CN111265658A - 一种新的缺氧信号调控分子及其应用 - Google Patents

一种新的缺氧信号调控分子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新的缺氧信号调控分子及其应用，该缺氧信号调控分子为去泛素化酶OTUD6B蛋白。实验证明，去泛素化酶OTUD6B可以抑制肝癌细胞的转移，其表达水平与肝癌细胞转移和复发有显著的相关性：去泛素化酶OTUD6B的表达量越低，肝癌患者的总生存期越短、肿瘤复发率越高；去泛素化酶OTUD6B能够抑制血管的生成；去泛素化酶OTUD6B可以下调HIF‑1α和HIF‑2α的蛋白水平，抑制多个HIF靶基因的表达；去泛素化酶OTUD6B能够增加VHL的蛋白稳定性，对肝癌细胞的迁移能力依赖于VHL蛋白。由此可见，去泛素化酶OTUD6B是缺氧信号调控分子，可以预防和/或治疗肝细胞癌及其它缺氧相关性疾病。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种新的缺氧信号调控分子及其应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种新的缺氧信号调控分子及其应用。
背景技术
肝癌主要包括肝细胞癌(Hepatocelluar carcinoma，HCC)和肝胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)两种类型。HCC是最常见的原发性肝癌类型，占整个肝癌发病类型的85％到95％之间。肝硬化(由炎症和纤维化导致的慢性肝损伤)和病毒感染(主要是乙肝病毒)是肝细胞癌发生的重要因素。长期酗酒和其它一些由糖尿病和肥胖引起的代谢综合征也是诱导肝细胞癌发生的常见因素。研究表明，吸烟和摄入黄曲霉素B1也可以促进HCC的发生发展；感染腺相病毒2也能促进HCC的发生，这一现象尤其在没有肝硬化的病患身上更为明显。
肝细胞癌转移起始于HCC细胞，从最初形成HCC的肿瘤部位转移到相邻的细胞外基质，随后HCC细胞通过血管内皮扩散到循环系统。在血管循环系统存活下来的HCC肿瘤细胞，最终渗出循环系统进入到其它部位形成克隆。在肝脏内部转移过程中，HCC细胞主要通过肝门静脉运输到肝脏的其它部位；在肝脏外部转移过程中，HCC细胞主要通过肝静脉运输到血液循环系统中，然后心脏将循环的HCC细胞泵送到肺部，最终到了其它器官，如骨骼，大脑和肾上腺腺体。
肝癌细胞区别于正常细胞的一个主要特征是生长失去控制，肝癌细胞的快速生长需要消耗更多的氧气，这样就导致了肝癌组织区域的氧气不足造成缺氧现象。缺氧诱导因子(Hypoxia inducible factor，HIF)-α是缺氧信号的主要效应分子，这个分子的蛋白稳定性与氧气的浓度密切相关。
泛素是一个由76个氨基酸组成的真核多肽，可以标记不需要的或受损的蛋白质并将其降解。随后这些被降解的小分子再用于其它合成代谢过程。细胞内超过80％的蛋白质都是由泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome system pathway，UPS)降解的。泛素化是一个由多个步骤完成最终将泛素分子共价结合到底物蛋白上的一个过程。泛素化修饰一般有三种类型，一种是单个泛素分子结合到目的蛋白上，一种是多个单个泛素分子结合到目的蛋白上，还有一种是多聚泛素化。由于泛素化调节了从蛋白质降解到蛋白质-蛋白质相互作用，从内吞作用到细胞周期进程，从底物活化到失活等多种细胞过程，泛素化修饰系统中的一种或多种成分出错就会导致多种的疾病的发生。
人类基因组编码约100个去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUB)。根据结构不同，DUB分为UCH、OTU(Ovarian Tumor Proteases)、USP、JAMM、MJD和MCPIP六个亚家族。OTU亚家族包含16个成员分子。OTU家族多个分子与肿瘤的发生发展有关，如CYLD通过影响NF-κB信号通路参与肺癌、脑癌和卵巢癌的发生发展；OTUB1通过调控Snail蛋白的稳定性促进食管鳞状细胞癌转移；OTUB2通过稳定YAP/TAZ促进乳腺癌的转移；OTUD3通过稳定PTEN抑制乳腺癌发生发展；OTUD5可以促进p53的蛋白稳定性。OTUD6B可以阻滞B淋巴细胞的循环，OTUD6B缺失可以引起与癫痫发作和变形特征相关的智力残疾综合征。
发明内容
本发明的目的在于治疗缺氧相关性疾病，如肝癌。
本发明首先保护去泛素化酶OTUD6B在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下C1)至C12)中的至少一种：
C1)抑制缺氧诱导因子信号通路；
C2)抑制缺氧诱导因子信号通路上基因的表达；
C3)抑制缺氧诱导因子信号通路下游靶基因的表达；
C4)抑制缺氧诱导因子的蛋白水平；
C5)降低缺氧诱导因子的转录因子活性；
C6)负向调控缺氧信号；
C7)预防和/或治疗缺氧相关性疾病；
C8)预防和/或治疗肝癌；
C9)抑制肝癌细胞的转移；
C10)提高肝癌患者生存率和/或总生存期；
C11)降低肝癌复发风险；
C12)抑制血管生成。
本发明还保护去泛素化酶OTUD6B的应用，可为如下C1)至C12)中的至少一种：
C1)抑制缺氧诱导因子信号通路；
C2)抑制缺氧诱导因子信号通路上基因的表达；
C3)抑制缺氧诱导因子信号通路下游靶基因的表达；
C4)抑制缺氧诱导因子的蛋白水平；
C5)降低缺氧诱导因子的转录因子活性；
C6)负向调控缺氧信号；
C7)预防和/或治疗缺氧相关性疾病；
C8)预防和/或治疗肝癌；
C9)抑制肝癌细胞的转移；
C10)提高肝癌患者生存率和/或总生存期；
C11)降低肝癌复发风险；
C12)抑制血管生成。
本发明还保护将去泛素化酶OTUD6B作为药物靶点的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下C1)至C12)中的至少一种：
C1)抑制缺氧诱导因子信号通路；
C2)抑制缺氧诱导因子信号通路上基因的表达；
C3)抑制缺氧诱导因子信号通路下游靶基因的表达；
C4)抑制缺氧诱导因子的蛋白水平；
C5)降低缺氧诱导因子的转录因子活性；
C6)负向调控缺氧信号；
C7)预防和/或治疗缺氧相关性疾病；
C8)预防和/或治疗肝癌；
C9)抑制肝癌细胞的转移；
C10)提高肝癌患者生存率和/或总生存期；
C11)降低肝癌复发风险；
C12)抑制血管生成。
本发明还保护抑制去泛素化酶OTUD6B活性和/或表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能可为如下A1)至A10)中的至少一种：
A1)激活缺氧诱导因子信号通路；
A2)促进缺氧诱导因子信号通路上基因的表达；
A3)促进缺氧诱导因子信号通路下游靶基因的表达；
A4)促进缺氧诱导因子的蛋白水平；
A5)提高缺氧诱导因子的转录因子活性；
A6)正向调控缺氧信号；
A7)促进肝癌细胞的转移；
A8)降低肝癌患者生存率和/或总生存期；
A9)提高肝癌复发风险；
A10)促进血管生成。
本发明还保护抑制去泛素化酶OTUD6B活性和/或表达量的物质的应用，可为如下A1)至A10)中的至少一种：
A1)激活缺氧诱导因子信号通路；
A2)促进缺氧诱导因子信号通路上基因的表达；
A3)促进缺氧诱导因子信号通路下游靶基因的表达；
A4)促进缺氧诱导因子的蛋白水平；
A5)提高缺氧诱导因子的转录因子活性；
A6)正向调控缺氧信号；
A7)促进肝癌细胞的转移；
A8)降低肝癌患者生存率和/或总生存期；
A9)提高肝癌复发风险；
A10)促进血管生成。
上述任一所述的应用中，所述产品可为药物。
本发明还保护产品甲或产品乙。
所述产品甲可含有去泛素化酶OTUD6B；所述产品甲的功能可为如下C1)至C12)中的至少一种：
C1)抑制缺氧诱导因子信号通路；
C2)抑制缺氧诱导因子信号通路上基因的表达；
C3)抑制缺氧诱导因子信号通路下游靶基因的表达；
C4)抑制缺氧诱导因子的蛋白水平；
C5)降低缺氧诱导因子的转录因子活性；
C6)负向调控缺氧信号；
C7)预防和/或治疗缺氧相关性疾病；
C8)预防和/或治疗肝癌；
C9)抑制肝癌细胞的转移；
C10)提高肝癌患者生存率和/或总生存期；
C11)降低肝癌复发风险；
C12)抑制血管生成。
所述产品乙可含有上述任一所述抑制去泛素化酶OTUD6B活性和/或表达量的物质；所述产品乙的功能可为如下A1)至A10)中的至少一种：
A1)激活缺氧诱导因子信号通路；
A2)促进缺氧诱导因子信号通路上基因的表达；
A3)促进缺氧诱导因子信号通路下游靶基因的表达；
A4)促进缺氧诱导因子的蛋白水平；
A5)提高缺氧诱导因子的转录因子活性；
A6)正向调控缺氧信号；
A7)促进肝癌细胞的转移；
A8)降低肝癌患者生存率和/或总生存期；
A9)提高肝癌复发风险；
A10)促进血管生成。
所述产品甲或产品乙可为药物。
上述任一所述C2)或所述A2)中，缺氧诱导因子信号通路上基因具体可为缺氧诱导因子信号通路上与细胞迁移相关的基因(如DCN、NOS2DUSP6)。
上述任一所述C3)或所述A3)中，缺氧诱导因子信号通路下游靶基因可为VEGF基因、MMP2基因和/或LOXL2基因。
上述任一所述C7)中，缺氧相关性疾病具体可为激活缺氧诱导因子信号通路导致的疾病。
上述任一所述促进血管生成可表现为血管数量增加。
上述任一所述抑制血管生成可表现为血管数量减少。
上述任一所述血管可为肿瘤组织中血管。所述肿瘤组织具体可由肝癌细胞增殖形成。
上述任一所述缺氧诱导因子可为HIF-1α和/或HIF-2α。
上述任一所述肝癌可为肝细胞癌。
上述任一所述肝癌细胞可为MHCC-LM3细胞、Bel-7402细胞和/或SMMC-7721细胞。
上述任一所述抑制去泛素化酶OTUD6B活性和/或表达量的物质也属于本发明的保护范围。
去泛素化酶OTUD6B作为缺氧信号调控分子的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述抑制去泛素化酶OTUD6B活性和/或表达量的物质可为z1)或z2)或z3)或z4)或z5)或z6)：
z1)寡聚核酸1；所述寡聚核酸1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
z2)寡聚核酸2；所述寡聚核酸2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
z3)含有所述寡聚核酸1的慢病毒载体；
z4)含有所述寡聚核酸2的慢病毒载体；
z5)以所述寡聚核酸1为靶点，由shRNA表达系统合成的shRNA；
z6)以所述寡聚核酸2为靶点，由shRNA表达系统合成的shRNA。
上述任一所述抑制去泛素化酶OTUD6B活性和/或表达量的物质具体可为以所述寡聚核酸1为靶点，以pGreenPuroTM慢病毒敲低载体或载体lentiCRISPR v2为载体，构建的慢病毒载体。
上述任一所述抑制去泛素化酶OTUD6B活性和/或表达量的物质具体可为将OTUD6B基因克隆到pCDH-Puro或pQXICH过表达载体上获得的重组载体。
上述任一所述去泛素化酶OTUD6B(简称OTUD6B)的Gene ID可为51633。
SMMC-7721细胞中，编码OTUD6B的基因(即OTUD6B基因)的GeneBank号具体可为NM_016023.5。
实验证明，去泛素化酶OTUD6B可以抑制肝癌细胞的转移，其表达水平与肝癌细胞转移和复发有显著的相关性：去泛素化酶OTUD6B的表达量越低，肝癌患者的总生存期越短、肿瘤复发率越高；去泛素化酶OTUD6B能够抑制血管的生成；去泛素化酶OTUD6B可以下调HIF-1α和HIF-2α的蛋白水平，抑制多个HIF靶基因的表达；去泛素化酶OTUD6B能够增加VHL的蛋白稳定性，对肝癌细胞的迁移能力依赖于VHL蛋白。由此可见，去泛素化酶OTUD6B是缺氧信号调控分子，可以预防和/或治疗肝细胞癌及其它缺氧相关性疾病。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为稳定敲低OTUD6B对肝癌细胞迁移能力的影响。
图2为稳定敲低OTUD6B对肝癌细胞增殖能力的影响。
图3为稳定敲低OTUD6B促进肿瘤细胞的肝转移和肺转移转移。A为1×106肝癌细胞经尾静脉注射到裸鼠体内，10周后取小鼠肝脏和肺脏检测GFP荧光信号，mean±SEM，**表示p<0.01；B、D为肝(B)、肺(D)组织病理切片的H&E染色分析。
图4为OTUD6B在肝癌组织的表达及其临床相关性。A为不同肝癌病理分期病人肝癌组织中OTUD6B蛋白表达水平分析；B为OTUD6B低、中、高表达组HCC患者癌组织中OTUD6B免疫组化染色结果；C为OTUD6B表达水平与HCC患者生存率及复发风险分析。P<0.05视为有统计学差异。
图5为OTUD6B调控HIF下游靶基因的表达。
图6为OTUD6B可以调控HIF的蛋白水平和转录活性。
图7为OTUD6B调控VHL蛋白水平变化，但不影响VHL mRNA水平。
图8为敲低OTUD6B后VHL蛋白稳定性下降。
图9为MG132可以恢复VHL的蛋白水平。
图10为敲低OTUD6B能够增加VHL的泛素化。
图11为过表达OTUD6B可以减少VHL的泛素化。
图12为肝癌组织中OTUD6B和VHL表达水平的相关性。
图13为外源VHL过表达能够挽救敲低OTUD6B对肿瘤转移的影响。
图14为OTUD6B通过稳定VHL，负调控HIF信号的示意图。
图15为敲低OTUD6B后肿瘤组织中血管的数量增加。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中，两组单点数据均采用学生t检验(students test)，两组多点数据均采用two-way ANOVA test。采用Graphpad Prism 5软件进行分析，P<0.05视为有统计学差异。
下述实施例中涉及的试剂名称及其购买途径信息见表1。
表1
Figure BDA0002400772190000061
下述实施例中涉及的抗体名称、购买途径信息及稀释度见表2。
表2
Figure BDA0002400772190000062
Figure BDA0002400772190000071
下述实施例涉及的质粒名称及其构建方法见表3。
表3
Figure BDA0002400772190000072
HEK293T细胞、HEK293FT细胞、MHCC-LM3细胞、Bel-7402细胞和SMMC-7721细胞均由申请人(即中国人民解放军军事科学院军事医学研究院)提供。其中HEK293T细胞和HEK293FT细胞均为人肾上皮细胞，MHCC-LM3细胞、Bel-7402细胞和SMMC-7721细胞均为人肝癌细胞系。所有细胞均在含10％(v/v)FBS的DMEM培养基中培养。
HA-Ub WT、pET28-a和pGEX-6P-1载体由申请人(即中国人民解放军军事科学院军事医学研究院)提供。
Flag-VHL和Myc-VHL由华中科技大学生命科学学院刘木根教授馈赠，记载于如下文献中：Chen J，Liu F，Li H，Archacki S，Gao M，Liu Y，Liao S，Huang M，Wang J，Yu S，LiC，Tang Z，Liu M.pVHL interacts with Ceramide kinase like(CERKL)proteinandubiquitinates it for oxygen dependent proteasomaldegradation.CellSignal.2015；27(11):2314-23.
下述实施例中，细胞迁移实验的步骤如下：
①选取生长状态良好的细胞，胰酶消化，细胞计数仪计数。
②在24孔板中加入含600μL含20％(v/v)FBS的培养基，取出从Corning购买的孔径为8μm的transwell小室置于其中。
③在上室中加入200μL含有1×105个细胞的无血清培养基。
④注意小室和下室之间不要产生气泡，气泡的存在会严重影响细胞的迁移。
⑤将24孔板置于37℃、5％CO2细胞培养箱，培养24h。
⑥24h后取出，用枪轻轻吸取上室溶液，然后用镊子将小室取出置于4％多聚甲醛中，固定20min。
⑦将小室放入0.5％的结晶紫溶液中，着色30min。
⑧将小室用PBS漂洗几次，至不再有蓝色液体出现。
⑨用棉签轻轻擦去上室中的细胞，显微镜下拍照。
下述实施例中，尾静脉肺转移实验的步骤如下：
①培养细胞达到实验用数量，待细胞状态良好时，消化细胞，细胞计数。
②将细胞溶于PBS中，置于冰上。
③对4-5周的裸鼠进行尾静脉注射，每组5只，每只注射1×106个细胞。
④在SPF动物房饲养10周后，处死裸鼠，取出肺。
⑤将肺置于4％多聚甲醛中固定24h，后送公司做HE染色切片。
⑥对HE着色切片进行观察、记录、分析。
下述实施例中，筛选稳定细胞株的步骤如下：
①构建慢病毒载体。
②将病毒包装质粒PMD、SPA和慢病毒载体按照1:2:3的比例转染到目的细胞中。
③分别在转染细胞后的24h或48h，收集上清培养基。将含病毒液的培养基上清用0.45μm过滤器过滤，以除去可能含有的杂质。
④将目的细胞铺在6孔板中，待其密度约为30％-40％时，将病毒和培养基按照1:1的比例加入到6孔板中，24h后，重复感染一次。
⑤加入嘌呤霉素(Puromycin，终浓度2μg/mL)或潮霉素(Hygromycin，终浓度20μg/mL)对细胞进行筛选，时间约为一周。
⑥western blot检测稳定细胞株构建是否成功。
具体的，慢病毒载体为将敲低靶向序列构建到pGreenPuroTM慢病毒敲低载体上获得、将敲低靶向序列构建到载体lentiCRISPR v2上获得或OTUD6B基因克隆到pCDH-Puro或pQXICH稳定过表达载体上获得。
敲低靶向序列见表4。
表4
Figure BDA0002400772190000081
Figure BDA0002400772190000091
去泛素化酶OTUD6B(简称OTUD6B)的Gene ID为51633。SMMC-7721细胞中，编码OTUD6B的基因(即OTUD6B基因)的GeneBank号为NM_016023.5。
VHL蛋白的Gene ID为7428。
实施例1、OTUD6B抑制肝癌细胞的转移
一、OTUD6B体外抑制肝癌细胞迁移
1、构建敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞和敲低OTUD6B的Bel-7402细胞。
2、Western Blot检测敲低效率和细胞迁移相关蛋白标志物(E-Cadhenrin、Snail)的表达(抗E-Cadhenrin抗体和抗Snail抗体均为Santa Cruz公司的产品)。
检测结果见图1。结果表明，两条靶向shRNA序列均有较高的敲低效率。
3、利用Transwell assay进行细胞迁移实验。
结果见图1。结果表明，与非靶向敲低序列相比，OTUD6B的下调显著促进了MHCC-LM3细胞的迁移能力；敲低OTUD6B后，Bel-7402细胞的迁移能力也显著增强。
将敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞分别命名为shOTUD6B-#1LM3和shOTUD6B-#2LM3。
将敲低OTUD6B的Bel-7402细胞分别命名为shOTUD6B-#17402和shOTUD6B-#27402。
上述结果提示，OTUD6B可能与肝癌细胞的迁移密切相关。
二、OTUD6B对肝癌细胞增殖能力无显著影响
无限增殖能力是癌细胞的一个主要特征，为检测OTUD6B是否影响肝癌细胞的增殖能力，采用CCK-8增殖实验分别检测shOTUD6B-#1LM3、shOTUD6B-#2LM3、shOTUD6B-#17402和shOTUD6B-#27402的增殖能力。CCK-8(cell counting kit-8)试剂中含有WST-8，它可以被线粒体中的脱氢酶还原为甲瓒，其在450nm的吸光值可以间接反映活细胞数量。
检测结果见图2。结果表明，OTUD6B对肝癌细胞系(如MHCC-LM3细胞、Bel-7402细胞)的增殖能力未产生显著影响。
三、敲低OTUD6B促进肝癌细胞在体内的转移
为进一步验证OTUD6B是否在体内肿瘤的转移过程中扮演重要作用，本发明的发明人进行了尾静脉肺转移实验。首先将敲低OTUD6B的shRNA序列构建到含有GFP绿色荧光标签的慢病毒包装载体pGreen-puro上，构建含有GFP标签的OTUD6B敲低细胞株(即含有GFP标签的、敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞)；然后采用尾静脉注射的方式，把细胞输送到裸鼠体内，10周后，将肝脏和肺脏取出，通过小动物荧光成像系统测定发现敲低OTUD6B组的荧光值显著高于对照组(图3中A、C)。病理组织切片后H&E染色显示敲低OTUD6B促进肝癌细胞系MHCC-LM3细胞在裸鼠中的肝肺转移灶的生成(图3中B、D)。
细胞迁移实验和裸鼠尾静脉肺转移实验表明，OTUD6B抑制肝癌细胞的迁移。OTUD6B在肝细胞癌的发生发展过程中可能扮演着负角色。
四、OTUD6B与HCC患者的生存率呈正相关性
为了进一步分析OTUD6B在HCC组织中的表达及其与肿瘤患者存活和临床病理指标的相关性。本发明的发明人利用免疫组化技术检测肝癌组织芯片中OTUD6B在90例HCC患者癌组织及其对应癌旁组织中的表达。
按照OTUD6B的表达水平，将90例HCC患者分为高表达、中表达和低表达组三组。利用SPSS2.0软件分析三组病人的生存率和复发风险。
结果见图4。结果表明，OTUD6B在肝细胞癌组织和癌旁组织中的表达无显著差异；OTUD6B表达水平与HCC患者的生存率及复发风险显著相关；OTUD6B低表达HCC患者的生存率显著低于OTUD6B中或高表达患者(P＝0.0097)，而其肿瘤复发风险也显著高于中或高表达患者(P＝0.0223)。
临床HCC组织样本分析显示，OTUD6B的蛋白表达水平与HCC病患的肝癌细胞转移和复发有显著的相关性：OTUD6B低表达的HCC病患总生存期短，肿瘤复发率高。
由此可见，OTUD6B作为抑癌基因可以抑制肝癌细胞的转移。
实施例2、OTUD6B为缺氧信号调控分子
一、RNA-Seq分析
提取敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞和MHCC-LM3细胞的RNA，进行转录组测序，分析差异基因的表达。
部分测序结果见表5。结果表明，敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞上调的基因中有较多基因和细胞迁移相关，进一步生物信息学分析，发现其中80％的基因(如DCN、NOS2DUSP6等)可以富集到HIF信号通路。
表5
Figure BDA0002400772190000101
Figure BDA0002400772190000111
注：N为否，Y为是。
二、OTUD6B抑制HIF下游靶基因的表达
血管内皮生长因子(Vascular end othelial growth factor，VEGF)是HIF的一个靶基因，它通过和配体VEGFR结合以激活下游调控血管生成的信号途径，促进癌细胞的转移。MMP2基因、LOXL2基因也是与细胞迁移有关的HIF的下游靶基因。
1、构建过表达OTUD6B的MHCC-LM3细胞，命名为OTUD6BLM3。
2、实时定量PCR检测细胞(shOTUD6B-#1LM3、shOTUD6B-#2LM3或OTUD6BLM3)mRNA中VEGF基因、MMP2基因和LOXL2基因的相对表达水平。
检测VEGF基因的引物为5’GAGGAGCAGTTACGGTCTGTG-3’和5’-TCCTTTCCTTAGCTGACACTTGT-3’。
检测MMP2基因的引物为5’-TGACTTTCTTGGATCGGGTCG-3’和5’-AAGCACCACATCAGATGACTG-3’。
检测LOXL2基因的引物为5’-GGGTGGAGGTGTACTATGATGG-3’和5’-CTTGCCGTAGGAGGAGCTG-3’。
检测结果见图5。结果表明，敲低OTUD6B可以上调HIF下游靶基因(如VEGF基因、MMP2基因、LOXL2基因)的表达，过表达OTUD6B则会抑制HIF下游靶基因(如VEGF基因、MMP2基因、LOXL2基因)的表达。
三、OTUD6B抑制HIF活性
转录组测序分析结果显示OTUD6B可以影响HIF信号通路。缺氧诱导因子(Hypoxiainducible factor，HIF)-α是缺氧信号的主要效应分子，而缺氧环境有利于肿瘤的转移，这在另一方面也印证了OTUD6B抑制肝癌细胞转移的功能。
1、作为HIF信号的主要标志性分子，对HIF-α是否受OTUD6B的调控进行了检测。考虑到OTUD6B是去泛素化酶，首先想到HIF-α的蛋白水平是否发生了变化。
western blot检测结果表明(图6中A)，敲低OTUD6B后，HIF-1α和HIF-2α的蛋白水平上调。
2、实时荧光定量PCR检测敲低OTUD6B后mRNA中HIF-1α基因和HIF-2α基因的相对表达水平。
检测HIF-1α基因的引物为5’-TTCCCGACTAGGCCCATTC-3’和5’-CAGGTATTCAAGGTCCCATTTCA-3’。
检测HIF2-α基因的引物为5’-CGGAGGTGTTCTATGAGCTGG-3’和5’-AGCTTGTGTGTTCGCAGGAA-3’。
结果表明(图6中B和C)，敲低OTUD6B后HIF-1α和HIF2-α的mRNA水平并未发生显著的变化。
3、荧光素酶报告实验发现，缺氧条件下，敲低OTUD6B，HIF的转录因子活性显著升高(图6中D)。
4、构建过表达OTUD6B的SMMC-7721细胞，命名为OTUD6BOE。OTUD6B OE中，HIF-1α和HIF-2α的蛋白水平下调(图6中E)，mRNA水平同样变化不显著(图6中F)，转录活性降低(图6中G)。
上述结果表明，通过RNA转录组测序分析发现OTUD6B可以影响HIF信号途径中多个基因的差异表达；OTUD6B可以下调HIF-1α和HIF-2α的蛋白水平，抑制多个靶基因(如VEGF基因、MMP2基因、LOXL2基因)的表达。
由此可见，OTUD6B是一种新的缺氧信号调控分子。
实施例3、OTUD6B通过调控VHL-HIF途径影响肝癌细胞迁移
一、OTUD6B稳定VHL蛋白水平
OTUD6B可以调控HIF-1α和HIF-2α的蛋白水平而其mRNA表达水平未发生显著改变，这一结果提示OTUD6B对HIF的调控可能是通过蛋白质翻译后修饰途径进行的，又联想到OTUD6B是去泛素化酶，因此推测OTUD6B通过调控其泛素化过程调控其稳定性。如果OTUD6B是去HIF的泛素化修饰，应该对其稳定性起正调控作用，但是敲低OTUD6B后,HIF-1α和HIF-2α的蛋白水平是上调的，所以推测OTUD6B可能通过调控HIF-1α和HIF-2α的E3泛素连接酶的稳定性继而调控其蛋白水平。
VHL是一个抑癌蛋白，其主要的功能是作为E3对HIF-1α和HIF-2α进行泛素化降解。
1、western blot分别检测敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞、敲低OTUD6B的Bel-7402细胞和过表达OTUD6B的SMMC-7721细胞中VHL蛋白水平。检测结果分别见图7中A、C和E。结果表明，敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞和敲低OTUD6B的Bel-7402细胞中VHL蛋白水平均显著下降，而过表达OTUD6B的SMMC-7721细胞中VHL的蛋白水平显著上调。
实时荧光定量PCR分别检测敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞、敲低OTUD6B的Bel-7402细胞和过表达OTUD6B的SMMC-7721细胞mRNA中的VHL基因的相对表达水平。检测VHL基因的引物为5’-GGGAACGGGGTGGGTTTAG-3’和5’-GCTCGCGTGAGTTCACAGA-3’。检测结果分别见图7中B、D和F。结果表明，敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞、敲低OTUD6B的Bel-7402细胞和过表达OTUD6B的SMMC-7721细胞mRNA中的VHL基因的相对表达水平无显著差异。
2、利用10μg/mL的放线菌酮(cycloheximide，CHX)分别处理MHCC-LM3细胞和敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞0h、4h、8h和12h，在阻止蛋白质合成的情况下，检测VHL的蛋白水平，进而分析VHL半衰期的变化。检测结果见图8。结果表明，敲低OTUD6B能够显著减少肝癌细胞MHCC-LM3中VHL蛋白的半衰期。
上述结果表明，去泛素化酶OTUD6B可以稳定VHL蛋白水平而mRNA水平未有显著改变。
二、MG132恢复VHL蛋白水平
为了验证OTUD6B对VHL的调控是否经过泛素蛋白酶体途径进行的，进行MG132恢复实验。具体步骤如下：
1、将敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞铺在6孔板中。
2、待细胞密度为60％-70％时，在敲低细胞株中加入蛋白酶体抑制剂MG132，培养8h。
3、收集蛋白，western blot检测VHL蛋白。
western blot结果见图9。结果表明，加入MG132后，OTUD6B对VHL的调控可以得到恢复。
三、OTUD6B抑制VHL的泛素化修饰
为了验证OTUD6B作为一个去泛素化酶，是否能够直接影响VHL的泛素化水平，利用细胞内泛素化实验检测敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞中VHL的泛素化修饰。具体步骤如下：
1、将敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞、过表达OTUD6B的MHCC-LM3细胞或MHCC-LM3细胞铺在10cm的培养皿中。
2、利用脂质体转染方法同时转染Flag-VHL和His-Ub质粒。
3、在培养液中加入MG132处理8h，收集细胞，利用RIPA裂解液裂解细胞。
4、将裂解液加到鏊合了镍离子的亲和层析柱中，亲和吸附His-Ub蛋白及与其相互作用的蛋白，然后用咪唑竞争结合镍离子，将吸附在层析柱上的His-Ub蛋白复合体洗脱下来。
5、Western Blot检测洗脱液中Flag-VHL的表达量，在蛋白泳道上可见VHL蛋白呈弥散状分布，即是检测到的泛素化修饰的VHL蛋白。
Western Blot结果见图10。结果表明，敲低OTUD6B能够显著增加VHL的泛素化。
利用细胞内泛素化实验检测过表达OTUD6B的SMMC7721细胞中VHL的泛素化修饰。结果见图11。结果表明，过表达OTUD6B能够显著抑制VHL的泛素化。
上述结果表明，OTUD6B通过泛素蛋白酶体途径调控VHL的蛋白稳定性。
四、OTUD6B与VHL临床相关性分析
VHL作为一个抑癌蛋白可以抑制癌细胞的迁移，同时上述结果表明OTUD6B可以抑制肝癌细胞的迁移且OTUD6B可以调控VHL的稳定性，为了研究OTUD6B在肝细胞癌中的功能是否与VHL有相关性，分别用OTUD6B抗体、VHL抗体对肝癌组织芯片上不同恶性程度的HCC组织进行免疫组织化学分析(图12中A)；之后利用SPSS2.0软件进行相关性分析,p<0.05视为有统计学差异。
检测结果见图12中B。结果表明，肝癌组织中OTUD6B与VHL蛋白的表达呈显著正相关。
五、OTUD6B抑制细胞迁移的功能依赖VHL
1、western blot检测MHCC-LM3细胞、敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞、过表达VHL的MHCC-LM3细胞或过表达VHL且敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞中OTUD6B和VHL蛋白表达情况。
检测结果见图13中A。
2、将MHCC-LM3细胞、敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞、过表达VHL的MHCC-LM3细胞或过表达VHL且敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞进行细胞迁移实验，然后graphpad 5.0统计分析迁移细胞数量。
检测结果见图13中B和C。结果表明，VHL能够挽救敲低OTUD6B对细胞迁移能力的影响。
3、采用尾静脉注射的方式，将MHCC-LM3细胞(作为对照组)、敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞或过表达VHL且敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞输送到裸鼠体内，10周后，将肝脏和肺脏取出，通过小动物荧光成像系统测定发现敲低OTUD6B组的荧光值显著高于对照组(图13中D、E)。VHL能够挽救敲低OTUD6B对细胞在体内转移能力的影响。
上述结果表明，去泛素化酶OTUD6B可以通过去泛素化VHL保持其蛋白稳定性。OTUD6B通过调控VHL-HIF途径影响肝癌细胞迁移(图14)。
实施例4、OTUD6B抑制肿瘤组织中血管生成
血管生成受缺氧信号的调控，鉴于去泛素化酶OTUD6B能够抑制缺氧诱导因子活性，进一步确定OTUD6B对组织内血管形成的影响。具体步骤如下：将1×106个敲低OTUD6B的MHCC-LM3细胞或MHCC-LM3细胞注射到裸鼠皮下，正常饲喂6周以后，待皮下肿瘤长到1mm3左右，处死动物，将肿瘤取出，制备组织病理切片并利用CD31抗体(购自Abcam)进行免疫组化染色，分析肿瘤组织中血管的数量。
实验结果见图15。结果表明，敲低OTUD6B后，肿瘤组织中血管的数量显著增加；但OTUD6B对肝癌细胞在裸鼠皮下的生长没有影响。
上述结果表明，OTUD6B抑制肿瘤组织中血管生成。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种新的缺氧信号调控分子及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ggtattgacc gaagagcttg a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gctgagaagg catcgcaaag a 21

Claims (10)

1.去泛素化酶OTUD6B在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下C1)至C12)中的至少一种：
C1)抑制缺氧诱导因子信号通路；
C2)抑制缺氧诱导因子信号通路上基因的表达；
C3)抑制缺氧诱导因子信号通路下游靶基因的表达；
C4)抑制缺氧诱导因子的蛋白水平；
C5)降低缺氧诱导因子的转录因子活性；
C6)负向调控缺氧信号；
C7)预防和/或治疗缺氧相关性疾病；
C8)预防和/或治疗肝癌；
C9)抑制肝癌细胞的转移；
C10)提高肝癌患者生存率和/或总生存期；
C11)降低肝癌复发风险；
C12)抑制血管生成。
2.去泛素化酶OTUD6B的应用，为如下C1)至C12)中的至少一种：
C1)抑制缺氧诱导因子信号通路；
C2)抑制缺氧诱导因子信号通路上基因的表达；
C3)抑制缺氧诱导因子信号通路下游靶基因的表达；
C4)抑制缺氧诱导因子的蛋白水平；
C5)降低缺氧诱导因子的转录因子活性；
C6)负向调控缺氧信号；
C7)预防和/或治疗缺氧相关性疾病；
C8)预防和/或治疗肝癌；
C9)抑制肝癌细胞的转移；
C10)提高肝癌患者生存率和/或总生存期；
C11)降低肝癌复发风险；
C12)抑制血管生成。
3.将去泛素化酶OTUD6B作为药物靶点的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下C1)至C12)中的至少一种：
C1)抑制缺氧诱导因子信号通路；
C2)抑制缺氧诱导因子信号通路上基因的表达；
C3)抑制缺氧诱导因子信号通路下游靶基因的表达；
C4)抑制缺氧诱导因子的蛋白水平；
C5)降低缺氧诱导因子的转录因子活性；
C6)负向调控缺氧信号；
C7)预防和/或治疗缺氧相关性疾病；
C8)预防和/或治疗肝癌；
C9)抑制肝癌细胞的转移；
C10)提高肝癌患者生存率和/或总生存期；
C11)降低肝癌复发风险；
C12)抑制血管生成。
4.抑制去泛素化酶OTUD6B活性和/或表达量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下A1)至A10)中的至少一种：
A1)激活缺氧诱导因子信号通路；
A2)促进缺氧诱导因子信号通路上基因的表达；
A3)促进缺氧诱导因子信号通路下游靶基因的表达；
A4)促进缺氧诱导因子的蛋白水平；
A5)提高缺氧诱导因子的转录因子活性；
A6)正向调控缺氧信号；
A7)促进肝癌细胞的转移；
A8)降低肝癌患者生存率和/或总生存期；
A9)提高肝癌复发风险；
A10)促进血管生成。
5.抑制去泛素化酶OTUD6B活性和/或表达量的物质的应用，为如下A1)至A10)中的至少一种：
A1)激活缺氧诱导因子信号通路；
A2)促进缺氧诱导因子信号通路上基因的表达；
A3)促进缺氧诱导因子信号通路下游靶基因的表达；
A4)促进缺氧诱导因子的蛋白水平；
A5)提高缺氧诱导因子的转录因子活性；
A6)正向调控缺氧信号；
A7)促进肝癌细胞的转移；
A8)降低肝癌患者生存率和/或总生存期；
A9)提高肝癌复发风险；
A10)促进血管生成。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述抑制去泛素化酶OTUD6B活性和/或表达量的物质为z1)或z2)或z3)或z4)或z5)或z6)：
z1)寡聚核酸1；所述寡聚核酸1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
z2)寡聚核酸2；所述寡聚核酸2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
z3)含有所述寡聚核酸1的慢病毒载体；
z4)含有所述寡聚核酸2的慢病毒载体；
z5)以所述寡聚核酸1为靶点，由shRNA表达系统合成的shRNA；
z6)以所述寡聚核酸2为靶点，由shRNA表达系统合成的shRNA。
7.产品甲或产品乙；
所述产品甲含有去泛素化酶OTUD6B；所述产品甲的功能为如下C1)至C12)中的至少一种：
C1)抑制缺氧诱导因子信号通路；
C2)抑制缺氧诱导因子信号通路上基因的表达；
C3)抑制缺氧诱导因子信号通路下游靶基因的表达；
C4)抑制缺氧诱导因子的蛋白水平；
C5)降低缺氧诱导因子的转录因子活性；
C6)负向调控缺氧信号；
C7)预防和/或治疗缺氧相关性疾病；
C8)预防和/或治疗肝癌；
C9)抑制肝癌细胞的转移；
C10)提高肝癌患者生存率和/或总生存期；
C11)降低肝癌复发风险；
C12)抑制血管生成；
所述产品乙含有权利要求4至6中任一所述抑制去泛素化酶OTUD6B活性和/或表达量的物质；所述产品乙的功能为如下A1)至A10)中的至少一种：
A1)激活缺氧诱导因子信号通路；
A2)促进缺氧诱导因子信号通路上基因的表达；
A3)促进缺氧诱导因子信号通路下游靶基因的表达；
A4)促进缺氧诱导因子的蛋白水平；
A5)提高缺氧诱导因子的转录因子活性；
A6)正向调控缺氧信号；
A7)促进肝癌细胞的转移；
A8)降低肝癌患者生存率和/或总生存期；
A9)提高肝癌复发风险；
A10)促进血管生成。
8.如权利要求1至6任一所述的应用、权利要求7所述产品甲或产品乙，其特征在于：
所述C2)或A2)中，缺氧诱导因子信号通路上基因为缺氧诱导因子信号通路上与细胞迁移相关的基因；
所述C3)或A3)中，缺氧诱导因子信号通路下游靶基因为VEGF基因、MMP2基因和/或LOXL2基因；
所述C7)中，缺氧相关性疾病为激活缺氧诱导因子信号通路导致的疾病；
所述C12)或A10)中，血管为肿瘤组织中血管；所述肿瘤组织由肝癌细胞增殖形成；
所述缺氧诱导因子为HIF-1α和/或HIF-2α；
所述肝癌为肝细胞癌；
所述肝癌细胞为MHCC-LM3细胞、Bel-7402细胞和/或SMMC-7721细胞。
9.权利要求4至6中任一所述抑制去泛素化酶OTUD6B活性和/或表达量的物质。
10.去泛素化酶OTUD6B作为缺氧信号调控分子的应用。
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