CN111249448A - Chir99021及fgf1的plga纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用 - Google Patents

Chir99021及fgf1的plga纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用 Download PDF

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范成铭
吴逊
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Abstract

本发明的目的是提供一种装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒由药物CHIR99021、酸性纤维生长因子(FGF1)及聚乳酸PLGA组成。所述CHIR99021及FGF1均为小分子药物，所述CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒可以缓慢释放药物长达4周，所述CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒主要作用于梗死边缘区附近，能保护心肌细胞的凋亡和促进血管新生，进而起到治疗缺血性心脏病的作用。

Description

CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物 中的应用
技术领域
本发明属于涉及分子治疗药物技术领域，具体涉及两种小分子药物CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗动物缺血性心脏病药物中的应用。
背景技术
急性心肌梗死患者的死亡率与梗死面积呈线性关系。由于哺乳动物成体心脏心肌祖细胞的心肌再生能力十分有限，因此抢救注定死亡的心肌细胞仍然是心血管科学的重要目标之一。当冠状动脉阻塞时间延长时，远端心肌细胞发生细胞膜破裂，然后将细胞内的酶释放到细胞外空间。如果我们假设急性心肌梗死是一种不同程度损伤的组织，那么发现保护边缘区受损较轻的心肌细胞的干预措施，将能够有效地减小梗死面积，挽救生命。
纳米颗粒(NPs)可作为生长因子和小分子的缓释载体，促进缺血性心脏病心肌的恢复。成纤维细胞生长因子1(FGF1)是这些生长因子之一，已有研究表明，心肌内注射载FGF1的聚乳酸-糖醛酸(PLGA)微粒到梗死边缘区可改善血管生成和/或动脉生成以及射血分数。CHIR99021是一种氨基嘧啶衍生物，起Wnt信号激活剂的作用。含CHIR99021的NPs能有效地将成纤维细胞重新编程成功能性心肌细胞，因此在心血管再生方面具有治疗潜力。然而目前仍没有一种方法在病人身上被证明是成功的，这可能是因为几乎所有的临床试验都以单一治疗方式进行，也许可以通过组合治疗的方式加以改进。未来的研究方向可能集中在包括检测这些生长因子的疗效，并找出这些生长因子联合使用的最佳剂量，这或许能够导致更多令人满意的临床结果。此外，现有条件下本领域技术人员不容易想到将二者结合使用。本发明是基于众多靶分子药物筛选出的最佳组合。
利用小鼠心肌梗死(MI)和猪心肌缺血再灌注(IR)损伤模型，我们研究了CHIR99021和FGF1联合应用是否能协同加速心肌细胞、内皮细胞或血管平滑肌细胞的增殖，从而增强缺血后心肌保护。包裹CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒控释制剂具有明显的心脏保护作用，是改善缺血后心肌保护的潜在新策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，包含该纳米颗粒的药物可用于急性心肌梗死的临床治疗。
装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述CHIR99021(GSK-3抑制剂)及FGF1(酸性成纤维细胞生长因子)均为小分子药物。
优选地，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒的制备方法为：采用双乳(水/油/水相)技术对重组人FGF1酸性蛋白(rhFGF1,aa 16-155)进行纳米颗粒制备，和采用单乳(油/水相)技术对CHIR99021进行纳米颗粒制备。
优选地，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒的制备方法为：
将100重量份的PLGA与5重量份的二氯甲烷溶液混匀后，加入浓度为1毫克/毫升的FGF1溶液，在4℃条件下超声处理2分钟，加入4％(w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液，在4℃下再次超声2分钟，将合成的混合物转移到含4％(w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液与去离子水中，所述聚乙烯醇(PVA)水溶液与去离子水体积比为1:2混合，搅拌4小时，直到二氯甲烷完全蒸发，将溶液以1000g的转速离心10分钟以去除大颗粒沉渣，得到的上清以45000g的转速高速离心20分钟以收集纳米颗粒，用去离子水对收集的纳米颗粒洗涤两次，最后以45000g的转速离心20分钟，-80℃冷冻过夜，真空负压抽吸冻干48小时，收集纳米颗粒-80℃保存备用，得到装载FGF1的PLGA纳米颗粒；
将100重量份的PLGA与5重量份的二氯甲烷溶液混匀后，加入浓度为8毫克/毫升的CHIR99021溶液，在4℃超声处理2分钟，加入1％(w/v)二甲胺硼烷(DMAB)水溶液，在4℃条件下超声处理2分钟，将合成的混合物转移到含4％(w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液与去离子水中，所述聚乙烯醇(PVA)水溶液与去离子水体积比为1:3混合，搅拌4小时，直到二氯甲烷完全蒸发，将溶液以1000g的转速离心10分钟以去除大颗粒沉渣，得到的上清以45000g的转速高速离心20分钟以收集纳米颗粒，用去离子水对收集的纳米颗粒洗涤两次，最后以45000g的转速离心20分钟，-80℃冷冻过夜，真空负压抽吸冻干48小时，收集纳米颗粒-80℃保存备用，得到装载CHIR99021的PLGA纳米颗粒。
优选地，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述缺血性心脏病包括：冠心病、心肌梗死。
优选地，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒可以缓慢释放药物长达4周。
优选地，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒为水溶剂。
优选地，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒的给药途径为心肌局部注射。
优选地，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒主要作用于梗死边缘区附近，能抑制心肌细胞的凋亡。
优选地，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒主要作用于梗死边缘区附近，能促进血管新生。
优选地，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒主要作用于梗死边缘区附近，能改善心肌肥大。
附图说明
图1为Poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)纳米颗粒特征分析；其中：
A为加载了CHIR99021的PLGA纳米颗粒(CHIR-NPs)的扫描电镜图；
B为加载了FGF1的PLGA纳米颗粒(FGF1-NPs)的扫描电镜图；
C为使用NIH ImageJ软件对CHIR-NPs的直径大小进行测量；
D为使用NIH ImageJ软件对FGF1-NPs的直径大小进行测量；
E为通过质谱测定CHIR-NPs时间累积释放率；
F为通过酶联免疫吸附试验测定FGF1-NPs时间累积释放率。
图2为PLGA纳米颗粒在冠状动脉左前降支结扎小鼠心肌内注射24小时后的示踪。
图3为各组小鼠术后4周心功能的评估：将心肌内注射不同种类的纳米颗粒(NPs)：CHIR-NP、FGF1-NP、C+F NP和Empty-NP的小鼠和注射等量PBS的小鼠(MI)及假手术组(Sham)小鼠在手术前及手术28天后行超声心动图以评估左心室功能；
A为超声心动图；
B为射血分数；
C左室短轴缩短率；
(每组动物数量为11至12只，*p<0.01vs.sham组、
Figure BDA0002396940130000031
p<0.01vs.MI组、
Figure BDA0002396940130000032
p<0.01vs.Empty NP组、§p<0.01vs.CHIR-NP组、||p<0.01vs.FGF1-NP组)。
图4为各组小鼠术后4周心肌梗死面积的评估；
A为各组心脏心底至心尖天狼星红-快速绿染色图；
B为心梗面积统计图；
(每组动物数量为11至12只，*p<0.01vs.MI组、
Figure BDA0002396940130000033
p<0.01vs.Empty NP组、
Figure BDA0002396940130000034
p<0.05vs.CHIR-NP组、§p<0.05vs.FGF1-NP组)。
图5为各组小鼠术后4周心肌肥厚的评估；
A为各组心梗边缘区的免疫染色；
B为心室肌细胞横截面大小的统计图；
(每组动物数量为11至12只，*p<0.01vs.sham组、
Figure BDA0002396940130000035
p<0.01vs.MI组、
Figure BDA0002396940130000036
p<0.01vs.Empty NPs组、§p<0.01vs.CHIR-NP组、||p<0.01vs.FGF1-NP组)。
图6为TUNEL法检测和定量心梗(MI)小鼠的细胞凋亡；
A为心梗及不同处理后第3天对左室心梗边缘区的切片行TUNEL[末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)dUTP镍端标记法]检测以揭示凋亡的心肌细胞和表达心脏特定收缩蛋白α-SA的正常心肌；
B为各组TUNEL阳性细胞数百分比统计图；
(αSA标记心肌细胞。每组动物5只，*p<0.01vs.sham组、
Figure BDA0002396940130000037
p<0.01vs.MI组、
Figure BDA0002396940130000038
p<0.01vs.Empty-NP组、§p<0.05vs.CHIR-NP组、||p<0.01vs.FGF1-NP组)。
图7为CHIR99021及FGF1纳米颗粒介导的心梗小鼠的血管新生；
A为各组动物术后4周心梗边缘区血管染色图；
B为毛细血管密度；
C为微小动脉密度；
(IB4标记内皮，SM22α标记血管平滑肌。每组动物5只，*p<0.01vs.假手术组、
Figure BDA0002396940130000041
p<0.01vs.MI组、
Figure BDA0002396940130000042
p<0.01vs.Empty NP组、§p<0.05vs.CHIR-NP组、||p<0.01vs.FGF1-NP组)。
图8为各实验组猪模型左室形态和功能评价；
A为心脏磁共振成像(MRI)及心梗面积、射血分数、心输出量及搏出量；
B为术后4周各组猪心脏新鲜组织连续横切面观(箭头所示为心梗组织)；
C为术后4周各组心室组织天狼星红/快速绿染色及左室前壁厚度统计图；
(每组动物4只，*p<0.01vs.假手术组、
Figure BDA0002396940130000043
p<0.05vs.IR组)。
图9为术后4周猪左室心梗边缘区心肌肥厚及细胞凋亡的检测；
A为心肌细胞肥厚免疫染色及统计图；
B为心肌细胞凋亡免疫染色及统计图；
(每组动物4只，*p<0.05vs.假手术组、
Figure BDA0002396940130000044
p<0.01vs.IR组)。
图10为CHIR99021及FGF1纳米颗粒介导的猪心梗边缘区血管新生；
(IB4：标记血管内皮、SM22α：标记血管平滑肌、cTnT：标记心肌。每组动物4只，*p<0.05vs.假手术组、
Figure BDA0002396940130000045
p<0.01vs.IR组)。
图11为CHIR99021及FGF1对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞周期相关蛋白PH3的影响；
(CD31标记HUVECs、DAPI标记细胞核。*p<0.01vs.Control、
Figure BDA0002396940130000046
p<0.05vs.CHIR、
Figure BDA0002396940130000047
p<0.01vs.FGF1)。
图12为人脐静脉内皮细胞(HUVECs)经CHIR99021和/或FGF1处理后细胞周期调控基因的表达情况；
A为与血管生成、细胞增殖、细胞死亡相关的基因表达谱；
B为CHIR(5μM)、FGF1(100ng/ml)或CHIR+FGF1干预24小时的HUVEC的实时定量PCR以检测细胞周期蛋白图；
C为不同的细胞周期调控蛋白的免疫印迹；
D为有统计学差异的蛋白免疫印迹半定量分析；
E为无统计学差异的蛋白免疫印迹半定量分析；
(*p<0.01vs.Control、
Figure BDA0002396940130000048
p<0.05vs.CHIR、
Figure BDA0002396940130000049
p<0.05vs.FGF1)。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
一材料和方法
1实验材料
1.1实验动物
实验用小鼠为12周龄且体重为25-30g的雌性C57BL/6小鼠，购于Jackson公司。实验用猪为出生45天体重为14公斤的Yorkshire雌性猪，购于Snyder农场。
1.2实验细胞
人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)购于Lonza公司，按照制造商的说明进行繁殖与传代培养。
1.3主要试剂与仪器
实验试剂一览表
Figure BDA0002396940130000051
实验抗体(一抗)一览表
Figure BDA0002396940130000052
实验主要仪器耗材一览表
Figure BDA0002396940130000061
2实验方法
所有动物实验均按照伯明翰阿拉巴马大学工程学院动物保护与使用委员会(IACUC,APN 20502)制定并批准的动物实验指南进行，并符合美国国立卫生研究院(2011)发布的《实验室动物护理和使用指南》。
2.1 PLGA纳米颗粒的制备
将100重量份的PLGA与5重量份的二氯甲烷溶液混匀后，加入浓度为1毫克/毫升的FGF1溶液，在4℃条件下超声处理2分钟，加入4％(w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液，在4℃下再次超声2分钟，将合成的混合物转移到含4％(w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液与去离子水中，所述聚乙烯醇(PVA)水溶液与去离子水体积比为1:2混合，搅拌4小时，直到二氯甲烷完全蒸发，将溶液以1000g的转速离心10分钟以去除大颗粒沉渣，得到的上清以45000g的转速高速离心20分钟以收集纳米颗粒，用去离子水对收集的纳米颗粒洗涤两次，最后以45000g的转速离心20分钟，-80℃冷冻过夜，真空负压抽吸冻干48小时，收集纳米颗粒-80℃保存备用，得到装载FGF1的PLGA纳米颗粒；
将100重量份的PLGA与5重量份的二氯甲烷溶液混匀后，加入浓度为8毫克/毫升的CHIR99021溶液，在冰上超声处理2分钟，加入1％(w/v)二甲胺硼烷(DMAB)水溶液，在4℃条件下超声处理2分钟，将合成的混合物转移到含4％(w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液与去离子水中，所述聚乙烯醇(PVA)水溶液与去离子水体积比为1:3混合，搅拌4小时，直到二氯甲烷完全蒸发，将溶液以1000g的转速离心10分钟以去除大颗粒沉渣，得到的上清以45000g的转速高速离心20分钟以收集纳米颗粒，用去离子水对收集的纳米颗粒洗涤两次，最后以45000g的转速离心20分钟，-80℃冷冻过夜，真空负压抽吸冻干48小时，收集纳米颗粒-80℃保存备用，得到装载CHIR99021的PLGA纳米颗粒。
2.2PLGA纳米颗粒的特性分析
使用量子扫描电子显微镜对PLGA纳米颗粒进行摄像并采用NIH ImageJ软件对颗粒直径进行测量。将含有CHIR或FGF1的纳米颗粒重悬于0.1％BSA和0.02％叠氮化钠的DPBS释放介质中。将重悬液置于37℃下并通过摇床不断摇晃，并在相应的时间节点上回收和替换900微升的释放介质，进而测定其释放浓度。为了测量CHIR和FGF1释放曲线，将收集的样本分别用质谱(CHIR)或酶联免疫吸附试验(FGF1)的方法分别进行定量分析。
2.3小鼠急性心梗(MI)模型建立与实验分组
2.3.1.用剃毛膏去除小鼠颈部正中及左胸部的毛发；
2.3.2.将小鼠置入联通异氟烷的麻醉箱内进行吸入麻醉诱导；
2.3.3.络合碘消毒颈部正中及左胸部皮肤后行颈部正中切口，充分游离气管前结缔组织，必要时离断少许颈前肌；
2.3.4.充分暴露气管后经口腔插入气管插管(20G的导管穿刺针)；
2.3.5.调整好呼吸参数：呼吸频率：100-150次/分，潮气量为250-300μl。将小鼠左后肢从新固定于右下侧，松开左上肢胶带，于左侧胸廓第3-4肋间开胸充分暴露心脏。
2.3.6.显微镜下镊子剥离心包，暴露冠状动脉左前降支(LAD)；
2.3.7.用6-0丝线将LAD近端结扎，判断急性心梗模型是否建立成功(肉眼见结扎部位远端LAD供血区域颜色由红变白)；
2.3.8.实验组立即将混有15μl装载20μg/μl CHIR及13.33μg/μl FGF1的纳米颗粒(C+F NP组)在心梗中心区(1)和心梗边缘区(2)共计3个注射部位进行注射(5μl/部位)，使治疗剂量达到2400ng CHIR和200ng FGF1；另外设立两组分别予以注射等量分别装载了CHIR及FGF1的纳米颗粒(CHIR-NP组及FGF1-NP组)；对照组予以注射等量空纳米颗粒(Empty-NP组)及等量PBS处理(MI组)；假手术组不予以结扎冠状动脉；
2.3.9.用4-0丝线间断缝逐层关胸并缝合皮肤；
2.3.10.关闭吸入麻醉，待小鼠恢复自主呼吸后拔除插管，放回笼中(术后分别予以每12小时腹腔内注射丁丙诺啡(0.1mg/kg x3天)及卡洛芬(5mg/kg x1天)处理)。
2.4小鼠心脏B超
2.4.1.将小鼠置入联通异氟烷的麻醉箱内进行吸入麻醉诱导，用剃毛膏去除小鼠左胸部的毛发。将小鼠平躺于操作板上予以监测心率，调整异氟烷吸入量直至小鼠心率维持在400-500次/分；
2.4.2.用胶带固定小鼠四肢及尾巴于检测操作台上，平台温度设置在37℃；
2.4.3.心前区涂抹超声专用胶后用高分辨超声探测系统(Vevo 2100，VisualSonics Inc)的小动物心脏超声专用探头获取胸骨旁长轴和二维短轴图像；
2.4.4.超声探测完后，移除超声专用胶，关闭麻醉，麻醉清醒后动物归笼；
2.4.5.用Vevo 2100系统进行数据分析。
2.5猪缺血再灌注损伤(IR)模型建立与实验分组
对出生45天的Yorkshire雌性猪(14公斤，Snyder农场，伯明翰)进行心肌缺血再灌注损伤诱导手术。先行猪经口气管插管后予以吸入2％异氟醚(FlurisoTM，
Figure BDA0002396940130000071
)并连接呼吸机以维持麻醉。在整个手术过程中，持续监测动物体温、动脉血压、心电图和氧饱和度。行胸骨正中切开，确定左冠状动脉第一和第二对角支的起始部位，予以套扎1小时后松开结扎线予以血液再灌注。
再灌注后立即给药。将混合有1000μl装载了20μg/μl CHIR及13.33μg/μl FGF1的纳米颗粒(C+F NP组，n＝4)经1ml注射器注射到5个心梗边缘区(200μl/注射点)，使治疗剂量分别达到160μg CHIR和1300ng FGF1。对照组予以注射同等体积的DPBS(IR组，n＝4)。另选取大小和体重匹配的4只动物作为额外的对照(假手术组，n＝4)。关闭胸腔后，每72小时皮下注射盐酸丁丙诺啡(0.24mg/kg,
Figure BDA0002396940130000081
Reckitt Benckiser PharmaceuticalsInc.)，持续3天；术后2天，每24小时注射一次卡洛芬(4mg/kg,，
Figure BDA0002396940130000082
Zoetis)。对照组中共6只动物接受IR手术(n＝6)，2只动物死亡，1只死于术前并发症，1只死于围手术期难控性心律失常。分别于术后1周、4周行心脏MRI检测心功能，术后第4周取材行后续组织学检测。
2.6心梗面积测定
将离体鼠心脏行横断面冰冻切片，以10μm的厚度从心尖切至心底，每300μm选取一张切片，行天狼星红和快速绿染色，计算左室前壁的厚度。
将猪的左室壁从心尖到心底横切成5个短轴片(R1～R5)。每片根据冠状动脉灌注生理学顺序切成2个样本(S1～S2)。收集R2S1并处理冰冻切片，行天狼星红和快速绿染色，计算左室前壁的厚度。
为了评估急性心肌梗死后第28天梗死面积的定量变化，使用光学显微镜拍摄了染色部分的数字图像。使用NIH ImageJ软件进行形态分析。梗死面积的计算公式如下：梗死面积％＝[总和(疤痕周长×各短轴厚度)/总和(短轴左心室长度×短轴厚度)]×100％。
2.7免疫组化与免疫荧光染色
2.7.1.对于染细胞浆抗体需用冷丙酮通透10分钟后(通透细胞膜)PBST清洗5分钟x3次，如无需染胞浆抗体，则直接进行第三步；
2.7.2.10％胎牛血清覆盖组织后细胞，室温封闭1小时；
2.7.3.移除封闭液后，4℃下孵育一抗(用封闭液稀释抗体)过夜；
2.7.4.室温孵育二抗1小时；
2.7.5.1xPBST低速摇床洗涤玻片4分钟x3次；
2.7.6.使用含DAPI的封片液封片；显微镜摄像。
2.8细胞凋亡
使用凋亡检测试剂盒，按照试剂盒说明书(货号#12156792910,Sigma-Aldrich)检测细胞凋亡水平：将样品：
2.8.1.用固定液在室温条件下固定1小时。PBS洗涤4分钟；
2.8.2.用通透液在冰上孵育玻片2分钟，PBST洗涤4分钟x3次后自然晾干；
2.8.3.将50μl酶液1加入450μl标记液2中，配成500ul的TUNEL反应液；
2.8.4.将组织或细胞用TUNEL反应液覆盖到样本上。注意：设立阴性对照组。
2.8.5.室温且湿润的抗体孵育盒环境中避光孵育切片60分钟后PBS洗涤玻片4分钟x 3次；
2.8.6.加入含DAPI的封片剂封片，荧光显微镜摄像。
2.9逆转录-实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)
采用TrizolTM试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行细胞总RNA的提取，用DNaseI处理剔除基因组DNA(gDNA)污染物。参照产品说明书将500ng、20μl的总RNA作为最终反应体系并使用SuperScript IV第一链合成系统(Invitrogen公司)。细胞周期蛋白D1(CCND1)、细胞周期相关蛋白-D2(CCND2)、细胞周期相关蛋白依赖蛋白激酶-1(CDK1)、细胞周期相关蛋白依赖蛋白激酶-4(CDK4)、β连环蛋白1(CTNNB1)c-Myc基因和GAPDH的引物采用基于web的软件设计后商业化合成(见下表)。
所有RT-qPCR均采用SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific)在QuantStudioTM3Real-Time PCR系统(Applied
Figure BDA0002396940130000092
)中进行，CT(threshold cycle)值采用QuantStudioTMDesign and Analysis软件(v1.4.3)计算。
表1.本研究采用RT-qPCR引物序列
Figure BDA0002396940130000091
靶基因表达水平＝2ΔΔCt2.10蛋白免疫印迹
将细胞用RIPA裂解液(Bio-Rad)冰上裂解10分钟后，收集细胞裂解液行超声波细胞破碎仪处理后以10000g 4℃条件离心3分钟，取上清，行BCA法测量蛋白样品浓度，加入适量4x上样缓冲液使其终浓度为1x，于沸水浴中继续煮沸3min以使蛋白变性，将蛋白样品分装后可行后续的蛋白免疫印迹检测或置入-80℃冷冻储存。蛋白免疫印迹：
2.10.1.按Bio-Rad产品说明书配好电泳液、转膜液。
2.10.2.电泳：首先以恒定电压110V电泳90min或肉眼见蛋白样品跑至底部时停止电泳。
2.10.3.转膜：裁剪一张相应大小PVDF膜、选取两块Bio-Rad专用转膜滤纸和。用甲醇打湿PVDF膜、用转膜缓冲液打湿滤纸。取出经上述电泳的商业胶按照以下顺序对齐组装转膜体系：负极-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-正极，用玻棒擀去气泡后连接电源，按Bio-Rad(#1704150)半干转说明书进行转膜。
2.10.4.封闭：将Bio-Rad脱脂奶粉(#1706404)用1xTBST稀释为5％后将转移好的PVDF膜浸入其中，室温封闭30分钟。
2.10.5.孵育一抗：用封闭液稀释一抗，将PVDF膜置入盛有一抗的小盒子中并于摇床上4℃过夜。
2.10.6.孵育二抗：取出PVDF膜后TBST洗3次，每次5分钟。用封闭液稀释辣根过氧化物酶标记lgG的二抗，将PVDF膜置入盛有一抗的小盒子中并于摇床上室温孵育1小时。孵育结束后再次TBST洗3次，每次5min。
2.10.7.曝光：按照Thermo ECL发光试剂盒说明书将发光底物缓冲液A与B液等比例混合后滴加至PVDF膜上，自动显影、输出影响。
2.10.8.结果分析：采用相应软件进行蛋白信号分析(AlphaView SA软件3.4版本，ProteinSimple)。管家蛋白GAPDH及BACT做为内参。
2.11心脏磁共振成象(MRI)
IR手术前及术后第7天、第28天分别用1.5特斯拉临床扫描仪(西门子Sonta，西门子医疗系统)和相控阵四通道表面线圈(ECG门控)对各组实验猪进行心脏磁共振成像(MRI)：将各组动物肌肉注射麻醉后通过吸入2％异氟醚以维持麻醉并以仰卧位放置在MRI扫描床上。采用TR＝3.1ms、TE＝1.6ms、FA＝79°、矩阵大小＝256x 120、FOV＝340x 265mm2、扫描厚度＝6mm、扫描间隙为4mm的QMASS分析软件程序(Medis Medical Imaging Systems,Leiden，荷兰)从一堆短轴电影图像中计算左室功能，如射血分数等。整个心脏周期有25个阶段。采用延迟增强(DE)心脏MRI(
Figure BDA0002396940130000101
Gadopentetate Dimeglumine:0.20mmol/kg,i.v.bolus)检测心肌梗死的特征和量化，数据以疤痕表面积与左心室总表面积的比值表示。DE-MRI参数为：TR＝16ms、TE＝4ms、FA＝30°、基质尺寸＝256x 148、FOV＝320x185mm2、扫描厚度＝6mm、扫描间隙为0mm。(TR：重复的时间；TE：时间的回声；FA：翻转角、FOV：视场)
2.12统计
数据以均数±标准误表示，两组之间的比较用Student's t检验，两组以上的比较用one-way ANOVA来进行假设检验。结果P<0.05认为有统计学差异。
二结果
1.CHIR-NP、FGF1-NP特性分析
PLGA纳米颗粒可以作为一个缓慢释放(长达4周)的介质。为了研究CHIR99021(CHIR)与FGF1联合在体内对心脏的保护作用，我们分别将CHIR与FGF1制备成PLGA纳米粒。用扫描电子显微镜对CHIR99021-及FGF1-加载的纳米颗粒进行了尺寸测量(图1A-1B)；CHIR-NPs(图1C)和FGF1-NPs(图1D)的颗粒直径分别为123.63±44.48nm和129.57±45.94nm。CHIR-NPs和FGF1-NPs的加载效率分别为50.41％和62.8±1.6％；药物装载的浓度分别为8.07μg/mg和1.26±0.03μg/mg。其药物释放动力学分别通过质谱(CHIR)或ELISA(FGF1)进行测定，CHIR及FGF1释放的累积百分比如图1E和1F所示。当1000μg CHIR-NPs或者FGF1-NPs在pH为7.4、温度为37℃的1000μl DPBS中，第一天释放了55％的CHIR，直至第十五天释放了近85％(图1E)。相比之下，55％FGF1在前三天被释放出来，前十天则释放了近63％(图1F)。
我们进一步探索了PLGA纳米颗粒在心梗小鼠体内的定位和示踪。心肌内注射24小时后，取左心室边缘区组织切片进行双重免疫染色，抗体靶向标记心脏特异性调节蛋白-心肌肌钙蛋白T(cTnT)。荧光显微镜显示纳米颗粒(NPs)主要富集于梗死边缘区附近(图2)。
2.C+F NP对心肌梗死小鼠心脏的保护作用
在MI手术诱导前(术前)和MI手术处理后第28天(术后)分别进行左心室功能超声心动图检测(图3A)。左室功能检测包括：左室射血分数(图3B)、左室短轴缩短率(图3C)。结果显示，CHIR-NPs+FGF1-NPs(C+F NP)治疗组心脏收缩功能明显高于其他治疗组。与其他治疗组相比，C+F NP治疗组梗死面积显著缩小(图4A和图4B)。
为了进一步评估梗死边缘区心肌组织的代偿性肥大情况。我们测量了心肌细胞横切面面积(图5A)。MI组和各NPs处理组心肌细胞横截面积显著大于假手术组。而，C+F NP治疗组心肌细胞横截面积明显小于其他治疗组(图5B)。
为了研究延长释放时间是否对观察到的心脏保护具有必要性，我们在LAD结扎后立即心肌内注射这些未经过纳米颗粒包装的化学物质，治疗28天后进行评估。有趣的是，我们没有观察到在直接心肌内注射CHIR和/或FGF1后有类似的心脏保护作用。MI组与各治疗组心脏功能与梗死面积均无统计学差异。这些数据表明，这些化学物质的长期缓慢释放对它们发挥心脏保护作用是有必要的。
3.PLGA纳米颗粒抑制心肌细胞凋亡
为了探讨C+F NP介导心肌保护的细胞机制，我们对梗死边缘区心肌细胞凋亡进行了评估。心梗及治疗后第3天对该区域的心室切片进行TUNEL染色检测表明C+F NP治疗组的凋亡细胞数量明显少于其他治疗组(图6A和图6B)，这提示CHIR和FGF1在保留心肌细胞方面具有协同作用。
4.PLGA纳米颗粒促进的心梗小鼠血管新生
应用内皮细胞和平滑肌细胞表型特异性标记物，即isolectin B4(IB4)和SM22-alpha(SM22α)双重免疫染色评价梗死边缘区的血管新生(图7A)。C+F NP治疗组与其他NP治疗组和PBS处理组相比，毛细血管密度和微小动脉密度均明显升高(图7B和图7C)。
5.C+F NP对猪缺血再灌注(IR)损伤模型的心脏保护作用
我们进一步将这项研究扩展到临床前的大型动物研究：猪缺血再灌注(IR)损伤模型(冠状动脉左前降支结扎60分钟后复流)。心脏MRI显示(图8A)，缺血损伤后第28天，与仅接受IR处理的对照组(IR组)相比，接受含有两种生长因子(CHIR和FGF1)的PLGA纳米颗粒(C+F NP组)的心脏梗死面积更小，左心室功能改善明显(图8A和图8B)。虽然与健康对照组(假手术Sham组)相比，IR组及C+F NP组的左室前壁厚度均显著降低。但与IR组动物相比，这一指标在C+F NP治疗组则显著增加。(图8C)。
我们还评估了梗死边缘区的心肌代偿性肥大情况。术后第28天，IR和NP处理组心肌细胞横截面积明显大于假手术组，但C+F NP处理组心肌细胞横截面积明显小于IR组(图9A)。
接下来，我们评估了I/R猪心脏心肌的细胞周期和凋亡情况。与我们在小鼠模型中观察到的相似，在梗死边缘区，C+F NP治疗导致Tunel阳性细胞数量明显少于IR组，但仍多于健康对照组(图9B)。
我们还测定了C+F纳米颗粒治疗I/R损伤猪后的血管新生反应。在IR后第28天左室切片中，使用心肌细胞、内皮细胞和平滑肌特异性表型标记物的免疫定位(图10)来评估梗死边缘区的血管新生。在心梗边缘区，C+F NP治疗组的毛细血管密度及微小动脉密度明显高于IR组，差异有统计学意义。
6.CHIR+FGF1治疗可促进体外血管细胞的周期进展
为了研究这些化学物质介导的心肌保护机制，我们使用体外细胞培养系统，用CHIR+FGF1处理血管内皮细胞(HUVECs)。分别予以CHIR(5μM)、FGF1(100ng/ml)、或CHIR+FGF1(C+F)(分别为5μM和100ng/ml)干预24小时同步化处理后的HUVEC，并检测磷酸化组蛋白H3(PH3)(细胞周期M期标记物)的阳性率。结果显示与单独治疗组(CHIR或FGF1)或对照组相比，CHIR+FGF1治疗组PH3的表达水平显著增多(图11)。
7.CHIR+FGF1处理HUVECs的基因、mRNA及蛋白表达分析
对予以CHIR+FGF1(分别位5μM和100ng/ml)干预的HUVECs进行细胞总RNA的提取并用RNA序列检测显示18845个基因中有815个基因表达水平有显著变化(p<0.05)。与血管生成、细胞增殖、细胞死亡相关的代表性基因如图12A所示。此外，qPCR结果显示：与对照组相比，CHIR+FGF1治疗组的细胞周期相关蛋白D1(CCND1)、CDK1、及c-Myc显著上调(图12B)。
同样的，对HUVEC提取细胞总蛋白行蛋白免疫印迹分析不同的细胞周期调控蛋白的表达如：细胞周期蛋白家族、CDKs、c-Myc、GSK3、β-catenin等(图12C)。结果提示，与对照组相比，CHIR+FGF1治疗组的CCND1、细胞周期蛋白H、CDK4、c-Myc、β-catenin及p-GSK3-α/β显著上调(图12D)。剩下的细胞周期蛋白的表达水平(A2、D2、E1和E2)、CDK7和GSK-3α/β在各组间差异无统计学意义(图12E)。

Claims (10)

1.装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，其特征在于，所述CHIR99021及FGF1均为小分子药物。
2.根据权利要求1所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，其特征在于，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒的制备方法为：采用双乳技术对重组人FGF1酸性蛋白进行纳米颗粒制备，和采用单乳技术对CHIR99021进行纳米颗粒制备。
3.根据权利要求2所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，其特征在于，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒的制备方法为：
将100重量份的PLGA与5重量份的二氯甲烷溶液混匀后，加入浓度为1毫克/毫升的FGF1溶液，在4℃条件下超声处理2分钟，加入4％(w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液，在4℃下再次超声2分钟，将合成的混合物转移到含4％(w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液与去离子水中，所述聚乙烯醇(PVA)水溶液与去离子水体积比为1:2混合，搅拌4小时，直到二氯甲烷完全蒸发，将溶液以1000g的转速离心10分钟以去除大颗粒沉渣，得到的上清以45000g的转速高速离心20分钟以收集纳米颗粒，用去离子水对收集的纳米颗粒洗涤两次，最后以45000g的转速离心20分钟，-80℃冷冻过夜，真空负压抽吸冻干48小时，收集纳米颗粒-80℃保存备用，得到装载FGF1的PLGA纳米颗粒；
将100重量份的PLGA与5重量份的二氯甲烷溶液混匀后，加入浓度为8毫克/毫升的CHIR99021溶液，在4℃超声处理2分钟，加入1％(w/v)二甲胺硼烷(DMAB)水溶液，在4℃条件下超声处理2分钟，将合成的混合物转移到含4％(w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液与去离子水中，所述聚乙烯醇(PVA)水溶液与去离子水体积比为1:3混合，搅拌4小时，直到二氯甲烷完全蒸发，将溶液以1000g的转速离心10分钟以去除大颗粒沉渣，得到的上清以45000g的转速高速离心20分钟以收集纳米颗粒，用去离子水对收集的纳米颗粒洗涤两次，最后以45000g的转速离心20分钟，-80℃冷冻过夜，真空负压抽吸冻干48小时，收集纳米颗粒-80℃保存备用，得到装载CHIR99021的PLGA纳米颗粒。
4.根据权利要求1～3任一所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，其特征在于，所述缺血性心脏病包括：冠心病、心肌梗死。
5.根据权利要求4所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，其特征在于，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒可以缓慢释放药物长达4周。
6.根据权利要求1～3任一所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒为水溶剂。
7.根据权利要求4所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒的给药途径为心肌局部注射。
8.根据权利要求4所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒主要作用于梗死边缘区附近，能抑制心肌细胞的凋亡。
9.根据权利要求4所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒主要作用于梗死边缘区附近，能促进血管新生。
10.根据权利要求4所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒在治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述装载CHIR99021及FGF1的PLGA纳米颗粒主要作用于梗死边缘区附近，能改善心肌肥大。
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