CN111194407A

CN111194407A - 用于测量三维细胞结构的药物应答动力学的无标记方法和系统

Info

Publication number: CN111194407A
Application number: CN201880065445.4A
Authority: CN
Inventors: 辜丽蓉; R·达斯古普塔; G·珀利亚萨密
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 2017-08-14
Filing date: 2018-08-14
Publication date: 2020-05-22
Also published as: SG11202001087RA; US20200218874A1; WO2019035766A1

Abstract

本文公开了提供一种计算模型的方法，该计算模型用于预测测试试剂相对于3D细胞结构(例如，球状体、类器官和肿瘤球体)的活性。具体地，采用机器学习算法以使用区域特定图像特征生成3D细胞结构中药物应答的定量模型，其中该区包括坏死区、静止区和增殖区。本文还公开了使用这种计算模型的无标记预测方法以及被配置为执行本文所公开的方法的装置。

Description

用于测量三维细胞结构的药物应答动力学的无标记方法和系统

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年8月14日提交的SG临时申请No.10201706639T的优先权权益，其内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明一般性地涉及图像处理、生物信息学和细胞生物学领域。特别地，本发明涉及图像处理在三维细胞结构中测量药物应答动力学的用途。

背景技术

与单层二维(2D)细胞培养物不同，三维(3D)肿瘤球状体模型再现了空间微环境并潜在地模拟了原发性肿瘤的病理生理应答。然而，大多数用于评价细胞生存力和药物功效的基于细胞的测定仍然基于单层2D细胞培养物，其尚未被证明充分预测体内功效。随着精密肿瘤学的出现，类体内模型(in-vivo like model)对于治疗策略的研究日益重要，这已经引起了人们对建立3D肿瘤球状体作为药物测试的替代或补充筛选模型的兴趣。事实上，一些研究揭示，与相同细胞系的相应2-D细胞培养物相比，3D球状体的基因组和蛋白质组图谱更反映了亲代肿瘤的细胞-细胞相互作用和微环境。已发表的数据还表明，在球状体中胞外基质(ECM)和低氧组分显著升高，表明3D模型更适合于转移和分化研究。另外，一些药物的功效高度依赖于3D微环境中的细胞-细胞相互作用，因此在2D细胞培养物中可能被非自然地抑制。

癌症肿瘤球状体已经在癌症研究的各个方面使用了几十年。已经建立了各种形式的肿瘤球状体(tumour spheroid)，包括多细胞肿瘤球状体、肿瘤球体(tumorosphere)如乳腺球(mammosphere)、结肠球(colonosphere)和组织源性肿瘤球体、以及器官型多细胞球状体。然而，直到最近几年，HCS和HTCS的发展以及显微技术的进步才使得建立用于疗效评价的大规模3D肿瘤球状体筛选平台成为可能。在这样的3D HCS/HCTS平台上，在单个实验中可以生成数千个球状体，并且用不同的化合物文库并以不同的稀释度平行查询。球状体呈现的形态学变化可以使用高分辨率显微镜来捕获，并且使用计算图像分析流水线来评估或量化。以高通量方式筛选3D肿瘤球状体的能力对于其在快速药物测试中的应用、特别是对于精密肿瘤学中的个性化疗效评价是关键的。

例如，至少500μm的良好形成的球状体显示出具有不同的增殖区、静止区和坏死区的同心结构，以及密切模拟体内肿瘤中来自血管的营养物质、氧气和代谢物的浓度衰减(concentration depreciation)的病理生理梯度。与单层细胞培养物相比，肿瘤球状体通常显示出对化疗药物的物理化学应答降低。许多在2D细胞培养物中具有高效率的处理在3D肿瘤球状体中具有降低的抑制活性，这可能是由于在3D环境中通过细胞-细胞和细胞-基质相互作用建立的肿瘤微环境生理学的调节以及通过缺氧坏死区、固有耐药性的静止区和直接暴露于药物作用的增殖区的存在建立的药物渗透梯度的调节。

已经证明3D肿瘤球状体在药物的阴性选择和阳性选择中是疗效评价的主要工具。作为更好地概括原发性肿瘤的类体内模型，肿瘤球状体模型可用于高通量化学筛选(HCTS)以能够消除(2D单层模型)假阳性，从而减少下游动物测试。最近的研究还揭示，由于诸如细胞-基质相互作用的存在等因素，某些信号传导通路(signalling pathway)仅在3D环境中被激活。因此，肿瘤球状体模型可用于鉴定在2D单层模型中可能具有体内功效但其活性被抑制的药物。当肿瘤球状体由源自患者的细胞系培养时，肿瘤球状体模拟患者特异性因子，该因子可以由于代谢和微环境差异而改变对药物的应答，并且可以是精密肿瘤学研究的有价值的工具。

使用3D肿瘤球状体作为药物筛选模型的主要障碍是缺乏测量球状体中药物应答动力学的自动化方法。已经开发了基于非图像的测定来确定细胞生存力或细胞毒性。这些方法包括使用ATP来定量代谢活性细胞、或使用刃天青还原来定量线粒体代谢活性、使用4-硝基苯基磷酸酯(4-nitrophenyl phosphate)来测量胞质酸性磷酸酶(APH)水平、以及使用四唑盐来测量乳酸脱氢酶(LDH)活性。上述测量主要基于吸收、发光或荧光。基于图像的测定通常包括活细胞染色/死细胞染色以及通过多通道采集图像。在基于非图像的测定和基于图像的测定中对细胞固定的需要将测定限制于终点实验，并限制了监测球状体应答于药物处理的药效学的能力。

另一方面，基于形态学的方法主要使用球状体的尺寸/体积或形状。然而，这些参数不能充分反映表型应答。相对地，区域特异性图像描述符更可预测肿瘤球状体的药理学应答，但具有有限的预测值(R<0.5)。需要更复杂的图像描述符以在每个时间点获得药物应答的更精确的量化，并绘制药物应答随时间的动力学曲线。

因此，需要一种无标记、非侵入性系统，用于在高通量装置中连续监测3D球状体的应答动力学。此外，结合附图和本公开的背景技术，通过随后的详细描述和所附权利要求，其他期望的特征和特性将变得显而易见。

发明内容

在一个方面，本发明涉及提供用于预测测试试剂相对于3D细胞结构的活性的计算模型的方法，该方法包括提供多个训练样本，每个训练样本包括应用于多个训练3D细胞结构中的相应训练3D细胞结构的多个训练测试试剂中的相应训练测试试剂；确定多个训练样本中的至少一个训练样本的相应图像；确定每个相应图像的相应特征集合；确定应用于与多个训练样本中的至少一个训练样本相对应的相应训练3D细胞结构的相应训练测试试剂的相应活性；基于所确定的相应特征集合和所确定的相应活性来确定计算模型。

另一方面，本发明涉及无标记预测方法，包括：提供计算模型；提供包含应用于3D细胞结构的测试试剂的样本；确定样本的图像；确定图像的特征集合；基于上述特征集合并基于上述计算模型预测该测试试剂相对于3D细胞结构的活性。

在又一方面，本发明涉及被配置为执行如本文所公开的方法的装置。

附图

图1显示了源自头颈癌患者的淋巴结活检组织的肿瘤球状体同心结构的示意图和显微照片。球状体呈现出增殖梯度，其中氧气和营养物质的含量从球状体的外表皮到内部低氧核心逐渐减少，并具有明显的增生区、静止区和坏死区。

图2显示了源自头颈癌患者的球状体的显微照片，其中(a)经高浓度的抗癌药顺铂处理；(b)经低浓度的抗癌药顺铂处理；以及(c)DMSO介质中未经处理。所有三种患者源性球状体具有大约500μm的相似尺寸。然而，在低浓度的顺铂下，肿瘤球状体的形态结构类似于DMSO介质中的未经处理的球状体的形态结构，而用较高浓度的顺铂处理的球状体显示扩大的核心区(以黄色包围)，反映了处理的功效。

图3显示了在超低附着384孔板中生长的球状体的明场图像。每个孔含有用480种抗癌药物其中之一处理的肿瘤球状体。

图4显示了504个图像特征的皮尔逊相关分析(Pearson correlation analysis)的结果，该图像特征从1,170个药物处理的球状体的分割图像中提取并与药物应答相关(y轴；基于

3D细胞生存力测定)。

图5显示了头部和颈部肿瘤球状体被分割成增殖区(底行，左框)、静止区(底行，中框)和坏死区(底行，右框)的显微照片。然后从下图中的三个区域特定图像独立地量化图像特征。

图6显示了通过“球状体剥离方法(Spheroid Peeling method)”的图像分割工作流程的实例。可以使用许多不同的方法来执行对象分割。假定球状体剥离基于明场图像，则在明场通道中进行分割，其中图像被表示为具有不同强度等级的像素。在Cell Profiler中，使用(1)阈值化(thresholding)和(2)滤波(filtering)来实现主要对象的识别。阈值化步骤涉及使用最大相关阈值从背景区域识别前景区域(Padmanabhan K，Eddy WF，CrowleyJC(2010)“A novel algorithm for optimal image thresholding of biological data”Journal of Neuroscience Methods193，380-384)。简单地，MCT方法通过最小化每个区域内的方差来确定阈值。然后，滤波步骤涉及通过拆分对象(解集)或合并对象来细化对象的边界。所使用的方法是高斯拉普拉斯算子(Laplacian of Gaussian)(R.Haralick andL.Shapiro,Computer and Robot Vision(计算机与机器视觉),Vol.1,Addison-WesleyPublishing Company,1992,346-351页)。拉普拉斯算子是图像的第二空间导数的度量。图像的拉普拉斯算子将增强快速强度变化的区域，即边缘，因此它可以用于边缘检测。

图7显示了机器学习工作流程的示意图，该工作流程用于使用从1,231个肿瘤球状体图像生成的超过600K区域特定图像特征来生成肿瘤球状体中药物应答的定量模型。所学习的模型可用于量化球状体在所有时间点的药物应答。

图8显示了回归分析的结果(左)和箱形图(右)，显示无标记肿瘤学评分(LaFOS)和药物应答之间r＝0.77的相对高相关性，以及通过LaFOS指示的药物应答随时间的总体增加。

图9显示了肿瘤球状体对3种抗癌化合物的四维药物应答的结果。用一式两份球状体评价每种药物(R1和R2)。患者的球状体显示在72小时进程内对NVP-TAE684和GSK2126458的应答增加，并且分别达到60％和80％的抑制率，而它们对BEZ235无应答。

图10显示了显示药物应答和491个图像特征之间相关性的点状图。

图11显示了本文公开的方法的总体方法的示意图。获得患者的活检组织(biopsies)并将其衍生成用于筛选目的的细胞系。实验阶段涉及建立高通量实验管道以(i)从细胞系生成肿瘤球状体，(ii)用小分子抑制剂的药物文库筛选肿瘤球状体，和(iii)以规则的时间间隔采集球状体的高分辨率共聚焦显微镜图像。第二个目的涉及能够实现4DHCS系统的计算技术的发展，包括以下方法：(i)从球状体的多个z平面显微照片重建“3D图像”，(ii)生成多参数机器学习模型以根据球状体随时间的形态学变化预测药物应答，和(iii)从其导出4D药物应答动力学(现象分布图)以及(iv)将它们分级以为患者选择候选药物。

图12显示了关于例如患者样本的整个过程。(A)显示了来自头颈癌患者的肿瘤。(B)显示了形成良好的球状体，其显示不同的增殖区、静止区和坏死区。肿瘤球状体中的药物敏感性以形态学改变的形式显现，其中药物敏感性球状体显示较大的坏死核心。(C)显示了在384孔超低附着板中培养的肿瘤球状体的图像。(D)显示了在YM155(在检查的细胞系中具有已知作用的药物)和对照DMSO存在下肿瘤球状体的显微照片。(E)显示了同一患者的3D肿瘤球状体/PDMT、2D单层培养物、原发性肿瘤和PDX的全基因组基因表达谱的相关矩阵，揭示了球状体模型和原发性肿瘤之间高度相关的转录组谱。(F)显示了(与单层细胞培养物相比)在3D肿瘤球状体中表达升高的基因的通路富集分析表，提示3D肿瘤球状体模型显示KRAS信号传导、ECM组织和癌症干细胞的富集，这反映了肿瘤发生和转移。

图13显示了皮尔逊相关图和线性相关图，描述了在LaFOS中优化机器学习方法以提高预测精度。最新结果显示肿瘤球状体的LaFOS显示出与相应的药物功效得分显著更高的相关性(R＝0.81，RMSE＝13.2)，这是前述方法的改进。

图14显示了概述本文公开的方法的开发背后的推理的示意图。

图15显示了描述基于其应答动力学的药物评价的分层的线形图。

图16显示了关于本发明的LaFOS进行的第一次初步测试的结果。DMSO(对照)中患者源性肿瘤球状体的图像被分割成增殖区(红色)、静止区(黄色)和坏死区(绿色)。

图17显示了关于本发明的LaFOS进行的第一次初步测试的结果。化合物YM155中患者源性肿瘤球状体的图像被分割成增殖区(红色)、静止区(黄色)和坏死区(绿色)。

图18显示了关于本发明的LaFOS进行的第一次初步测试的结果。化合物吉非替尼中患者源性肿瘤球状体的图像被分割成增殖区(红色)、静止区(黄色)和坏死区(绿色)。

图19显示了机器学习工作流程的示意图的第一部分，该工作流程用于使用从1,231个肿瘤球状体图像生成的超过600K区域特定图像特征来生成肿瘤球状体中药物应答的定量模型。在该部分中，上述示意图显示了如何使用高分辨率图像来得出药物应答模型。

图20显示了机器学习工作流程的示意图的第二部分，该工作流程用于使用从1,231个肿瘤球状体图像生成的超过600K区域特定图像特征来生成肿瘤球状体中药物应答的定量模型。这里，显示了如何使用来自多孔实验的数据来产生药物应答预测。

图21显示了球状体的显微照片。本文公开的方法已经应用于来自4种适应症——7种头颈癌(HN120M、HN120P、HN137M、HN137P、HN148M、HN160P和HN182M)、1种乳腺癌(MDA-MB-231)、1种卵巢癌(OV169AP)和2种结肠直肠癌(CRC948和HCT116)的11个细胞系。它们包括9个患者源性细胞系和2个商业细胞系MDA-MB-231和HCT116。用包含超过600种化合物的Selleck抗癌和激酶抑制剂小分子文库独立筛选由这些细胞系生成的肿瘤球状体。由这些细胞系生成的肿瘤球状体在5个时间点——0小时、24小时、48小时、72小时和96小时(或120小时)成像。这里显示的是在72小时时源自11个细胞系的球状体的示例图像。将这些图像分割为坏死区、静止区和增殖区，并利用深度学习预测药物的功效。

图22显示了来自6种癌细胞系的顶级抑制剂(top inhibitor)的药物应答动力学的线形图，该癌细胞系是使用本文公开的方法鉴定的针对五(5)种头颈癌和一(1)种卵巢癌细胞系的顶级抑制剂。根据球状体在24小时、48小时、72小时和96小时(或120小时)的形态学模式预测药物应答得分。具体地，YM155在HN137M中的功效和夫拉平度(Flavopiridol)在HN120M中的功效已经在体内模型中得到证实，并且先前已在独立研究中发表(R.Haralickand L.Shapiro,Computer and Robot Vision(计算机与机器视觉),Vol.1,Addison-Wesley Publishing Company,1992,346-351页；参见图23)。

图23显示了描述夫拉平度在HN120M中和YM155在HN137M中的体内验证实验的线形图。在右图中，用载体(对照)和5mg kg^-1夫拉平度(HN120)处理在一侧胁腹携带患者匹配的PDX的六组独立的小鼠(n＝6)。在左图中，与载体(对照)相比，用2mg kg^-1的YM155处理在两侧胁腹携带来自HN137P PDX和HN137M PDX的肿瘤的五组独立的雄性小鼠(n＝5)。在HN137MPDX中观察到YM155处理具有显著的抗肿瘤效果，而HN137P PDX对YM155没有显示显著的敏感性。进行双尾Student’s t检验；*P<0.05,**P<0.01,**P<0.001。

具体实施方式

本公开描述了在药物或药物组合存在下测量三维(3D)细胞结构(例如肿瘤球状体)的应答动力学的方法和系统。举例来说，在经过药物处理后，3D肿瘤球状体显示出区域特定的形态学变化，其可以使用高空间分辨率明场显微镜来捕获。这些形态学变化可以使用复杂的计算图像描述符来精确地量化。本文公开的方法利用随时间的区域特定的形态学变化来确定肿瘤球状体对给定药物/药物组合的应答动力学，和/或这种药物/测试试剂在3D细胞结构中的药代动力学。由于本文公开的方法尤其利用明场图像，并且不需要固定或染色球状体，因此可以基于本文公开的内容建立无标记、非侵入性系统，用于在存在不同环境提示的情况下连续和动态监测例如3D球状体的应答动力学。此外，根据本公开的方法利用机器学习方法来生成具有改进的药物应答预测性的图像特征的多变量模型。

如本文所用，术语“应答动力学(response kinetics)”(也称为“药效学(pharmacodynamics)”)是指3D细胞结构(例如本文公开的球状体)对测试试剂的存在的生物学应答和/或化学应答。这种应答动力学可包括但不限于以下参数，例如细胞形态、总体结构变化、粘附或缺乏、细胞锚定到血管壁、坏死或细胞死亡、细胞表面标记物的变化、培养容器内的环境pH水平的变化等。

如本文所用，术语“药代动力学(pharmacokinetics)”是指确定施用给活生物体的物质的规律(fate)。在本公开中，术语药代动力学是指3D细胞结构对测试试剂的影响。换句话说，药代动力学的研究本身涉及细胞结构的代谢和一种或多种测试试剂的所得代谢物。总之，通过药效学和药代动力学分析获得的信息可用于确定处理参数，例如但不限于剂量范围、给药方案、不良反应(adverse effect)、副作用(side effect)和药物益处。

如本文所用，短语“无标记预测方法(label-free prediction method)”是指预测或检测过程，其不需要用任何标记过程标记测试试剂或靶细胞(即3D细胞结构)的额外步骤。在一些实例中，可以在不需要光学染色3D细胞结构或测试试剂的情况下执行无标记预测方法。在一些实例中，无标记预测方法不需要将荧光团或其他报道分子共价连接到测试试剂或3D细胞结构的步骤。

本文公开的主题有多种转化应用(translational application)。本文公开的方法可以在大规模3D高通量化学筛选(HTCS)和/或高含量筛选(HCS)药物测试平台中实施，以使得能够用超过数百种药物或药物组合并以不同稀释水平对细胞结构(包括但不限于肿瘤球状体)进行并行探寻(parallel interrogation)，从而使得能够对治疗策略进行分级和选择。

该3D药物测试平台可用作例如动物前测试步骤，以确定候选药物如标准护理化疗对源自癌症患者的肿瘤球状体的药效学和长效作用(pro-longed effect)。肿瘤球状体可以例如从患者的永生化细胞系或原代细胞系培养。在后一种情况下，该系统能够对单个患者的不同治疗策略的应答动力学进行全面评估，并为治疗选择(therapeutic selection)提供增强的信息，从而促进个性化肿瘤学和精密治疗。

因此，在一个实例中，本文公开的样本获自患病受试者。在一个实例中，受试者患有癌症。在另一个实例中，将样本培养成三维结构。这种三维结构可以是但不限于球状体(也称为球形结构)、球状结构等。如本文所用，术语“球状体(spheroid)”是指“球形(sphere-like)”结构。相反，术语“球状(globular)”是指球状的结构，其可以包括球形结构以及由多个球体组成的结构。例如，扁平球将被认为落在术语“球状”之下，但不会被认为是球形的。还包括在形状上类似于球状体的类器官模型(organoid model)、球形类器官(spherical organoid)以及球形类器官3D细胞结构。本文公开的样本可以例如从固体活检样本或液体活检样本获得。本文获得的样本也可以是临床样本或来自天然存在的组织的样本。在另一个实例中，样本可以包含肿瘤细胞。

一旦从受试者获得，这些样本可以在贴壁条件或低附着条件或非贴壁条件下在细胞培养物中生长，以便根据本领域已知的方法获得球状体细胞结构。在一个实例中，本文公开的3D结构包括肿瘤细胞。在另一个实例中，本文公开的球状体包含肿瘤细胞。

本文公开的方法涉及将细胞球状体的区域(area)分成三个不同的区(zone)(坏死的、静止的和增殖的)以及使用从每个区提取的多个图像特征构建多变量药物应答模型。虽然这些区的存在在本领域中是公知的并且已经在前面讨论过，但是单个的图像特征与药物应答相关，而不是作为多变量模型。

因此，在一个实例中，球状体包括坏死区、静止区和增殖区。在另一个实例中，球状体的区包括坏死区、静止区和增殖区。在另一个实例中，球状体包括静止区和增殖区。在一个实例中，可能只有来自球状体的两个区可以通过计算进行分割——在这种情况下，这两个区将是静止区和增殖区。当仍然向球状体中心供应氧气和营养物质时，坏死核心无法牢固地建立自身的位置。因此，在这种情况下，只可能确定两个区的存在。在球状体不显示任何区带分化(zonal differentiation)的情况下，不能应用本文公开的方法。例如，当未完全形成球状体和/或存在松散的细胞聚集时，就会发生这种情况。

本文所用术语“静止(quiescence)”是指静止区(quiescent zone)，静止是指细胞或3D的区或区域，其中细胞处于休眠状态且基础活动最小。换句话说，静止区包含存活的但不增殖的细胞。

本文公开的球状体包含细胞，基于这些细胞，本领域技术人员将理解，一旦限定，这些区可以是圆形的或不规则的，例如，显示为围绕球状体的特定区域的条带，或甚至显示为球状体的限定部分。这些区不一定包括球状体，但也可以作为位于球状体一侧的球状体的细胞区域。在另一个实例中，本文所揭示的方法包括确定每一区的大小或宽度并将其与相应基线测量值进行比较。应当理解，区的尺寸变化指示了被测试试剂在所述3D细胞结构的处理中是否被认为有效或无效。换句话说，区的尺寸变化指示了药物在处理中的功效和/或3D细胞结构对药物的应答。

本领域已知的方法先前已经评价了为肿瘤球状体从核心区至外围的强度梯度的函数的药物应答。本领域已知的另一种方法讨论了在侵入测定中将肿瘤球状体分成三个重叠区域——核心、晕圈和外周的方法。本文公开的方法限定了三个不同的区，它们不完全对应于使用本领域已知的方法确定的那些区。本领域中还已知的方法通常集中在肿瘤球状体的三个区域上的密度梯度，而本文公开的方法从球状体的每个区提取多个特征。

因此，本文公开了一种方法，其中应用机器学习将肿瘤球状体的形态学变化与药物应答相关联。更具体地，应用机器学习来确定计算模型，以关联应答于药物处理的肿瘤球状体的形态学变化。计算模型的确定包括训练计算模型和确定计算模型的参数。此后，根据本公开，计算模型用于输出测试试剂或药物相对于3D细胞结构的活性或应答得分。例如，计算模型被配置为输出测试试剂或药物相对于3D细胞结构的抑制得分。在一个实例中，细胞毒性可用于滤出毒性化合物，因此可与细胞生存力结合用于治疗药物选择。

假定本文公开的方法可以应用于明场图像，本文公开的细胞结构不需要固定。也就是说，本文公开的细胞结构不需要锚定或粘附于反应容器的表面以进行分析，细胞也不需要在其当前状态下化学停止，因此能够连续监测例如球状体区中的形态学变化并以时间方式对药物应答相应预测。这使得例如能够简单地通过高分辨率显微成像随时间连续描绘每个肿瘤球状体的应答动力学。

与单层二维(2D)细胞培养物不同，3D肿瘤球状体模型重现了空间微环境并模拟了原发性肿瘤的病理生理应答。然而，大多数用于评价细胞生存力和药物功效的基于细胞的测定仍然基于单层2D细胞培养物，其尚未被证明充分预测体内功效。随着精密肿瘤学的出现，类体内模型对于治疗选项的研究日益重要，这已经引起了人们对建立3D肿瘤球状体作为药物测试的替代或补充筛选模型的兴趣。事实上，一些研究揭示，与相同细胞系的相应2-D细胞培养物相比，3D球状体的基因组和蛋白质组图谱更反映了亲代肿瘤的细胞-细胞相互作用和微环境。已经表明在球状体中胞外基质(ECM)和缺氧组分显著升高，表明3D模型更适合于转移和分化研究。另外，一些药物的功效高度依赖于3D微环境中的细胞-细胞相互作用，因此在2D细胞培养物中可能被非自然地。

癌症肿瘤球状体已经在癌症研究的各个方面使用了几十年。已经建立了各种形式的(肿瘤)球状体的实例，包括多细胞肿瘤球状体、肿瘤球体如乳腺球、结肠球和组织源性肿瘤球体、以及器官型多细胞球状体。多细胞肿瘤球状体是通过在非贴壁条件下在细胞培养物中再聚集细胞而形成的。包括乳腺球(如果该球体由乳腺癌细胞组成)和结肠球(对于由结肠癌细胞组成的球体)的肿瘤球体的实例可以从癌症干细胞/祖细胞的增殖发展而来，并且在补充有生长因子的无血清培养基中生长。组织源性肿瘤球体可以例如通过部分解离肿瘤组织并将细胞再压缩成球形结构而获得。器官型多细胞球状体可通过切割肿瘤组织并在非贴壁条件下使组织变圆而形成。因此，在一个实例中，3D细胞结构可以是但不限于球状体、类器官或肿瘤球体。然而，仅在最近几年中，高含量筛选和高通量化学筛选的发展以及显微技术的进步已经加强了用于疗效评价(therapeutic evaluation)的大规模3D肿瘤球状体筛选平台的建立。在这样的3D平台上，可以在单个实验中生成数千个球状体，并且用不同的化合物文库并以不同的稀释度进行并行探寻。球状体呈现的形态学变化可以使用高分辨率显微镜来捕获，并且使用计算图像分析流水线来评估或量化。以高通量方式筛选3D肿瘤球状体的能力对于其在快速药物测试中的应用、特别是对于精密肿瘤学中的个性化疗效评价是关键的。

因此，在一个实例中，本文公开的方法可用于高含量筛选和/或高通量化学筛选。这种筛选可以是手动的或自动的。

3D细胞结构的尺寸具有100μm至1000μm、或至少100μm、或至少200μm、或至少300μm、或至少400μm、或至少410μm、或至少420μm、或至少430μm、或至少440μm、或至少450μm、或至少460μm、或至少470μm、或至少480μm、或至少490μm、或至少500μm、或至少510μm、或至少520μm、或至少530μm、或至少540μm、或至少550μm、或至少560μm、或至少570μm、或至少580μm、或至少590μm、或至少600μm、或至少700μm、或至少800μm、或至少900μm的平均直径。在一个实例中，3D细胞结构具有约500μm的平均直径。在另一个实例中，球状体具有约500μm的平均直径。

在一个实例中，至少500μm的良好形成的球状体显示出具有不同的增殖区、静止区和坏死区的同心结构，以及密切模拟体内肿瘤中来自血管的营养物质、氧气和代谢物的浓度衰减的病理生理梯度。

使用3D肿瘤球状体作为药物筛选模型的主要障碍是缺乏测量球状体中药物应答动力学的自动化方法。已经开发了基于非图像的测定来确定细胞生存力或细胞毒性。这些方法包括使用三磷酸腺苷(ATP)来定量代谢活性细胞、或使用刃天青还原来定量线粒体代谢活性、或使用4-硝基苯基磷酸酯来测量胞质酸性磷酸酶(APH)水平、或使用四唑盐来测量乳酸脱氢酶(LDH)活性、或这些方法的组合。上述测量主要基于吸收、发光或荧光。基于图像的测定通常包括活细胞染色/死细胞染色以及通过多通道采集图像。在基于非图像的测定和基于图像的测定中对细胞固定的需要将测定限制于终点实验，并限制了监测球状体应答于药物处理的球状体的药效学的能力。

另一方面，基于形态学的方法主要使用球状体的尺寸/体积或形状。然而，这些参数不能充分反映表型应答。基于源自口腔癌患者的肿瘤球状体的研究(数据未显示)揭示，尽管肿瘤球状体在经过药物处理后可能保持其尺寸和形状，但其内部空间区域结构应答于药物活性而改变(图2)。

还应当注意，由于本文公开的方法是基于预测模型的，所以它受到取决于计算模型的精度以及训练样本的尺寸和质量的误差率的影响。该方法还假设可以获得肿瘤球状体的高分辨率图像。该方法还要求球状体良好地形成有独特的静止区、坏死区和增殖区。

在涉及同一患者的类似研究中，以高通量384孔形式生成肿瘤球状体(图3)。在四个384孔超低附着板中培养1,170个球状体，并用480种抗癌小分子和12种癌症的激酶抑制剂处理，其中一些是FDA批准的。

在一个实例中，在药物处理后72小时采集共焦明场图像，并将其分割以从每个肿瘤球状体的坏死区、静止区和增殖区获得504个图像测量值，其方法在本文公开。每个图像特征分别与药物应答的相关联揭示了球状体的尺寸(“TotalArea-Proliferating”，r＝0.10)和药物对肿瘤球状体的功效之间的弱相关性(poor correlation)(图4)。相反，源自球状体不同区的选定的形状相关图像特征、文本相关图像特征和尺寸相关图像特征与药物应答更好地相关。这些包括球状体中坏死核心区的面积(“AreaShape_Area-Necrotic”，r＝0.40)、坏死区的曲率(“AreaShape_Solidity-Necrotic”，r＝0.32)和静止区的纹理(“Granularity_1-Quiescent”，r＝0.49)与药物应答更好地相关。与药物应答反向相关的特征如坏死区的强度(“Intensity_Meanintensity-Necrotic”，r＝-0.41)也与表征球状体对药物的应答的指标(proxy)相关，而逻辑上不相关的特征如图像中坏死区的y位置(“AreaShape_Center_Y-Necrotic”，r＝-0.02)显示与药物应答非常低的相关性。注意，这里使用的术语“r”是指皮尔逊相关系数(Pearson’s correlation coefficient)。

与单层细胞培养物相比，肿瘤球状体通常显示出对化疗药物的物理化学应答降低。许多在2D细胞培养物中具有高效率的处理在3D肿瘤球状体中具有降低的抑制活性，这可能是由于在3D环境中通过细胞-细胞和细胞-基质相互作用建立的肿瘤微环境生理学的调节以及通过缺氧坏死区、固有耐药性的静止区和直接暴露于药物作用的增殖区的存在建立的药物渗透梯度的调节。

因此，在一个实例中，3D结构是球状体。在另一个实例中，3D结构是肿瘤球状体。

已经证明3D肿瘤球状体在药物的阴性选择和阳性选择中是疗效评价的主要工具。作为更好地再现原发性肿瘤的类体内模型(in-vivo-like model)，肿瘤球状体模型可用于高通量化学筛选以能够消除(2D单层模型)假阳性，从而减少下游动物测试。还已经表明，由于诸如细胞-基质相互作用的存在等因素，某些信号传导通路仅在3D环境中被激活。因此，肿瘤球状体模型可用于鉴定具有体内功效但其活性在2D单层模型中被抑制的药物。当从源自患者或受试者的细胞系中培养肿瘤球状体时，肿瘤球状体模拟患者特异性因子，该因子可以由于代谢差异和微环境差异而改变对药物的应答，并且可以是精密肿瘤学研究的有价值的工具。

如本文所用，术语“试剂(agent)”包括但不限于蛋白质、多肽、无机分子、有机分子(如有机小分子)、多糖、多核苷酸等。在一个实例中，试剂是但不限于物质、分子、元素、化合物、实体或其组合。在本申请的表(例如表1至2)以及附图(例如图22)中提供了这类试剂的列表。

在另一个实例中，试剂可以是但不限于多肽、β-转角模拟物(beta-turnmimetics)、多糖、磷脂、激素、前列腺素、类固醇、芳香族化合物、杂环化合物、苯二氮卓类(benzodiazepines)、寡聚N-取代甘氨酸、寡聚氨基甲酸酯、多肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物及其组合。

在另一个实例中，试剂可以是一种或多种合成分子。在另一个实例中，试剂可以是一种或多种天然分子。本文所述的试剂可从多种来源获得，包括合成化合物文库或天然化合物文库。

在一个实例中，试剂是多肽。在这种试剂是多肽的实例中，多肽的长度可以是约4至约30个氨基酸、约5至约20个氨基酸、或约7至约15个氨基酸。

在另一个实例中，试剂可以是一种或多种多核苷酸。这种多核苷酸的实例包括但不限于天然存在的核酸、随机核酸或“偏倚的(biased)”随机核酸。多核苷酸试剂的其他实例可以是但不限于siRNA、shRNA、cDNA、gRNA及其组合。

在另一个实例中，试剂可以是抗分子靶点的抗体或包括抗分子靶点的抗体。这些抗体可以是但不限于本领域已知的任何类型的抗体，例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。如本文所用，术语“抗体”是指能够结合抗原上的特定表位的免疫球蛋白分子。抗体可以由多克隆混合物组成，或者本质上可以是单克隆的。此外，抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白。本文公开的抗体可以多种形式存在，包括例如作为完整抗体、或作为抗体片段、或抗体的其他免疫活性片段，如互补决定区。类似地，抗体可以作为具有功能性抗原结合结构域(即重链可变结构域和轻链可变结构域)的抗体片段存在。此外，抗体片段可以以选自下组但不限于下组的形式存在：Fv、Fab、F(ab)2、scFv(单链Fv)、dAb(单结构域抗体)、双特异性抗体、双抗体和三抗体。

如本文所用，术语“活性(activity)”和“应答(response)”可以互换使用，并且用于指试剂关于3D细胞结构的生物活性。应答或活性可包括但不限于对一种或多种细胞的抑制活性、减少一种或多种细胞的生长、对一种或多种细胞的细胞毒性、抑制一种或多种细胞生长的增殖、抑制一种或多种细胞生长的分化等。

当测试3D细胞结构的活性或应答时，3D细胞结构和测试试剂必须彼此接触。此外，实验条件可能要求3D结构暴露于测试试剂或与测试试剂接触一段预定的时间。因此，在一个实例中，3D结构暴露于测试试剂或经受测试试剂一段预定或确定的时间。

在一些实例中，本文所述的特征包括但不限于下文所列的特征。如本领域技术人员将理解的，本文所述的方法中的特征选择可以通过本领域已知的方法来执行。在一些实例中，在如本文所述的方法中，使用诸如但不限于相关特征选择(例如具有截止值0.5的CFS)、基于熵的选择、交互信息、最佳优先、遗传算法、用于子集选择的贪婪逐步选择(greedy stepwise selection)等的方法来选择特征。本领域技术人员还将能够确定每个待选择的特征的可接受阈值的截止值。例如，容易理解，截止值可以根据数据集而不同，并且每个数据集将具有稍微不同的优化参数。

这是一种新颖的图像分割和分析方法，如本文所公开的，综合地利用肿瘤球状体的不同区的形态(使用诸如文本、强度等不同的图像参数)来构建球状体对药物敏感性的定量模型。可以从肿瘤球状体的明场/数字相衬图像中测量形态学变化。重要的是，本文公开的方法使得无标记方法能够连续监测单个肿瘤球状体的应答动力学，并且能够在3D肿瘤模型中全面地描绘(profile)药物的药代动力学。

使用本公开的方法，已经清楚地显示了下述可行性：(1)分割明场/数字相衬图像以提取多个球状体区域特定图像特征；(2)用机器学习训练分类器以识别/确定药物应答；以及(3)与标准细胞毒性测量(使用3-D细胞滴定GLO作为使用当前在临床中的多种标准护理药物的原理论证的验证)进行比较。

应用于源自患者的肿瘤球状体，本文公开的方法和系统允许定量描述患者肿瘤球状体对广谱药物的特异性应答动力学。这使得能够对单个患者的不同治疗策略(therapeutic option)进行全面评估，并为治疗选择提供增强的信息，从而促进个性化肿瘤学和精密治疗。

总之，已经显示了使用球状体尺寸或体积预测药物应答的缺陷。相对地，区域特定图像描述符更可预测肿瘤球状体的药理学应答，但具有有限的预测值(r<0.5)。需要更复杂的图像描述符来(1)在每个时间点获得更精确的药物应答定量，以及(2)绘制药物应答随时间的动力学曲线。本文公开的方法和系统利用肿瘤球状体的区带结构中的形态学变化，并且利用机器学习方法来生成具有改进的药物应答可预测性的图像特征的多变量模型。假定图像是从明场图像采集的，可以建立一种无标记的、非侵入性的系统，用于在高通量装置中连续监测3D球状体的应答动力学。

如在本申请中使用的，单数形式“一种(a、an)”和“该(the)”包括复数引用，除非上下文另外清楚地指示。例如，术语“遗传标记(a genetic marker)”包括多个遗传标记，包括其混合物和组合。

词语“基本上(substantially)”不排除“完全地(completely)”，例如“基本上不含(substantially free)”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中省略。

如本文所用，在制剂组分浓度的上下文中，术语“约(about)”通常为所述值的+/-5％、更通常为所述值的+/-4％、更通常为所述值的+/-3％、更通常为所述值的+/-2％、甚至更通常为所述值的+/-1％、以及甚至更通常为所述值的+/-0.5％。

在整个本公开中，某些实施方案可以范围格式公开。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对所公开范围的范畴的僵化限制。因此，应当认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及在该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5、6。无论范围的宽度如何，这都适用。

某些实施方案也可以在本文中被广泛地和一般性地描述。落入一般公开内的较窄种类和亚类分组中的每一个也形成本公开的一部分。这包括具有从该类中去除任何主题的附带条件或否定限制的实施方案的一般性描述，无论本文是否具体列举了去除的材料。

本文说明性地描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下适当地实践。因此，除非另外指明，否则术语“包括(comprising)”、“包含(including)”和“含有(containing)”及其语法变体旨在表示“开放式”或“包容性”语言，使得它们包含所列举的元素，但也允许包括另外的未列举的元素。另外，本文所采用的术语和表达已被用作描述性术语而非限制性术语，且在使用这些术语和表达时无意排除所示出和描述的特征或其部分的任何等效物，但应认识到，在所要求保护的本发明的范围内可进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的本发明进行修改和变化，并且这些修改和变化被认为在本发明的范围内。

如在本申请中使用的，单数形式“一种(a、an)”和“该/所述(the)”包括复数引用，除非上下文另外清楚地指示。例如，术语“遗传标记(a genetic marker)”包括多个遗传标记，包括其混合物和组合。

在整个本公开中，某些实施方案可以范围格式公开。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对所公开范围的范畴的非灵活限制。因此，应当认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及在该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5、6。无论范围的宽度如何，这都适用。

表

表1：来自Selleck的抗癌药物文库

表2：来自Selleck的激酶抑制剂药物文库

表3:HN137M5K 72小时特征区

实施例

方法

3D肿瘤球状体的生成

3D肿瘤球状体的生成可以使用不同的方案完成，包括悬滴技术和超低附着板。典型的技术包括减少细胞表面接触和促进细胞聚集，以促进细胞-细胞偶联成球状体。本文公开的方法独立于用于生成3D肿瘤球状体的技术。然而，该方法要求预处理球状体最佳地形成为平均尺寸为350μm至500μm(微米)的球状体，并呈现明确的坏死核心区、静止区和增殖区。

本公开中使用的实例是通过将5000个细胞接种到

384孔黑色透明圆底超低附着球状体微孔板的每个孔中生成的。将测定板在37℃、5％CO₂孵育3天以形成肿瘤球状体。在96小时，使用共聚焦显微镜在20X(Perkin Elmer Opera Phenix高含量筛选系统)下使球状体成像(在研究中标记为“未经处理的”)，然后(在DMSO中)用1μM的化合物处理。总共生成1,231个球状体，并在96小时用来自Selleck抗癌文库和Selleck激酶抑制剂化学文库的小分子和激酶抑制剂一式两份处理。随后在处理后24、48和72小时对药物处理的球状体成像。

3D肿瘤球状体的计算分割

通过称为“球状体剥离”的方法(图5)，将在不同时间点和z平面采集的1,231个球状体的明场图像计算分割成增殖区(红色)、静止区(绿色)和坏死区(黄色)。也可以使用其他成像方法——相衬成像、电子显微镜技术、宽场、暗场、超分辨率显微镜技术等。

简言之，“球状体剥离”涉及从外围到核心区重复分割球状体图像。首先将整个球状体分割为一个对象(以下称为球状体对象)，然后从原始孔图像中裁剪出来(图6)。然后从球状体对象中识别出“内核”，在此称为静止对象。通过从球状体对象对静止对象进行掩膜操作获得增殖区。类似地，坏死区被识别为静止对象的“内核”，并且通过从静止对象对坏死区进行掩膜操作来获得静止区。从每个增殖区、静止区和坏死区量化许多图像特征，得到每个球状体的总共504个图像描述符。“球状体剥离”算法可以用多种语言或图像分析工具编写，例如Cell Profiler、MATLAB或ImageJ。

使用基于多变量学习的方法对药物应答进行建模

如图4所示，在R＜0.5时，单个图像特征对药物应答的预测值有限。然而，通过使用基于学习的方法生成多变量图像特征模型，可以显著提高精度。尽管可以使用任何机器学习方法(例如支持向量机、随机森林、回归)来建立药物应答预测模型，但是本实例中使用的方法基于人工神经网络(ANN)/深度学习。可根据本公开用于生成多变量图像特征模型的基于学习的方法的非穷举列表包括但不限于：人工神经网络(ANN)、深度学习(例如卷积神经网络)、支持向量机(SVM)、基于回归的方法(例如线性回归或逻辑回归)、基于树的方法(例如决策树或随机森林方法)、提升方法(例如梯度提升或Adaboost方法)、基于距离的方法(例如K-最近邻(即KNN)或K-均值方法)和降维算法(例如主成分分析(PCA))。

该方法的整个工作流程如图19所示。图19是示出根据本公开的用于生成球状体中药物应答的计算模型(或学习模型)的基于机器学习的训练方法的流程图700。分别生成两组球状体用于成像和生存力测量。两组球状体用相同的药物处理。为了可行性测试，生成了1,231个球状体1902的训练集。在药物治疗后72小时，获得明场图像1906的采集1904。作为数据预处理708，应用“球状体剥离”1910以通过图像特征量化1912，从每个肿瘤球状体的增殖区、静止区和坏死区获得504个图像描述符，从而产生总共超过～600K的图像描述符1916。

平行地，培养一式两份的1,231个球状体，并且使用终点

3D细胞生存力测定法(72小时)测量1918在药物处理存在下每个球状体的生存力。通过将ATP读数(以RLU计)标准化为每个板的DMSO孔的读数，计算每个肿瘤球状体的抑制得分。将每个球状体的图像特征和相应的抑制得分用作监督式学习1920的输入。

学习过程生成计算模型1922，该计算模型1922可以被感知为球状体药物应答的复杂多特征数值量化。生成计算模型包括训练计算模型或确定计算模型的参数中的一个或多个。从该学习模型预测的得分被称为LaFOS(无标记肿瘤学得分，Label Free OncologyScore)，并且可以被认为是测试试剂相对于3D细胞结构的抑制得分或测试试剂相对于3D细胞结构的活性(或应答)得分。该模型可用于预测对从同一患者或不同患者培养的球状体的药物活性。

参考图20，根据本公开的药物测试平台可以有效地包括一次训练步骤2000，随后将学习的模型1922应用于在多个时间点源自同一或其他患者的球状体的图像，以获得药物应答预测2002。然而，为了避免由于实验设置的差异引起的形态学变化，使用相似的方案培养肿瘤球状体。实际上，药物测试工作流程仅需要以规则的间隔对药物处理的球状体成像。对随时间的形态学变化作图以确定不同药物对球状体的应答动力学。

在进行的可行性测试中，在480种抗癌药物之一处理后的4个时间点(未经处理的、24小时、48小时和72小时)对1,231个球状体中的每一个成像，总共得到4,924个图像。这些图像用作测试阶段的输入，以生成球状体在不同药物存在下的应答动力学的综合分布图(comprehensive profile)。

与单个图像特征相比(图4)，72小时时球状体的LaFOS显示与球状体的抑制得分显著更高的相关性(R＝0.77，RMSE＝13.2)。当应用于所有时间点时，大多数球状体的LaFOS随时间增加(图8b)。这是所预期的，并提示LaFOS能够捕获球状体对药物处理(drugtreatment)随时间递增的敏感性。

然而，时程曲线显示大多数化合物对3D肿瘤球状体没有功效——72小时LaFOS的中值小于20。只有少数化合物在72小时显示出大于50％的功效。例如，对于BEZ235，LaFOS保持不变(图9)。少数选择的化合物，如NVP-TAW684和GSK2126458在药物处理后3天的过程中显示出对肿瘤球状体增加的功效，表明该方法可用于描绘药物在3D肿瘤球状体上的药代动力学。

PDX的生成和传代。根据新加坡卫生伦理审查委员会(SingHealth CentralizedInstitutional Review Board)(CIRB：2014/2093/B)的要求，在获得知情的患者同意后，从手术后的患者获得肿瘤样本。将肿瘤切碎成～1mm³碎片并悬浮在DMEM/F12(ThermoFisher，货号10565-018)中的5％Matrigel(康宁，货号354234)的混合物中。然后使用18号针头将肿瘤碎片混合物皮下植入5至7周龄NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)(美国杰克逊实验室,库存号005557)小鼠的左侧胁腹和右侧胁腹。当肿瘤达到1.5cm³时，切除肿瘤并传代。为了传代，将组织切成1mm³的小碎片，然后再悬浮于20％Matrigel/DMEM/F12混合物中，然后将肿瘤碎片皮下接种到5至7周龄NSG小鼠中。A*STAR生物资源中心(BRC)动物管理与使用委员会(IACUC)根据协议#151065批准了所有上述动物实验的方案。

PDC细胞系的衍生和细胞培养。

将肿瘤切碎，随后在37℃，在DMEM/F12中使用4mg mL.1IV型胶原酶(ThermoFisher，货号17104019)进行酶解。使用沉淀和在磷酸盐缓冲盐水(Thermo Fisher，货号14190235)中再悬浮的循环处理洗涤细胞三个循环。在沉淀和重悬于补充有10％胎牛血清(Biowest，货号S181B)和1％青霉素-链霉素(Thermo Fisher，货号15140122)的RPMI(Thermo Fisher，货号61870036)中之前，将最终的细胞悬浮液通过70μm细胞过滤器(Falcon，货号352350)过滤。将细胞保持在37℃的5％CO₂的湿润气氛中。通过比较每种细胞系与其原始肿瘤的STR谱(Index BioResearch)来鉴定细胞系身份。使用

GEMOneStep支原体检测试剂盒(MinevaBiolabs，货号11-8100)常规筛选细胞的支原体污染。

药物制剂和体内处理。

吉非替尼(易瑞沙)是通过将250mg临床级片剂(AstraZeneca)溶于含有0.05％Tween-80(Sigma-Aldrich，货号P4780)的无菌水中至10mg/mL的浓度来制备，并且以每日25mg/kg的剂量通过口服管饲法给药。将YM155(Selleckchem，货号S1130)溶于盐水中至浓度为0.5mg mL/l，并通过腹膜内(i.p.)注射给药，每2天以2mg/kg给药一次。将夫拉平度(flavopiridol)(LC实验室，货号A-3499)溶解在DMSO中至浓度为200mg/mL，然后用盐水稀释至5mg/mL，通过i.p.注射给药，每2天以5mg/kg给药一次。将贝利司他(Belinostat)(Med-Chem Express,货号HY-10225)溶解在DMSO中至浓度为100mg/mL，然后使用含有(2％Tween-80和1％DMSO的盐水)的溶剂稀释至5mg/mL，并以每天40mg/kg的剂量通过i.p.注射给药。根据公开的制剂制备多西他赛(docetaxol)并通过i.p.注射给药，每2天以8mg/kg注射一次。将奥拉帕尼溶于DMSO，用含10％(w/v)2-羟基-丙基-β-环糊精(Sigma，货号332607)的盐水稀释至5mg mL-1，并通过i.p.注射每天以50mg/kg给药。将厄洛替尼溶于pH值为4.5的6％captisol(CyDex,Inc.,Lenexa,KS)水溶液中，并通过i.p.注射每天以150mg/kg给药。在不存在化合物的情况下，将所有化合物的对照组在其相应的稀释剂中进行处理。如上所述，通过将肿瘤移植到两侧胁腹或单侧胁腹来生成PDX。肿瘤的长度和宽度通过卡尺每2天测量一次。使用以下改进的椭圆体公式估算肿瘤体积：肿瘤体积＝1/2(长度×宽度²)。当对照组中的肿瘤达到2.0cm³时，对小鼠实施安乐死。不直接测量肿瘤的重量，而是使用假定组织密度为1g/cm³的体积来估算。在每个时间点，经处理的肿瘤体积的变化(ΔT)与对照肿瘤体积的平均变化(ΔT/平均ΔC)的比率计算如下：

T＝处理组的肿瘤体积

ΔT＝研究日的药物处理组的肿瘤体积-给药首日的肿瘤体积

C＝对照组的肿瘤体积

ΔC＝研究日对照组的肿瘤体积-给药首日的肿瘤体积

平均ΔC＝对照-处理组中肿瘤体积的平均变化。

Claims

1.一种提供用于预测测试试剂相对于3D细胞结构的活性的计算模型的方法，所述方法包括：

提供多个训练样本，每个训练样本包括应用于多个训练3D细胞结构中的相应训练3D细胞结构的多个训练测试试剂中的相应训练测试试剂；

确定所述多个训练样本中的至少一个训练样本的相应图像；

确定每个所述相应图像的相应特征集合；

确定应用于与所述多个训练样本中的至少一个训练样本相对应的所述相应训练3D细胞结构的所述相应训练测试试剂的相应活性；

基于所述确定的相应特征集合和所述确定的相应活性来确定所述计算模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，使用明场显微术、相差显微术、宽场显微术、暗场显微术和超分辨率显微术中的至少一种来确定所述多个训练样本中的至少一个训练样本的所述相应图像。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，确定每个所述相应图像的所述相应特征集合包括处理每个所述相应图像。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，处理每个所述相应图像包括将所述图像分割成多个片段，每个片段对应于所述训练3D细胞结构的不同区。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，处理每个所述相应图像还包括裁剪所述多个片段以获得多个区的图像。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述区包括坏死区、静止区和增殖区。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中，所述区是圆形的或不规则的。

8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中，每个所述相应图像的所述相应特征的集合是基于所述相应图像的所述片段来确定的。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述训练3D细胞结构包括球状体、类器官和肿瘤球体中的至少一种。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，每个特征集合与所述相应训练3D细胞结构的特征的中的至少一个相关或所述相应训练3D细胞结构的区的特征相关。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，每个特征集合与所述相应训练3D细胞结构的区之一的尺寸或面积或体积中的至少一个相关、与所述相应训练3D细胞结构的区之一的曲率相关、与所述相应训练3D细胞结构的区中的至少一个的形状相关、与所述相应训练3D细胞结构的区中的至少一个的强度相关、或与所述相应训练3D细胞结构的区中的至少一个的细胞的纹理相关。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，针对所述多个训练样本中的至少一个训练样本确定应用于所述相应训练3D细胞结构的所述相应训练测试试剂的所述相应活性包括一种或多种独立的细胞生存力或增殖测定，用于确定已知对所述3D细胞结构具有影响的所述训练测试试剂的应答(活性/毒性)。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述计算模型被配置为输出测试试剂相对于3D细胞结构的活性(或应答)得分。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，确定所述计算模型包括训练所述计算模型。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，确定所述计算模型包括确定所述计算模型的参数。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述计算模型包括至少一种机器学习算法，包括但不限于人工神经网络(ANN)、深度学习(例如但不限于卷积神经网络)、支持向量机(SVM)、基于回归的方法(例如但不限于线性回归、逻辑回归等)、基于树的方法(例如但不限于决策树、随机森林等)、提升方法(例如但不限于梯度提升、Adaboost等)、基于距离的方法(例如但不限于K-最近邻(即KNN)、K均值等)、降维算法(例如主成分分析(PCA)等)。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述多个训练样本中的每个训练样本被用于确定所述相应图像和确定所述相应活性二者。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，所述多个训练样本中的每个训练样本被用于确定所述相应图像或确定所述相应活性，其中所述多个训练样本包括针对每种测试试剂和针对每种3D细胞结构的两个训练样本。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述多个训练样本包括多个不同的训练测试试剂。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，提供所述多个训练样本中的每个训练样本包括使所述多个训练测试试剂中的所述相应训练测试试剂与所述多个训练3D细胞结构中的所述相应训练3D细胞结构接触。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述多个训练样本包括如下训练样本，所述训练样本具有所述多个训练测试试剂中的相应训练测试试剂与所述多个训练3D细胞结构中的相应训练3D细胞结构的不同接触时间。

22.一种无标记预测方法，包括：

提供计算模型；

提供包括应用于3D细胞结构的测试试剂的样本；

确定所述样本的图像；

确定所述图像的特征集合；

基于所述特征集合并基于所述计算模型预测所述测试试剂相对于所述3D细胞结构的活性。

23.根据权利要求22所述的预测方法，其中，使用明场显微镜、相衬显微镜、宽场显微镜、暗场显微镜和超分辨率显微镜中的至少一种来确定所述样本的所述图像。

24.根据权利要求22至23中任一项所述的预测方法，其中，确定所述图像的所述特征集合包括处理所述图像。

25.根据权利要求24所述的预测方法，其中，处理所述图像包括：将所述图像分割为多个片段，每个片段对应于所述3D细胞结构的不同区。

26.根据权利要求25所述的预测方法，其中，处理所述图像还包括：剪切所述多个片段以获得多个区的图像。

27.根据权利要求25或26所述的预测方法，其中，所述区包括坏死区、静止区和增殖区。

28.根据权利要求25至27中任一项所述的预测方法，其中，所述区是圆形的或不规则的。

29.根据权利要求25至28中任一项所述的预测方法，其中，所述图像的所述特征集合是基于所述图像的所述片段来确定的。

30.根据权利要求22至29中任一项所述的预测方法，其中，所述3D细胞结构包括球状体、类器官和肿瘤球体中的至少一种。

31.根据权利要求22至30中任一项所述的预测方法，其中，所述特征集合与所述3D细胞结构的特征、所述3D细胞结构的区的特征、对应于所述3D细胞结构的至少一种细胞的特征、或所述3D细胞结构的所述区之一的至少一种细胞的特征中的至少一个相关。

32.根据权利要求22至31中任一项所述的预测方法，其中，所述特征集合与所述3D细胞结构的区之一的尺寸或面积中的至少一个相关、与所述3D细胞结构的区之一的曲率相关、与所述3D细胞结构的区中的至少一个的形状相关、与所述3D细胞结构的区中的至少一个的强度相关、或与所述3D细胞结构的所述区中的至少一个的所述细胞的纹理相关。

33.根据权利要求22至32中任一项所述的预测方法，其中，所述计算模型被配置为输出所述测试试剂相对于所述3D细胞结构的抑制得分。

34.根据权利要求22至33中任一项所述的预测方法，其中，所述计算模型包括人工神经网络(ANN)、深度学习、支持向量机(SVM)、随机森林和回归中的至少一个。

35.根据权利要求22至34中任一项所述的预测方法，其中，所述计算模型包括根据权利要求1至21中任一项所述的方法确定的计算模型。

36.根据权利要求22至35中任一项所述的预测方法，其中，提供所述样本包括使所述测试试剂与所述3D细胞结构接触。

37.根据权利要求36所述的预测方法，其中，所述样本具有所述测试试剂与所述3D细胞结构的预定接触时间。

38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述测试试剂是选自由物质、分子、元素、化合物、实体或其组合组成的组中的至少一种。

39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述3D细胞结构具有至少500μm的平均直径。

40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述3D细胞结构包括肿瘤细胞。

41.一种被配置为执行根据前述权利要求中任一项所述的方法的装置。