CN111295390B - 使癌细胞对抗癌治疗敏感的方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及用于治疗癌症的组合疗法。本公开内容还涉及用于治疗癌症和用于使癌细胞对广谱抗癌剂敏感的组合物、方法和试剂盒。

Description

使癌细胞对抗癌治疗敏感的方法

技术领域

本公开内容涉及癌症的治疗。更具体地，本公开内容涉及用于使癌细胞对抗癌治疗敏感的组合物、方法和试剂盒。

背景技术

以下列出了被认为与本公开的主题的背景相关的参考文献：

[1]Yao，H.et al.2016，Oncotarget，DOI：10.18632/oncotarget.12284.

[2]Andre，F.and Zielinski，C.C.2012，Annals of Oncology 23(Supplement6)：vi46-vi51.2012.

[3]WO 2009/083968.

[4]Sandler，T.et al.2010，Recent Advances in Clinical Medicine，ISSN：1790-5125，ISBN：978-960-474-165-6.

本文对以上参考文献的承认不应被推断为意味着这些参考文献以任何方式与本公开的主题的可专利性相关。

背景

存在超过100种类型的癌症和相应的许多类型的癌症治疗。目前的一些抗癌疗法具有不完全的有效性，因为它们是在假设转移性肿瘤在不同器官中表现相似的情况下设计的。此外，癌症的细胞毒性化学疗法或放射疗法受到严重的、有时危及生命的副作用的限制，这些副作用是由对敏感的正常细胞的毒性引起的。因此，正在持续努力开发识别肿瘤相关抗原的靶向疗法。

乳腺癌是最常见的癌症形式，并且是全世界女性中癌症相关死亡率的第二大主要原因，导致2015年期间美国约40,000例死亡。每年，全世界估计100万至130万乳腺癌病例被诊断出。在这些病例中，约15％-20％属于三阴性乳腺癌(TNBC)亚型(1)。

TNBC根据雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)的表达的缺乏以及人表皮生长因子受体2(HER2)的表达或扩增的缺乏所定义。

TNBC的治疗目前基于被批准用于普通乳腺癌患者的许多剂。这种治疗包括，仅举几例，蒽环类、紫杉烷类、基于铂的方案和抗血管生成疗法(2)。

然而，在不存在特定治疗靶的情况下，TNBC目前被认为是具有有限的治疗选择并且在用标准方案治疗后预后非常差的侵袭性癌症亚型。目前对于新的有效疗法，特别是用于患有转移性疾病的患者的新的有效疗法存在未被满足的需求(2)。

先前已示出被称为“KTPAF50”的肽及其片段与体外和小鼠中的多种类型的癌细胞的存活力降低和增殖的抑制相关(3,4)。

一般描述

本公开内容通过其一个方面提供了一种用于治疗有相应需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物。

在一些实施方案中，根据本公开内容的分离的多肽增加所述患者对所述至少一种抗癌剂的响应性。在另外的实施方案中，根据本公开内容的分离的多肽调节所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达。在仍另外的实施方案中，根据本公开内容的分离的多肽增加或减少所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达。

在一些实施方案中，如本公开内容定义的细胞部分存在于所述癌细胞的细胞表面，或者是细胞内部分。在其他实施方案中，如本公开内容定义的细胞部分是受体、多肽、酶、转录因子或衔接分子(adapting molecule)。在具体实施方案中，如本公开内容定义的细胞部分是细胞表面受体。

在又另外的具体实施方案中，根据本公开内容的分离的多肽增加所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达，并且如本文定义的细胞部分是受体。

在一些实施方案中，根据本公开内容的细胞部分是以下的至少一种：人表皮生长因子受体2(HER2/neu受体)、雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、谷胱甘肽(GSH)、表皮生长因子受体(EGFR)、雄激素受体、B淋巴细胞抗原分化簇CD20(CD20)、分化簇33(CD33)、程序性细胞死亡配体(PD-L)或ST2受体。

在其他实施方案中，根据本公开内容的至少一种抗癌剂与所述至少一种细胞部分直接地或间接地相互作用。在另外的实施方案中，根据本公开内容的抗癌剂是免疫治疗剂、化学治疗剂、信号转导抑制剂、受体抑制剂、基因表达调节剂、凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、激素治疗剂、代谢抑制剂、抗自噬剂(anti-autophagy agent)、内质网应激诱导剂、反应性氧物质(ROS)诱导剂或其组合。

在一些实施方案中，根据本公开内容的至少一种抗癌剂是免疫治疗剂，优选地单克隆抗体或缀合抗体。在其他实施方案中，如本文定义的单克隆抗体或缀合抗体针对HER2、ER或PR中的至少一种。

在其他实施方案中，如本文定义的至少一种抗癌剂是受体抑制剂，优选地表皮生长因子受体(EGFR)的抑制剂。在另外的实施方案中，根据本公开内容的至少一种抗癌剂是化学治疗剂，优选地多柔比星(doxorubicin)或多柔比星衍生物、顺铂、紫杉醇(taxol)或反应性氧物质(ROS)诱导剂。

在特定实施方案中，根据本公开内容，当在没有所述分离的多肽的情况下进行施用时，患者对所述抗癌剂无响应。

在一些实施方案中，如本文定义的癌症是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、B细胞淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)或胰腺癌中的至少一种。在多种实施方案中，如本文定义的癌症为三阴性乳腺癌(TNBC)。

本公开内容还提供了一种用于治疗有相应需要的患者中的三阴性乳腺癌(TNBC)的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物。在一些实施方案中，由本公开内容定义的分离的多肽增加所述患者的癌细胞中的人表皮生长因子受体2(HER2/neu受体)、雌激素受体(ER)或孕酮受体(PR)中的至少一种的表达。

在一些实施方案中，本公开内容的分离的多肽由用SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列组成。

在其他实施方案中，如本文定义的至少一种抗癌剂与Her2/neu受体、ER或PR相互作用。在另外的实施方案中，如本文定义的至少一种抗癌剂是化学治疗剂，优选地多柔比星或多柔比星衍生物、顺铂、紫杉醇或反应性氧物质(ROS)诱导剂。

本公开内容通过其另一个方面提供了一种用于使有相应需要的患者中的癌细胞对至少一种抗癌剂敏感的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述分离的多肽调节所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达，从而使所述癌细胞对所述至少一种抗癌剂敏感。在一些实施方案中，用于使癌细胞对至少一种抗癌剂敏感的方法还包括向所述患者施用如本文定义的所述至少一种抗癌剂。

在多种实施方案中，本公开内容的分离的多肽和/或所述至少一种抗癌剂被包含在药物组合物中，所述药物组合物任选地还包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

在一些实施方案中，根据本公开内容的方法是其中在本公开内容的至少一种抗癌剂的施用之前、与本公开内容的至少一种抗癌剂的施用同时地或在本公开内容的至少一种抗癌剂的施用之后施用如本文定义的分离的多肽的方法。

本公开内容通过其仍另一个方面提供了一种分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽和至少一种抗癌剂用于在治疗有相应需要的患者中的癌症的方法中使用，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物。

仍另外地，本公开内容提供了一种分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽和至少一种抗癌剂用于在治疗有相应需要的患者中的三阴性乳腺癌(TNBC)的方法中使用，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物。

本公开内容还提供了一种分离的多肽，所述分离的多肽用于在使有相应需要的患者中的癌细胞对至少一种抗癌剂敏感的方法中使用，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述分离的多肽调节所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达，从而使所述癌细胞对所述至少一种抗癌剂敏感。在一些特定实施方案中，根据本发明的分离的多肽和至少一种抗癌剂用于在使癌细胞对至少一种抗癌剂敏感的方法中使用，其中所述方法还包括向所述患者施用所述至少一种抗癌剂。

仍另外地，本公开内容提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)分离的多肽和任选地药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物；

(ii)抗癌剂和任选地药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

在一些实施方案中，根据本公开内容的试剂盒还包含使用说明书。

在多种实施方案中，如本文定义的试剂盒用于在治疗有相应需要的患者中的癌症的方法中使用。

附图简述

为了更好地理解本文公开的主题并且例示在实践中可以如何实施所述主题，现在将参考附图仅通过非限制性实例的方式描述实施方案，在附图中：

图1A-图1D：MDA-MB-231细胞中的HER2的FACS分析

这些图示出了未处理的MDA-MB-231细胞(对照细胞，图1A)或在用100μg/ml(图1B)和250μg/ml(图1C)的两个剂量的APC1处理后的MDA-MB-231细胞上的HER2受体表达的FACS分析图。在第一次施用的情况下将细胞孵育24小时，并且在第二次施用的情况下孵育72小时。图1D示出了不存在APC1时N87细胞上的HER2表达的阳性对照。

图2A-图2B：施用APC1的MDA-MB-231细胞的免疫荧光

这些图示出了在单个剂量的APC1(250μg/ml)不存在(图2A)或存在(图2B)下被孵育48小时的MDA-MB-231细胞的免疫荧光显微照片。HER2表示使用针对HER2的抗体的免疫荧光；DAPI表示DAPI染色的免疫荧光；并且合并(Merge)表示HER2和DAPI两者的免疫荧光。

图3A-图3B：施用多个剂量的APC1的MDA-MB-231细胞的免疫荧光

这些图示出了在多个剂量的APC1(各自为250μg/ml)不存在(图3A)或存在(图3B)下被孵育144小时、96小时和72小时的MDA-MB-231细胞的免疫荧光显微照片。HER2表示使用针对HER2的抗体的免疫荧光；DAPI表示DAPI染色的免疫荧光；合并表示HER2和DAPI两者的免疫荧光。

图4A-图4B：施用APC1的MDA-MB-468细胞的免疫荧光

这些图示出了在多个剂量的APC1(各自为100μg/ml)不存在(图4A)或存在(图4B)下被孵育24小时和72小时的MDA-MB-468细胞的免疫荧光显微照片。HER2表示使用针对HER2的抗体的免疫荧光；DAPI表示DAPI染色的免疫荧光；合并表示HER2和DAPI两者的免疫荧光。

图5A-图5B：施用APC1和Kadcyla的MDA-MB-231细胞的凋亡分析

这些图示出了首先施用APC1(250μg/ml的两个剂量，各剂量随后分别为24小时和72小时的孵育)，并然后施用5μg/ml或10μg/ml的Kadcyla持续72小时(图5A)或5μg/ml、10μg/ml或25μg/ml的Kadcyla持续72小时(图5B)的MDA-MB-231细胞的凋亡百分比的柱状图。细胞还在存在指定浓度的APC1(如上文详述的)或Kadcyla情况下被孵育。缩写：对照，未处理；Kad，Kadcyla。

图6：施用APC1和Kadcyla的MDA-MB-231细胞在延长孵育的情况下的凋亡分析

柱状图示出了首先施用APC1(250μg/ml的两个剂量，各剂量随后分别为24小时和72小时的孵育)并然后施用5μg/ml、10μg/ml或25μg/ml的Kadcyla持续96小时的MDA-MB-231细胞的凋亡百分比。细胞还在存在指定浓度的APC1(如上文详述的)或Kadcyla的情况下被孵育。缩写：对照，未处理；Kad，Kadcyla。

图7：施用APC1和Kadcyla的BTS49细胞和MDA-MB-468细胞的凋亡分析

柱状图示出了首先施用APC1(250μg/ml的两个剂量，各剂量随后分别为24小时和72小时的孵育)，并然后施用5μg/ml、10μg/ml或25μg/ml的Kadcyla持续96小时的BTS49细胞和MDA-MB-468细胞的凋亡百分比。细胞还在存在指定浓度的APC1(如上文详述的)或Kadcyla的情况下被孵育。缩写：对照，未处理；Kad，Kadcyla。

图8A-图8B：来自裸鼠的MDA-MB-231肿瘤的HER2免疫组织化学

这些图示出了从Balb/C裸鼠获得的MDA-MB-231肿瘤切片的免疫荧光显微照片，所述Balb/C裸鼠进行了MDA-MB-231肿瘤注射且施用了多次APC1施用(每次以350μg/小鼠的剂量)。HER2，使用针对HER2的抗体的免疫荧光；DAPI，DAPI染色的免疫荧光；合并表示HER2和DAPI两者的免疫荧光。

图9：施用APC1和赫赛汀(Herceptin)的MDA-MB-468细胞的凋亡分析

柱状图示出了在没有任何处理(对照)、在施用赫赛汀(12μg/ml)、APC1(250μg/ml)后或在施用以上量的APC1和赫赛汀后的MDA-MB-468细胞的凋亡水平。还示出了在存在和不存在赫赛汀(100μg/ml)时N87细胞的凋亡水平。

图10：施用APC1的MDA-MB-231细胞的细胞膜上的Notch3受体水平

柱状图示出了施用APC1(250μg/ml)持续1小时(第2道)、3小时(第3道)、5小时(第4道)或24小时(第5道)的MDA-MB-231细胞的细胞膜上的Notch3受体水平(示出了任意密度单位)。第1道是对照。

图11A-图11C：施用APC1和他莫昔芬(tamoxifen)(孵育24小时)的MDA-MB-231细胞的存活力

柱状图示出了在培养基(指示为“0”)或10nM、50nM或100nM他莫昔芬存在下被孵育24小时的MDA-MB-231细胞(图11A)、经APC1处理的MDA-MB-231细胞(图11B)和用抗PRT3处理的MDA-MB-231细胞(图11C)的细胞存活力(使用刃天青测定)。对照，未处理。

图12A-图12C：施用APC1和他莫昔芬(孵育48小时)的MDA-MB-231细胞的存活力分析

柱状图示出了在培养基(指示为“0”)或10nM、50nM或100nM他莫昔芬存在下被孵育48小时的MDA-MB-231细胞(图12A)、经APC1处理的MDA-MB-231细胞(图12B)或用抗PRT3处理的MDA-MB-231细胞(图12C)的细胞存活力(刃天青测定)。对照，未处理。

图13：与APC1一起孵育的MDA-MB-231细胞中的ERα表达的蛋白质印迹分析

该图示出了在用APC1(250μg/ml)每周一次持续一周(从左侧起泳道3至7)或每周两次持续3周或4周(从左侧起泳道9、10)处理的MDA-MB-231细胞中，在指定时间点用抗雌激素受体α(ERα)抗体测定的雌激素受体α表达的蛋白质印迹分析。缩写：M，蛋白质标志物；c，对照；h，小时；w，周。

图14A-图14B：用APC1和化学治疗剂处理TNBC细胞

这些图示出了用APC1预处理并然后在指定浓度的多柔比星(图14A)或顺铂(图14B)存在下孵育的MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞的相对细胞存活力。缩写：Dox，多柔比星；CisPt，顺铂。

图15：APC1和多柔比星对人TNBC肿瘤的作用

该图示出了用TNBC细胞接种并用APC1(15mg/kg，每周3次持续多达5周)、多柔比星(3mg/kg，每周一次)或用APC1和多柔比星(15mg/kg APC1，每周两次和3mg/kg多柔比星，每周一次)处理的裸鼠中的相对肿瘤体积。对照组小鼠用盐水(saline)处理。

图16：APC1和多柔比星对人卵巢癌肿瘤的作用

该图示出了用人卵巢癌细胞(OV90)接种并用APC1(15mg/kg，每周3次持续多达5周)、多柔比星(3mg/kg，每周一次)或用APC1和多柔比星(15mg/kg APC1，每周两次和3mg/kg多柔比星，每周一次)处理的裸鼠中的相对肿瘤体积。对照组小鼠用盐水处理。

图17：APC1和多柔比星对人胰腺癌肿瘤的作用

该图示出了用人胰腺癌细胞(Panc1)接种并用APC1(15mg/kg，每周3次，持续多达5周)、多柔比星(3mg/kg，每周一次)或用APC1和多柔比星(15mg/kg APC1，每周两次和3mg/kg多柔比星，每周一次)处理的裸鼠中的相对肿瘤体积。对照组小鼠用盐水处理。

图18A-图18C：APC1对人癌细胞中的谷胱甘肽水平的影响

这些图示出了用指定浓度的APC1处理的人卵巢癌细胞(图18A)、人胰腺癌细胞(图18B)和人TNBC细胞(图18C)中的相对谷胱甘肽水平。

实施方案的详细描述

本发明基于这样的令人惊讶的发现：施用由氨基酸序列EKGAAFSPIYPRRK(由SEQID NO:1表示)组成的、在本文中被称为“APC1”的多肽增加了癌细胞对广谱抗癌剂的敏感性，并且因此所述多肽可用作抗癌剂(药物)的治疗效果的增强剂(augmenter)。

如下文的实施例中详述的，向三阴性乳腺癌(TNBC)细胞施用多肽APC1增加了TNBC细胞上的人表皮生长因子受体2(HER2)受体以及雌激素受体的表达。

TNBC尤其根据雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)的表达的缺乏(或至少表达减少)所定义。在不存在特定治疗靶的情况下，TNBC被认为是具有有限的治疗选择的侵袭性癌症亚型。如下文证明的，施用APC1增加了细胞表面的HER2和雌激素受体的表达，并且因此不希望受理论束缚，使得经处理的细胞对基于HER2的抗癌疗法更敏感(或更易响应于基于HER2的抗癌疗法)。

为了检查APC1和基于HER2的抗癌疗法对TNBC细胞(其通常被认为对基于HER2的靶向抗癌疗法不敏感)的组合效果，首先向TNBC细胞施用APC1，并且然后施用特定的抗癌剂例如Kadcyla，如下文的实施例中描述的。Kadcyla是一种抗体-药物缀合物(ADC)，其将针对HER2的抗体曲妥珠单抗和化学治疗剂emtansine(DM1)的作用机制组合在一种药物中。

如图5A中展示的，如预期的，由于施用Kadcyla而引起的MDA-MB-231细胞的凋亡水平是相对低的。令人惊讶的是，在用APC1和Kadcyla两者处理的细胞中，凋亡水平是用单独的Kadcyla处理的细胞中的至少2.5倍大。此外，还展示出用APC1处理的小鼠中的MDA-MB-231肿瘤细胞中HER2受体的表达，如下文的实施例所示。

另外，如例如在图11B中所示，相对于仅用他莫昔芬处理的细胞，在用APC1预处理并然后用他莫昔芬(一种选择性雌激素受体调节剂(SERM))处理的TNBC细胞中，细胞存活力降低，这意味着在经处理的细胞上雌激素受体的表达增加。雌激素受体表达的增加还在图13中被直接证明。

令人惊讶的是，将APC1施用至TNBC细胞(图14)以及用多种癌症类型的肿瘤接种的小鼠(图15、图16和图17)，当也向这些细胞施用多柔比星或顺铂时，分别导致细胞存活力降低和肿瘤体积减小。

综上，上文的结果(其在下文被进一步详述)证明，APC1增加了癌细胞对广谱抗癌剂的敏感性并且因此可用作抗癌剂的治疗效果的增强剂。

因此，本公开内容提供了一种用于治疗有相应需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽包含由SEQ IDNO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物。

本公开内容通过其另一个方面提供了一种分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽和至少一种抗癌剂用于在治疗有相应需要的患者中的癌症的方法中使用，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物。

公布WO 2009/083968(3)先前已示出被称为“KTPAF50”的多肽及其片段与白血病和前列腺癌细胞的存活力降低相关，并且还与阻止小鼠中的肿瘤生长相关。

如WO 2009/083968(3)中示出的，全长KTPAF50多肽的长度为74个氨基酸残基，并且具有氨基酸序列MPGHSRLLSILVSGLCVVGSSIGVLRRREQAERGSRRCAIAGEERAMLSPSPLPETPFSPEKGAAFSPIYPRRK(在本文中由SEQ ID NO：2表示)。在WO 2009/083968中描述的KTPAF50的片段是缺乏KTPAF50的N末端24个氨基酸残基(信号序列)的多肽，该多肽在本文中由SEQ IDNO:3表示并且该多肽具有LRRREQAERGSRRCAIAGEERAMLSPSLPETPFSPEKGAAFSPIYPRRK的氨基酸序列。

本公开内容现在示出，将APC1肽自身施用至多种类型的细胞导致这些细胞不显著(如果有的话)的凋亡，即对细胞存活力没有影响(图5A和图5B)，该APC1肽由肽KTPAF50的14个C末端氨基酸残基组成，具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列EKGAAFSPIYPRRK。然而，施用APC1与另外的抗癌剂(例如Kadcyla或赫赛汀)导致TNBC MDA-MB-231细胞的凋亡。换句话说，在APC1肽的存在下，细胞对Kadcyla的响应性增加，这种效果还在图6和图7中展示出。增加的响应性还针对赫赛汀(针对HER2受体的另外的剂)(图9)以及针对他莫昔芬(图11和图12)、多柔比星(例如图14A)和顺铂(例如图14B)展示出。

因此，在一些实施方案中，如本文定义的分离的多肽增加所述患者对所述至少一种抗癌剂的响应性。

在特定实施方案中，本公开内容提供了一种用于治疗有相应需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述分离的多肽增加所述患者对所述至少一种抗癌剂的响应性。

在其他实施方案中，本公开内容提供了一种分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽和至少一种抗癌剂用于在治疗有相应需要的患者中的癌症的方法中使用，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述分离的多肽增加所述患者对所述至少一种抗癌剂的响应性。

在本公开内容的上下文中，术语“增加响应性”或“增加的响应性”是指由于治疗的患者的总体结果(例如改善)，其可以使用本发明领域中的技术人员已知的任何临床参数评估。响应性的增加可以通过将在如本文定义的分离的多肽存在和不存在的情况下特定抗癌疗法对从患者获得的细胞样品的效果进行比较来评估。

更具体地，与对照、未处理的细胞或生物体的相应比率相比，响应性可以增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或约1000％。

可以通过本领域已知的任何方法，例如通过评估肿瘤标志物或通过计算机轴断层摄影术(CT)或磁共振成像(MRI)评估肿瘤尺寸来进行响应性的评估。

如下文例如图5中所示，在APC1不存在的情况下，细胞对Kadcyla的治疗的响应较小。因此，在一些实施方案中，当在没有所述分离的多肽的情况下进行施用时，患者如本文定义的对所述抗癌剂无响应。换句话说，当被单独施用时，患者如本文定义的可能对所述抗癌剂无响应。

在特定实施方案中，本公开内容提供了一种用于治疗有相应需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中当在没有所述分离的多肽的情况下进行施用时，所述患者对所述抗癌剂无响应。

在另外的具体实施方案中，本公开内容提供了一种分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽和至少一种抗癌剂用于在治疗有相应需要的患者中的癌症的方法中使用，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中当在没有所述分离的多肽的情况下进行施用时，所述患者对所述抗癌剂无响应。

如本文使用的术语“无响应”意指所述患者对特定的抗癌治疗具有边际(如果有的话)益处或反应。如上文指示的，可以通过本领域已知的任何方法，例如通过评估肿瘤标志物或通过计算机轴断层摄影术(CT)或磁共振成像(MRI)评估肿瘤尺寸来评估对治疗的响应性。

如本文所示，施用APC1增加了癌细胞对多种抗癌剂(仅举几例，即，Kadcyla、赫赛汀)的敏感性。不希望受理论束缚，施用APC1调节了细胞靶(本文中被称为“细胞部分”)的表达。

因此，在一些实施方案中，根据本发明的分离的多肽调节所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达。在特定实施方案中，本公开内容包括一种用于治疗有相应需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述分离的多肽调节所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达。

在另外的具体实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽和至少一种抗癌剂用于在治疗有相应需要的患者中的癌症的方法中使用，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述分离的多肽调节所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达。

如本文使用的术语“调节”意指改变、增加或降低如本文定义的至少一种细胞部分的活性。

在本公开内容的上下文中，术语“癌细胞”意指包括本领域已知的任何细胞类型和任何癌症类型。

如下文详述的，施用APC1增加了细胞表面的HER2表达以及雌激素受体的表达，并且因此不希望受理论束缚，使得经处理的细胞对靶向HER2的治疗更敏感(或易受所述治疗影响)。此外，下文已示出，卵巢癌细胞、胰腺癌细胞和TNBC癌细胞中的谷胱甘肽水平在用APC1处理这些细胞后降低。

因此，在一些实施方案中，如本文定义的分离的多肽增加或减少所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达。

在其他特定实施方案中，如本文定义的分离的多肽增加所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达。

如本文定义的术语“细胞部分”包括可被抗癌剂靶向的任何细胞分子或其片段。

在本公开内容的上下文中，术语“增加表达”是指所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分或其片段的转录速率、翻译速率、蛋白质和/或mRNA稳定性、基因产物量以及蛋白质和/或mRNA成熟的升高(escalation)、提高(rise)或增加(increment)。更具体地，与对照、未处理的细胞或生物体的相应比率相比，表达可以增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或约1000％。

相反，在本公开内容的上下文中，术语“减少表达”是指所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分或其片段的转录速率、翻译速率、蛋白质和/或mRNA稳定性、基因产物量以及蛋白质和/或mRNA成熟的下降(decline)、减少(reduction)或缩小(constriction)。更具体地，与对照、未处理的细胞或生物体的相应比率相比，表达可以减少至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或约1000％。

如本文定义的细胞部分的表达的增加或减少可以通过本领域已知的任何方法例如但不限于下文例示的方法来监测。

如随附实施例中所示，施用APC1调节细胞受体(即HER2和雌激素受体)以及谷胱甘肽的表达。已知HER2与癌细胞增殖(生长)和转移(扩散)的控制相关。如本领域已知的，谷胱甘肽调节细胞在应激条件下增殖的能力，其中反应性氧物质(ROS)在肿瘤附近产生并且谷胱甘肽抑制其损伤。此外，谷胱甘肽还与药物耐受性机制相关，并且因此可以抑制化学治疗剂的活性。

因此，在一些实施方案中，根据本公开内容的细胞部分与癌细胞的生长、调节或扩散中的至少一种相关。特别地，根据本公开内容的细胞部分与癌细胞生长的增加或减少相关。

在一些实施方案中，如本文定义的细胞部分是细胞内分子部分(即存在于细胞内)，而在其他实施方案中，细胞部分是存在于所述癌细胞的细胞表面的部分(即可在细胞表面获得)。在仍另外的实施方案中，细胞部分或其片段嵌入细胞膜，以这样的方式使得其至少一个片段驻留于细胞内并且其至少另一个片段存在于细胞表面。

因此，在另外的实施方案中，如本文定义的细胞部分存在于所述癌细胞的细胞表面，或者是细胞内部分。

在另外的具体实施方案中，根据本公开内容的细胞部分是受体、多肽、酶、转录因子或衔接分子。

如本领域已知的，术语“受体”是指嵌入细胞内或细胞表面的分子结构，其特征在于选择性结合特定物质和由该结合产生的特定生理学作用。本公开内容包括的受体的非限制性实例是，仅举几例，雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、人表皮生长因子受体2(HER2/neu受体)、表皮生长因子受体(EGFR)、雄激素受体或ST2。

在具体实施方案中，根据本公开内容的细胞部分是细胞表面受体。

如本文提及的术语“细胞表面受体”(也被称为“膜受体”或“跨膜受体”)涉及嵌入细胞膜中的尤其通过结合细胞外分子(或与细胞外分子相互作用)在细胞信号传导中起作用的受体。细胞外分子，除其他以外，可以是激素、神经递质、细胞因子、生长因子、细胞粘附分子或营养物，它们与受体反应以诱导细胞的代谢和活性的变化。细胞表面受体的非限制性实例是，仅举几例，人表皮生长因子受体2(HER2/neu受体)、雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)。

在另外的具体实施方案中，如本文定义的分离的多肽增加所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达，并且所述细胞部分是受体(例如细胞表面受体)。

在另外的特定实施方案中，本公开内容包括一种用于治疗有相应需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述分离的多肽增加所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达，并且其中所述细胞部分是受体。

在仍另外的实施方案中，本公开内容包括一种分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽和至少一种抗癌剂用于在治疗有相应需要的患者中的癌症的方法中使用，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述分离的多肽增加所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达，并且其中所述细胞部分是受体。

在多种具体实施方案中，根据本公开内容的分离的多肽增加所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达，并且所述细胞部分是细胞表面受体，优选地人表皮生长因子受体2(HER2)、雌激素受体(ER)或孕酮受体(PR)。

如上文详述的，如本文定义的细胞部分可以是受体、多肽、酶、转录因子或衔接分子。

如本领域已知的，术语“多肽”是指氨基酸残基的分子链，并且如本领域已知的，术语“酶”是指具有特征性氨基酸序列的多肽(或蛋白质)分子，其折叠产生特定的三维结构，所述三维结构赋予分子独特的性质。本公开内容所包括的多肽的非限制性实例是程序性细胞死亡配体1(PD-L1)、程序性细胞死亡配体2(PD-L2)和与谷胱甘肽的合成相关的酶和/或多肽。

如本文定义的术语“转录因子”是指通过结合特定的DNA序列控制遗传信息从DNA向信使RNA转录的速率的一种分子(或更多种分子)。

如本文使用的术语“衔接分子”是指能够与另一个分子物理上相互作用并能够改变其生物活性的分子。衔接分子的非限制性实例是具有结构(2S)-2-氨基-4-{[(1R)-1-[(羧甲基)氨甲酰基]-2-氢硫基乙基]氨甲酰基}丁酸的谷胱甘肽(GSH)和含有SH2和/或SH3结构域的分子。

在仍另外的实施方案中，本公开内容的细胞部分是人表皮生长因子受体2(HER2/neu受体)、雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、谷胱甘肽(GSH)、表皮生长因子受体(EGFR)、雄激素受体、B淋巴细胞抗原分化簇CD20(CD20)、分化簇33(CD33)、程序性细胞死亡配体(PD-L)或ST2受体中的至少一种。

如本文定义的术语“雌激素受体”(ER)是指在细胞内部和表面发现的一组蛋白质。这些受体由激素雌激素(也被称为17β-雌二醇)激活。存在两类ER：核雌激素受体(ERα和ERβ)，其是细胞内受体的核受体家族的成员；以及膜雌激素受体(mER，即GPER(GPR30)、ER-X和Gq-mER)，其主要是G蛋白偶联受体。一旦被雌激素激活，ER能够移位到核中并且与DNA结合以调节不同基因的活性(即它是DNA结合转录因子)。ER受体还具有独立于DNA结合的另外的功能。将癌细胞(特别是乳腺癌细胞)调节为ER阳性细胞的益处是本领域已知的，因为ER阳性细胞对雌激素(以及对其拮抗剂和/或激动剂)敏感并且可以响应于激素疗法。可被施用至被诊断为具有ER阳性的乳腺癌细胞的患者的治疗剂的非限制性实例是他莫昔芬或任何其他选择性雌激素受体调节剂(SERM)。

如本领域已知的，术语“他莫昔芬”涉及抗肿瘤选择性雌激素受体调节剂(SERM)激素疗法。他莫昔芬(2-[4-[(Z)-1,2-二苯基丁-1-烯基]苯氧基]-N,N-二甲基乙胺)在乳腺组织中充当抗雌激素(抑制剂)，但在胆固醇代谢、骨密度和子宫内膜的细胞增殖中充当雌激素(刺激剂)。他莫昔芬竞争性地抑制雌二醇与雌激素受体的结合，从而防止受体结合DNA上的雌激素响应元件。结果是DNA合成和对雌激素的细胞响应减少。他莫昔芬尤其用于降低早期激素-受体-阳性乳腺癌在手术和其他治疗之后复发(coming back)的风险，缩小手术之前的大的激素-受体-阳性乳腺癌，并且治疗晚期激素-受体-阳性乳腺癌，包括转移性乳腺癌。

术语“孕酮受体”(PR，尤其也被称为NR3C3)是指在细胞内发现的蛋白质。它被类固醇激素孕酮激活。在人中，PR由单个PGR基因编码。它具有两种主要形式，PRA和PRB，它们的分子量不同。也存在第三种较不为人知的同种型(PRC)。孕酮是诱导孕酮受体所必需的。当不存在结合激素时，羧基末端抑制转录。与激素结合诱导结构改变，这消除抑制作用。孕酮拮抗剂防止结构重构。在孕酮与受体结合之后，随后二聚化重组，并且复合物进入核并结合DNA。在那里转录发生，导致信使RNA的形成，信使RNA被核糖体翻译以产生特定的蛋白质。

将癌细胞(特别是三阴性乳腺癌细胞)调节为PR阳性细胞的益处是本领域已知的，因为PR阳性细胞对孕酮(以及对其拮抗剂和/或激动剂)敏感并且可以响应于激素疗法。

特别地，增加孕酮受体的表达可以使得能够将PR阳性细胞靶向选择性孕酮受体调节剂(SPRM)，其是一种作用于孕酮受体的剂。SPRM可以与完全受体激动剂(诸如孕酮)和完全拮抗剂(诸如阿来司酮(aglepristone))区分开，因为它们的作用在不同组织中不同，即它们在一些组织中充当激动剂，而在其他组织中充当拮抗剂。这种混合的作用概况以组织特异性方式导致刺激或抑制。

如上文指示的，HER2表达的增加在APC1存在下在被视为TNBC的细胞中展示出，并且因此本公开内容尤其涉及施用APC1(由SEQ ID NO:1表示)和针对HER2的抗癌剂(例如Kadcyla或赫赛汀)的组合以用于治疗三阴性乳腺癌。

如本领域已知的“人表皮生长因子受体2”(也被称为NEU、NGL、HER2、TKR1、HER-2、c-erb B2和HER-2/neu)由人表皮生长因子受体2基因(ERBB2)编码，该基因在约18％至20％的乳腺癌中被扩增。扩增是HER2过表达的主要机制，并且在这些肿瘤中发现异常高水平的具有酪氨酸激酶活性的185-kd糖蛋白。HER2过表达与患有乳腺癌的患者的临床结果相关。存在HER2状态的几种可能的用途，尤其是评估预后和预测几种系统疗法的响应性。因此，HER2状态可能被并入推荐的抗癌疗法类型的临床决策(具有其他预后因素)中。重要的是，几项研究已表明，靶向HER2的剂在转移性和佐剂环境两者中均显著有效。例如，曲妥珠单抗(赫赛汀)，一种人源化单克隆抗体，当在HER2阳性患者的转移性乳腺癌中单独使用或添加到化学疗法时改善响应速率、进展时间和甚至存活率。

如本领域已知的，术语“谷胱甘肽”(GSH，谷胱甘肽(γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酰甘氨酸))是指含有小的氨基酸的分子(肽)，小的氨基酸包括L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸。该分子在食物供应和人体中发现，在食物供应和人体中它充当抗氧化剂。“谷胱甘肽系统”包括在细胞内合成谷胱甘肽的酶和使用谷胱甘肽作为发挥抗氧化剂作用的手段的酶。谷胱甘肽也与多药耐受性相关。先前已示出烷化剂、放射疗法和顺铂之间的耐受性和交叉耐受性与细胞GSH水平的升高相关。

如本领域已知的和如本文使用的术语“表皮生长因子受体”(EGFR、ErbB1或HER1)是指表皮生长因子受体酪氨酸激酶(ErbB)家族的成员，其在调节细胞增殖、存活、分化和迁移中发挥重要作用。ErbB受体的调节的损失是许多人类疾病(最显著地癌症)的基础。EGFR是单链跨膜糖蛋白，其由细胞外配体结合胞外域、跨膜结构域、短近膜区(shortjuxtamembrane section)、酪氨酸激酶结构域和含酪氨酸的C末端尾组成。可溶性配体与受体的胞外域的结合促进受体之间的同二聚体和异二聚体形成。受体二聚化对细胞内酪氨酸激酶结构域的激活和C末端尾的磷酸化是必需的。然后磷酸酪氨酸残基直接地或通过信号传导途径的下游组分衔接体蛋白(adaptor protein)激活。EGFR是靶向抗癌剂的合理设计的靶。靶向EGFR的抗癌剂是本领域熟知的，并且尤其包括埃罗替尼盐酸盐(Tarceva)、拉帕替尼(Tykerb)、西妥昔单抗(Erbitux)、帕尼单抗(Vectibix)或吉非替尼(Iressa)。

如本领域已知的术语“雄激素受体”是指具有3个主要功能结构域(N末端结构域、DNA结合结构域和雄激素结合结构域)的蛋白质。该蛋白质起类固醇激素激活转录因子的作用。在结合激素配体后，受体从辅助蛋白中解离，移位到核中，二聚化，并且然后刺激雄激素响应性基因的转录。雄激素受体牵涉多种癌症，多种癌症中的是前列腺癌和乳腺癌。特定剂靶向雄激素受体是本领域熟知的。

如本领域已知的和本文中使用的“B淋巴细胞抗原分化簇CD20”(CD20)是指在所有B细胞的表面表达的激活的糖基化磷蛋白。B淋巴细胞表面分子在B细胞发育和分化成浆细胞中发挥作用。CD20是多种单克隆抗体的靶，所述单克隆抗体尤其利妥昔单抗(rituximab)、obinutuzumab、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)和托西莫单抗(tositumomab)，它们都是治疗所有B细胞淋巴瘤和白血病的活性剂。

如本领域已知的和本文中使用的术语“分化簇33”(CD33)是指在髓系细胞上表达的跨膜受体。它通常被认为是骨髓特异性的，但它也可以在一些淋巴细胞上发现。它结合唾液酸，因此是SIGLEC凝集素家族的成员。

如本领域已知的，术语“程序性细胞死亡配体(PD-L)”是指程序性细胞死亡受体的配体。程序性细胞死亡配体的非限制性实例是PD-L1和PD-L2。

如本文定义的术语“ST2受体”或T1/ST2受体(也被称为“T1/ST2”和“ST2/T1”)是指IL-IR超家族的成员，其具有三个细胞外免疫球蛋白结构域和一个细胞内TIR结构域。

应当认识到，通过施用本发明的分离的多肽调节如本文定义的任何细胞部分或其片段的表达经由改变细胞对多种抗癌剂的响应性扩展了有相应需要的患者的抗癌治疗选择。

根据美国癌症协会(American Cancer Society)，直到20世纪90年代末，除了激素治疗，癌症疗法由通过杀死增殖细胞起作用的细胞毒性剂(化学治疗药物)组成。这些剂也影响正常细胞，但程度较小。与传统的化学治疗药物相比，靶向疗法通过影响控制癌细胞的生长、分裂和扩散的过程以及引起癌细胞自然死亡的信号来起作用。靶向疗法在多种途径中起作用。

术语“抗癌剂”在本文中以其最宽泛的意义使用，并且是指本领域已知用于治疗癌症和控制癌性细胞生长的任何抗癌药物或抗肿瘤药物。在多种实施方案中，抗癌剂是靶向细胞部分或其片段的抗癌剂，并且是指通过与至少一种参与癌症的生长、进展和扩散的特定分子或部分(也被称为“分子靶”)相互作用来阻断癌症的生长和/或扩散的药物(分子)。靶向癌症疗法有时被称为“分子靶向药物”、“分子靶向疗法”或“精准医疗(precisionmedicines)”。

在一些实施方案中，本公开内容的抗癌剂是靶向治疗剂，即靶向细胞分子、部分或其片段的抗癌剂，其驻留在细胞内或细胞表面(至少部分地)。

靶向疗法与标准化学疗法不同之处在于其作用于与癌症相关的特定分子靶(或如本文定义的“细胞部分”)，而大多数标准化学疗法作用于所有快速分裂的正常细胞和癌性细胞。

如本文的实施例中展示的，向TNBC细胞施用多肽APC1增加TNBC细胞中的人表皮生长因子受体2(HER2)受体和雌激素受体α的表达，使得这些细胞对基于HER2或ER的抗癌疗法更敏感。

因此，在一些实施方案中，根据本公开内容的所述至少一种抗癌剂与所述至少一种细胞部分直接地或间接地相互作用。

在特定实施方案中，本公开内容提供了一种用于治疗有相应需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述分离的多肽增加或减少所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达，并且其中所述至少一种抗癌剂与所述至少一种细胞部分直接地或间接地相互作用。

在其他实施方案中，本公开内容提供了一种分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽和至少一种抗癌剂用于在治疗有相应需要的患者中的癌症的方法中使用，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述分离的多肽增加或减少所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达，并且其中所述至少一种抗癌剂与所述至少一种细胞部分直接地或间接地相互作用。

如本文在抗癌剂的上下文中使用的术语“与……相互作用”意指直接地或间接地与靶连接或接触，以便改变靶(细胞部分)的活性，仅通过实例的方式，包括增强靶的活性、抑制靶的活性、限制靶的活性或扩展靶的活性。

存在多种类型的靶向癌症治疗剂，例如，仅举几例，生长信号抑制剂、血管生成抑制剂和凋亡诱导药物。在本公开内容的方法和其他方面的一些实施方案中，至少一种抗癌剂直接地或间接地抑制所述患者的癌细胞的生长或扩散中的至少一种。

在具体实施方案中，如本文定义的至少一种抗癌剂直接地或间接地抑制所述患者的癌细胞的生长或扩散中的至少一种。

如本文使用的术语“生长”是指细胞质体积、细胞发育和细胞繁殖的增加，以及细胞的尺寸或群体的增加。在癌细胞的上下文中，术语“扩散”涉及癌细胞转移和能够实现或导致转移的多种细胞过程。如本文提及的术语“抑制(inhibits)”或“抑制(inhibition)”涉及将癌细胞的生长或扩散中的至少一种阻滞或减少约1％至5％、约5％至10％、约10％至15％、约15％至20％、约20％至25％、约25％至30％、约30％至35％、约35％至40％、约40％至45％、约45％至50％、约50％至55％、约55％至60％、约60％至65％、约65％至70％、约75％至80％、约80％至85％、约85％至90％、约90％至95％、约95％至99％、或约99％至99.9％中的任一值。

在另外的具体实施方案中，如本文定义的至少一种抗癌剂与所述至少一种细胞部分直接地或间接地相互作用，其中所述细胞部分是细胞表面受体。

特别地，本公开内容包括一种用于治疗有相应需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽包含由SEQ IDNO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述分离的多肽增加所述患者的细胞中的至少一种细胞表面受体的表达，并且其中所述至少一种抗癌剂与所述至少一种细胞表面受体直接地或间接地相互作用。

在另外的实施方案中，本公开内容包括一种分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽和至少一种抗癌剂用于在治疗有相应需要的患者中的癌症的方法中使用，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述分离的多肽增加所述患者的细胞中的至少一种细胞表面受体的表达，并且其中所述至少一种抗癌剂与所述至少一种细胞表面受体直接地或间接地相互作用。

在多种实施方案中，根据本公开内容的抗癌剂是免疫治疗剂、化学治疗剂、信号转导抑制剂、受体抑制剂、基因表达调节剂、凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、激素治疗剂、代谢抑制剂、抗自噬剂(例如博来霉素或多柔比星)、内质网应激诱导剂、反应性氧物质(ROS)诱导剂或其组合。

如下文例示的，在施用肽APC1后，多种免疫疗法抗癌剂的效果示出被增强或增大，所述抗癌剂例如针对人表皮生长因子受体2(HER2/neu受体)的抗体。

如本领域已知的，术语“免疫疗法”(也被称为“生物疗法(biologic therapy)”或“生物疗法(biotherapy)”)在癌症治疗的上下文中是指触发免疫系统以破坏癌细胞的治疗。目前用于治疗癌症的主要类型的免疫治疗剂尤其包括单克隆抗体、癌症疫苗和免疫检查点抑制剂。这些蛋白质有助于在检查中保持免疫响应，并且可以防止T细胞杀死癌细胞。当这些蛋白质被阻断时，免疫系统上的所谓的“刹车物(brake)”被释放，并且T细胞能够更好地杀死癌细胞。在T细胞或癌细胞上发现的检查点蛋白的实例包括PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/B7-2。

其他免疫治疗剂包括识别癌细胞表面的特定分子的单克隆抗体，其中单克隆抗体与靶分子的结合导致表达该靶分子(在本文中被称为“细胞部分”，例如细胞表面受体)的细胞的免疫破坏。

因此，在多种具体实施方案中，本公开内容的抗癌剂是免疫治疗剂，例如抗体、单克隆抗体或其任何片段或缀合物。

在其他实施方案中，根据本公开内容的抗癌剂是免疫治疗剂，优选地单克隆抗体或缀合抗体。在多种另外的实施方案中，如本文定义的单克隆抗体或缀合抗体针对表皮生长因子受体2(HER2)、雌激素受体(ER)或孕酮受体(PR)中的至少一种。在具体实施方案中，根据本公开内容的至少一种抗癌剂针对Her2/neu受体。在仍另外的实施方案中，单克隆抗体针对PD-L1。

术语“抗体”在本文中以其最宽泛的意义使用，并且是指由免疫球蛋白基因编码的多肽或其功能片段，其特异性结合和识别抗原并且包括单克隆抗体、多克隆抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)，并且还包括抗原结合抗体片段。这样的抗原结合片段可以是例如Fab和F(ab')₂，它们能够结合抗原。这样的片段可以通过本领域已知的任何方法，例如通过使用酶诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab')₂片段)的蛋白酶裂解来产生。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。

如本文定义的术语“单克隆抗体”(mAb)是指基本上同质的抗体群体，即构成该群体的个体抗体除了可少量存在的可能的天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体针对单一抗原位点(表位)。

单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法制备和纯化。例如，单克隆抗体可以通过从经免疫的动物(例如大鼠、小鼠或猴)的脾或淋巴结中获取的B细胞与永生化B细胞在有利于杂交细胞生长的条件下融合来制备。

如本文定义的术语“缀合抗体”(也被称为“免疫缀合物”)是指根据本发明的与另外的剂缀合(连接(linked)或连接(joined))的抗体或其任何抗原结合片段。可以通过本领域技术人员已知的任何方法，例如通过使另外的剂与根据本发明的抗体交联或通过重组DNA方法来制备免疫缀合物。

抗体的制备是本领域熟知的。在多种具体实施方案中，单克隆抗体，特别地缀合抗体Kadcyla递送可导致癌细胞死亡的毒性分子。Kadcyla(也被称为trastuzumab emtansine或ado-trastuzumab emtansine)是由与细胞毒性剂emtansine(DM1)连接的单克隆抗体曲妥珠单抗(也被称为赫赛汀)组成的抗体-药物缀合物。单独的曲妥珠单抗通过与HER2/neu受体结合阻止癌细胞的生长，而DM1进入细胞并通过与微管蛋白结合破坏细胞。与Her2结合的曲妥珠单抗防止受体的同二聚化或异二聚化(Her2/Her3)，最终抑制MAPK和PI3K/Akt细胞信号传导途径的激活。因为单克隆抗体靶向HER2，并且HER2仅在特定癌细胞中过表达，所以缀合物将毒素特异性地递送至肿瘤细胞。

因此，在仍另外的具体实施方案中，如本文定义的抗癌剂是针对HER2的单克隆抗体或缀合抗体。在另外的实施方案中，如本文定义的至少一种抗癌剂是Kadcyla或赫赛汀。

术语“信号转导抑制剂”是指阻断信号从一个分子传递到另一个的物质。阻断这些信号可影响许多细胞功能，包括细胞分裂和细胞死亡，并且因此可能杀死癌细胞。换句话说，信号转导抑制剂阻断参与信号转导的分子的活性，信号转导是细胞对来自其环境的信号作出响应的过程。在一些癌症中，恶性细胞被刺激以持续分裂而无需外部生长因子的促进。信号转导抑制剂干扰这种不适当的信号传导。

如本领域已知的术语“受体抑制剂”意指阻断或至少调节受体活性的任何物质。在一些非限制性实施方案中，受体抑制剂是指表皮生长因子受体家族成员的抑制剂，即阻断表皮生长因子受体(EGFR)家族成员的活性的物质。表皮生长因子受体在一些正常细胞的表面被发现，并且参与细胞生长。高水平的EGFR也可在某些类型的癌细胞上发现，EGFR导致这些细胞生长和分裂，而阻断EGFR可以抑制癌细胞生长。

本公开内容所包括的一些非限制性受体是，仅举几例，人表皮生长因子受体2(HER2/neu受体)、雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、表皮生长因子受体(EGFR)、雄激素受体、CD20或ST2。

在多种另外的实施方案中，如本文定义的抗癌剂(例如他莫昔芬、氟维司群)通过阻断雌激素受体起作用。

在具体实施方案中，根据本公开内容的至少一种抗癌剂与所述至少一种细胞部分直接地或间接地相互作用，其中所述至少一种细胞部分是细胞表面受体，例如HER2、ER和/或PR。在其他实施方案中，根据本公开内容的抗癌剂针对HER2、ER和/或PR。在仍另外的具体实施方案中，根据本公开内容的抗癌剂是受体抑制剂，优选地表皮生长因子受体(EGFR)的抑制剂。

如本文定义的术语“基因表达调节剂”是指与控制基因表达直接或间接相关的剂。

如本文使用的术语“凋亡诱导剂”意指导致癌细胞经历受控的细胞死亡过程，即凋亡的剂。凋亡诱导剂的一些非限制性实例包括，仅举几例，多柔比星、博来霉素、顺铂、氟尿嘧啶(5FU)。

具有结构(7S,9S)-7-[(2R,4S,5S,6S)-4-氨基-5-羟基-6-甲基氧杂环己-2-基]氧基-6,9,11-三羟基-9-(2-羟基乙酰基)-4-甲氧基-8,10-二氢-7H-并四苯-5,12-二酮的多柔比星(也被称为例如阿霉素或Doxil)是从波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)获得的抗肿瘤抗生素。多柔比星是蒽环类拓扑异构酶抑制剂，其插入DNA螺旋中的碱基对之间，从而防止DNA复制并最终抑制蛋白质合成。此外，多柔比星抑制拓扑异构酶II，这导致在DNA复制期间可裂解酶-DNA连接的复合物的增加和稳定，并且随后防止核苷酸链在双链断裂之后的连接。多柔比星还形成氧自由基(ROS)，导致继发于细胞膜脂质的脂质过氧化的细胞毒性。本公开内容包括多柔比星的任何衍生物。

顺铂(cisplatin、cisplatinum)或顺-二氯化二氨铂(cis-diamminedichloroplatinum)(II)(C_l2H₆N₂Pt)是用于治疗多种类型的癌症的基于铂的化学治疗药物，它是此类别中的第一个成员，现在还包括卡铂和奥沙利铂。

在具体实施方案中，本公开内容提供了一种用于治疗有相应需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述至少一种抗癌剂是凋亡诱导剂，优选地多柔比星、多柔比星衍生物或顺铂。

在另外的实施方案中，本公开内容提供了一种分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽和至少一种抗癌剂用于在治疗有相应需要的患者中的癌症的方法中使用，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述至少一种抗癌剂是凋亡诱导剂，优选地多柔比星、多柔比星衍生物或顺铂。

如本文使用的术语“血管生成抑制剂”是指阻断新血管生长出肿瘤(肿瘤血管生成)的剂。抑制血管生成的一些靶向疗法干扰血管内皮生长因子(VEGF)的作用，VEGF是刺激新血管形成的物质。

如本领域已知的和本文中使用的术语“激素治疗剂”是指阻止或至少减缓激素敏感性肿瘤的生长的剂，激素敏感性肿瘤需要某些激素才能生长。激素治疗剂通过防止身体产生激素或通过干扰激素的作用来起作用。激素治疗剂的实例包括但不限于用于治疗和预防乳腺癌的他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制剂和促黄体生成激素(LH)阻断剂以及用于治疗前列腺癌的促黄体生成激素-释放激素(LHRH)激动剂。

如本文使用的“代谢抑制剂”是指干扰癌细胞代谢的剂，例如，仅举几例，抑制糖酵解的剂(例如柔红霉素(也被称为道诺霉素)或紫杉醇(Paclitaxel))、抑制线粒体代谢的剂(例如紫杉醇或奥美拉唑)。

如下文的实施例中详述的，在预施用APC1后，癌细胞对多柔比星或顺铂的敏感性增加。多柔比星和顺铂尤其可以被归类为化学治疗剂。

如本领域熟知的，“化学治疗剂”用于治疗癌症，有时在数天至数周的时间段内与其他剂组合。这样的剂对具有高增殖速率的细胞是有毒性的。

因此，通过另外的实施方案，如本文定义的至少一种抗癌剂是化学治疗剂，优选地多柔比星或多柔比星衍生物、顺铂、紫杉醇或反应性氧物质(ROS)诱导剂。

如本文定义的术语“抗自噬剂”意指包括至少部分地抑制参与自噬的任何过程的任何剂。如本领域已知的，自噬是一种经由受损的细胞器和蛋白质的降解促进营养物再循环的过程，并且被认为是针对至少神经退行性疾病的细胞保护机制。然而，自噬抑制在多种癌症的治疗中是期望的(例如，氯喹(Chloroquine)或羟化氯喹(Hydroxychloroquine)与其他药物组合用于治疗多种肿瘤(neoplasm))。

如本文定义的术语“内质网应激诱导剂”意指包括增强或刺激内质网(ER)应激的任何剂。如本领域已知的，内质网(ER)起作用以正确折叠和加工分泌的蛋白和跨膜蛋白。破坏ER作用的剂导致ER腔内错误折叠的蛋白和未折叠的蛋白的积累，这种状况被称为“ER应激”。在无法解决的ER应激状况下，在多种类型的癌症的治疗中凋亡如期望的被促进。

反应性氧物质(ROS)，一组离子和分子，包括羟基自由基(·OH)、烷氧基自由基、超氧化物阴离子(O2·-)、单线态氧和过氧化氢(H₂O₂)，所有这些都是高反应性的化学物种。内源ROS主要在呼吸期间在线粒体中形成。虽然低水平的ROS在调节哺乳动物细胞的生物功能中发挥重要作用，但是ROS的过量产生可能通过对细胞内生物大分子的氧化损伤作用而导致细胞死亡。在多种类型的癌症的治疗中诱导细胞死亡是期望的，并且因此ROS作为抗肿瘤疗法发挥重要的作用。

事实上，一些抗癌药物，诸如分子靶向药物和化学治疗剂，通过诱导ROS产生来有效杀死癌细胞。此外，光动力疗法(PDT)主要基于诱导ROS爆发来杀死癌细胞。使用电离辐射的放射疗法诱导细胞死亡的机制也涉及ROS产生。因此，如本文使用的术语“反应性氧物质(ROS)诱导剂”是指诱导ROS产生的任何剂。

如上文指示的，如本文定义的分离的多肽与至少一种抗癌剂一起施用。术语“至少一种”意指包括如本文定义的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种抗癌剂。

如上文指示的，本发明基于这样的发现：向细胞施用本公开内容的分离的多肽增加了TNBC细胞的细胞表面的人表皮生长因子受体2(HER2)受体的表达，使得这些细胞易于进行针对HER2受体的靶向疗法。事实上，在用肽APC1和Kadcyla两者处理的细胞中，凋亡水平是用单独的Kadcyla处理的细胞中的至少2.5倍大。所附实施例还证明了本公开内容的肽增强雌激素受体表达以及他莫昔芬(例如图11、图12和图13)和其他抗癌剂即多柔比星和顺铂(图14、图15、图16和图17)的效果。

因此，本公开内容提供了一种组合疗法，其中本发明的分离的多肽与至少一种抗癌剂一起施用。换句话说，本公开内容提供了一种用于治疗有相应需要的患者中的癌症的方法，包括向所述患者施用与至少一种抗癌剂组合的分离的多肽，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物。

本发明还提供了与至少一种抗癌剂组合的分离的多肽，用于在治疗有相应需要的患者中的癌症的方法中使用，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物。

术语“组合”或“组合疗法”可以意指两种或更多种剂(即如本文定义的分离的多肽和至少一种抗癌剂)的同时或连续施用。例如，同时(concurrent、simultaneous)施用意指两种或更多种剂被平行(在同一时间)施用，而连续施用意指两种或更多种剂在不同时间且任选地通过不同施用途径被施用至患者。

在具体实施方案中，与仅用所述至少一种抗癌剂处理的细胞或生物体的相应比例相比，如本文定义的组合将所述患者对所述至少一种抗癌剂的响应性增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或约1000％。

在多种实施方案中，根据本公开内容的分离的多肽在所述至少一种抗癌剂的施用之前、与所述至少一种抗癌剂的施用同时地或在所述至少一种抗癌剂的施用之后被施用。如本文定义的分离的多肽和至少一种抗癌剂的施用可以通过本领域已知的任何途径进行。

根据本发明的施用可以通过以下任何途径进行：口服施用、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内或皮下注射、直肠内施用、鼻内施用、眼施用或局部施用。

在特定实施方案中，如本文定义的分离的多肽在施用所述至少一种抗癌剂之前被施用。在另外的具体实施方案中，如本文定义的分离的多肽在施用所述至少一种抗癌剂之前约1-7天被施用。

如上文详述的，本发明提供了用于治疗癌症的方法和分离的多肽。

如本文使用的，术语“癌症”和“肿瘤”以其最宽泛的意义使用，并且同样涉及组织或器官的增生。如果组织是淋巴系统或免疫系统的一部分，恶性细胞可能包括循环细胞的非实体瘤。其他组织或器官的恶性肿瘤可能产生实体瘤。一般来说，本发明的方法和另外的方面可以用于治疗非实体瘤和实体瘤。癌症和癌症类型的诊断由技术医师如本领域熟知的进行。

癌症类型的非限制性实例包括肾上腺皮质癌、黑素瘤、恶性黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌、卡波西肉瘤、膀胱癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、神经外胚层和松果体癌、儿童脑干胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童髓母细胞瘤、儿童视觉通路胶质瘤、脑膜瘤、混合型胶质瘤、少突神经胶质瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、垂体腺瘤、转移性腺癌、听神经瘤、脊椎旁恶性畸胎瘤(Paravertebral Malignant teratoma)、乳腺癌、导管癌、乳腺瘤形成(neoplasia)、卵巢癌、类癌瘤、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、妊娠性滋养层细胞癌、Fallopain癌、子宫肉瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、成视网膜细胞瘤、软组织肉瘤、肾母细胞瘤、范科尼贫血、Langerhan细胞组织细胞增生症、肾恶性横纹肌样瘤(Malignant Rhabdoid Tumour of Kidney)、肝癌、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、绒毛膜癌、内分泌癌、食管癌、尤因肉瘤、眼癌、胃癌(Gastric cancer)、胃肠癌、泌尿生殖系统癌、胶质瘤、妇科癌、头颈癌、肝细胞癌、下咽癌、胰岛细胞癌、肾癌、喉癌、肺癌、男性乳腺癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非黑素瘤皮肤癌、食管癌、骨肉瘤、胰腺癌、脑垂体癌、前列腺癌、肾细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌(Stomach cancer)、Testicular cancerthymus cancer、甲状腺癌、移行细胞癌、滋养层细胞癌、急性淋巴细胞性白血病、白血病、急性髓性白血病、腺样囊性癌(Adenocysticcarcinoma)、肛门癌、骨癌、肠癌、脂肪肉瘤、肾胚细胞瘤和骨肉瘤。

本公开内容所包括的特定癌症类型是将受益于通过施用如本文定义的分离的多肽使对所述至少一种抗癌剂的响应性增加的癌症类型，例如如至少一种细胞部分(例如，仅举几例，受体、细胞表面受体)的表达水平增加所显示的。

在另外的具体实施方案中，根据本公开内容的癌症是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、B细胞淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)或胰腺癌中的至少一种。

如下文展示的，被施用至MDA231、MDA-MB-468和BTS49(所有这些为三阴性乳腺癌细胞系)的分离的肽APC1增加这些细胞对用抗癌剂的治疗的敏感性，抗癌剂特异性地靶向分子部分，受体HER2。因此，在具体实施方案中，如本文定义的癌症是乳腺癌。在另外的具体实施方案中，如本文定义的癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)。

术语“三阴性乳腺癌”(TNBC)是指不表达雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)或Her2/neu的基因的任何乳腺癌。上文的受体表达的缺乏使得TNBC更难治疗，因为大多数化学疗法靶向三种受体中的一种。

如本领域已知的，某些乳腺癌治疗策略，如激素疗法(例如抗雌激素)或靶向疗法(例如曲妥珠单抗)，仅在肿瘤细胞表达相应受体和靶时有效。在乳腺癌中，激素疗法需要雌激素受体(ER)和/或孕酮受体(PR)的表达有效，而曲妥珠单抗疗法仅适用于携带HER2由于其编码致癌基因ERBB2的扩增而导致的过表达的肿瘤。如上文指示的，靶向疗法(例如激素疗法和曲妥珠单抗)比化学疗法产生较少的不良负作用，并且相比于化学疗法具有另外的优势(例如延长患者的无疾病存活和总体存活)。然而，一些癌症肿瘤既不表达ER和PR，也不过表达HER2(例如TNBC)。

三阴性乳腺癌包括一组异质癌症。本公开内容包括任何类型的TNBC。在上文和其他实施方案中，TNBC是晚期TNBC、局部晚期TNBC或转移性TNBC。

通过本公开内容的方面的另一个，本公开内容提供了一种用于治疗有相应需要的患者中的三阴性乳腺癌(TNBC)的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物。

本公开内容还提供了一种分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽和至少一种抗癌剂用于在治疗有相应需要的患者中的三阴性乳腺癌(TNBC)的方法中使用，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物。

在另外的具体实施方案中，如本文定义的所述至少一种抗癌剂针对HER2、ER和/或PR。

在多种具体实施方案中，如本文定义的分离的多肽增加所述患者的癌细胞中的人表皮生长因子受体2(HER2/neu受体)、雌激素受体(ER)或孕酮受体(PR)中的至少一种的表达。

在另外的具体实施方案中，根据本公开内容的抗癌剂与Her2/neu受体(例如，如本文定义的抗癌剂是针对Her2/neu受体的抗体，诸如Kadcyla或赫赛汀)、ER(例如，如本文定义的抗癌剂是他莫昔芬或雷洛昔芬)或PR相互作用。

在另外的实施方案中，根据本公开内容的至少一种抗癌剂是化学治疗剂，优选地多柔比星或多柔比星衍生物、顺铂、紫杉醇或反应性氧物质(ROS)诱导剂。

如本文使用的术语“治疗”("treat”、"treating”、"treatment”)意指改善本文定义的患者的疾病活性的一个或更多个临床象征。“治疗”是指治疗性治疗。需要治疗的那些是患有癌症的哺乳动物受试者。因此，术语“患者”或“有相应需要的患者”意指任何哺乳动物，例如人，对于他们，施用如本文定义的分离的多肽和至少一种抗癌剂、或分离的多肽和至少一种抗癌剂的任何药物组合物是期望的，以便克服或至少减缓特别是人类患者中的癌症。癌症诊断可以通过技术医师已知的任何方法进行。

在一些实施方案中，根据本发明的有相应需要的患者是被诊断为遭受乳腺癌的受试者，并且在特定实施方案中，有相应需要的患者是指被诊断为遭受三阴性乳腺癌(TNBC)的受试者。

在多种实施方案中，如本文定义的有相应需要的患者先前已被施用化学疗法，并且经历癌症进展或复发。

本公开内容还提供了分离的多肽和至少一种抗癌剂在制备用于治疗有相应需要的患者中的癌症或用于治疗三阴性乳腺癌(TNBC)的药物中的用途，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物。

如上文指示的，本公开内容提供了一种用于治疗有相应需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物。

如下文详述的，本公开内容例示了在向癌细胞(或动物，视情况而定)施用肽APC1后，癌细胞对用抗癌剂的治疗的响应性增加，所述肽APC1具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列EKGAAFSPIYPRRK。

如本文定义的术语“分离的多肽”包括包含由SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列(本文中被称为“APC1”)或由SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列的功能片段或衍生物的多肽或所述分离的肽的药学上可接受的盐。术语“分离的”是指从其自然环境中移除、分离(isolated)或分离(separated)的分子，诸如本文描述的氨基酸序列、肽或多肽。

在具体实施方案中，根据本公开内容的分离的多肽由用SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列组成。在其他实施方案中，根据本公开内容的分离的多肽由以SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3表示的氨基酸序列组成。

如上文指示的，“多肽”是指氨基酸残基的分子链，其可以任选地在其氨基酸残基的一个或更多个处例如通过甘露糖基化、糖基化、酰胺化(例如C末端酰胺)、羧基化或磷酸化被修饰。本公开内容的多肽可以通过遗传工程化方法、在宿主细胞中表达或通过如本领域已知的任何其他合适的手段通过合成获得。用于产生肽和多肽的方法是本领域熟知的。

如本文使用的术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸残基，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸以及之后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。术语氨基酸包括L-氨基酸和D-氨基酸，D-氨基酸是L-氨基酸的镜像，其中α碳的手性反转。

术语“氨基酸序列”或“多肽序列”也涉及通过肽键连接的氨基酸残基在肽和蛋白质的链中的顺序。序列通常从含有游离氨基基团的N末端到含有游离羧基基团的C末端报告。

术语“包含”意指根据本公开内容的分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列，但还可以在肽的N末端或C末端或两个末端处包含另外的氨基酸残基(例如，分离的多肽可以包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列，使得其由以SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列组成，两者在它们的C末端都包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列)。本公开内容所包括的分离的多肽还包括包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的多肽，其中由SEQ ID NO:1表示的肽的N末端和/或C末端携带保护基团。保护性(protective)(或保护(protecting))基团是本领域熟知的，并且尤其包括醇保护基团、胺保护基团、羰基保护基团以及其他。

如上文指示的，本公开内容还包括分离的多肽，其包含具有由SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列的多肽的功能片段或衍生物。

如本文定义的术语“片段”是指比根据本公开内容的分离的多肽短至少一个氨基酸的任何肽或多肽，其通过从根据本发明的多肽中缺失至少一个氨基酸残基而获得。

具体地，根据本发明的分离的多肽的片段是包含SEQ ID NO:1的连续氨基酸部分的多肽，其比由SEQ ID NO:1表示的序列短1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸残基。换句话说，如本文定义的片段可以包括由SEQ ID NO:1表示的序列的9个、10个、11个、12个、13个或14个氨基酸残基。

术语“衍生物(derivative)”或“衍生物(derivatives)”意指包括这样的多肽，该多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列，但它们的整体序列中的一个或更多个氨基酸残基不同，即在SEQ ID NO:1的整体序列内具有缺失、取代(例如，至少一个氨基酸被另一个氨基酸替代)、倒位或添加。该术语还包括整体序列中的至少一个氨基酸残基被其相应的D氨基酸残基替代。衍生物还包括由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸残基被合成氨基酸残基、氨基酸类似物或氨基酸模拟物替代。

氨基酸“取代”是一个氨基酸被另一个氨基酸，例如被具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸替代(保守氨基酸替代)的结果。氨基酸取代可以基于所涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性来进行。例如，以下八组各自包含彼此保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。

氨基酸取代也可以通过将由SEQ ID NO:1表示的序列的至少一个氨基酸残基替代为至少一个合成氨基酸残基，以及替代为如上文定义和如本领域已知的至少一种氨基酸类似物或氨基酸模拟物进行。

应当理解，这些修饰的多肽片段或衍生物不必改变原始肽的生物活性。术语“功能”意指包括保留与未修饰多肽(具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列)的生物活性定性上相似的生物活性的由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的任何片段或衍生物。如本文定义的片段或衍生物的生物活性可以通过本领域已知的任何方法，例如如本文描述的，即通过监测其中所述片段或衍生物增加癌细胞中的如本文定义的至少一种细胞部分的表达来确定。

在特定实施方案中，本公开内容涉及包含由SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列的分离的多肽的功能片段或衍生物，其中所述功能片段或衍生物具有与本发明的未修饰的分离的多肽的氨基酸序列至少约70％、75％、80％、85％、90％、更优选地95％、特别地99％相同的氨基酸序列，即由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列中的一种。

因此，在多种实施方案中，本公开内容提供了一种用于治疗有相应需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽和至少一种抗癌剂，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中功能片段或衍生物与由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％相同。

本公开内容的分离的肽和/或抗癌剂可以通过本领域已知的任何方法单独施用，或与如本领域已知的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或盐水)一起施用。此外，本公开内容包括如本文定义的分离的肽的任何药学上可接受的盐或溶剂化物。

换句话说，如本文定义的分离的多肽和/或所述至少一种抗癌剂被包含在药物组合物中，该药物组合物任选地还包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。分离的多肽和抗癌剂可以被包含在单独的药物组合物中或同一药物组合物中。

本公开内容的药物组合物通常包含缓冲剂、调节其渗透压的剂以及任选地一种或更多种如本领域已知的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。补充的活性成分也可掺入组合物中。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。

在多种实施方案中，根据本公开内容的分离的多肽和/或所述抗癌剂以治疗有效量被施用。

如本领域已知的，术语“治疗有效量”旨在意指由研究者、兽医、内科医生或其他临床医师正在寻找的将引发组织、系统、动物或人类的生物或医学响应的药物或药剂(即如本文定义的分离的多肽和抗癌剂)的量。治疗有效量的确定由技术医师基于本领域熟知的临床参数进行。

在人中是治疗有效的APC1的剂量可以由本领域技术人员通过本领域已知的方法，例如通过如下文例示的测定来评估。

如下文的实施例中所示，肽APC1增加癌细胞对多种抗癌剂的响应性，抗癌剂包括针对HER2/neu受体的抗体、针对雌激素受体的他莫昔芬以及另外地通过其他作用机制起作用的多柔比星和顺铂。因此，本发明还提供了一种用于使有相应需要的患者中的癌细胞对至少一种抗癌剂敏感的方法，所述方法包括向所述患者施用分离的多肽，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述分离的多肽调节所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达，从而使所述癌细胞对所述至少一种抗癌剂敏感。

又通过另外的方面，本发明提供了一种分离的多肽，所述分离的多肽用于使有相应需要的患者中的癌细胞对至少一种抗癌剂敏感的方法中使用，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物，其中所述分离的多肽调节所述患者的癌细胞中的至少一种细胞部分的表达，从而使所述癌细胞对所述至少一种抗癌剂敏感。

在具体实施方案中，根据本发明的用于使癌细胞敏感的方法是其中所述方法还包括向所述患者施用所述至少一种抗癌剂。

在另外的具体实施方案中，根据本发明的用于使癌细胞敏感的方法是其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌、B细胞淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)或胰腺癌中的至少一种。

在用于使有相应需要的患者中的癌细胞对至少一种抗癌剂敏感的方法的仍另外的具体实施方案中，如本文定义的所述分离的多肽被施用至结肠直肠癌细胞和肺癌细胞并且将这些细胞转化为EGFR阳性细胞，从而使得这些细胞对用经典EGFR抑制剂的治疗敏感，例如对结合EGFR并诱导细胞死亡的单克隆抗体敏感。

在一些实施方案中，诱导如本文定义的癌细胞分化的方法在体内进行，而在其他实施方案中在体外进行。

在本公开内容的上下文中，术语“使……敏感(sensitizing)”是指这样的状态，在该状态中，癌细胞对特定刺激(在本情况中对如本文定义的靶向细胞部分的抗癌剂的效果)更有倾向性、更有反应性、更易受影响或更有响应性，其比未用本文定义的分离的肽处理的细胞敏感至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或约1000％。

特别地，其是指在不存在本公开内容的分离的多肽的施用的情况下，癌细胞对如本文定义的靶向细胞部分的抗癌剂的效果是幼稚的、不敏感的或无反应的。在多种实施方案中，如本文定义的分离的多肽可以转化不再响应于激素疗法或对激素疗法的细胞响应去势(castrate)的前列腺癌细胞。

在另外的实施方案中，根据本公开内容的分离的多肽将对EGFR抑制剂无响应的肺癌细胞转化变成响应细胞(从而使对EGFR抑制剂无响应的肺癌细胞对EGFR抑制剂敏感)。

在仍另外的实施方案中，根据本公开内容的分离的多肽将对EGFR抑制剂无响应的结肠直肠癌(CRC)细胞转化变成响应细胞(从而使对EGFR抑制剂无响应的CRC细胞对EGFR抑制剂敏感)。

可与如本文定义的本发明的分离的肽组合的抗癌剂的特别但非限制性实例包括但不限于Kadcyla、赫赛汀、他莫昔芬、顺铂和多柔比星。

如本文使用的术语“癌细胞”意指包括任何类型的癌症和来源于其的任何类型的癌细胞。

仍另外地，本公开内容提供了一种试剂盒，包含：

(i)分离的多肽和任选地药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂，所述分离的多肽包含由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物；

(ii)抗癌剂和任选地药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

在多种具体实施方案中，根据本发明的试剂盒涉及与所述至少一种细胞部分直接地或间接地相互作用的抗癌剂。在另外的实施方案中，根据本发明的试剂盒涉及靶向细胞部分的抗癌剂。

在一些实施方案中，根据本发明的试剂盒还包括使用说明。

在其他实施方案中，根据本发明的试剂盒涉及抗癌剂，其为免疫治疗剂、化学治疗剂、信号转导抑制剂、受体抑制剂、基因表达调节剂、凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、激素治疗剂、代谢抑制剂、抗自噬剂、内质网应激诱导剂、反应性氧物质(ROS)诱导剂或其组合。

在另外的实施方案中，根据本发明的试剂盒涉及由用SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列组成的分离的多肽。

本公开内容还提供了如本文定义的试剂盒，所述试剂盒用于在治疗有相应需要的患者中的癌症的方法中使用。

在多种具体实施方案中，如本文定义的分离的多肽可以以单个剂量施用。在另外的实施方案中，如本文定义的分离的多肽可以以多个剂量施用。

如本文使用的术语“约”指示可以偏离所指的值，比所指的值高或低多达1％、更具体地5％、更具体地10％、更具体地15％、并且在一些情况中多达20％的值，偏离范围包括整数值，并且如果适用也包括非整数值，构成连续的范围。

公开的和描述的将被理解为本发明不限制于本文公开的特定实施例、方法步骤和组合物，因为此类方法步骤和组合物可以稍微变化。还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求及其等价物限定。

术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”及其同源词意指“包括但不限于”。该术语包括术语“由......组成”和“基本上由......组成”。措辞“基本上由......组成”意指组合物或方法可以包括另外的成分和/或步骤，但前提是另外的成分和/或步骤不实质性地改变要求保护的组合物或方法的基础特征和新特征。贯穿本说明书和实施例和后面的权利要求，除非上下文另外需要，词语“包含(comprise)”和变化形式诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为隐含包括陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他的整数或步骤或者整数或步骤的组。

如本文使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式(manners)、方法(means)、技术和程序，包括但不限于化学、药理、生物、生化和医疗领域的从业者已知或容易从已知的方式、方法、技术和程序开发的那些方式、方法、技术和程序。

本公开内容还提供了诱导癌细胞分化的方法，包括向所述细胞施用包含由SEQ IDNO:1表示的氨基酸序列或其功能片段或衍生物的分离的多肽。

术语“诱导分化(inducing differentiation)”或“诱导分化(induction ofdifferentiation)”意指引起、产生、促进或影响细胞化学变化、抑制生长和促进细胞类型的分化。

在一些实施方案中，如本文定义的分离的多肽诱导肺、结肠、前列腺或乳腺中的癌症干细胞的分化，使得这些细胞响应于这些疾病的经典靶向抗癌疗法。

应该注意的是，通过上文的实施方案，同样提及了本发明的多个方面，即治疗方法、使癌细胞敏感的方法、用于使用的分离的肽和另外的抗癌剂以及本发明的试剂盒。

必须要注意的是，如本说明书和所附的权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非内容另外明确规定。

贯穿本说明书和实施例和后面的权利要求，除非上下文另外需要，词语“包含(comprise)”和变化形式诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为隐含包括陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他的整数或步骤或者整数或步骤的组。

以下实施例是发明人在实施本发明的方面中采用的技术的代表。应当理解的是，尽管这些技术是用于实践本发明的优选实施方案的示例，但根据本公开内容，本领域技术人员将认识到，可以进行许多修改而不脱离本发明的精神和预期范围。

实施例

实验程序

材料

除非下文另外指示，否则细胞培养基DMEM高葡萄糖、L-谷氨酰胺(Gibco 41965-039)或RPMI(Gibco目录号21875)包含(每500ml)50ml FBS(Biological industries目录号04-121-1A)、5ml丙酮酸钠11mg/ml(100mM)(Biological industries目录号03-042-1B)、0.5ml两性霉素B 2500μg/ml(Biological industries目录号03-029-1)和5ml硫酸庆大霉素50mg/ml(Biological industries目录号03-035-1)。

胰蛋白酶EDTA(Biological industries目录号03-052-1B)。

培养瓶：75cm²(Nunc目录号178905)、25cm²(Nunc目录号136196)。

室载玻片(chamber slide)(8孔，Nunc目录号154534)。

APC1(磷酸盐缓冲盐水中的50mg/ml)。APC-1肽(Novetide,Israel)具有氨基酸序列EKGAAFSPIYPRRK(由SEQ ID NO:1表示)。APC1可被磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶解。

Kadcyla，100mg(trastuzumab emtansine,Roche)，20mg/ml溶液在0.45％盐水中制备并立即使用。

二甲苯(Sigma#534056)。

乙醇，无水变性，组织学等级(100％Solufix#E003和95％Sigma#32294)。

去离子水(dH₂O)。

苏木精Gill2(Sigma#GHS216)。

细胞

三阴性乳腺肿瘤细胞系MDA-MB-231(用DMEM生长)、MDA-MB-468(用RPMI生长)和BTS-149(用RPMI生长)从ATCC获得。细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468在本文中也分别被称为“MDA231”和“MDA468”。

细胞培养维持

三阴性乳腺肿瘤细胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468和BTS-149)在培养箱中在37℃、5％CO₂下生长，直到达到70％-80％的密度(不应超过该密度)。然后弃去生长培养基，并且用5ml胰蛋白酶EDTA洗涤细胞瓶。接下来，将另外的5ml量的胰蛋白酶EDTA添加到细胞瓶中，并且将细胞瓶放置在培养箱中，直到大部分细胞不再附着到瓶(不应为了增加细胞的脱离而轻拍瓶；此过程花费几分钟)。然后，将培养基(10ml)添加到经胰蛋白酶处理的细胞。最后，将悬浮在培养基和胰蛋白酶中的细胞分到2个瓶中，并且将15ml新鲜培养基添加到每个瓶中。将细胞放置在培养箱中在以上条件下持续2天-3天，直到达到约70％-80％的密度，并且根据需要重复以上程序。本文使用的其他细胞系如本领域已知的生长。

在APC1存在下的细胞生长

使细胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468和BTS-149)生长，直到达到70％-80％的密度。然后弃去生长培养基，并且如上文描述的将细胞用胰蛋白酶和培养基处理。在细胞从表面脱离之后，将20ml细胞悬浮液(即培养基和胰蛋白酶中的细胞)转移到50ml圆锥管中，并且在4℃以300g离心10min。接下来，弃去上清液，并且将2ml新鲜培养基添加到细胞沉淀物中。然后将细胞流体化，并将13ml培养基添加到管中，从而将细胞悬浮在总计15ml培养基中。对细胞进行计数并以10,000个-15,000个细胞/孔接种在室载玻片上的1ml生长培养基中。将接种有细胞的室载玻片放置在罩中1小时，并且然后转移到培养箱中在以上条件下孵育过夜。第二天，将培养基从细胞室载玻片中吸出并弃去，并且添加1ml补充有APC1(100μg/ml或250μg/ml的最终浓度)的细胞处理培养基或对照(仅培养基)。将培养基添加到每个孔中(使用APC1的等分试样以便避免反复的冻融循环)。然后将细胞孵育24小时-144小时。任选地，将另外剂量的APC1施用至经处理的细胞，并且在第二剂量存在下将细胞另外孵育多达96小时，并在第三剂量存在下孵育多达144小时。然后收集细胞并进行如下文详述的进一步分析。

在APC1和Kadcyla存在下的细胞生长

使细胞生长，直到达到70％-80％的密度。然后弃去生长培养基，并且如上文描述的将细胞用胰蛋白酶和培养基处理。然后将悬浮在培养基和胰蛋白酶中的细胞转移到50ml圆锥管中，并且在4℃以300g离心10分钟。接下来，弃去上清液，并将2ml新鲜培养基添加到细胞沉淀物中。将细胞流体化，并且将另外的13ml培养基添加到细胞中，使得细胞悬浮在总计15ml培养基中。对细胞进行计数，并将约40,000个细胞放置在9个25cm²瓶的每个瓶中的10ml培养基中(每个瓶中)。将细胞放置在培养箱中过夜。第二天，弃去上清液，并用含有2.5％FBS(而不是10％FBS)的10ml DMEM或RPMI替代。将细胞瓶例如按如下进一步处理：

瓶1+9：无处理

瓶2：250μg/ml APC1

瓶3：无处理

瓶4：无处理

瓶5：无处理

瓶6：250μg/ml APC1

瓶7：250μg/ml APC1

瓶8：250μg/ml APC1

将如上文指示处理的细胞在培养箱中孵育48小时。然后，将第二剂量的APC1(以相同的最终浓度)添加到细胞瓶2、6、7和8中，并且将细胞进一步孵育24小时。如果细胞达到超过85％汇合，则将50％的细胞从瓶中刮出。弃去培养基，并将含有10％FBS的10ml DMEM或RPMI添加到每个瓶中。将细胞瓶例如按如下进一步处理(用第三剂量的APC1和/或Kadcyla)：

瓶1+9：无处理

瓶2：250μg/ml APC1

瓶3：5μg/ml Kadcyla

瓶4：10μg/ml Kadcyla

瓶5：25μg/ml Kadcyla

瓶6：250μg/ml APC1+5μg/ml Kadcyla

瓶7：250μg/ml APC1+10μg/ml Kadcyla

瓶8：250μg/ml APC1+25μg/ml Kadcyla(任选地)

将细胞孵育另外的72小时-96小时。最后收集细胞并进行如下文描述的分析(凋亡标志物的FACS分析，或评估HER2表达)。将Kadcyla(trastuzumab emtansine,Roche)称重，并且在0.45％盐水中稀释至20mg/ml的浓度，并立即使用(弃去剩余溶液)。

换句话说，将细胞与第一剂量的APC1一起孵育48小时，然后与第二剂量的APC1一起孵育24小时，接下来将培养基去除，添加新鲜的FBS培养基以及为相同初始剂量的第三剂量的APC1，并根据指示添加或不添加Kadcyla。在72小时之后，将细胞送去进行FACS分析。

用APC1和他莫昔芬处理的MDA-MB-231细胞的刃天青细胞存活力测定

材料

透明底部的96孔细胞培养板；

细胞培养基，包含丙酮酸钠、青霉素/链霉素和两性霉素B的DMEM中的10％FBS；

细胞细胞毒性测定试剂盒(Cell Cytotoxicity Assay Kit)(Colorimetric)ab112118；

稀释至2.5mg/ml(6.65mM)的他莫昔芬(Sigma T5648)；

50mg/ml APC1储备溶液：在PBS中稀释；

细胞系：MDA-MB-231细胞和每周2次用250μg/ml APC1处理持续1周的MDA-MB-231细胞，除非另外指示。

程序

将MDA-MB-231或用APC1处理的MDA-MB-231以10³个细胞/孔接种在96孔板中的细胞培养基(100μl)中。将用APC1处理的细胞在具有250μg/ml APC1的情况下进行接种并孵育过夜。然后，在有或没有250μg/ml APC1的培养基中制备以下处理溶液：对照、10nM他莫昔芬、50nM他莫昔芬和100nM他莫昔芬。接下来，将培养基从板中吸出，并将处理溶液(100μl)添加到合适的孔中。每个处理以一式三份进行，并且将细胞孵育48小时。然后将20μl的细胞细胞毒性测定试剂盒(Colorimetric,ab112118)添加到每个孔中，并且将细胞孵育1小时。在分光光度计中在570和605OD对板进行读取。

接下来，基于以下式计算样品和对照的细胞存活力百分比：％细胞存活力＝100×(R样品-Ro)/(R对照-Ro)。“R样品”是在测试化合物(APC1)存在下OD570/OD605的吸光度比率。“R对照”是在测试化合物不存在下(对照)OD570/OD605的吸光度比率，并且“Ro”是OD570/OD605的平均背景(无细胞对照)吸光度比率。

用APC1和顺铂或多柔比星处理的MDA-MB231细胞的细胞存活力测定(刃天青)

材料

透明底部的96孔细胞培养板；

细胞培养基是包含丙酮酸钠、青霉素/链霉素和两性霉素B的DMEM中的10％FBS；

细胞细胞毒性测定试剂盒(Colorimetric)ab112118；

顺铂(Sigma EPCC221000)，在DMSO中被新鲜地稀释至40mg/ml(133.3mM)。

多柔比星(D1515 Sigma)，在DW中被稀释至50mg/ml(86.6mM)(在4℃保持多达3周)。

APC1，50mg/ml，在PBS中稀释。

细胞系是MDA-MB-231细胞、用APC1(250μg/ml，每周2次持续1周)处理的MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞和用APC1(250μg/ml，每周2次持续1周)处理的MDA-MB-468细胞。

程序

将细胞(10³个)接种在96孔板中的细胞培养基(100μl)中。将用APC1处理的细胞在具有250μg/ml APC1的情况进行接种。将细胞孵育过夜。然后在有或没有250μg/ml APC1的培养基中制备以下处理溶液：对照、500μM顺铂、750μM顺铂、1000μM顺铂、0.3μM多柔比星、0.5μM多柔比星和1μM多柔比星。

然后将培养基从板中吸出，并且将100μl的处理溶液添加到合适的孔中，每个处理以一式三份进行。将细胞孵育48小时。接下来，将20μl的细胞细胞毒性测定试剂盒(Colorimetric,ab112118)添加到每个孔中，并且将细胞孵育1小时并在分光光度计中在570和605OD读取。如上文详述的，基于以下式计算样品和对照的细胞存活力百分比：％细胞存活力＝100×(R样品-Ro)/(R对照-Ro)。

荧光激活细胞分选(FACS)分析

使用FACS分析检查细胞的凋亡或HER2表达。所使用的HER2抗体是abcam ab16901。标志物膜联蛋白(Enco)被用于评估凋亡。

用APC1处理的人肿瘤细胞的免疫荧光

用于用APC1处理的人肿瘤细胞的免疫荧光的材料如下。载玻片：Nunc^TMLab-Tek^TMII CC2^TM室载玻片系统(154917Nunc)，洗涤缓冲液：PBS(02-023-5A BiologicalIndustries)，固定溶液：PBS中的3％甲醛(252549Sigma)，透化溶液：PBS中的0.25％TritonX-100(0694Amresco)，封闭/抗体缓冲液：具有0.1％吐温20(0777Amresco)的PBS中的1％BSA(A7906Sigma)，第一抗体：抗ErbB 2抗体(3B5)(ab16901)abcam，二抗：预吸附的驴抗小鼠IgG H&L(Alexa488)(ab150109)，具有DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)的封固介质：具有DAPI的Fluoroshield封固介质(abcam ab104139)。

如上文详述的在将细胞与APC1一起孵育之后，将培养基吸出，并且通过用洗涤缓冲液填充每个孔来洗涤细胞。弃去缓冲液，并且将300μl固定溶液添加到每个孔中，并将细胞在室温(RT)孵育15分钟。然后弃去固定溶液，将孔用洗涤缓冲液短暂冲洗两次，并且将300μl透化溶液添加到每个孔中。然后将细胞在RT孵育10分钟。接下来，弃去溶液，并且孔通过以下来处理：将洗涤缓冲液添加到每个孔中并等待5分钟，然后弃去孔中的洗涤缓冲液。在洗涤完成之后，将封闭缓冲液(1ml)添加到每个孔中，并将细胞在RT孵育1小时。在孵育时间结束之前，稀释第一抗体(一抗)，即将抗ErbB 2抗体(3B5)(ab16901)abcam 1:400稀释在抗体稀释缓冲液中。然后弃去孔中的封闭缓冲液，并将120μl一抗添加到每个孔中。覆盖细胞(用封口膜(Parafilm)或胶带(duct tape))并在4℃孵育过夜。第二天，弃去一抗，并且将细胞用洗涤缓冲液洗涤三次(每次洗涤五分钟，如上文描述的)。然后稀释二抗，即将预吸附的驴抗小鼠IgG H&L(Alexa488)1:1000稀释在抗体稀释缓冲液中，并将150μl二抗添加到每个孔中。将细胞在RT在黑暗中孵育1小时。然后将细胞用洗涤缓冲液洗涤三次(在黑暗中进行，每次洗涤五分钟，如上文描述的)。然后将孔从载玻片上移除，并且将载玻片在黑暗中进行空气干燥。添加具有DAPI的封固介质，从载玻片上移除室，然后将封固介质添加到载玻片上，用盖玻片覆盖，用指甲油密封，并在黑暗中在4℃储存。将细胞在具有用于Alexa fluor 488(绿光发射)和DAPI(蓝光发射)的滤波器的荧光显微镜中可视化。

用于注射到Balb/C裸鼠中的癌细胞培养物的制备

使MDA-MB-231细胞在175cm²瓶(Nunc 178883)内的具有Hepes(Gibco 41965-039)、含有10％热灭活胎牛血清(Biological industries，#04-121-1A)和1％青霉素-链霉素(Pen-Strep)抗生素(Biological industries，03-031-1B)的DMEM培养基中生长。将细胞在5％CO₂和95％湿度的情况下在37℃孵育。注射到小鼠中的其他癌细胞(即OV90和Panc1)以类似的方式制备。

当存在足够数目的细胞时，将细胞以300g离心5分钟。弃去上清液，并将5ml-10mlPBS(Biological Industries，#02-023-5A)添加到细胞沉淀物中以洗去剩余的培养基。将细胞再次离心(以相同的速度和时间)，弃去上清液，并且将5ml-10ml盐水添加到细胞。在此阶段，使用血细胞计数器(Hemocytometer)在光学显微镜下对细胞进行计数，并相应地添加盐水以达到8×10⁶个细胞/200μl的浓度。

实验动物

雌性Balb/C裸鼠(BALB/cOlaHsd-Foxn1nu，5-6周龄)购自Harlan实验室。在购买前，小鼠维持在无病原体环境中。清洁笼子(425×266×185mm-底板面积800cm²(1291HEurostandard Type III H，Tecniplast，每个笼子中6-9只小鼠)，并且每周更换一次锯屑(Harlan Telkad Sani-Chips，2.2Cu.Ft.实验室级)和水(1L瓶中的自来水)。使用无菌耳号钳(ear punch)标识小鼠。

Balb/C裸鼠的癌细胞注射

将雌性Balb/C裸鼠(如上文详述的)在发明人的动物设施中保留至少24小时。接下来，使用27G针头对所有小鼠腹膜内注射8×10⁶个细胞(在200μl盐水中)。

小鼠的APC1处理

将APC1肽在盐水中稀释至合适的浓度，以便注射350μg/小鼠的剂量。在肿瘤达到0.5cm×0.5cm尺寸(通常5天)之后，开始对小鼠进行处理。对照组用盐水注射。治疗组用APC1(350μg/小鼠)注射。在周日、周二和周四对小鼠进行注射，持续2周(总计6次注射)。

监测肿瘤尺寸和小鼠体重

在处理期间，将每只小鼠称重，并且用数显卡尺(Digital caliper)测量肿瘤尺寸。

肿瘤切片的HER2免疫组织化学

溶液和试剂

使用以下溶液和试剂：洗涤缓冲液：为了制备1L 1X TBS/0.1％吐温20(1X TBST)，将50ml 20X TBS(Amresco#J640)添加到950ml蒸馏H₂O(dH₂O)中。然后将1ml吐温20(Amresco#J640)添加到溶液中，并将溶液混合。抗体稀释剂：抗体稀释剂#8112。抗原暴露(unmasking)：柠檬酸盐：为了制备1L 10mM柠檬酸钠缓冲液，将2.94g柠檬酸三钠盐二水合物(C₆H₅Na₃O₇·2H₂O)添加到1L dH₂O中，并将pH调节至6.0。过氧化氢(3％)：将10ml 30％H₂O₂(Sigma#216763)添加到90ml dH₂O中。封闭溶液：Background Buster(Innovex#NB306)。一抗(第一抗体)：抗ErbB 2抗体[3B5](ab16901)(abcam)。荧光二抗：预吸附的驴抗小鼠IgG H&L(Alexa />488)(ab150109)。具有DAPI的封固介质：具有DAPI的Fluoroshield封固介质(abcam ab104139)。

脱石蜡和再水合

在此程序期间的任何时间都不允许载玻片干燥。切片由Harlan实验室制备—将固定的切片进行石蜡处理(parafised)，切割成4微米的切片，并附着到玻璃载玻片。为了使切片脱石蜡/水合，将切片在以下中孵育：二甲苯，进行三次洗涤，每次5分钟；100％乙醇，进行两次洗涤，每次10分钟；95％乙醇，进行两次洗涤，每次10分钟；并且最后在dH₂O中洗涤两次，每次5分钟。

抗原暴露

将载玻片在pH 6.0的10mM柠檬酸钠缓冲液中煮沸，并且然后在亚沸腾温度维持10分钟。允许载玻片在台上冷却30分钟。

染色

将切片在dH₂O中洗涤三次，每次5分钟。将切片在3％过氧化氢中孵育10分钟，并且然后在dH₂O中洗涤两次，每次5分钟，并在洗涤缓冲液中洗涤5分钟。将每个切片用100μl-400μl封闭溶液在室温封闭30分钟。接下来，去除封闭溶液，并且将在抗体稀释剂中1:400稀释的100μl-400μl一抗添加到每个切片中，并将切片在4℃孵育过夜。然后去除抗体溶液，并且将切片在洗涤缓冲液中洗涤三次，每次5分钟。将二抗1:1,000稀释在抗体稀释剂中，并将100μl-400μl二抗添加到每个切片中。然后将切片在黑暗中在室温孵育1小时。最后，去除二抗溶液，并且将切片用洗涤缓冲液在黑暗中洗涤三次，每次5分钟，并在黑暗中在dH₂O中洗涤5分钟。

将切片脱水

将封固有切片的载玻片在黑暗中进行空气干燥。盖玻片使用封固介质封固。

Notch蛋白受体的蛋白质印迹分析

将MDA-MB-231细胞(0.8×10⁶个)接种在5个75cm²瓶中的包含10％胎牛血清(FBS)、硫酸庆大霉素(03-035-1C Biological industries)和两性霉素B(03-029-1C Biologicalindustries)的25ml DMEM(41965039Gibco)培养基中。将细胞在培养箱中孵育过夜。然后将在PBS中的50mg/ml的肽APC1储备溶液在室温(R.T.)解冻，并添加到瓶中至250μg/ml的最终浓度，并且将细胞孵育0小时、1小时、3小时、5小时或21小时。

然后去除培养基，并且将细胞用细胞刮取器从瓶中刮到1.8ml新鲜的DMEM培养基中。将细胞以两种级分：胞质蛋白和膜蛋白(通过膜蛋白提取试剂盒(Thermo scientific#89842)提取)收集到2ml Eppendorf管中。将蛋白酶抑制剂(Sigma p2714)和磷酸酶抑制剂(Sigma P5726)添加到透化缓冲液和溶解缓冲液中，如制造商推荐的。

如下制备用于蛋白质印迹的样品：将样品缓冲液(invitrogen目录号NP0007，4倍浓缩)和样品还原剂(Invitrogen目录号NP0009，10倍浓缩)添加到每个样品中，并且将样品煮沸5分钟。

然后将样品装载到4％-20％Tris-甘氨酸凝胶(NuSep目录号NG21-420)上，每个孔中装载50μl。将凝胶在150V运行1小时(前10min在80V运行)，然后转移到PVDF膜(Immbilon-P转移膜目录号:IPV00010-PORE SIZE:0.45)上持续1小时。将膜使用TBST中的5％牛奶在RT在震荡下封闭1小时。将Notch3抗体(abcam ab23426)以1:1000稀释度添加在TBST中的5％牛奶中，并在4℃在震荡下孵育过夜。

使用TBST洗涤膜3次，并且然后添加二抗α兔-HRP(以1:5000稀释在TBST中的5％牛奶中)，在室温在震荡下孵育1小时。最后，使用TBST洗涤膜3次(每次洗涤之间允许4-5分钟)，并且添加ECL底物(Clarity Western 1705061BIO-RAD)。使用Li-COR C-Digit装置扫描该膜。将Notch3抗体施加到膜上，并且对蛋白进行定量并用β-肌动蛋白校准。

用APC1处理的细胞中的谷胱甘肽还原酶确定

材料

75cm²细胞培养瓶；

细胞培养基是包含丙酮酸钠、青霉素/链霉素和两性霉素B的DMEM中的10％FBS；

谷胱甘肽测定试剂盒(Sigma CS0260)；

APC1溶液，PBS中的50mg/ml；

使细胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-468)在75cm²细胞培养瓶中生长，达到80％-90％汇合。将细胞用APC1(250μg/ml，每周2次持续1周)处理。

程序

将细胞用10ml PBS洗涤两次，添加PBS(5ml)并通过刮取收集细胞，在4℃以300G离心5分钟，然后弃去上清液并将细胞用APC1处理，如上文指示的。谷胱甘肽标准溶液的值被用于确定标准曲线，并且根据制造商的说明计算相当于每孔1nmol还原型谷胱甘肽的ΔA412/min。

实施例1

用APC1处理三阴性乳腺癌细胞增加了细胞表面HER2受体的表达

如上文指示的，三阴性乳腺癌(TNBC)尤其根据雌激素受体(ER)和孕酮受体(ER)表达的缺乏和人表皮生长因子受体2(HER2)表达或扩增的缺乏所定义。

具有氨基酸序列EKGAAFSPIYPRRK(由SEQ ID NO:1表示)的在本文中被称为“APC1”的肽由肽KTPAF50的14个C末端氨基酸残基组成，肽KTPAF50先前已被发现影响体外和小鼠中的癌细胞的存活力和增殖(3,4)。如上文描述的，将APC1施用至已知为三阴性乳腺癌细胞(且不表达HER2)的MDA-MB-231细胞的作用首先通过FACS分析来检查，并且在图1中展示出。

简言之，如上文详述的，将APC1以多个剂量施用至MDA-MB-231细胞。将第一剂量的APC1(最终浓度为100μg/ml或250μg/ml)添加到细胞中，并将细胞孵育48小时。然后将另外剂量的APC1施用至经处理的细胞，并且将细胞进一步孵育24小时。

如图1A中所示，在不存在APC1处理的MDA-MB-231细胞(对照细胞)的细胞膜上几乎不存在HER2表达。令人惊讶的是，在用APC1处理的MDA-MB-231细胞中，存在HER2表达的增加，如图1B和图1C中展示的。这种效果是浓度依赖的，如当比较图1B(100μg/ml APC1)和图1C(250μg/ml APC1)时从HER2表达的移位推断的。明显地，在250μg/ml APC1的情况下，MDA-MB-231细胞的细胞表面的HER2表达与已知为HER2阳性的N87细胞上的HER2表达相似(图1D)。

APC1施用对TNBC细胞上的HER2表达的影响还通过用多个浓度的APC1处理且孵育多个时间段的MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞的HER2表达的免疫荧光来检查，如上文详述的。

首先，如图2B中展示的，当通过HER2表达的免疫荧光进行分析并与对照细胞(图2A)比较时，在250μg/ml APC1存在下孵育48小时的MDA-MB-231细胞示出了明显的HER2表达。

此外，如图3B中所示，当将MDA-MB-231细胞在三个剂量的250μg/ml APC1存在下孵育并且孵育延长的时间段(即在初始剂量之后孵育144小时，并在第二剂量和第三剂量之后分别另外孵育96小时和72小时)时，以上效果被增强。以上指示的条件以及250μg/ml APC1的剂量被发现对于增加目前细胞类型的HER2表达是最佳的。

对于其他已知的TNBC细胞，即MDA-MB-468获得了相似的结果，如图4B中展示的。在这种情况下，向细胞施用两个剂量的APC1(各自为100μg/ml)，并在第一剂量和第二剂量之后分别使细胞经历24小时和72小时的孵育时间段。

值得注意的是，在所有未施用APC1的对照细胞中，通过免疫荧光未观察到HER2表达(如图2A、图3A和图4A中展示的)。

以上结果表明施用APC1增加了细胞表面的HER2表达，并且因此不希望受理论束缚，这使得经处理的细胞对靶向HER2的治疗更敏感(或易受所述治疗影响)。

实施例2

Kadcyla对用APC1处理的MDA-MB-231细胞的作用

以上结果证明，向TNBC细胞施用APC1至少增强或增加了细胞表面的HER2的表达，并且因此APC1可用作增加这些细胞对靶向HER2的任何治疗(例如针对HER2的抗体)的敏感性的剂。

为了检查APC1是否确实增加TNBC细胞对靶向HER2的治疗的敏感性，如上文描述的，首先向MDA-MB-231细胞施用APC1，并且然后施用Kadcyla。Kadcyla是一种抗体-药物缀合物(ADC)，其将曲妥珠单抗(一种针对HER2的抗体，也被称为赫赛汀)和化学治疗分子emtansine(DM1)的作用机制组合在一种药物中。

简言之，首先向细胞施用两个剂量的APC1(各自为250μg/ml，在第一次施用和第二次施用之后分别进行48小时和24小时的孵育时间段)，并且进一步施用5μg/ml或10μg/ml的Kadcyla(并孵育另外的72小时)。然后对经处理的细胞进行凋亡标志物膜联蛋白的FACS分析。

已知MDA-MB-231细胞是三阴性细胞，如上文详述的，并且因此对Kadcyla治疗不敏感。事实上，如图5A中展示的，由于向未用APC1预处理的MDA-MB-231细胞施用单独的Kadcyla而引起的凋亡水平是相对低的(当施用5μg/ml Kadcyla时实际上没有引起凋亡并且当施用10μg/ml Kadcyla时引起10％凋亡)。

令人惊讶的是，对于所使用的Kadcyla剂量中的每一个剂量，在用APC1和Kadcyla两者处理的细胞中，凋亡水平是用单独的Kadcyla处理的细胞中的至少2.5倍大。不希望受理论束缚，APC1允许Kadcyla进入细胞并释放充当细胞死亡因子的药物部分。

对于如上文描述的首先被施用APC1并然后施用Kadcyla(Kadcyla以5μg/ml、10μg/ml或25μg/ml施用)的MDA-MB-231细胞获得了相似的结果，如图5B中展示的。然而在这种情况下，在用APC1和Kadcyla两者处理的细胞中的凋亡水平是在仅用APC1处理的相应细胞中的凋亡水平的3-10倍大。

为了进一步证实向TNBC细胞施用APC1对这些细胞对用抗HER2剂进一步治疗的敏感性的影响，在MDA-MB-231细胞以及其他TNBC细胞，即MDA-MB-468和BTS49中进行另外的实验。

在这些实验中，施用APC1两次(各自为250μg/ml)，进行如上文详述的孵育时间段。然后施用5μg/ml、10μg/ml或25μg/ml的Kadcyla，并且进一步孵育细胞，如上文详述的。

图6展示出在用Kadcyla处理之前用APC1预处理的MDA-MB-231细胞中2-6倍更高的凋亡水平。在对照和仅用APC1/Kadcyla处理的细胞中存在低的凋亡水平，而在用APC1和Kadcyla两者处理的细胞中，存在细胞凋亡水平的显著增加。

此外，图7示出了在用Kadcyla处理之前用APC1预处理的BTS49细胞中2.5-5倍更高的凋亡水平，这与MDA-MB-231细胞示出的结果相似。然而，在MDA-MB-468细胞的情况中，在未用APC1预处理的细胞中获得的基础凋亡水平相当高。

实施例3

HER2受体在用APC1处理的小鼠中的MDA-MB-231肿瘤细胞上的表达

还示出了APC1增加注射有肿瘤细胞的小鼠中的TNBC细胞(MDA-MB-231)上的HER2表达，如下文详述的。

向雌性Balb/C裸鼠(5-6周龄)腹膜内注射8×10⁶个MDA-MB-231细胞。在肿瘤达到0.5cm×0.5cm的尺寸之后(通常在5天之后)，每周三次向小鼠注射APC1(350μg/小鼠)，持续两周(即在周日、周二和周四注射，持续2周，总计6次注射)。

为了监测APC1对在小鼠中生长的MDA-MB-231肿瘤细胞的作用，进行肿瘤切片的HER2免疫组织化学。如图8中展示的，虽然在对照细胞(图8A，从用盐水处理的小鼠中获得)中，在细胞表面未观察到HER2表达，但在从用APC1处理的小鼠中获得的细胞中(图8B)，存在明显的HER2表达。

鉴于以上结果并且不希望受理论束缚，APC1导致HER2在细胞表面表达，使得这些细胞易受针对HER2的基于HER2的抗癌疗法影响或对所述疗法敏感。

实施例4

赫赛汀对用APC1处理的MDA-MB-468细胞的作用

如上文展示的，APC1增加细胞上的HER2表达，并且从而允许癌症的基于HER2的抗体治疗特异性靶向细胞。为了证明另外的基于HER2的抗癌剂靶向用APC1预处理的TNBC细胞的能力，使用干扰HER2/neu受体的单克隆抗体赫赛汀。

图9示出了在用APC1和赫赛汀两者处理的TNBC细胞MDA-MB-468中，凋亡水平与仅用赫赛汀(10％)或仅用APC1(15％)处理的细胞中的凋亡水平相比更高(25％)。此外，用APC1和赫赛汀两者的组合处理的MDA-MB-468细胞中的凋亡水平与用单独的赫赛汀处理的N87细胞中的凋亡水平相当。

实施例5

用APC1处理TNBC细胞增加了Notch3蛋白的表达

如本领域已知的，神经源性位点缺口同源蛋白3(Notch3)在几种类型的癌症中过表达，并且目前正在作为抗癌药物的靶被研究。测定了施用APC1对TNBC细胞MDA-MB-231中的Notch3水平的影响，如上文详述的。

如图10中展示的，在APC1施用至MDA-MB-231细胞后，细胞膜上活性Notch3受体的表达增加，如通过膜蛋白级分的蛋白质印迹分析所示的，其对于3小时和5小时的孵育时间段是最高的。

该结果进一步证明了肽APC1在以上情况中诱导细胞蛋白膜蛋白表达的能力。

实施例6

用APC1处理TNBC细胞使得细胞对他莫昔芬敏感

将TNBC细胞在APC1存在下孵育，以便检查APC1是否还调节雌激素受体的表达。为此目的，用APC1预处理MDA-MB-231细胞，并且然后在他莫昔芬存在下孵育24小时-48小时。然后通过刃天青细胞存活力测定检查这些细胞的存活力，如上文详述的。

当与图11A所示的未用APC1预处理且在单独的他莫昔芬存在下生长的对照细胞相比时，如图11B中展示的，用APC1(250μg/ml的三个剂量)和他莫昔芬(持续24小时)处理的MDA-MB-231细胞示出降低的存活力。

当MDA-MB-231细胞用APC1(250μg/ml的三个剂量)和他莫昔芬(持续48小时)处理时，存活力的降低更明显，如从比较图12B与图12A可见的。

与未用APC1处理的MDA-MB-231细胞相比，在用APC1和他莫昔芬的组合处理的MDA-MB-231细胞中观察到的存活力降低说明，不受理论束缚，APC1对他莫昔芬的靶即雌激素受体的明显作用。换句话说，这些结果示出APC1增加癌细胞中雌激素受体的表达，使得这些细胞对他莫昔芬更敏感。

实施例7

用APC1处理MDA-MB-231细胞增加了雌激素受体α的表达

鉴于上文所示的结果，直接测定了雌激素受体α的表达水平。如图13中展示的，用抗雌激素受体α(ERα)抗体进行的蛋白质印迹分析显示，用APC1(250μg/ml)每周一次持续一周(图13中从左侧起泳道3至7)或每周两次持续3或4周(图13中从左侧起泳道9、10)处理的MDA-MB-231细胞中的雌激素受体α的表达水平的明显增加。

这些结果进一步说明，APC1增加癌细胞中的细胞部分的表达，这一次，细胞部分为雌激素受体。

实施例8

APC1增加了TNBC细胞对化学治疗剂的敏感性

除了示出APC1增加TNBC细胞对用针对特定细胞靶的剂的治疗的敏感性的以上结果之外，以下结果示出，APC1还增加了TNBC细胞对通过不同作用机制起作用的其他抗癌剂的敏感性。

为此目的，将TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468与APC1一起预孵育，并且然后在多柔比星或顺铂的存在下孵育，如上文详述的。如图14A中所示的，APC1以浓度依赖的方式增加以上TNBC细胞对多柔比星的敏感性。

APC1和顺铂的组合示出了相似的效果，如图14B中所示的。

实施例9

APC1增加了TNBC肿瘤对多柔比星的敏感性

除了示出APC1的施用增加TNBC细胞对多柔比星或顺铂的敏感性的以上结果之外，还测定了APC1和多柔比星的组合在接种有人TNBC细胞(肿瘤)的小鼠中的效果。

为此目的，如上文详述的，将小鼠用TNBC细胞接种，简言之，将32只裸鼠用TNBC细胞(MDA-MB-231，8x10⁶个细胞/小鼠)皮下接种。当肿瘤超过50mm³的体积时，将小鼠随机分成如下四组，每组8只小鼠。对照组仅用盐水处理，经APC1处理的组每周三次用15mg/kg剂量的APC1处理，经多柔比星和APC1处理的组每周两次用(15mg/kg)剂量的APC1且每周一次用多柔比星(3mg/kg)处理，并且经多柔比星处理的组每周一次仅用3mg/kg剂量的多柔比星处理。在整个实验中即持续5周重复这些剂量方案。

如图15中清楚示出的，尽管在对照组中，相对肿瘤体积线性增加，但在经多柔比星处理的组和经APC1处理的组中，存在肿瘤体积的适度增加(对于经APC1处理的组，效果更明显)。

显著地，在用APC1和多柔比星两者处理的小鼠中，存在明显的对肿瘤体积的协同作用，导致肿瘤生长的抑制以及甚至肿瘤尺寸的减小(相对于其原始尺寸)。

这些实施例清楚地示出，APC1增加TNBC细胞自身或当作为肿瘤存在于动物中时对化学治疗剂的敏感性。

实施例10

用于治疗卵巢肿瘤和胰腺肿瘤的APC1和多柔比星的组合

鉴于APC1和多柔比星的组合对TNBC肿瘤的作用，发明人还研究了以上组合对来源于其他癌症，即人卵巢癌和人胰腺癌的肿瘤的作用。

为此目的，将裸鼠用人卵巢细胞(OV90，9×10⁶个细胞/小鼠)或人胰腺癌细胞(Panc1，7×10⁶个细胞/小鼠)皮下接种。当肿瘤超过40mm³或50mm³的体积(分别对于OV90和Panc1)时，将小鼠随机分成如下四组，每组8只小鼠。对照组仅用盐水处理，经APC1处理的组每周三次用各自为15mg/kg剂量的APC1处理，经多柔比星和APC1处理的组每周两次用(各自为15mg/kg)剂量的APC1且每周一次用多柔比星(3mg/kg)处理，并且经多柔比星处理的组每周一次仅用3mg/kg剂量的多柔比星处理。在整个实验中即持续5周重复这些剂量方案。

如图16中所示，尽管在对照组中相对肿瘤体积线性增加，但在经多柔比星处理的组和经APC1处理的组中，存在肿瘤体积的适度增加，并且经APC1处理的组的效果更明显。

令人惊讶的是，在用APC1和多柔比星两者处理的小鼠中，存在明显的对肿瘤体积的协同作用，导致肿瘤生长的抑制(到第20天)和从第20天起到实验结束时肿瘤尺寸相对于原始肿瘤尺寸的减小。

接种到小鼠中的人胰腺癌肿瘤细胞示出了相似的协同作用，如图17中所示。

实施例11

APC1降低了人癌细胞中的谷胱甘肽水平

如本领域熟知的，抗癌药物的谷胱甘肽缀合和谷胱甘肽缀合物运输出细胞被认为是抗癌药物的解毒机制之一。

通常，谷胱甘肽可以与抗癌药物组合以形成较小毒性的和更大水溶性的缀合物。事实上，已发现谷胱甘肽相关酶在许多药物耐受性细胞中增加或过表达，导致药物耐受。

在本实施例中，发明人已研究了APC1对卵巢癌细胞、胰腺癌细胞和TNBC癌细胞中的谷胱甘肽水平的影响。

如上文详述的，将卵巢癌细胞OV90和OV3、胰腺癌细胞BxPC3和Panc1以及TNBC癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468用APC1处理，并且然后测量这些细胞中的相对谷胱甘肽水平，如上文详述的。

如图18A、图18B和图18C中所示，卵巢癌细胞、胰腺癌细胞和TNBC癌细胞中的谷胱甘肽水平分别在用APC1处理这些细胞后降低。

不希望受理论束缚，这些结果可以解释APC1藉以发挥作用以增加癌细胞对用多种剂的治疗的敏感性的至少一种途径，即显示出APC1发挥作用以降低细胞的谷胱甘肽水平，从而降低细胞中的药物耐受性水平。

序列表

<110> 两合生物科技公司

<120> 使癌细胞对抗癌治疗敏感的方法

<130> 2535789

<150> US 62/507,939

<151> 2017-05-18

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> KTPAF50的C末端肽

<400> 1

Glu Lys Gly Ala Ala Phe Ser Pro Ile Tyr Pro Arg Arg Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 74

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Pro Gly His Ser Arg Leu Leu Ser Ile Leu Val Ser Gly Leu Cys

1 5 10 15

Val Val Gly Ser Ser Ile Gly Val Leu Arg Arg Arg Glu Gln Ala Glu

20 25 30

Arg Gly Ser Arg Arg Cys Ala Ile Ala Gly Glu Glu Arg Ala Met Leu

35 40 45

Ser Pro Ser Pro Leu Pro Glu Thr Pro Phe Ser Pro Glu Lys Gly Ala

50 55 60

Ala Phe Ser Pro Ile Tyr Pro Arg Arg Lys

65 70

<210> 3

<211> 50

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Leu Arg Arg Arg Glu Gln Ala Glu Arg Gly Ser Arg Arg Cys Ala Ile

1 5 10 15

Ala Gly Glu Glu Arg Ala Met Leu Ser Pro Ser Pro Leu Pro Glu Thr

20 25 30

Pro Phe Ser Pro Glu Lys Gly Ala Ala Phe Ser Pro Ile Tyr Pro Arg

35 40 45

Arg Lys

50

Claims (14)

1. 分离的多肽和至少一种抗癌剂在制备用于治疗有相应需要的患者中的三阴性乳腺癌(TNBC)的药物中的用途，所述分离的多肽由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列组成，其中所述至少一种抗癌剂是针对HER2的单克隆抗体或缀合抗体、他莫昔芬、多柔比星或顺铂。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述分离的多肽增加所述患者对所述至少一种抗癌剂的响应性。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中当在没有所述分离的多肽的情况下进行施用时，所述患者对所述抗癌剂无响应。

4. 根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述分离的多肽调节人表皮生长因子受体2 (HER2/neu受体)和雌激素受体中的至少一种的表达。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中针对HER2的所述单克隆抗体是赫赛汀，并且针对HER2的所述缀合抗体是Kadcyla。

6. 分离的多肽在制备用于使有相应需要的患者中的三阴性乳腺癌(TNBC)细胞对至少一种抗癌剂敏感的药物中的用途，所述分离的多肽由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列组成，其中所述至少一种抗癌剂是针对HER2的单克隆抗体或缀合抗体或他莫昔芬，并且其中所述分离的多肽调节所述患者的人表皮生长因子受体2 (HER2/neu受体)和雌激素受体中的至少一种的表达，从而使所述癌细胞对所述至少一种抗癌剂敏感。

7.根据权利要求6所述的用途，其中针对HER2的所述单克隆抗体是赫赛汀，并且针对HER2的所述缀合抗体是Kadcyla。

8.根据权利要求6或7所述的用途，其中，当所述药物被使用时，还向所述患者施用所述至少一种抗癌剂。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途，其中所述分离的多肽和/或所述至少一种抗癌剂被包含在药物组合物中，所述药物组合物任选地还包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的用途，其中，当所述药物被使用时，所述分离的多肽在所述至少一种抗癌剂的施用之前、与所述至少一种抗癌剂的施用同时地或在所述至少一种抗癌剂的施用之后被施用。

11.以下(i)和(ii)在制备用于治疗有相应需要的患者中的三阴性乳腺癌(TNBC)的试剂盒中的用途：

(i) 分离的多肽和任选地药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂，所述分离的多肽由SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列组成；

(ii) 抗癌剂和任选地药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂，其中所述抗癌剂是针对HER2的单克隆抗体或缀合抗体、他莫昔芬、多柔比星或顺铂。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述试剂盒还包含使用说明书。

13. 根据权利要求11或权利要求12所述的用途，其中所述抗癌剂与人表皮生长因子受体2 (HER2/neu受体)和雌激素受体中的至少一种直接地或间接地相互作用。

14.根据权利要求11至13中任一项所述的用途，其中针对HER2的所述单克隆抗体是赫赛汀，并且针对HER2的所述缀合抗体是Kadcyla。