CN111257302B

CN111257302B - 用于显微拉曼光谱检测好氧或兼性厌氧病原微生物的液体样品池

Info

Publication number: CN111257302B
Application number: CN202010198979.3A
Authority: CN
Inventors: 付钰; 李焓菲; 卢维来
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2040-03-20
Also published as: CN111257302A

Abstract

本发明提供了用于显微拉曼光谱检测好氧或兼性厌氧的病原微生物的液体样品池，所述液体样品池包括样品池体和盖玻片，所述盖玻片为石英玻片或氟化钙玻片，所述样品池体具有侧壁和底壁，所述底壁上设有一个或更多个通孔，所述盖玻片粘附到所述底壁的外表面并且覆盖所述通孔以形成一个或更多个检测孔。本发明的液体样品池成本低，操作简单，可用于单样本或多样本测量，并具有生物安全性。

Description

用于显微拉曼光谱检测好氧或兼性厌氧病原微生物的液体样品池

技术领域

本发明属于拉曼光谱分析领域，特别涉及一种用于显微拉曼光谱检测好氧或兼性厌氧病原微生物的液体样品池。

背景技术

拉曼光谱技术是根据光子与化学分子之间发生非弹性碰撞而产生的非弹性散射的原理而发展来的。通过显微镜可以在显微结构下观测到微观样品，如细胞、原生生物、微生物等，将激光辐照于微观样品后可激发样品产生拉曼散射，散射光经分光后而形成谱带，通过拉曼光谱可以判断分子的振动模式，进而推断分子的结构信息。显微拉曼光谱具有快速、简单、可重复和无损分析等优点，并且所需样品量少(例如，激光拉曼光谱的样品量可低至1微升)，可以实现微量检测、分析。显微拉曼光谱被广泛用于化学、化工、材料(例如，聚合物)、药物、医学以及微生物等领域。

目前，用显微拉曼光谱检测液体中的微观样品(如细胞、微生物等)所用的支撑器皿采用载玻片或敞口的圆柱形器皿，该圆柱形器皿的底面(检测区，又称为“光学窗口”)为普通玻璃或树脂材料，侧面为普通玻璃或为树脂材料。然而，普通玻璃或树脂材料产生的拉曼散射干扰样品的拉曼散射信号，导致样品的显微拉曼光谱效果差。而且采用这样的液体样品池进行微量检测时，在移动液体样品池的过程中，微量的样品可能会发生位移，显微镜确认样品位置耗时长，不便于检测。另外，现有的液体样品池难以用于多样本检测。

发明内容

本发明的目的是针对现有显微拉曼细胞检测中样品支撑器皿存在的问题，提供一种用于显微拉曼光谱检测好氧或兼性厌氧病原微生物的液体样品池。本发明的液体样品池成本低，操作简单，可用于单样本或多样本测量。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

本发明提供了一种用于显微拉曼光谱检测好氧或兼性厌氧病原微生物的液体样品池，其中，所述液体样品池包括样品池体和盖玻片，所述盖玻片为石英玻片或氟化钙玻片，所述样品池体具有侧壁和底壁，所述底壁上设有一个或更多个通孔，所述盖玻片粘附到所述底壁的外表面并且覆盖所述通孔以形成一个或更多个检测孔。

根据本发明提供的液体样品池，其中，所述液体样品池可以具有1个、2个或更多个检测孔。特别地，本发明的液体样品池设置有2个以上的检测孔。在一些具体实施方案中，所述液体样品池的底壁可以具有1个、2个、3个、4个、5个6个、7个、8个或9个检测孔。

本发明对检测孔的排列方式没有特殊要求。在一些实施方案中，所述检测孔呈阵列排列；以及在一些实施方案中，所述检测孔圆周排列。

根据本发明提供的液体样品池，其中，所述检测孔上可以设置有识别编号，以便于加样和检测时样品的定位。

根据本发明提供的液体样品池，其中，所述检测孔可以是方孔、圆孔或倒圆台孔。

在一些具体实施方案中，所述检测孔是倒圆台孔。不希望受理论限制，认为这样的检测孔便于滴加待检测样品，并有利于待检测样品的保持。

根据本发明提供的液体样品池，其中，检测孔的宽度尺寸可以根据检测所需的样品量、加样操作等来确定。

在一些实施方案中，所述检测孔的宽度尺寸为1～5mm。当检测孔的尺寸小于1mm时，不便于滴加待测样品；检测孔尺寸大于5mm时，寻找样品中微观样品(细胞、微生物等)耗时长，并且过多地占用样品池底面的面积，不利于增加检测孔数目。

在一些优选实施方案中，所述检测孔的宽度尺寸为3～5mm。

本发明中，检测孔的宽度尺寸是指检测孔在其垂直于深度(高度)的横截面上距离最大的两点之间的长度。由此，对于方形检测孔(方孔)，检测孔的尺寸为对角线长度；对于圆形检测孔(圆孔)或倒圆台形检测孔(倒圆台孔)，检测孔的宽度尺寸为其(最大底面的)直径。

根据本发明提供的液体样品池，其中，所述检测孔的深度为0.5～2mm，优选为1.5mm。

根据本发明提供的液体样品池，其中，所述样品池体可以为长方体形或圆柱形。在一些实施方案中，所述样品池体呈长方体形，其横截面的边长为15～50mm，例如20～30mm；以及在另一些实施方案中，所述样品池体呈圆柱形，直径为15～50mm，例如20～30mm。

本发明中，术语“横截面”是指垂直于高度(或深度)方向的截面。

根据本发明提供的液体样品池，其中，所述样品池体由树脂材料形成。适合用于本发明的液体样品池的树脂材料的实例包括但不限于：聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯。在一些优选实施方案中，所述样品池体由聚苯乙烯形成。

根据本发明提供的液体样品池，其中，所述液体样品池设有顶盖，以便于密闭。通过设置顶盖可以减少或避免样品挥发，有利于长时间监测，并且可以避免污染样品，特别是在用于临床微生物检测时，可以避免空气中微生物的污染。

根据本发明提供的液体样品池，其中，所述顶盖与所述底壁之间的距离为10～20mm，例如，15mm。显微拉曼光谱仪的激光束经物镜聚集到检测孔中的样品上后，激发样品产生拉曼散射，发散的光线照射到顶盖(采集180°方向的背散射信号)，顶盖的树脂分子对样品的拉曼散射没有干扰。由此，通过设置所述顶盖与所述底壁之间的距离，不仅可以将液体样品池密封，而且还不影响样品拉曼散射光的收集。

根据本发明提供的液体样品池，其中，所述顶盖旋转密封连接到所述样品池体的顶部。

根据本发明提供的液体样品池，其中，所述顶盖可以采用与样品池体相同的材料制备。

根据本发明提供的液体样品池，其中，所述盖玻片的厚度为0.085～0.17mm。在一些具体实施方案中，所述盖玻片的厚度为0.13mm。

根据本发明提供的液体样品池，其中，本发明对盖玻片的尺寸没有特殊要求，只要盖玻片能够粘附到底壁的外表面并密封通孔即可。特别地，可以根据通孔的尺寸和/或其分布来确定所述盖玻片的尺寸，所述盖玻片通常超出所述一个或更多个通孔的外侧轮廓，以便有效粘接。

在一些实施方案中，所述底壁上设有1个圆形通孔，所述盖玻片为长方形或正方形，其边长为通孔直径的1.5～2倍。

在另一些实施方案中，底壁上设有2个圆形通孔，2个圆形通孔间隔0.5倍圆形通孔直径，所述盖玻片为长方形，长度为通孔直径的3～4倍，宽度为通孔直径的1.5～2倍。

根据本发明提供的液体样品池，其中，所述盖玻片双面抛光。

根据本发明提供的液体样品池，其中，采用粘合剂将所述盖玻片粘附到所述底壁的外表面。粘合剂涂覆在底壁外表面，但是通孔处不施加粘合剂。

根据本发明提供的液体样品池，其中，所述粘合剂为UV胶。适合用于本发明的液体样品池的UV胶的实例包括但不限于：环氧丙烯酸酯UV胶、聚氨酯丙烯酸酯UV胶、聚醚丙烯酸酯UV胶、聚酯丙烯酸酯UV胶和丙烯酸树脂UV胶。

根据本发明提供的液体样品池，其中，所述的好氧或兼性厌氧病原微生物的实例包括但不限于：新生隐球菌、白色念球菌、酿酒酵母菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌。

本发明的液体样品池具有以下优势：

(1)本发明的液体样品池成本低(特别是降低了高成本的石英玻片或氟化钙玻片的占比)，可以作为一次性样品池使用，安全性高，操作简单，可用于单样本或多样本测量。特别地，本发明提供的液体样品池，通过样品池体进行转移，便于持拿，将待测样品置于检测孔中，检测孔对样品具有限位作用，可以避免待测样品在移动液体样品池过程中发生位移(如，滚动、滑动等)，利于待测样品的检测定位，并且可以避免多样品检测时样品间交叉污染。

(2)本发明的液体样品池可以用于多样品检测，提高了液体样品池的利用度，可以有效减少环境污染。

(3)本发明的液体样品池可设有顶盖，特别是旋转安装到样品池体的顶盖，密闭性好，具有生物安全性，不仅可以减缓样品挥发，延长测量时间(这一点对于多样品检测尤其重要)，还可以避免空气中可能存在的微生物的污染，测量结果可信度高。

(4)采用本发明的液体样品池采集病原微生物拉曼光谱特别是好氧或兼性厌氧病原微生物的拉曼光谱，操作简便，并具有生物安全性。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是根据本发明的液体样品池的一种实施方案的结构示意图；

图2是根据本发明的液体样品池的一种实施方案的剖视图；

图3是采用本发明的液体样品池测得的真菌拉曼谱图，其中，(a)为新生隐球菌的拉曼谱图，(b)为白色念球菌的拉曼谱图，(c)为酿酒酵母菌的拉曼谱图；

图4是采用本发明的液体样品池测得的细菌拉曼谱图，其中，(d)为鲍曼不动杆菌的拉曼谱图，(e)为铜绿假单胞菌的拉曼谱图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。同时，应当明白，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。

实施例1液体样品池

如图1和图2所示，液体样品池由样品池体、顶盖5和双面抛光的盖玻片3组成。选用石英玻片作为盖玻片3，样品池体和顶盖5均由聚苯乙烯形成，顶盖5旋转密封连接到样品池体的顶部。样品池体的直径为30mm，高度为15mm，样品池体具有侧壁1和底壁2，底壁2的厚度为1.5mm。底壁2上设有2个直径为3mm的圆形的通孔4，采用环氧丙烯酸酯UV胶将盖玻片3粘附到底壁2的外表面并且覆盖通孔4，由此形成2个检测孔。其中，盖玻片3的厚度为0.13mm，长度为22.5mm，宽度为4.5mm。

实施例2液体样品池的性质测试

向实施例1的液体样品池的一个检测孔中加入20μl的浓度为3μg/ml的红色素水滴，旋紧顶盖(记为“测试1”)；向一个相同尺寸、相同材质的现有液体样品池(未设置检测孔)中加入20μl的浓度为3μg/ml的红色素水滴，盖上顶盖(该顶盖没有旋紧结构，不能旋紧)作为对照(记为“对照”)。使用微量取样器(量程为10μl)测量液体样品池中存留的样品量，结果如表1所示。

表1不同放置时间下的样品存留量

	初始样品量	1小时存留量	2小时存留量	3小时存留量
					测试1	20μl	17.8μl	15.8μl	12.5μl
对照	20μl	12.3μl	5.5μl	0μl

由表1可知，本发明的液体样品池可以形成良好的密封性，进而可以减少或避免样品挥发。

实施例3采集细胞拉曼光谱

(1)将一个或多个病原菌的样品用生理盐水洗涤一次，将病原菌悬浮在生理盐水中。

(2)将20μl带有病原菌的样品加入液体样品池的检测孔中；

(3)将液体样品池放在显微拉曼光谱仪上捕获单细胞获得拉曼光谱。

图3-4显示了由以上方法测得的不同真菌和细菌的拉曼光谱，其中，(a)为新生隐球菌的拉曼谱图，(b)为白色念球菌的拉曼谱图，(c)为酿酒酵母菌的拉曼谱图，(d)为鲍曼不动杆菌的拉曼谱图，(e)为铜绿假单胞菌的拉曼谱图。

由图3-4可知，本发明的液体样品池可以用于检测好氧或兼性厌氧病原微生物的显微拉曼光谱。

在本发明的描述中，需要理解的是，方位词如“前、后、上、下、左、右”、“横向、竖向、垂直、水平”和“顶、底”等所指示的方位或位置关系通常是基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，在未作相反说明的情况下，这些方位词并不指示和暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位或者以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制；方位词“内、外”是指相对于各部件本身的轮廓的内外。

为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其他器件或构造之下”。因而，示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。

此外，需要说明的是，使用“第一”、“第二”等词语来限定零部件，仅仅是为了便于对相应零部件进行区别，如没有另行声明，上述词语并没有特殊含义，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.用于显微拉曼光谱检测好氧或兼性厌氧病原微生物的液体样品池，其中，所述液体样品池包括样品池体和盖玻片，所述盖玻片为石英玻片或氟化钙玻片，所述样品池体具有侧壁和底壁，所述底壁上设有一个或更多个通孔，所述盖玻片粘附到所述底壁的外表面并且覆盖所述通孔以形成一个或更多个检测孔，其中，所述液体样品池设有顶盖，所述顶盖与所述底壁之间的距离为10～20mm。

2.根据权利要求1所述的液体样品池，其中，所述液体样品池设置有2个以上的检测孔。

3.根据权利要求2所述的液体样品池，其中，所述检测孔呈阵列排列或圆周排列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的液体样品池，其中，所述检测孔为方孔、圆孔或倒圆台孔。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的液体样品池，其中，所述检测孔的宽度尺寸为1～5mm。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的液体样品池，其中，所述检测孔的宽度尺寸为3～5mm。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的液体样品池，其中，所述检测孔的深度为0.5～2mm。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的液体样品池，其中，所述检测孔的深度为1.5mm。

9.根据权利要求1至3中任一项所述的液体样品池，其中，所述顶盖与所述底壁之间的距离为15mm。

10.根据权利要求1至3中任一项所述的液体样品池，其中，所述顶盖旋转密封连接到所述样品池体的顶部。

11.根据权利要求1至3中任一项所述的液体样品池，其中，所述样品池体呈圆柱形。

12.根据权利要求11所述的液体样品池，其中，所述样品池体的直径为15～50mm。

13.根据权利要求11所述的液体样品池，其中，所述样品池体的直径为20～30mm。

14.根据权利要求1至3中任一项所述的液体样品池，其中，所述样品池体和所述顶盖的材质为聚乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯。

15.根据权利要求1至3中任一项所述的液体样品池，其中，所述盖玻片的厚度为0.085～0.17mm。

16.根据权利要求1至3中任一项所述的液体样品池，其中，所述盖玻片的厚度为0.13mm。

17.根据权利要求1至3中任一项所述的液体样品池，其中，所述盖玻片经由粘合剂粘附到所述底壁的外表面。

18.根据权利要求17所述的液体样品池，其中，所述粘合剂为UV胶。

19.根据权利要求17所述的液体样品池，其中，所述粘合剂为选自环氧丙烯酸酯UV胶、聚氨酯丙烯酸酯UV胶、聚醚丙烯酸酯UV胶、聚酯丙烯酸酯UV胶和丙烯酸树脂UV胶中的一种或多种。