CN111302502A - 一种湖滨带氧化亚氮的减排方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种湖滨带氧化亚氮的减排方法,具体包括以下步骤:湖滨带基质收集、分选和均质化、功能微生物驯化及富集培养。本发明方法针对于水生植物生长茂盛的湖滨带地区较高的氧化亚氮排放通量,富集特定的功能微生物,强化微生物介导的氧化亚氮减排过程,维持湿地脱氮作用的生态功能的同时,抑制其对大气温室气体的排放。本发明的实例显示,富集功能微生物后的底泥样品能明显降低原位沉积物中的氧化亚氮的排放量。本发明对湖滨带环境有较强的针对性,无二次污染,具备良好推广性。
Description
技术领域
本发明涉及温室气体减排的微生物控制技术领域,具体是一种湖滨带氧化亚氮的减排方法。
技术背景
作为极为重要的温室气体,氧化亚氮的全球增温潜势是二氧化碳的296倍,且对平流层臭氧有严重危害。氧化亚氮排放的全球调查显示,淡水湖的湖滨带、水陆交错区是陆地生态系统中重要的氧化亚氮“源”。作为硝化、反硝化过程中的伴随产物,湖滨带的氧化亚氮主要来源是有氧条件下反硝化微生物介导的不完全反硝化过程。长期的水位波动以及岸带大型水生植物根系活动,都会导致湖滨带基质处于有氧-缺氧的循环过程,很大程度上抑制了微生物的完全反硝化进程,从而造成湖滨带氧化亚氮排放的增加。但同时,湖滨带富含有机质的环境,促进了微生物的生长繁殖,而水生植物的根际效应提高了硝化-反硝化的耦合作用,增强了代谢氧化亚氮微生物的活性,这些条件使得湖滨带有望成为是氧化亚氮的潜在“汇”。
随着人类的生产生活污水排放剧增,湖滨带的截污纳污能力受到极大挑战。水生植物无法完全吸收转化的氮素营养盐,势必要通过脱氮微生物进行去除。中国专利文献CN109626585A在2019年4月16日公布的一种湖滨带强化脱氮除磷的技术,该技术通过引入生物炭,增强了湖滨带脱氮除磷的过程。但该发明侧重于补充湖滨带基质的有机质和含氧条件,虽然能有效去除氮磷营养盐,但无法去除这种此技术带来的氧化亚氮排放量增加的趋势。此外,现有的其他针对氧化亚氮减排的技术方法,往往适用于农业生态系统,无法在湖滨带形成有效的氧化亚氮减排功效,且无法延伸到湖滨带环境,或存在成本高、推广困难的难题。基于湖滨带的高度异质性的生境条件,以及其高度时间动态的污染负荷过程,组织和构建出高性价比、实施简单、可持续性的氧化亚氮减排方法具有重要实际意义。
发明内容
发明目的:针对现有技术的不足,本发明提供一种湖滨带氧化亚氮的减排方法。该技术方法以湖滨带基质为原料,通过调节营养条件和氧含量,富集湿地沉积物中具备氧化亚氮还原能力的微生物类群,并促进其还原功能的表达,获取的基质产物,施用到原湿地环境中,监测发现湖滨带基质的氧化亚氮排放有显著下降趋势。该方法因地制宜,实施简单,成本低廉,且便于推广。
技术方案:为了实现上述目的,如本发明所述一种湖滨带氧化亚氮的减排方法,包括如下步骤:
(1)湖滨带基质收集:选择水生植物生长茂盛的、水位波动频繁的湖滨带进行基质沉积物采集;
(2)分选和均质化:剔除收集的基质沉积物中的动植物、腐败物、筛去大颗粒杂质,并混合均匀,静置并使其阴干;
(3)功能微生物驯化:处理后的基质沉积物在通入氧化亚氮进行培养驯化,激活沉积物中反硝化微生物的氧化亚氮代谢能力,富集携带相关代谢酶的微生物;
(4)富集培养:继续向驯化后的基质沉积物中添加富含有机质的溶液,厌氧条件下进行培养得到底泥;底泥施用于原位沉积物后实现湖滨带氧化亚氮的减排。
本发明中所述原位沉积物实际指原位湖滨带环境或者原位湖滨带环境中含氧化亚氮的原始沉积物,基质沉积物是指采集的用于功能微生物驯化的沉积物样本,本发明通过将驯化后的基质沉积物加入到原位沉积物能够实现湖滨带沉积物的氧化亚氮减排过程。
在湖滨带选取有植物根系的沉积物,沉积物深度设置为水土界面以下5~15厘米深度,先剪去植株的茎叶组织,挖掘出带有挺水植物根系组织的沉积物样,剔除表面大量腐败凋落物,沥水后收集得到底泥样本原料即为基质沉积物。
其中,步骤(1)所述湖滨带基质沉积物采集为选取包含植物根系的沉积物,采集深度设置为水土界面以下5~15厘米深度,避免植物凋落物对沉积物的污染,且有利于室内沉积物分选操作的进行。
作为优选,步骤(1)所述基质沉积物采集选取在每年6~8月份。此时水生植物,特别是挺水植物生长繁盛;水位波动幅度较大,湖滨带基质沉积物饱和水的频率和持续时间变异程度高,这都为反硝化微生物的生长及功能表达提供了条件。此外,这段时期气温适宜,有助于微生物的生长繁殖。
其中,步骤(2)所述剔除收集的基质沉积物中的动植物、腐败物、筛去大颗粒杂质,静置并使其阴干具体为剔除收集基质沉积物中的植物根系、腐败物,筛去大颗粒石块、底栖节肢类动物和蠕虫,静置并使其阴干。
作为优选,步骤(2)所述基质沉积物过20-30目筛网去除大颗粒杂质、腐败物、底栖动物残体、蠕虫和植物根系组织,于阴凉出进行干燥,最终含水量要求不高于50%。
更优选地,采用过20目筛网去除大颗粒杂质、腐败物、底栖动物残体、蠕虫和植物根系组织。
进一步地,步骤(2)所述通入氧化亚氮进行培养驯化为采用可控制进气的密闭培养体系,基质沉积物中淋入蒸馏水,维持基质沉积物的含水量为饱和含水量的50%~60%,向密闭的培养体系中通入含氧化亚氮的气体,控制密闭体系的温度为20~25℃,避光培养一周时间。
作为优选,控制密闭体系的温度为21℃,避光培养一周时间。此外,通入含氧化亚氮的气体的量为保持培养体系的气体中含有氧化亚氮即可,一般持续通入培养容器体积五倍的气体体积。
其中,步骤(2)所述向密闭的培养体系中通入含氧化亚氮的气体,所述气体中氧化亚氮与高纯空气的体积比为0.8~1.5:1。优选地,所述氧化亚氮为高纯度的氧化亚氮,可以通过等摩尔浓度的盐酸羟胺溶液和亚硝酸钠溶液制备得到,
作为优选,氧化亚氮与高纯空气的体积比为1:1。所述,高纯空气是指含78%氮气、21%氧气和其他稀有气体的无水蒸气、杂质的气体,一般可直接通过市售购买得到。所述高纯度的氧化亚氮是指氧化亚氮含量在90%以上,通过等摩尔浓度两溶液制备的氧化亚氮纯度可以达到90%的含量。
其中,步骤(4)所述富含有机质的溶液包括葡萄糖的溶液、稀盐酸和氢氧化钠溶液。
作为优选,步骤(4)所述厌氧条件下进行持续培养为在向基质沉积物中添加富含有机质的溶液,并加入蒸馏水使其被完全淹没,保持蒸馏水淹没下的待培养体系避光,恒温培养,得到最终制备底泥。
进一步地,步骤(4)所述保持蒸馏水淹没下的待培养体系pH值处于6.8~7.1,避光,恒温20~25℃培养一周,得到最终制备底泥。
更进一步地,所述步骤(4)所述保持蒸馏水淹没下的待培养体系pH值处于6.8~7.1,避光,恒温21℃,培养一周,得到最终制备底泥。
优选地,步骤(4)添加的富含有机质的溶液以葡萄糖为例,要求最终每千克基质沉积物中葡萄糖含量(以碳C计)不低于1.5毫克,沉积物酸碱性通过稀盐酸或氢氧化钠水溶液调节,控制pH值维持在6.5~7.5之间,沉积物完全淹水,避光,保持温度为21℃,进行持续一周的恒温避光培养期间,每日加入蒸馏水,使培养体系恰好被蒸馏水淹没。
湖滨带中多种微生物具备氧化亚氮的还原代谢能力,除常见的完全反硝化菌外,存在一类潜在的携带氧化亚氮还原酶编码基因nosZ分支II的“非典型”反硝化微生物。这类微生物具备在有氧条件下的代谢氧化亚氮的功能,有必要强化这类微生物的氧化亚氮还原能力,以达到湖滨带的彻底脱氮过程。根据这些微生物类群的生理生态特征,通过调节沉积物中的有机碳、无机氮含量,创造这类微生物的偏好环境,可以有目的性地调节湖滨带基质中此类微生物的功能表达,使其形成竞争优势,将不完全反硝化过程向完全反硝化过程进行转化。
因此,本发明针对高度特异性(水生植物生长茂盛的、水位波动频繁的湖滨带)的湖滨带环境,通过驯化、富集湖滨带基质中的代谢氧化亚氮的功能微生物,强化其功能表达能力,提供了一种湖滨带氧化亚氮的减排方法。本发明立足于原位环境,不产生二次污染,成本低廉,操作简便。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下优点:
本发明湖滨带氧化亚氮的减排方法针对湿地生态系统,强化其原位环境的氧化亚氮还原作用,并能避免化学制剂引入的二次环境污染。
本发明氧化亚氮通入的厌氧培养方式,调节了功能微生物的驯化方向,缩短了富集所需的培养时间,提高了生成效率。同时,操作方法易于操作,适合推广。
本发明中得到的富集微生物的沉积物可用于后续生理生态学科学调查,为工业化的菌剂提纯和进一步富集提供了基础。
本发明最终富集了氧化亚氮还原菌的沉积物(即底泥)能够有效降低湖滨带的氧化亚氮排放,提高微生物介导的完全反硝化作用,配合水生植物修复方式,能够极大地完善湿地脱氮、温室气体减排的功能,促进湖滨带环境保护。
综上,本发明湖滨带氧化亚氮的减排方法因地制宜,实施简单,成本低廉,且便于推广,可持续性的实现氧化亚氮减排。
附图说明
图1为培养期间每天采集的样品中功能基因nosZ的拷贝数浓度记录图;
图2为添加和未添加制备底泥处理组的氧化亚氮排放速率变化图。
具体实施方式
本发明提供了一种湖滨带氧化亚氮的减排方法,操作过程包括湖滨带基质沉积物采集,富集氧化亚氮还原功能微生物,将富集功能微生物后的沉积物样品施用于原位湖滨带环境中,评估氧化亚氮减排功效。以下列举较佳实施例(以东太湖的湖滨带区域为代表),并作详细说明如下:
实施例1
1、湖滨带基质沉积物(底泥样本)收集:东太湖湖滨带区域生长有禾本科芦苇、茭草等大型挺水植物,先前的调查显示湖滨带区域的氧化亚氮排放量明显高于长期淹水区的,且挺水植物生长的底泥反硝化潜势要高于无植被覆盖区域的。以6月23日为例(实际在6~8月份均可),采集基质沉积物时,选取有植物根系的沉积物,沉积物深度设置为水土界面以下5~15厘米深度,先剪去植株的茎叶组织,挖掘出带有挺水植物根系组织的沉积物样,剔除表面大量腐败凋落物,沥水后收集得到底泥样本原料即为基质沉积物。
2、底泥于阴凉处阴干,再对底泥(基质沉积物)进行分选过筛和均质化预处理,采用20目筛网去除植物根系组织、腐败物和大颗粒石块杂质等以及底栖节肢类动物和蠕虫,并混合均匀,置于阴凉透风处干燥,最终含水量不高于50%即可,基质沉积物原料A最终呈现出松散状态。
3、功能微生物驯化:分选后的基质沉积物原料A置于密闭的培养容器中,淋入无菌蒸馏水,通过称重维持沉积物含水量为饱和含水量的50%~60%(饱和含水量通过105℃烘箱干燥测得)。容器内通入氧化亚氮和高纯空气(体积比1:1),持续通入培养容器体积五倍的气体体积。保持避光及恒温(21℃)条件进行为期一周的培养实验,得到驯化培养后的基质沉积物为底泥产物B。培养期间,每天采集一次样品,提取DNA并分析其携带的氧化亚氮还原酶编码基因nosZ的丰度(以每克底泥样本中基因的拷贝数计),并采用上述相同步骤,但是无氧化亚氮气体通入,仅通入相同体积的高纯空气做对照,具体分析方法如下:
(2)使用赛默飞公司Applied BiosystemsTM Green实时荧光定量PCR试剂配置定量PCR体系:每个体系(20微升)中包括10微升的预混液、各0.2微升的上下游引物溶液(编码酶nosZ基因的特异引物)、2微升的DNA样品以及7.6微升的无菌蒸馏水。配置后的体系上载到澳大利亚CorbettTM IQ5通道荧光定量PCR仪,按照Green实时荧光定量PCR试剂提供的标准程序进行扩增运行。根据同批次运行的已知拷贝数浓度的标准样品,获取样品中编码酶nosZ基因的拷贝数浓度。
图1为获取底泥产物B的培养期间每天采集的样品中功能基因nosZ的拷贝数浓度记录图。从图1中可以看出,对比无氧化亚氮气体通入的对照组(未添加组)体系,本发明的培养体系中(氧化亚氮气体添加组),催化氧化亚氮还原的功能基因丰富度迅速增长,很快达到稳定期(第五天),功能微生物得到迅速富集,未添加组的功能微生物有所增加,但速度明显低于本发明的添加组。培养至第七天后,添加组的功能基因nosZ的拷贝数浓度平均值是未添加组的2.8倍。
4、富集培养:准备富集培养所需的富含有机质的溶液,包括葡萄糖的溶液(浓度为0.5摩尔/升)、稀盐酸和氢氧化钠水溶液(每升含0.1摩尔盐酸、氢氧化钠)。向底泥产物B中添加葡萄糖的溶液以提高其有机质含量,每千克底泥产物B中含2克葡萄糖,并加入蒸馏水使其被完全淹没。使用稀盐酸和氢氧化钠溶液调节酸碱度,监测得到蒸馏水淹没下的待培养体系的pH值在培养期间处于6.8~7.1之间。避光,恒温(21℃)培养一周,得到最终制备底泥C。
制备底泥C施用于原位沉积物后,与未施用的沉积物进行比较,对比分析氧化亚氮的排放量,具体分析方法如下:
(1)称取25克东太湖湖滨带原位采集的阴干底泥样品(采用实施例1的步骤1中的采集处理方式得到的基质沉积物阴干后的样品,具体为放置于避光、通风、阴凉(实测室温不超过23℃)的室内空间14天后的样品,即为原位沉积物),置于250毫升的蓝盖瓶中,形成6个平行样。其中3个蓝盖瓶为一组作为对照组,继续加入5克相同阴干底泥样品,另外3个蓝盖瓶为一组,作为添加组,加入5克制备产物底泥C。蓝盖瓶中加入无菌蒸馏水,调节阴干底泥样品(以30克重计)含水量为饱和含水量的60%,使用保鲜膜覆盖并留有气孔。
(2)两组蓝盖瓶置于避光、恒温(21℃)环境中进行培养,培养开始后在第24、48、72、120、168小时后进行气体采样。气体采样时使用高纯氮气冲洗10秒,并在厌氧条件(顶空空气为高纯氮气)下培养1小时后,使用10毫升注射器连续抽取5次,气体混匀后储存于铝箔采气袋中。采用气相色谱仪(Agilent GC 7890B)测定每份气体样品中的氧化亚氮浓度,并计算排放速率。测定计算的结果绘制成图2,对比添加组和未添加制备底泥C的湖滨带沉积物样品的氧化亚氮排放速率差异。
图2为氧化亚氮排放速率的趋势图。从图中可以看出,在第24、48、72、120、168小时时刻,添加组的氧化亚氮排放速率分别是未添加组(对照组)的0.40、0.27、0.31、0.43和0.58。这说明添加了制备产物C的处理组氧化亚氮排放速率明显低于未添加的,实现了湖滨带氧化亚氮的减排。
实施例2
实施例2与实施例1的方法相同,不同之处在于:步骤(2)采用30目筛网去除植物根系组织、腐败物和大颗粒石块杂质等以及底栖节肢类动物和蠕虫,并混合均匀,置于阴凉透风处干燥,基质沉积物原料A最终呈现出松散状态;步骤(3)容器内通入氧化亚氮和高纯空气(体积比0.8:1),保持避光及恒温(20℃)条件进行为期一周的培养实验;步骤(4)避光,恒温(20℃)培养一周,得到最终制备底泥C。
实施例3
实施例3与实施例1的方法相同,不同之处在于:步骤(3)容器内通入氧化亚氮和高纯空气(体积比1.5:1),保持避光及恒温(25℃)条件进行为期一周的培养实验;步骤(4)避光,恒温(25℃)培养一周,得到最终制备底泥C。
实施例2和实施例3氧化亚氮的减排效果和实施例1一致。
Claims (10)
1.一种湖滨带氧化亚氮的减排方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)湖滨带基质收集:选择水生植物生长茂盛的、水位波动频繁的湖滨带进行基质沉积物采集;
(2)分选和均质化:剔除收集的基质沉积物中的动植物、腐败物、筛去大颗粒杂质,并混合均匀,静置并使其阴干;
(3)功能微生物驯化:处理后的基质沉积物通入氧化亚氮进行培养驯化,激活沉积物中反硝化微生物的氧化亚氮代谢能力,富集携带相关代谢酶的微生物;
(4)富集培养:继续向驯化后的基质沉积物中添加富含有机质的溶液,厌氧条件下进行培养得到底泥;底泥施用于原位沉积物后实现湖滨带氧化亚氮的减排。
2.根据权利要求1所述的湖滨带氧化亚氮的减排方法,其特征在于,步骤(1)所述湖滨带基质沉积物采集为选取包含植物根系的沉积物,采集深度设置为水土界面以下5~15厘米深度。
3.根据权利要求1所述的湖滨带氧化亚氮的减排方法,其特征在于,步骤(1)所述基质沉积物采集选取在每年6~8月份。
4.根据权利要求1所述的湖滨带氧化亚氮的减排方法,其特征在于,步骤(2)所述剔除收集的基质沉积物中的动植物、腐败物、筛去大颗粒杂质,静置并使其阴干,具体为剔除收集基质沉积物中的植物根系、腐败物,筛去大颗粒石块、底栖节肢类动物和蠕虫,静置并使其阴干。
5.根据权利要求4所述的湖滨带氧化亚氮的减排方法,其特征在于,步骤(2)所述基质沉积物过20-30目筛网去除大颗粒杂质、腐败物、底栖动物残体、蠕虫和植物根系组织,于阴凉出进行干燥。
6.根据权利要求1所述的湖滨带氧化亚氮的减排方法,其特征在于,步骤(3)所述通入氧化亚氮进行培养驯化为采用可控制进气的密闭培养体系,基质沉积物中淋入蒸馏水,维持基质沉积物的含水量为饱和含水量的50%~60%,向密闭的培养体系中通入含氧化亚氮的气体,控制密闭体系的温度为20~25℃,避光培养一周时间。
7.根据权利要求6所述的湖滨带氧化亚氮的减排方法,其特征在于,步骤(3)所述向密闭的培养体系中通入含氧化亚氮的气体,所述气体中氧化亚氮与高纯空气的体积比为0.8~1.5:1。
8.根据权利要求1所述的湖滨带氧化亚氮的减排方法,其特征在于,步骤(4)所述富含有机质的溶液包括葡萄糖的溶液、稀盐酸和氢氧化钠水溶液。
9.根据权利要求1所述的湖滨带氧化亚氮的减排方法,其特征在于,步骤(4)所述厌氧条件下进行持续培养为在向基质沉积物中添加富含有机质的溶液,并加入蒸馏水使其被完全淹没,保持蒸馏水淹没下的待培养体系避光,恒温培养,得到最终制备底泥。
10.根据权利要求9所述的湖滨带氧化亚氮的减排方法,其特征在于,步骤(4)所述保持蒸馏水淹没下的待培养体系pH值处于6.8~7.1,避光,恒温20~25℃培养一周,得到最终制备底泥。
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