CN111184707B - 托芬那酸或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗新型冠状病毒炎症药物中的应用 - Google Patents

托芬那酸或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗新型冠状病毒炎症药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了托芬那酸或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗新型冠状病毒炎症药物中的应用。本发明所述托芬那酸与新型冠状病毒引发肺部等炎症靶点3CL具有较强结合强度，能显著性地抑制新型冠状病毒3CL酶的活性，从而抑制了新型冠状病毒的复制，因此所述托芬那酸或其药学上可接受的盐具有预防和/或防治新型冠状病毒引发肺炎的作用，可制备为抗肺炎药物进行应用；同时还可与其他抗冠状病毒药物、增强人体免疫能力的药物共同应用，进一步强化疗效。

Description

托芬那酸或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗新型 冠状病毒炎症药物中的应用
技术领域
本发明涉及药学技术和肺部疾病技术领域，更具体地，涉及托芬那酸或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗新型冠状病毒炎症药物中的应用。
背景技术
2019冠状病毒病(COVID-19)是指由新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的肺炎，目前已列为乙类传染病，并按甲类传染病采取预防、控制措施。临床特征表现为发热，伴有干咳，乏力，并逐渐出现气短，呼吸乏力等症状，病情严重者急速进展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脓毒症、肾功能衰竭、难以纠正的代谢性酸中毒和出血凝血障碍。该疾病具有高度传染性，截止2020年2月17日，根据国家卫健委数据，中国累积报告确诊病例72436例，现有疑似病例6242例，累计死亡病例1868例，累计追踪到密切接触者560901人，尚在医学观察的密切接触者141552人。确诊病例中，粗略病死率为2.6％，造成了极大的社会和经济影响。
目前2019冠状病毒病尚无特效药物，目前治疗多为对症治疗，无法有效逆转重症患者病程进展。新型冠状病毒与SARS-CoV以及MERS-CoV虽有部分相似性，但截然不同，部分患者在经过抗病毒和抗炎治疗后效果不佳，容易合并感染，造成多发性，弥漫性病变。因此针对新型冠状病毒的靶点开展靶向药物研究具有重大意义。
2019-nCoV水解酶3CL(Mpro)是控制冠状病毒复制复合物活性的关键水解酶，在病毒的复制周期中起到关键作用。3CL水解酶可以水解病毒多聚体蛋白，产生非结构性蛋白(non-structural proteins，NSPs)，如RNA依赖性RNA聚合酶和解旋酶，从而参与到病毒的转录和复制中。3CL水解酶是抗冠状病毒感染的良好药物靶标。
托芬那酸是非甾体抗炎药物，可抑制环氧合酶，减少花生四烯酸向炎症介质前列腺素的转化，从而起到抗炎、镇痛的作用。托芬那酸进人体内后几乎分布于所有组织中，血浆、肝脏、肺及肾脏中的含量显著增加，且副作用少，安全范围广。目前托芬那酸作为消炎镇痛药广泛应用关节炎、偏头疼、痛风、痛经等疾病，但目前尚无托芬那酸作用于冠状病毒3CL水解酶，应用于新型冠状病毒炎症的相关报道。
发明内容
本发明针对目前由新型冠状病毒引起的肺部等相关炎症疾病缺乏有效防治药物的问题，提供托芬那酸或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗新型冠状病毒炎症药物中的应用。本发明利用分子对接，绝对自由能微扰等方法预测了托芬那酸与新型冠状病毒3CL靶点(Mrpo)的结合模式，通过表面等离子共振技术(SPR)验证了托芬那酸与新型冠状病毒3CL靶点的结合，表明所述托芬那酸可以结合在新型冠状病毒3CL靶点上，抑制3CL水解酶活性，抑制蛋白多聚体向非结构性功能蛋白转化，阻止病毒的转录和复制，可见所述托芬那酸具有预防和/或治疗新型冠状病毒炎症的作用，可制备成为预防和/或治疗新型冠状病毒炎症药物进行应用。
本发明另一目的在于提供托芬那酸或其药学上可接受的盐在制备冠状病毒3CL水解酶抑制剂药物中的应用。
本发明再一目的在于提供一种包含托芬那酸或其药学上可接受的盐的预防和/或治疗新型冠状病毒炎症的药物。
本发明还一目的在于提供一种包含托芬那酸或其药学上可接受的盐的冠状病毒3CL水解酶抑制剂药物。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种由托芬那酸或其药学上可接受的盐在制备预防和或治疗新型冠状病毒炎症药物中的应用。
所述托芬那酸的结构如式(I)所示：
Figure GDA0002950350550000021
优选地，所述托芬那酸或其药学上可接受的盐可与冠状病毒3CL水解酶紧密结合，抑制冠状病毒3CL水解酶活性。
本发明同时还保护所述托芬那酸或其药学上可接受的盐在制备冠状病毒3CL水解酶抑制剂药物中的应用。
进一步地，所述冠状病毒是2019新型冠状病毒(2019-nCoV)。
一种冠状病毒3CL水解酶抑制剂药物，包含托芬那酸或其药学上可接受的盐，也在本发明的保护范围之内。
一种预防和或治疗新型冠状病毒炎症药物，包含托芬那酸或其药学上可接受的盐，也在本发明的保护范围之内。
进一步地，所述药物为胶囊、片剂、丸剂、颗粒剂、冲剂、注射药剂或喷剂。
进一步地，所述药物还可以包括药学上可接受的辅料或载体。
优选地，所述药物还可以包含其他抗冠状病毒药物。
优选地，所述药物还可以包含增强人体免疫能力的成分。
当所述托芬那酸或其药学上可接受的盐抑制新型冠状病毒复制的同时，采用其他抗冠状病毒药物抑制已有新型冠状病毒，并增加人体的免疫能力，增强人体自身对新型冠状病毒的抑制和清楚，从而达到清除新型冠状病毒的目的。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述托芬那酸与新型冠状病毒引发肺部等炎症靶点3CL具有较强结合强度，能显著性地抑制新型冠状病毒3CL酶的活性，从而抑制了新型冠状病毒的复制，因此所述托芬那酸或其药学上可接受的盐具有预防和/或防治新型冠状病毒引发肺炎的作用，可制备为抗肺炎药物进行应用；同时还可与其他抗冠状病毒药物、增强人体免疫能力的药物共同应用，进一步强化疗效。
附图说明
图1为托芬那酸与病毒肺炎靶点3CL水解酶的结合模式。
图2为托芬那酸与病毒肺炎靶点3CL水解酶相互作用的SPR图。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图，对本发明做出进一步，清除详细的阐述。当然，所述实施例仅用于阐释本发明，并不用于限定本发明的范围，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所述试验材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径获取。
实施例1托芬那酸对新型冠状病毒靶点3CL水解酶(Mpro)结合模式
本实施例依托天河二号和深圳超算等超级计算机及团队自主研发药物/靶标结合强度精准预测软件(GA-FEP)，采用分子对接、动力学模拟和绝对自由能微扰方法(具体方法参考J Med Chem，2019，62，2099-2111)预测托芬那酸与新型冠状病毒引发肺炎靶点3CL水解酶(Mrpo高分辨晶体结构，PDB ID:6LU7)的结合强度，其结合模式(如图1所示)，托芬那酸一侧的3-氯-2-甲基苯基与41号组氨酸形成π-π堆叠作用，并伸入由41号组氨酸、44号半胱氨酸和49号甲硫氨酸组成的疏水口袋。同时托芬那酸的羧基作为氢键受体与143号甘氨酸形成氢键相互作用。托芬那酸与新型冠状病毒靶点3CL水解酶有较强的结合强度，可抑制3CL水解酶活性，从而抑制病毒的转录和复制。说明托芬那酸对新型冠状病毒所致肺炎有潜在治疗作用。
实施例2托芬那酸与新型冠状病毒靶点3CL水解酶结合
(1)实验材料：
含有3CL基因的重组质粒由武汉普健生物公司合成，GST Beads购自SmartLifescience公司，分子相互作用仪为美国GE Healthcare Life Sciences公司的Biacore8K，N-已基-N-二甲基-氨丙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化试剂、醋酸钠缓冲液(pH 4.5和5.0)及传感生物芯片CM5均由美国GE Healthcare Life Sciences公司生产，托芬那酸及其他常用试剂购自Sigma。
(2)实验方法：
a.重组3CL水解酶的表达与纯化
将包含2019-nCov来源的3CL重组质粒(pGEX4T1)转化入大肠杆菌菌株BL21(codonplus)，再将菌株在LB或2xYT培养基中生长至OD600为0.6-0.8，然后加入0.1mM异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)在15℃继续生长24小时进行低温诱导表达，通常1L培养基可收获约8-15克湿菌。按1：5的比例加入裂解液将菌重悬，经超声、高压破碎等方式破碎菌体后，离心取上清经GST Beads按生产商的说明进行亲和层析纯化，通过牛α-凝血酶切除GST-Tag纯化标签后，用SDS-PAGE的方法对蛋白纯度进行验证。
b.偶联pH值的筛选
靶点3CL水解酶的等电点(PI值)为5.94，因此选用10mmol/L醋酸钠缓冲液(pH值分别为5.0和4.5)稀释3CL蛋白至终浓度为90μg/mL和45μg/mL，在Contro Software(控制软件)中，采用手动进样法进行pH值和蛋白浓度的筛选，选取偶联值最优的pH值和蛋白浓度进行后续实验。
c.3CL水解酶在CM5传感片表面的偶联
用上述筛选得到的最佳pH值的醋酸钠缓冲液稀释3CL水解酶至最优终浓度，通过氨基偶联的方法将3CL水解酶偶联到CM5芯片葡聚糖表面上的羧基。芯片表面用0.2mol/LEDC和50mmol/LNHS以1:1比例配制的混合液活化，以10μL/min的流速进样，连续进样7min后注射3CL水解酶溶液，然后以1mol/L乙醇胺盐酸(pH 8.5)封闭液进样7min，封闭活化的芯片表面。
d.3CL水解酶与托芬那酸的动力学和亲和力分析
将托芬那酸用10mmol/L的PBS缓冲液(pH 7.4)稀释至100、80、40、20、10和5μmol/L持续进样200s，并以10mmol/L的PBS缓冲液(pH 7.4)作为再生液，采用动力学分析Wizard模板中的动力学和亲和力法进行动力学试验，分析配体与受体的相互作用，所得数据根据分析软件拟合，以时间为横坐标，响应值为纵坐标，计算动力学常数。
(3)实验结果：
a.高纯度3CL水解酶的表达纯化
经GST Beads亲和层析获得了大量的3CL水解酶，经SDS-PAGE鉴定其纯度达95％以上，用于后续的SPR测定亲和力实验。
b.托芬那酸与3CL水解酶的动力学分析
试验结果发现，在pH值为4.5和蛋白浓度为90μg/mL条件下偶联时效果最佳，3CL水解酶在CM5芯片表面最终偶联量的响应值达到1800RU。SPR动力学分析数据显示，托芬那酸与3CL水解酶的结合常数(Ka)为6.10×102，解离常数(Kd)为2.13×10-1，亲和力常数(KD)为3.49×10-4M，见图2。说明托芬那酸与3CL水解酶具有较强的结合能力。
由上述实验结果得到的结论为：托芬那酸可以与病毒肺炎靶点Mpro有较强结合。这提示托芬那酸具有抑制冠状病毒3CL水解酶Mpro活性作用，表明所述托芬那酸具有防治新型冠状病毒引发肺炎的作用，可制备为抗肺炎药物进行应用。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (3)

1.托芬那酸或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗新型冠状病毒炎症药物中的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒是2019新型冠状病毒(2019-nCoV)。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述托芬那酸或其药学上可接受的盐抑制2019新型冠状病毒3CL水解酶(Mpro)活性。
3.托芬那酸或其药学上可接受的盐在制备新型冠状病毒3CL水解酶(Mpro)抑制剂药物中的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒是2019新型冠状病毒(2019-nCoV)。
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