP所含羟基(–OH)的伸缩频率在3450cm-1处，另外，当VKCP和纤维蛋白(SF、ESM)共轭成VCFP时，纤维蛋白与VKCP结合的官能团为酰胺I、酰胺II和酰胺III，其在红外光谱上分别于1653cm-1、1551cm-1和1267cm-1处出现吸收带，在3055cm-1和3500cm-1处观察到吸收峰代表了脂肪族亚甲基，从而证实了VCFP水凝胶结构中存在羟基和氨基官能团(上述红外光谱结果证实了所合成的VCFP水凝胶如预期实现)。
还包括维生素K3-肌肽(VKCP)体外细胞毒性试验：将VKCP稀释为0.5μmol/L和1μmol/L两种浓度，分别处理小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)和人包皮成纤维细胞(HFF1)12小时、24小时和36小时，然后用CCK8法检测上述两种细胞在VKCP稀释液中的细胞活力，结果显示，即使当VKCP浓度为1μmol/L，处理36小时后，观察到HFF1和NIH 3T3中的细胞活力约为100％，上述结果进一步证实了所合成的VKCP具有有效的生物活性且无细胞毒性，显示出良好的安全性。
还包括检测VKCP的抗菌活性：将合成的VKCP分别放置于金黄色葡萄球菌(革兰阳性细菌)和大肠杆菌(革兰阴性细菌)培养平板中，发现其抑菌圈直径分别为(28±22)mm和(32±31)mm，这一结果表明VKCP对革兰阳性球菌及革兰阴性杆菌均具有较强的抗菌作用，将VKCP应用于支气管胸膜瘘的封堵中，将有助于控制瘘口周围的感染，预防脓胸的发生，促进伤口愈合。
还包括检测VCFP的体外生物相容性、细胞黏附和增殖能力：在体外，使用人包皮成纤维细胞(HFF1)、小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)和人支气管上皮样细胞(16HBE)细胞系进行生物相容性和细胞增殖能力测定，在VCFP水凝胶培养上述三种细胞4天，每隔2天测定细胞计数，实验结果表明，随着时间的增加，在第4天，生长在VCFP水凝胶上的三种细胞均显示出良好的生长增殖效果，提示VCFP水凝胶在短时间内即可促进细胞粘附、增殖，具有良好的生物相容性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种用于治疗支气管胸膜瘘的新型可注射水凝胶，其特征在于：其合成方法包括以下步骤：
A、维生素K3-肌肽(VKCP)的合成：分别取甲萘醌和硫代乳酸置于双颈圆底烧瓶中，然后加入甲醇，在冰浴条件下进行巯基-迈克尔加成反应2小时，并在室温下过夜，从而得到新的硫代甲萘醌，对该粗品进行重结晶，随后，在水作为溶剂的情况下，利用EDC/NHS交联剂(0-10℃过夜)，使硫代甲萘醌与左旋肌肽反应，反应结束后，将反应混合物在旋转蒸发器中浓缩以去除溶剂(用乙酸乙酯和水进行处理)，用正己烷多次洗涤得到粗样品，最后将该样品制成冻干剂型，就是维生素K3-肌肽(VKCP)；
B、从家蚕中提取丝素蛋白：将从家蚕中获得的蚕蛹和丝胶在0.02M纯碱中煮沸30min后，用超纯水多次漂洗，所得的丝线干燥过夜，随后，将10g丝线溶解9.3M溴化锂溶液中60℃过夜，从而得到丝素蛋白溶液，然后用去离子水对丝素蛋白溶液透析2天，所得的溶液4℃环境下储存以供下一步使用；
C、蛋壳膜的制备：收集新鲜破碎的蛋壳膜，用纯冷水洗净，将洗净后的蛋壳膜在醋酸(70％体积比)中溶解2天，随后在90℃，存在醋酸(10％体积比)的条件下，将该溶液转移至3-巯基丙酸(3-MPA)水溶液中，反应4小时后，所制备的蛋壳膜溶液贮存备用；
D、维生素K3-肌肽共轭纤维蛋白水凝胶(VCFP)的制备：在制备好的15ml蛋壳膜和丝素蛋白溶液中加入VKCP，将该混合溶液超声震荡15分钟，随后，加入多巴胺(2mmol/ml)和EDC/NHS(1.5mmol/ml)并再次超声震荡30分钟，将反应后的混合物在室温下搅拌过夜，反应结束后，将所获得的水凝胶混合物以12000rpm离心10min，并用超纯水洗涤3-4次，将该样品制成冻干粉，最后所得的为维生素K3-肌肽共轭纤维蛋白水凝胶(VCFP)于室温下保存；
E、干细胞负载制备成SVCFP：将干细胞用0.2％胰蛋白酶消化，离心后在培养基中重新悬浮，然后再次离心。将上一步骤制备的VCFP以适当浓度加入干细胞中，并将两者混合，通过对该水凝胶的粘度和可注射情况进行检测从而得到SVCFP。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗支气管胸膜瘘的新型可注射水凝胶，其特征在于：所述步骤A中，甲萘醌和硫代乳酸均为1mmol，重结晶方式为：采用薄层色谱法，以乙酸乙酯和石油醚(两者按10：90配比)为展开剂，观察反应的完成，EDC/NHS为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺。
3.根据权利要求1所述的一种用于治疗支气管胸膜瘘的新型可注射水凝胶，其特征在于：所述还包括利用电喷雾质谱(ESI-MS)、质子和碳核磁共振波谱(1H&13C NMR)明确VKCP的结构：使用电喷雾质谱测得VKCP的结构质量约为ESI-MS：m/z 483.15[M-1]，在质子核磁共振波谱中(1H NMR)，VKCP在δ1.38ppm和2.36ppm处分别出现一个峰，对应于甲基质子的硫代乳酸和醌，芳香族质子波谱出现在δ8.11ppm-6.97ppm之间。
4.根据权利要求1所述的一种用于治疗支气管胸膜瘘的新型可注射水凝胶，其特征在于：所述还包括应用红外光谱(FT-IR)验证所制备的新型VKCP、SF、ESM和VCFP水凝胶的官能团：在VKCP的红外光谱中，1743cm-1、1629cm-1和1535cm-1处的谱带分别对应于醌羰基和酰胺羰基伸缩频率。
5.根据权利要求1所述的一种用于治疗支气管胸膜瘘的新型可注射水凝胶，其特征在于：所述还包括维生素K3-肌肽(VKCP)体外细胞毒性试验：将VKCP稀释为0.5μmol/L和1μmol/L两种浓度，分别处理小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)和人包皮成纤维细胞(HFF1)12小时、24小时和36小时，然后用CCK8法检测上述两种细胞在VKCP稀释液中的细胞活力。
6.根据权利要求1所述的一种用于治疗支气管胸膜瘘的新型可注射水凝胶，其特征在于：所述还包括检测VKCP的抗菌活性：将合成的VKCP分别放置于金黄色葡萄球菌(革兰阳性细菌)和大肠杆菌(革兰阴性细菌)培养平板中。
7.根据权利要求1所述的一种用于治疗支气管胸膜瘘的新型可注射水凝胶，其特征在于：所述还包括检测VCFP的体外生物相容性、细胞黏附和增殖能力：在体外，使用人包皮成纤维细胞(HFF1)、小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)和人支气管上皮样细胞(16HBE)细胞系进行生物相容性和细胞增殖能力测定，在VCFP水凝胶培养上述三种细胞4天，每隔2天测定细胞计数。
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