CN111296506A - 一种利用芦苇叶片提取物制备高效抑菌剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型抑菌剂制备技术，特别涉及一种利用芦苇提取物生物合成纳米银抑菌剂的制备方法。1、采集芦苇叶片，洗净后烘干至恒重；2、将干燥的芦苇叶片剪碎，连同提取剂一起置于回流装置内进行加热回流，将加热回流后的产物自然冷却、过滤，然后进行离心处理，取上清液即得到芦苇叶片提取液，溶液为浅黄色，保存备用；3、取上述芦苇叶片提取液与双蒸水混合制得混合液，再加入硝酸银溶液搅拌均匀后进行加热回流处理，待溶液变为金黄色时停止加热回流，即得纳米银抑菌剂。本发明原料资源丰富、成本低、绿色环保，利用芦苇叶中的丰富抗氧化物质为还原剂，合成的纳米银抑菌剂具有显著的抑菌活性和稳定性。

Description

一种利用芦苇叶片提取物制备高效抑菌剂的方法
技术领域
本发明涉及新型抑菌剂制备技术，特别涉及一种利用芦苇提取物生物合成纳米银抑菌剂的制备方法。
背景技术
芦苇(Phragmites communis Trin.)为禾本科芦苇属多年生水生草本植物。芦苇多生于湿地、浅水中，繁殖能力强、生物量大，具有很强的环境适应能力，在水土保持、盐碱地治理、生态环境保护中发挥了重要的作用。芦苇纤维含量丰富，可以用于民用建筑材料、编制、纺织、造纸、饲料加工等多种用途。另外，芦苇的也有重要的药用价值和保健功能，其根、茎、叶中富含阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、淀粉、芦丁、野黄芩苷、橙皮苷、槲皮素、芹菜素、黄芩素、阿魏酸、咖啡酸、丁香醛、氨基酸、维生素C等生物活性成分。研究表明芦苇提取物对大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus myloliquefaciens)和黑曲霉(Aspergillus niger)等均具有一定的抑制作用。因此，芦苇中还原性物质含量较高，并且具有较强的抑菌作用，为成功制备抑菌剂提供了依据。
纳米银(Silver nanoparticles，AgNPs)因其具有独特的小量子尺寸效应和大比表面效应表现出优异的抑菌性能，其抗菌谱广且不易产生耐药性，被看做是未来能替代抗生素的新一代的抑菌剂，成为抑菌领域研究的热点。传统制备纳米银的方法主要有化学合成法和物理合成法。其中，物理法对合成设备要求较高，不利于推广普及；而化学合成法在实验过程中往往需要加入硼氢化钠、水合肼等还原剂，对环境造成危害。近年来，以天然生物提取物为还原剂和稳定剂生物制备纳米银成为人们关注的热点，生物制备纳米银成本低廉、方法简单、反应条件温和、绿色环保，制备的产品分散性好、不易团聚、具有很好的抑菌活性。虽然人们已经利用生姜、橘皮、芒果皮、蓝莓叶、甘蓝等植物提取物成功制备出纳米银，但研究表明不同生物材料制备的纳米银在理化特性和生物学活性方面存在较大的差异。因此，需要人们不断筛选优化生物原材料以达到理想的制备效果。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术存在的不足之处，提供一种利用芦苇叶片提取物制备高效抑菌剂的方法，该方法中用到的芦苇原材料资源丰富、成本低、制备过程简单、绿色环保，利用芦苇叶中的丰富抗氧化物质为还原剂，合成的纳米银抑菌剂具有较为显著的抑菌活性和稳定性，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为19.8和18.5mm，对两种病原菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为3.13μg/mL和6.25μg/mL，常温避光条件下能稳定放置三个月以上，适合做为抑菌剂加以推广和应用。
一种利用芦苇叶片提取物制备高效抑菌剂的方法，其特殊之处在于包括以下步骤：
1、备料
采集芦苇叶片，洗净后烘干至恒重，得到干燥的芦苇叶片；
所述芦苇叶片先用水冲洗干净，再用双蒸水洗涤2-5次；
所述芦苇叶片置于烘箱中烘干，烘箱内的温度控制在40-80℃；
2、制备芦苇提取物
将干燥的芦苇叶片剪碎，连同提取剂一起置于回流装置内进行加热回流，干燥的芦苇叶片与提取剂按照质量比1∶(2-500)的比例混合，将加热回流后的产物自然冷却、抽滤，然后进行离心处理，取上清液即得到芦苇叶片提取液，溶液为浅黄色，保存备用；
所述提取剂为双蒸水、乙醇、氯仿中的任意一种；
所述加热回流的温度控制在40-100℃，加热回流0.5-12h；
所述离心处理在离心机内进行，离心机的转速控制在5000-12000rpm，离心10-30min；
所述保存备用是在0-10℃的环境下进行保存；
3、以芦苇叶片提取物为还原剂一步法生物合成纳米银
取上述芦苇叶片提取液与双蒸水按照体积比为1∶(1-100)的比例混合制得混合液，再加入硝酸银溶液搅拌均匀后进行加热回流处理，其中，硝酸银溶液与混合液的体积比为1∶(1-1000)，待溶液变为金黄色时停止加热回流，即得到生物合成的纳米银抑菌剂，避光保存；
所述AgNO3溶液的浓度为0.01-1M；
所述加热回流的温度控制在40-100℃，加热回流0.5-12h；
所述避光保存的温度控制在0-10℃。
本发明利用芦苇叶提取液生物合成的纳米银抑菌剂，采用的原料芦苇叶在自然界生物量大，通过本发明可以将其充分利用。本发明涉及的合成方法生产成本低廉，反应温和环保，能够避免传统化学合成法危害环境的弊端，合成时间短，生产效率高。抑菌实验表明，芦苇叶生物合成纳米银抑菌剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为19.8和18.5mm，对两种病原菌的MIC分别为3.13μg/mL和6.25μg/mL。说明该抑菌剂对水产病原菌抑菌谱广，抑菌效果显著，稳定性实验表明该抑菌剂在常温避光条件下能稳定放置三个月以上，适合做为抑菌剂加以推广和应用。
附图说明
图1：本发明芦苇叶片提取液生物合成纳米银抑菌剂的紫外可见吸收光谱图；
图2：本发明芦苇叶片提取液生物合成纳米银抑菌剂的透射电镜照片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例的一种利用芦苇叶提取液生物合成的纳米银抑菌剂的制备工艺，具体步骤入如下：
(1)材料准备：
采集芦苇叶片，先用自来水冲洗干净后，再用双蒸水洗涤3次，60℃烘干至恒重，得到干燥的芦苇叶片。
(2)芦苇提取物的制备：
称取上述芦苇叶片1.0g，将叶片剪碎，加入100mL的双蒸水，90℃加热回流3h，将制得的溶液自然冷却，抽滤，8000rpm离心10min，取上清液即得到芦苇叶片提取液。
(3)以芦苇叶片提取物为还原剂一步法生物合成纳米银：
取上述芦苇叶片提取液5mL，加入到14mL双蒸水中，再加入0.1M的硝酸银溶液1mL(终浓度5mM)，搅拌均匀，90℃加热回流约1h，待溶液逐渐变为金黄色时停止加热，4℃避光保存。
实施例2
本实施例的一种利用芦苇叶提取液生物合成的纳米银抑菌剂的制备工艺，具体步骤如下：
(1)材料准备：
采集芦苇叶片，先用自来水冲洗干净后，再用双蒸水洗涤3次，60℃烘干至恒重，得到干燥的芦苇叶片。
(2)芦苇提取物的制备：
称取上述芦苇叶片5.0g，将叶片剪碎，加入100mL70％的乙醇，70℃加热回流1h，将制得的溶液自然冷却，抽滤，8000rpm离心10min，取上清液即得到芦苇叶片提取液。
(3)以芦苇叶片提取物为还原剂一步法生物合成纳米银：
取上述芦苇叶片提取液1mL，加入到18mL双蒸水中，再加入0.1M的硝酸银溶液200μL，定容至20mL(硝酸银终浓度1mM)，搅拌均匀，70℃加热回流约15min，待溶液逐渐变为金黄色时停止加热，4℃避光保存。
实施例3
芦苇生物合成纳米银抑菌剂紫外-可见分光光度计表征：
采用紫外-可见分光光度计检测实施例2合成的生物合成的纳米银溶液的最大吸收光谱，以芦苇叶片提取液为对照，300-800nm范围全波长扫描。从附图1可以看出芦苇生物合成纳米银在419nm附近有最大吸收峰，而芦苇叶片提取液则无吸收峰。纳米银的表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)吸收峰范围在400～500nm内，由此可以推断芦苇叶片提取物成功将介导了纳米银的产生。
实施例4
芦苇生物合成纳米银抑菌剂透射电镜表征：
取5μL实施例2合成样品滴加到覆炭铜网上，室温干燥，用透射电子显微镜在100kV电压下观察纳米银颗粒的形态、分布及粒径，从附图2可以看出由芦苇生物合成的纳米银颗粒呈球形，在溶液中较为分散，纳米银颗粒较为均匀，粒径约为20nm。并且图中可以看到纳米银颗粒表面有生物物质附着的迹象，验证了植物提取物中的黄酮、氨基酸、蛋白质等物质能够结合在纳米银的表面，对纳米银起到分散和稳定的作用。
对比例1
本对比例采用生姜生物合成纳米银抑菌剂，包括以下制备工艺：
1、材料的预处理
将生姜先用自来水冲洗干净后，再用双蒸水洗涤3次，切片，60℃烘干至恒重，将干燥的姜片粉碎成粉末；
2、生姜提取液的制备
称取上述生姜粉末5.0g，加入100mL70％的乙醇，70℃加热回流2h,自然冷却，抽滤，8000rpm离心10min，取上清液，得到生姜提取液。
3、生物合成纳米银抑菌剂
取上述生姜提取液1mL，加入到20mL双蒸水中，再加入0.1M的硝酸银溶液200μL，定容至20mL(硝酸银终浓度1mM)，搅拌均匀，85℃加热回流约30min，待溶液逐渐变为金黄色时停止加热，4℃避光保存。
对比例2
将实施例2中芦苇生物合成纳米银、对比例1中生姜生物合成纳米银样品进行如下步骤的对比评价：
1、抑菌圈实验：
采用常规杯碟法进行抑菌圈实验检测纳米银抑菌剂的抑菌活性。以临床病原菌大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为指示菌，采用LB培养基(胰化蛋白胨10g酵母提取物5g，NaCl 5g，蒸馏水定容至1000mL，pH调至7.4)，37℃培养至对数增长期，用生理盐水稀释菌液浓度至1×106CFU/mL，取100μL均匀涂布到对应的固体培养基上，在每个皿上分别放置三个牛津杯(杯外径8mm)，分别加入实施例1、对比例1的样品及生理盐水各20μL，将培养平皿置于恒温培养箱中37℃培养过夜，分别测量各培养皿中产生的抑菌圈直径，所有实验重复三次，结果用平均值±标准偏差表示，具体实验结果见附表1。从表1可以看出以生物合成的纳米银抑菌剂对供试的革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌均产生明显的抑菌圈，而生理盐水对照则对供试病原菌完全没有抑制作用。芦苇生物合成纳米银抑菌剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为19.8和18.5mm；生姜提取液生物合成纳米银抑菌剂产生的抑菌圈直径分别为13.5和12.2mm。由上述研究结果可以看出芦苇生物合成纳米银抑菌剂对供试革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑菌活性均显著高于生姜提取液生物合成纳米银抑菌剂。因此，不同植物材料生物合成的纳米银抑菌效果存在显著差异，只有通过不断筛选和优化生物材料才能制备出优良的纳米银抑菌剂。芦苇叶片中的生物活性物质能有助于合成纳米银抑菌剂，并通过协同效应，促使其达到较为理想的抑菌状态。
表1纳米银抑菌剂对供试病原菌的抑菌圈直径/mm
Figure BDA0002366080840000061
2、最小抑菌浓度实验：
采用二倍稀释法测定纳米银抑菌剂的最小抑菌浓度(Minimum inhibitoryconcentration,MIC)。两种生物合成纳米银抑菌剂对大肠杆菌的MIC结果如表2所示，当芦苇生物合成纳米银3.13μg/mL以上的浓度对应的试管中溶液澄清，无细菌生长现象，故芦苇生物合成纳米银对大肠杆菌的MIC为3.13μg/mL，生姜生物合成纳米银对大肠杆菌的MIC为12.5μg/mL。对临床耐药病原菌金黄色葡萄球菌的MIC结果如表3所示，芦苇生物合成纳米银对金黄色葡萄球菌的MIC为6.25μg/mL，而生姜生物合成纳米银的MIC为25μg/mL。由此进一步可以说明芦苇生物合成纳米银抑菌剂在较小浓度下即可达到抑菌的效果，具有较为显著的抑菌活性，在抑菌领域具有很好的应用价值。
表2纳米银抑菌剂对大肠杆菌的最小抑菌浓度
Figure BDA0002366080840000071
注：“+”表示有浑浊，“-”表示没有浑浊
表3纳米银抑菌剂对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度
Figure BDA0002366080840000072
注：“+”表示有浑浊，“-”表示没有浑浊
3、稳定性实验：
将上述两种纳米银溶液在室温避光条件下放置三个月以后观察，均溶液澄清，无明显颜色改变，无团聚沉淀现象发生，抑菌圈实验表明仍具有显著的抑菌效果。说明生物合成纳米银抑菌剂较为稳定，适合推广应用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种利用芦苇叶片提取物制备高效抑菌剂的方法，其特征于包括以下步骤：
1)备料
采集芦苇叶片，洗净后烘干至恒重，得到干燥的芦苇叶片；
2)制备芦苇提取物
将干燥的芦苇叶片剪碎，连同提取剂一起置于回流装置内进行加热回流，干燥的芦苇叶片与提取剂按照质量比1∶(2-100)的比例混合，将加热回流后的产物自然冷却、过滤，然后进行离心处理，取上清液即得到芦苇叶片提取液，溶液为浅黄色，保存备用；
3)以芦苇叶片提取物为还原剂一步法生物合成纳米银
取上述芦苇叶片提取液与双蒸水按照体积比为1∶(1-100)的比例混合制得混合液，再加入硝酸银溶液搅拌均匀后进行加热回流处理，其中，硝酸银溶液与混合液的体积比为1∶(1-1000)，待溶液变为金黄色时停止加热回流，即得到生物合成的纳米银抑菌剂，避光保存。
2.按照权利要求1所述的一种利用芦苇叶片提取物制备高效抑菌剂的方法，其特征于步骤1)中所述芦苇叶片先用水冲洗干净，再用双蒸水洗涤2-5次。
3.按照权利要求1所述的一种利用芦苇叶片提取物制备高效抑菌剂的方法，其特征于步骤1)中所述芦苇叶片置于烘箱中烘干，烘箱内的温度控制在50-80℃。
4.按照权利要求1所述的一种利用芦苇叶片提取物制备高效抑菌剂的方法，其特征于步骤2)中所述提取剂为双蒸水、乙醇、氯仿中的任意一种。
5.按照权利要求1所述的一种利用芦苇叶片提取物制备高效抑菌剂的方法，其特征于步骤2)中所述加热回流的温度控制在40-100℃，加热回流0.5-12h。
6.按照权利要求1所述的一种利用芦苇叶片提取物制备高效抑菌剂的方法，其特征于步骤2)中所述离心处理在离心机内进行，离心机的转速控制在5000-10000rpm，离心10-15min。
7.按照权利要求1所述的一种利用芦苇叶片提取物制备高效抑菌剂的方法，其特征于步骤2)中所述保存备用是在0-10℃的环境下进行保存。
8.按照权利要求1所述的一种利用芦苇叶片提取物制备高效抑菌剂的方法，其特征于步骤3)中所述AgNO3溶液的浓度为0.01-1M。
9.按照权利要求1所述的一种利用芦苇叶片提取物制备高效抑菌剂的方法，其特征于步骤3)中所述加热回流的温度控制在40-100℃，加热回流0.5-12h。
10.按照权利要求1所述的一种利用芦苇叶片提取物制备高效抑菌剂的方法，其特征于步骤3)中所述避光保存的温度控制在0-10℃。
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