CN111316955A - 一种踝关节创伤性骨关节炎模型造模角度固定器及其模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药应用技术领域，为了解决目前针对踝关节OA的研究很少，还没有一个可靠的踝关节骨关节炎模型，极大地限制踝关节OA研究的问题，提供了一种踝关节创伤性骨关节炎模型造模角度固定器及其模型的构建方法。所述角度固定器为固定板两端部分别固定连接截骨刀固定槽和卡骨槽，截骨刀固定槽与卡骨槽端部成37°角连接；所述固定板、截骨刀固定槽和卡骨槽（3.3）形成三角形角度固定器。利用本发明所制备的模型可以用来研究踝关节骨关节炎的病理过程以及评价相关药物对踝关节骨关节炎的疗效。

Description

一种踝关节创伤性骨关节炎模型造模角度固定器及其模型的 构建方法

技术领域

本发明属于医药应用技术领域，具体涉及一种踝关节创伤性骨关节炎模型造模角度固定器及其模型的构建方法，利用本发明所制备的模型可以用来研究踝关节骨关节炎的病理过程以及评价相关药物对踝关节骨关节炎的疗效。

背景技术

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是目前老年人中最常见的致残原因。这种疾病以关节软骨退行性改变引起的疼痛和继发性的行动限制而致残为特征。不幸的是，目前以OA机制为目标的药物治疗相对无效，很大程度上是由于对OA的病因和发病机制仍然了解的不够清楚。在人类OA中发生的复杂的病理生物学改变可能受到了多种遗传和环境因素的影响。为了阐明OA 发病和发展过程中发生的分子事件，使用体内模型变得非常必要。研究人员倾向于利用膝关节OA模型来研究这些因素，但忽略了其他类型OA模型的建立，例如踝关节OA模型。

研究表明，踝关节OA的生物标志物和机制可能与膝关节OA不同,研究者报道了aggrecan、骨形态发生蛋白（BMP）-2、BMP-7和纤维粘连蛋白-aggrecan复合物（FAC）可作为踝关节OA的关键标志物，但不能作为膝关节OA的关键标志物。在膝关节和髋关节，原发性OA分别占所有病例的67%和58%。与此同时，78%的踝关节OA是创伤性骨关节炎(PTOA)。此外，虽然65岁以后成年人群膝关节骨性关节炎的发病率从6%上升到10%，但踝关节骨性关节炎的发病率随年龄的增长而保持不变。踝关节骨折是踝关节最常见的骨折类型，大约有37-53%的晚期或终末期踝关节骨性关节炎患者出现这种骨折。超过50%的胫骨远端关节面骨折患者出现骨关节炎。由于关节内骨折后，踝关节接触压力增加；此外，炎症反应也是影响OA发展的一个因素。

人和猪膝关节创伤后软骨细胞的坏死和凋亡与软骨损伤和退行性改变有关。PTOA模型的一个优点是可以暂时控制疾病诱导（与自发性的动物OA和人类疾病相比），同时模拟人类疾病的分子病理学和组织病理学。尽管踝关节创伤性骨关节炎的发病率很高，但大多数临床和基础研究都与膝关节和髋关节有关，针对踝关节OA的研究很少。这将极大地限制踝关节OA的研究。

最近，在小鼠（通过内侧和外侧韧带切除）和小型猪（通过骨折）中仅建立了两种踝关节PTOA模型。小鼠踝关节韧带切除模型体积太小，无法收集关节液和软骨来用ELISA和qPCR进行生物标记物的研究。小型猪模型对于大多数研究群体来说价格昂贵，不适合用于药物筛选。然而，大鼠模型具有成本低、关节体积相对较大的优点，可以收集关节液和软骨，以及在特定的品种中遗传具有相似性，并且易于遗传操作。此外，人类和啮齿类动物的踝关节解剖和组织学特征具有可比性。因此，有必要开发新的踝关节PTOA模型以促进踝关节OA的疾病研究。临床上，有些患者仅出现踝关节骨折，而另一些则出现骨折和移位。因此，有必要开发新的踝关节PTOA模型以促进踝关节OA的疾病研究。

发明内容

本发明为了解决目前针对踝关节OA的研究很少，还没有一个可靠的踝关节骨关节炎模型，极大地限制踝关节OA研究的问题，提供了一种踝关节创伤性骨关节炎模型造模角度固定器及其模型的构建方法。

本发明由如下技术方案实现的：一种踝关节创伤性骨关节炎模型造模角度固定器，所述角度固定器为固定板两端部分别固定连接截骨刀固定槽和卡骨槽，截骨刀固定槽与卡骨槽端部成37°角连接；所述固定板、截骨刀固定槽和卡骨槽形成三角形角度固定器。

所述截骨刀固定槽为截骨刀固定板两侧向三角形外延伸并向外折弯成C型固定片，所述卡骨槽为骨固定板两侧向外延伸并折弯呈“n”型。所述C型固定片之间的距离为5mm，所述固定板两侧的距离为5mm。

一种踝关节创伤性骨关节炎模型的构建方法，具体步骤如下：

（1）选择动物模型：选择2月龄雄性Sprague Dawley大鼠行右内踝骨折；

（2）动物麻醉后，踝关节准备实施无菌手术：大鼠取仰卧位，右髋关节外展90度，右膝关节弯曲90度；内踝行A 1cm纵行切口。随后，对浅、深筋膜和胫后肌腱进行钝性剥离，露出内踝；将截骨刀与角度固定器置入胫骨远端，并将其锤入内踝，直到阻力突然停止，角度固定器在内侧1/3胫距关节处形成一个可重复且稳定的骨折，微型手术钳夹住并摇晃骨折块，确保其完全骨折；

（3）闭合切口前，对骨折块进行压缩，解剖复位；切口逐层闭合；实验动物术后自由活动；术后镇痛采用0.03mg/kg盐酸丁丙诺啡连续三天镇痛；

（4）建模期间，定时进行X射线检测，骨折愈合和骨关节炎的变化在骨折八周后通过UltraFocus100 x-ray cabinet检测，软骨下骨、关节间隙和软骨的形态学变化通过X射线和番红-O进行检测；用荧光分子层析成像FMT、酶链免疫吸附实验ELISA法和免疫组化法检测OA相关生物标志物的蛋白水平，qPCR法检测OA相关基因的mRNA水平；

使用上述方法，通过八周的时间，在大鼠体上构建成踝关节创伤性骨关节炎模型。

所述UltraFocus100 x-ray cabinet检测，曝光时间为4s ,电压设定值约为30-40kv。

所述FMT监测关节内注射MMPSense680 24小时后体内的炎症水平，检测MMPs-3、MMPs-9和MMPs-13；使用ROI兴趣区分析确定踝关节内探针的picomolar浓度，并将测量区域限制在胫骨远端致距骨，以分离关节间隙。

实时定量PCR检测中，引物对如下：大鼠Col2al，正向：AAG-GGA-CAC-CGA-GGT-TTC-ACT-GG ；反向：GGG-CCT-GTT-TCT-CCT-GAG-CGT；大鼠Acan，正向：CAG-TGC-GAT-GCA-GGC-TGG-CT；反向：CCT-CCG-GCA-CTC-GTT-GGC-TG；大鼠MMP-13：正向：GGA-CCT-TCT-GGT-CTT-CTGGC；反向：GGA-TGC-TTA-GGG-TTG-GGG-TC；18sRNA, 正向：CGG-CTA-CCA-CAT-CCAAGG-AA；反向：GCT-GGA-ATT-ACC-GCG-GCT；根据公式x = 2-ΔΔCt，计算相对转录水平，其中ΔΔCt= ΔCtE -ΔCtC(ΔCtE = CtE - Ct18S, ΔCtC = CtC - Ct18S) ；数据报告为均数±标准差。

用重复测量的双向分组的方差分析评价统计学差异；采用Bonferroni post-test进行随机配对比较。结果用均数±标准差表示，P值小于0.05为有统计学意义；用GraphPadPrism5软件进行统计分析。

本发明建立了踝关节骨折致大鼠踝关节创伤后OA（PTOA）模型，该模型将为研究者提供一个可重复的、有用的研究踝关节OA的工具。

附图说明

图1为右踝关节手术骨折部位前视图；图中：1-骨锤；2-截骨刀；3-角度固定器；4-内踝，图中内踝的虚线为骨折的位置；

图2为踝关节手术致OA模型的制作过程图；图中：a为踝关节的位置；b为暴露内踝；c为截骨刀和角度固定器一起放置在胫骨远端；d为采用显微手术器械确保完全骨折；e为角度固定器的正面视图；f为角度固定器的侧面视图；d显示关节间隙变窄，黑箭头显示软骨下硬化，白箭头显示骨赘；

图3为术后8周（b、d） 与术后即刻（a、c）X射线检查照片，图中：a、c为术后即刻X射线检查照片，b、d为术后8周X射线检查照片；a和b为对照组，c和d为骨折组；

图4为角度固定器结构示意图；图中：3.1-固定板；3.2-截骨刀固定槽；3.3-卡骨槽；3.4-固定板；3.5-C型固定片；3.6-骨固定板；

图5为术后8周荧光分子层析成像图；图中：左图为：脱位组踝关节骨折处MMPs阳性信号较对照组增强；右图为：骨折组踝关节骨折处MMPs阳性信号较对照组增强；

图6为酶链免疫吸附实验结果图；

图7为对照组、骨折大鼠的典型切片图；图中：a为：对照组中心软骨的OA损伤切片图；b为：脱位组中心软骨的OA损伤切片图；c为：骨折组中心软骨的OA损伤切片图；

图8为组织学评价结果图；

图9为免疫组织化学分析结果图；图中：a为：脱位组和骨折组的II型胶原染色较对侧对照组明显减少；b为：脱位组和骨折组均可见强X型胶原染色；c为：脱位组合骨折组均检测到MMP-13强染色；d为：阴性对照；

图10为qPCR踝关节OA软骨分解代谢基因表达增强；图中：a为与对照组相比，实验组Col2a1的mRNA水平较低 ；b为 与对照组相比，实验组Acan的mRNA水平较低；c为 ：实验组MMP-13的mRNA水平较对照组升高。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

一种踝关节创伤性骨关节炎模型造模角度固定器，所述角度固定器为固定板3.1两端部分别固定连接截骨刀固定槽3.2和卡骨槽3.3，截骨刀固定槽与卡骨槽端部成37°角连接；所述固定板3.1、截骨刀固定槽3.2和卡骨槽3.3形成三角形角度固定器。

所述截骨刀固定槽3.2为截骨刀固定板3.4两侧向三角形外延伸并向外折弯成C型固定片3.5，所述卡骨槽3.3为骨固定板3.6两侧向外延伸并折弯呈“n”型。

1、实验动物：这项研究得到了机构审查委员会和山西医科大学机构动物护理和使用委员会（2015LL020）的批准。将19只来自山西医科大学实验动物中心的2月龄雄性Sprague Dawley(SD)大鼠（220±20g）行右内踝骨折。以对侧踝关节作为对照。动物被分为每笼2只。他们在实验中随时都可以获得食物和水。术后8周，用过量的戊巴比妥钠（150mg/kg静脉注射）对大鼠实施安乐死。

2、内踝手术性骨折：如图1所示，骨折部位为右踝关节。动物被麻醉后，踝关节准备实施无菌手术。如图2a所示，大鼠取仰卧位，右髋关节外展90度，右膝关节弯曲90度。如图2b所示，暴露内踝，内踝采用#11刀片行A 1-cm纵行切口。随后，对浅、深筋膜和胫后肌腱进行钝性剥离，露出内踝。用两个1ml注射器作为拉钩。如图2c所示，截骨刀和角度固定器一起放置在胫骨远端。将截骨刀与角度固定器结合（37度，在内侧1/3胫距关节处形成一个可重复且稳定的骨折，）置入胫骨远端，并将其锤入内踝，直到阻力突然停止。如图2d所示，使用微型手术钳夹住并摇晃骨折块，确保其完全骨折。

闭合切口前，对骨折块进行压缩，以达到解剖复位。切口采用4-0缝线逐层闭合。这些动物在手术后可以自由活动。术后镇痛采用盐酸丁丙诺啡（0.03mg/kg SQ ,连续三天）镇痛。

为了验证模型的成功性，用X射线和番红-O观察了软骨下骨、关节间隙和软骨的形态学变化。采用FMT,ELISA法和免疫组化法检测OA相关生物标志物的蛋白水平，qPCR法检测OA相关基因的mRNA水平。

射线照相技术：骨折后立即在麻醉状态下仰卧位进行X线检查，确保踝关节骨折成功。骨折愈合和骨关节炎的变化在骨折八周后通过UltraFocus100 x-ray cabinet（FAXITRON,亚利桑那州，美国）确认。曝光时间为4s ,电压设定值约为30-40kv. 所有大鼠都证实内踝骨折。（图3c）X线片显示所有骨折在术后8周完全愈合（图3d）。骨折组关节间隙较术后0天及对照组狭窄，术后8周出现软骨下硬化及骨赘（图3）。

荧光分子层析成像（FMT）：FMT是一种无创、定量的荧光技术，对活体动物的三维组织成像具有较高的分子特异性和敏感性。使用活体FMT成像方法和探针，可以获得关于生物过程的实时和深层组织成像信息。在这项研究中，FMT被用来监测关节内注射MMPSense680(10ul,13.3um)(PerkinEL-mer,Massachusetts,USA)24小时后体内的炎症水平，检测MMPs-3、-9和-13。使用兴趣区分析（ROI）以确定踝关节内探针的picomolar浓度，并将测量区域限制在胫骨远端致距骨，以分离关节间隙。FMT数据资料显示，骨折后8周，手术侧踝关节的MMPs含量明显高于对侧。数据报告为均数±标准差,n=5/每组。骨折组和对照组的MMPs含量分别为33.02 ± 19.19 pmol 与26.70 ± 19.35 pmol, t = 3.328, P < 0.05。(图5)

酶链免疫吸附实验（ELISA）：安乐死后立即从脚踝收集关节液（SF）。简单来说，100微升等渗盐水通过关节腔注入踝关节，使用0.3ml胰岛素注射器和31G针头。注射后关节囊明显扩张。在采集前，踝关节通过弯曲和伸展手动循环5次以使液体均匀分布。大约有70微升的注入液被回收。这些样本在1000g下离心20分钟，在零下80摄氏度下冷冻，直到分析。根据制造商提示，使用ELISA试剂盒（Uscn生命科学，中国武汉）测定SF样品中MMP-13的含量。样本在磷酸缓冲液（PBS）中1：1稀释。使用设置为450nm的Thermo Multskan MK3微板阅读器（Thermo,马萨诸萨州，美国）测定显影板上的比色密度。数据报告为均数±标准差,n=8/每组。

骨折组MMP-13水平为2.30 ± 1.07 ng/ml，对照组为1.23 ± 0.75 ng/ml (t =2.792, P < 0.05)。（图6）

组织学评价：术后8周处死大鼠。踝关节在4%甲醛中固定48小时。用20%EDTA摇瓶脱钙6周。包括胫骨远端和距骨在内的每个踝关节在中冠状面上都是半截的，有前、后两个关节。两个组织块(前半部分和后半部分)都被埋入一个单一的石蜡块中，切面朝下。切块露出软骨。每隔0、100和200微米收集十个相邻切片。从每个间期取两个5微米厚的连续切片，用番红O和固绿染色。软骨退化由两名独立的观察者并使用盲法根据骨关节炎研究学会国际评分系统进行改良和量化。在照片上用显微目镜或直尺分别将胫骨远端和距骨的关节面分成三个等宽区。正常软骨得分为0分；受Acan、基质或软骨细胞丢失和基质纤维化影响的软骨总投影面积的5-10%样本为1分；受影响的比例占11-25%的为2分；受影响的比例占26-50%的为3分；受影响的比例占51-75%的为4分；受影响的比例占75%以上的为5分。最高的软骨损伤评分为30分。数据报告为均数±标准差，n=11/每组。11只大鼠用于组织学分析，其余8只大鼠用于收集关节液和软骨用于ELISA和qPCR。对照组、骨折大鼠的典型切片如图7所示。在这种模型中，踝关节软骨有退行性改变，包括胫骨远端和距骨软骨，中心软骨的OA损伤比周围严重。在骨折模型中踝关节总分为11.45±2.81，对照组的总分为1.27 ± 0.90(t =9.028, P < 0.05)。（图8）

免疫组织化学：II型胶原，X型胶原，和MMP-13通过免疫组化分析使用超敏SP IHC试剂盒(Mixin BioTeor,福州，中国)。为了提取抗原，切片用0.05%胰蛋白酶在37摄氏度下消化20分钟。内源性的过氧化物酶阻断内源性的过氧化物酶活性，山羊非免疫血清在室温下阻断10分钟非特异性抗体结合。将切片与大鼠II型胶原（Boster,中国武汉）、X型胶原或MMP-13的初代抗体在4摄氏度下培养过夜。然后，用生物素化的二级抗体和链霉亲和素过氧化物酶缀合物在室温下培养10分钟，然后在3,3′二氨基联苯胺显色剂中培养。使用奥林巴斯BX51显微镜（日本东京奥林巴斯）进行拍摄。用imageproplus6.3系统在×400倍镜下计数阳性染色细胞。随机计数五个软骨区，结果以平均阳性细胞数表示。排除软骨细胞附近区域和基质丢失。切片由两个独立的观察者采用盲法进行计数。数据报告为均数±标准差，n=3/每组。骨折组的II型胶原染色较对侧对照组明显减少。与对侧对照组踝关节相比，骨折组检测到Strong TypeX胶原和MMP-13染色（图9a-9d）。typeX胶原阳性细胞在骨折组为29.67±6.66，对照组为4.67 ± 0.58(t = 9.525, P < 0.05)。骨折组MMP-13阳性细胞为28.00 ±7.55，在对侧对照组为15.00 ±5.29(t = 5.166, P < 0.05)。

实时定量PCR(qPCR)：软骨标本用#11刀片刮除，用研钵和杵在液氮下进行研磨（n=6）。用RNAiso Plus从软骨中提取总RNA.（Takara,中国大连）1微克总RNA用Prime ScriptRT Master Mix(Takara ,中国大连）反转录到互补DNA。以合成的cDNA（40ng/L）为模板，用SYBR 预混料Ex-Tag(Takara,中国大连)和iQ-5光学模块检测系统（Bio-Rad,美国加利福尼亚）来定量mRNA的相对水平。

引物对如下：大鼠Col2al, AAG-GGA-CAC-CGA-GGT-TTC-ACT-GG (正向)GGG-CCT-GTT-TCT-CCT-GAG-CGT (反向);大鼠Acan，CAG-TGC-GAT-GCA-GGC-TGG-CT（正向）;CCT-CCG-GCA-CTC-GTT-GGC-TG (反向)；大鼠MMP-13, GGA-CCT-TCT-GGT-CTT-CTGGC（正向）；GGA-TGC-TTA-GGG-TTG-GGG-TC(反向);18sRNA, CGG-CTA-CCA-CAT-CCAAGG-AA（正向） ；GCT-GGA-ATT-ACC-GCG-GCT(反向)。根据公式x = 2-ΔΔCt，计算相对转录水平，其中ΔΔCt =ΔCtE -ΔCtC(ΔCtE = CtE - Ct18S, ΔCtC = CtC - Ct18S) .数据报告为均数±标准差。qPCR 结果显示两种OA模型的Col2al(n=6)和Acan(n=6) mRNA水平较低，MMP-13（ n=6）mRNA水平较高（图6）。

统计分析：采用重复测量的双向分组的方差分析评价统计学差异。采用Bonferroni post-test进行随机配对比较。结果用均数±标准差表示。 P值小于0.05，被认为有统计学意义。用GraphPad Prism5软件进行统计分析。

基于初步研究，发现37度角固定器在内侧1/3胫距关节处建立了一个稳定的骨折模型。这些骨折模型稳定，无需固定。所有动物骨折均于骨折后8周完全愈合，无踝关节畸形。组织学资料经Safranin-O染色证实，OA的变化与人踝、膝关节OA的变化相似，包括软骨颤动、关节面粗糙、Acan减少、基质和软骨细胞数量减少。FMT法、免疫组化法、qPCR法和ELISA法进一步检测MMP-13和X型胶原的增加，II型和Acan的减少。值得注意的是，内踝骨折导致轻度至中度OA软骨损伤。病变主要位于胫距关节的中心承重区，伴有罕见的软骨下硬化。与我们的模型相比，在小鼠韧带切断的踝关节OA模型中，软骨丢失和软骨下硬化是严重和常见的。

Claims (7)

1.一种踝关节创伤性骨关节炎模型造模角度固定器，其特征在于：所述角度固定器为固定板（3.1）两端部分别固定连接截骨刀固定槽（3.2）和卡骨槽（3.3），截骨刀固定槽与卡骨槽端部成37°角连接；所述固定板（3.1）、截骨刀固定槽（3.2）和卡骨槽（3.3）形成三角形角度固定器。

2.根据权利要求1所述的一种踝关节创伤性骨关节炎模型造模角度固定器，其特征在于：所述截骨刀固定槽（3.2）为截骨刀固定板（3.4）两侧向三角形外延伸并向外折弯成C型固定片（3.5），所述卡骨槽（3.3）为骨固定板（3.6）两侧向外延伸并折弯呈“n”型；所述C型固定片之间的距离为5mm，所述固定板两侧的距离为5mm。

3.一种踝关节创伤性骨关节炎模型的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）选择动物模型：选择2月龄雄性Sprague Dawley大鼠行右内踝骨折；

（2）动物麻醉后，踝关节准备实施无菌手术：大鼠取仰卧位，右髋关节外展90度，右膝关节弯曲90度；内踝行A 1cm纵行切口；随后，对浅、深筋膜和胫后肌腱进行钝性剥离，露出内踝；将截骨刀与角度固定器置入胫骨远端，并将其锤入内踝，直到阻力突然停止，角度固定器在内侧1/3胫距关节处形成一个可重复且稳定的骨折，微型手术钳夹住并摇晃骨折块，确保其完全骨折；

（3）闭合切口前，对骨折块进行压缩，解剖复位；切口逐层闭合；实验动物术后自由活动；术后镇痛采用0.03mg/kg盐酸丁丙诺啡连续三天镇痛；

（4）建模期间，定时进行X射线检测，骨折愈合和骨关节炎的变化在骨折八周后通过UltraFocus100 x-ray cabinet检测，软骨下骨、关节间隙和软骨的形态学变化通过X射线和番红-O进行检测；用荧光分子层析成像FMT、酶链免疫吸附实验ELISA法和免疫组化法检测OA相关生物标志物的蛋白水平，qPCR法检测OA相关基因的mRNA水平；

使用上述方法，通过八周的时间，在大鼠体上构建成踝关节创伤性骨关节炎模型。

4.根据权利要求3所述的一种踝关节创伤性骨关节炎模型的构建方法，其特征在于：所述UltraFocus100 x-ray cabinet检测，曝光时间为4s ,电压设定值约为30-40kv。

5.根据权利要求3所述的一种踝关节创伤性骨关节炎模型的构建方法，其特征在于：所述FMT监测关节内注射MMPSense680 24小时后体内的炎症水平，检测MMPs-3、MMPs-9和MMPs-13；使用ROI兴趣区分析确定踝关节内探针的picomolar浓度，并将测量区域限制在胫骨远端致距骨，以分离关节间隙。

6.根据权利要求3所述的一种踝关节创伤性骨关节炎模型的构建方法，其特征在于：实时定量PCR检测中，引物对如下：大鼠Col2al，正向：AAG-GGA-CAC-CGA-GGT-TTC-ACT-GG ；反向：GGG-CCT-GTT-TCT-CCT-GAG-CGT；大鼠Acan，正向：CAG-TGC-GAT-GCA-GGC-TGG-CT；反向：CCT-CCG-GCA-CTC-GTT-GGC-TG；大鼠MMP-13：正向：GGA-CCT-TCT-GGT-CTT-CTGGC；反向：GGA-TGC-TTA-GGG-TTG-GGG-TC；18sRNA, 正向：CGG-CTA-CCA-CAT-CCAAGG-AA；反向：GCT-GGA-ATT-ACC-GCG-GCT；根据公式x = 2-ΔΔCt，计算相对转录水平，其中ΔΔCt = ΔCtE-ΔCtC(ΔCtE = CtE - Ct18S, ΔCtC = CtC - Ct18S) ；数据报告为均数±标准差。

7.根据权利要求3所述的一种踝关节创伤性骨关节炎模型的构建方法，其特征在于：用重复测量的双向分组的方差分析评价统计学差异；采用Bonferroni post-test进行随机配对比较；结果用均数±标准差表示，P值小于0.05为有统计学意义；用GraphPad Prism5软件进行统计分析。

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