CN111183232A - 确定不具有供体基因型的供体无细胞dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在来自对象的样品中评估非对象核酸例如供体特异性无细胞DNA的量的方法和系统。所述方法和系统可包含在未知情况下对非对象基因型的模拟。本文中提供的方法和系统可用于确定病症例如移植排斥的风险。

Description

确定不具有供体基因型的供体无细胞DNA的方法
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求提交日期为2017年8月17日提交的美国临时申请62/547,098的权益，其全部内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及用于评估来自对象的样品中非对象核酸例如供体特异性无细胞DNA的量的方法和系统。本发明提供了用于在没有非对象基因型信息的情况下分析和/或评估来自对象的样品中非对象核酸的量的系统。本文中提供的方法、组合物和系统可用于确定病症例如移植排斥的风险。
发明内容
本公开内容至少部分基于在无需了解非对象基因型的情况下确定无细胞DNA(例如非对象和/或对象无细胞DNA)的量的方法的令人惊讶的发现。描述了用于在无需了解非对象基因型(例如，供体基因型)的情况下在对象(例如移植对象)中量化cf-DNA的这些方法和系统，其可用作非侵入性测定法，例如用于诊断急性排斥和/或临床上显著的不良事件。所述方法和系统还可用于确定处于低或高的例如排斥和/或临床不良事件的风险之中的对象。所述方法和系统还可用于监测本文中提供的任何对象。在一些实施方案中，所述方法和系统采用非对象基因型(例如，供体基因型)的模拟(例如，蒙特卡罗模拟(Monte Carlosimulation))。这样的方法和系统可用于其中样品具有混合基因型且非对象基因型未知的任何情况。涉及移植对象情况的实例和文本仅作为示例，并不旨在暗示必须对测定进行如此限制。
在一方面，提供了在来自对象的样品中确定非对象核酸的量的方法。在一些实施方案中，该方法包括分析样品中多个相应靶标上的等位基因的量，并且在样品内确定可量化和/或信息性靶标，用非对象的可能基因型执行模拟；以及基于从模拟确定的可能或很可能的非对象基因型来确定归属于非对象和任选地对象的每个靶标的等位基因的量，并且任选地，确定样品中非对象相对于对象cf-DNA的量(例如，百分比或比率(ratio))。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括确定对象基因型。在任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括进行扩增以确定等位基因的量。在任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括进行测序测定以确定等位基因的量。
在任何一种方法或系统的一个实施方案中，对至少30、40、50、60、70、80、90或更多个靶标进行测序测定或扩增。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括基于样品中确定的量(例如，百分比或比率)来计算质量度量。任何一种方法或系统的质量度量可以是本文中提供的或另有本领域中已知的任何一种质量度量。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统包括模拟很可能或可能的非对象基因型空间(non-subject genotype space)。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，执行模拟(例如，蒙特卡罗模拟)以确定非对象的可能或很可能的基因型的范围。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括基于相应的可能或很可能的基因型来调整对相应靶标的测量的贡献(例如，响应于确定所述非对象可能的基因型是杂合的，将测量的贡献值加倍)。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括计算平均(例如平均或中值)的量，例如百分比或比率。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括确定每个标准曲线和/或样品扩增值满足置信度阈值。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括基于对以下中的至少一项的分析来确定置信度值：历史扩增形状(historic amplification shape)、等位基因特异性PCR测定(例如，关于第二等位基因)的特异性、样品的信噪比、标准曲线集的斜率和r平方值、在插入的对照上获得的非扩增值、或在来自阴性对照的样品上获得的污染值。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括以历史扩增形状拟合从样品获得的数据。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括确定标准曲线集的斜率和r平方值不超过阈值。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括在样品中确定为可量化和/或信息性的每个靶标上为所述非对象或对象建立标记。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括响应于根据基因型对相应靶标进行分类来确定样品内的可量化和/或信息性靶标。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括响应于确定对象和非对象具有不同的基因型(例如，所述对象对于一个等位基因是纯合的并且所述非对象对于另一个等位基因不是纯合的或是纯合的)，将相应靶标分类为可量化和/或信息性的。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括响应于确定非对象是杂合的来调整对相应靶标的测量的贡献(例如，响应于确定非对象是杂合的，将测量的贡献值加倍)。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括计算信息性(例如，由基因分型组件确定)和质量控制通过的(例如，由质量控制组件确定)等位基因量(例如，百分比或比率)的均值或中值，并且将所述均值或中值存储为量(例如，比率或百分比)。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括基于信息性和/或可量化靶标的分布以及相关量(例如，百分比或比率)来计算正则化的稳健变异系数(robust coefficient of variation，“rCV”)。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括基于与中值次要物质比例的中值绝对差异来计算稳健标准差(robust standard deviation，“rSD”)。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括通过除以例如非对象cf-DNA量(例如，比率或百分比)将rSD转换为rCV。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括调整rSD以避免被零除(例如，通过将百分之一的四分之一(a quarterof one percent)加到除数上)。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括基于阈值rCV值确定适合用于量化的样品，所述阈值rCV值是基于信息性和/或可量化靶标的分布以及相关量(例如，百分比或比率)而确定的。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括针对污染阈值评价对象纯合的和不可量化和/或非信息性靶标的平均次要等位基因比例。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括基于对象纯合的和不可量化和/或非信息性靶标的平均次要等位基因比例来计算不一致质量检验(discordance quality check，“dQC”)值，并且针对阈值评价所述dQC值。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括基于鉴定低于阈值例如0.5％的dQC值来确定适合用于量化的样品。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，非对象是供体。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，样品来自移植对象。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，移植对象是心脏移植对象。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，样品来自儿科对象。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，样品来自妊娠对象。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还包括选择可能或很可能的模拟的合计(aggregate)和/或95％置信区间。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法还包括选择具有低于中值dQC和rCV的模拟和/或确定95％置信区间。
在另一方面，本文中提供了用于分析来自对象的样品的系统，其中该系统包含有效连接至存储器的至少一个处理器；由所述至少一个处理器执行的第一组件(例如，质量控制组件)，其配置成分析(例如，定量基因分型(quantitative genotyping，“qGT”))样品中多个相应靶标的等位基因的量并且在样品内确定可量化和/或信息性靶标；第二组件(例如，建模组件)，其配置成模拟非对象的可能的基因型信息；以及由所述至少一个处理器执行的第三组件(例如，基因分型组件)，其配置成基于从模拟确定的可能或很可能的非对象基因型来确定归属于非对象和任选地对象的每个靶标的等位基因的量，并且任选地确定样品中非对象相对于对象量的量(例如，百分比或比率)。
在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，该系统还包含由所述至少一个处理器执行的第四组件(例如，分析组件)，所述第四组件配置成基于样品中确定的量(例如，百分比或比率)来计算质量度量。
在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，第三组件配置成模拟很可能或可能的非对象基因型空间。在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，第三组件配置成执行模拟(例如，蒙特卡罗模拟)以确定非对象的可能或很可能的基因型的范围。在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，第三组件配置成基于相应的可能或很可能的基因型来调整对相应靶标的测量的贡献(例如，响应于确定非对象可能的很可能的基因型是杂合的，将测量的贡献值加倍)。
在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，所述至少一个处理器配置成计算平均(例如平均中值)的量(例如，百分比或比率)。
在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，第一组件配置成确定每个标准曲线和/或样品扩增值满足置信度阈值。在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，第一组件配置成基于对以下中的至少一项的分析来确定置信度值：历史扩增形状、等位基因特异性PCR测定(例如，关于第二等位基因)的特异性、样品的信噪比、标准曲线集的斜率和r平方值、在插入的对照上获得的非扩增值、或在来自阴性对照的样品上获得的污染值。在所提供的任何一种系统的一个实施方案中，第一组件配置成以历史扩增形状拟合从样品获得的数据。在所提供的任何一种系统的一个实施方案中，第一组件配置成确定标准曲线集的斜率和r平方值不超过阈值。
在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，第一或第三组件配置成在样品中确定为可量化和/或信息性的每个靶标上为非对象或对象建立标记。在所提供的任何一种系统的一个实施方案中，第一或第三组件配置成响应于根据基因型对相应靶标进行分类来确定样品内的可量化和/或信息性靶标。在所提供的任何一种系统的一个实施方案中，第三组件配置成响应于确定对象和非对象具有不同的基因型(例如，所述对象对于一个等位基因是纯合的并且所述非对象对于另一个等位基因不是纯合的或是纯合的)，将相应靶标分类为可量化和/或信息性的。
在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，第三组件配置成响应于确定非对象是杂合的来调整对相应靶标的测量的贡献(例如，响应于确定非对象是杂合的，将测量的贡献值加倍)。在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，第三组件计算信息性(例如，由基因分型组件确定)和质量控制通过的(例如，由质量控制组件确定)等位基因比率的均值或中值并将中值存储为量(例如，比率或百分比)。
在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，任何一种组件(例如，分析组件)配置成基于信息性和/或可量化靶标的分布以及相关量(例如，百分比或比率)来计算正则化的稳健变异系数(“rCV”)。在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，任何一种组件(例如，分析组件)配置成基于与中值次要物质比例的中值绝对差异(median absolutedivergence)来计算稳健标准差(“rSD”)。在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，任何一种组件(例如，分析组件)配置成通过除以例如非对象cf-DNA量(例如，百分比或比率)将rSD转换为rCV。在所提供的任何一种系统的一个实施方案中，该组件配置成调整rSD以避免被零除(例如，通过加上百分之一的四分之一)。在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，该系统配置成基于阈值rCV值来确定适合用于量化的样品，所述阈值rCV值是基于信息性和/或可量化靶标的分布以及相关量(例如，百分比或比率)而确定的。在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，该系统配置成针对污染阈值评价对象纯合的和非信息性靶标的平均次要等位基因比例。
在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，该系统配置成基于对象纯合的和不可量化和/或非信息性靶标的平均次要等位基因比例来计算不一致质量检验(“dQC”)值并针对阈值评价dQC值。在所提供的任何一种系统的一个实施方案中，该系统配置成基于鉴定例如低于0.5％的dQC值阈值来确定适合用于量化的样品。
在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，该系统还配置成选择可能或很可能的模拟的合计和/或95％置信区间。
在本文中提供的任何一种系统的一个实施方案中，该系统还配置成选择具有低于中值dQC和rCV的模拟和/或确定95％置信区间。
在一个方面，提供了报告，其包含由任何一种本文中所述的方法或系统产生的任何一个或更多个值。
在另一方面，本文中提供了治疗对象的方法。该方法包括基于由任何一种前述方法或系统产生的任何一个或更多个值来评价对象，以及对对象进行治疗、推荐对其进行治疗、改变对其进行的治疗、对其进行进一步监测或推荐对其进行进一步监测。
在一个实施方案中，本文中提供的方法的任何一个实施方案可以是本文中提供的任何一种组合物、系统或报告的一个实施方案。在一个实施方案中，本文中提供的系统的任何一个实施方案可以是本文中提供的任何一种组合物、方法或报告的一个实施方案。
附图简述
附图不意欲按比例绘制。附图仅是举例说明性的而不是实现本公开内容所必需的。
图1A示出了在有供体基因型信息的情况下CR2的阈值点(“割点(cutpoint)”)的实验确定。
图1B示出了在没有供体基因型信息的情况下CR2的阈值点(“割点”)的实验确定。
图2A示出了在有供体基因型信息的情况下移植物血管病变的阈值点(“割点”)的实验确定。
图2B示出了在没有供体基因型信息的情况下移植物血管病变的阈值点(“割点”)的实验确定。
图3是样品分析系统的示例性实施方案的框图。
图4是在其上实践本公开内容的多个方面和功能的示例性分布式计算机系统的框图。
图5是根据一个实施方案的样品分析平台的框图。
发明详述
相应地，多个方面提供了用于在从对象获得的样品中检测、分析和/或量化核酸(例如，无细胞DNA)，例如非对象核酸(例如，非对象无细胞DNA)的技术。如本文中所用的，“非对象核酸”是指来自另一个来源或者是在对象中发现的核酸的突变形式(相对于特定序列，例如野生型序列)的核酸。因此，“对象核酸”为不是来自另一个来源并且不是在对象中发现的核酸的突变形式(相对于特定序列，例如野生型序列)的核酸。如本文中所用的，本文中提供的任何一种方法或系统可用于确定来自非对象来源的无细胞DNA(例如对供体具有特异性的DNA或供体特异性无细胞DNA(例如，供体特异性cf-DNA)或胎儿DNA(例如，胎儿无细胞DNA))的量。本文中提供的任何一种方法或系统都可以用于来自已经接受移植的对象的样品。在一些实施方案中，移植物是心脏移植物。本文中提供的任何一种方法或系统均可用于来自妊娠对象的样品。
“无细胞DNA”(cell-free DNA，cf-DNA)是指(不希望受到任何理论的束缚)通常在凋亡、裂解、坏死或损伤期间从细胞释放的DNA片段，其被发现例如在对象的血液、血浆、血清、尿等中自由循环。如本文中所用的，本文中提供的组合物和方法可用于确定例如可在移植接受者中发现的供体的或例如妊娠对象的无细胞DNA(例如非对象无细胞DNA)的量。可对“对象”cf-DNA进行独特地量化和检测以区别于“非对象”cf-DNA，例如在移植对象或妊娠期间母体血清中的胎儿DNA的情况下(Norton等，N Engl J Med 373：2582(2015))。
当非对象基因型未知时，本文中提供的系统和方法可以采用使用模拟，例如蒙特卡罗模拟。通常，系统和方法分析许多靶标上的等位基因的量。“靶标”是其中存在、可能存在或存在预期序列同一性可变性的核酸序列。在一个实施方案中，靶标是、可能是或预期是其中在单核苷酸上具有序列可变性的靶标，例如在个体群体中或者由于可能在对象中发生以及可能与疾病或病症相关的突变的结果。因此，靶标具有或预期具有多于一个等位基因，并且在一些优选实施方案中，靶标是双等位基因。“多个靶标”是指多于一个靶标(即，多个靶标)。
在所提供的任何一种系统或方法的一些实施方案中，对至少25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95或更多个靶标的等位基因的量进行分析。在本文中提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，对少于105、104、103、102、101、100、99、98或97个靶标的等位基因的量进行分析。在本文中提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，对40至105、45至105、50至105、55至105、60至105、65至105、70至105、75至105、80至105、85至105、90至105、90至104、90至103、90至102、90至101、90至100、90至99、91至99、92至99、93、99、94至99、95至99或90至95个靶标的等位基因的量进行分析。在所提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，对40至99、45至99、50至99、55至99、60至99、65至99、70至99、75至99、80至99、85至99、90至99、90至99、90至98、90至97或90至96个靶标的等位基因的量进行分析。在所提供的任何一种方法或系统的另一些实施方案中，对40至95、45至95、50至95、55至95、60至95、65至95、70至95、75至95、80至95、85至95或90至95个靶标的等位基因的量进行分析。在所提供的任何一种方法或系统的另一些实施方案中，对40至90、45至90、50至90、55至90、60至90、65至90、70至90、75至90、80至90或85至90个靶标的等位基因的量进行分析。在所提供的任何一种方法或系统的另一些实施方案中，对40至85、45至85、50至85、55至85、60至85、65至85、70至85、75至85或80至85个靶标的等位基因的量进行分析。在所提供的任何一种方法或系统的另一些实施方案中，对40至80、45至80、50至80、55至80、60至80、65至80、70至80或75至80个靶标的等位基因的量进行分析。在所提供的任何一种方法或系统的另一些实施方案中，对40至75、45至75、50至75、55至75、60至75、65至75或70至75个靶标的等位基因的量进行分析。
可以将靶标确定为可量化(即，可以测量等位基因量)和/或信息性的。如本文中提供的“信息性靶标”是其中等位基因的量可用于量化相对于或区别于样品中的对象核酸的非对象核酸的量的那些。通常，信息性结果可以排除对象核酸对于特定靶标是杂合的结果以及“无调用”或错误调用的结果。根据信息性结果，在所提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，可以例如使用标准曲线来计算等位基因量(例如，比率或百分比)。在所提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，非对象和/或对象核酸的量分别表示非对象和/或对象核酸的所有信息性结果的平均值。在本文中提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，平均值以绝对量或比率或百分比给出。优选地，在本文中提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，平均值是均值或中值。在本文中提供的任何一种方法或系统的另一些实施方案中，平均值是截尾均值。如本文中所用的，“截尾均值”是指去除最低报告靶标(例如，两个最低)以及最高报告靶标(例如，两个最高)的组合。在本文中提供的任何一种方法或系统的另一些实施方案中，平均值是均值。
在另一方面是使用本文中提供的任何一种方法或系统产生的多个值中的任何一个的报告。在一个实施方案中，报告提供了在一个或更多个时间点的非对象无细胞DNA的量。在一个实施方案中，报告可包含和/或还可包含通过本文中提供的任何一种方法或系统产生的任何一个或更多个其他值。优选地，报告是临床医生可以使用其中的至少一个值来评估对象和/或治疗对象的报告。本文中提供的任何一种或更多种方法可包括以下的步骤：生成报告和/或提供报告和/或基于一个或更多个值来评估对象和/或基于一个或更多个值来治疗对象，所述一个或更多个值由本文中提供的任何一种方法或系统产生或者在本文中提供的任何一种报告中提供。
报告可以为口头、书面(或硬拷贝)或电子形式，例如可以为可以显现或显示的形式。在一些实施方案中，本文中提供的“原始”结果在报告中提供，并且通过该报告可以采取进一步的步骤以确定样品中非对象核酸的量。在另一些实施方案中，报告提供了样品中非对象核酸的量。在一些实施方案中，通过该量，临床医生可以评估对对象进行治疗的需要或监测对象的需要，例如稍后时间的非对象核酸的量。因此，在本文中提供的任何一种方法中，该方法可包括在另一个时间点评估对象中非对象核酸的量。可以用本文中提供的任何一种方法来进行这样的评估。在一些实施方案中，该报告提供了随时间的来自对象的非对象核酸的量。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，该量处于数据库中或输入数据库中。在一方面，提供了具有这样的值的数据库。通过该量，临床医生可评估对对象进行治疗或监测的需要。因此，在本文中提供的任何一种方法中，该方法可包括在多于一个时间点评估对象中的量。可以用本文中提供的任何一种方法或系统来进行这样的评估。
如本文中所用的，“量”是指用于核酸(例如，cf-DNA)的测量的任何定量值并且可以以绝对或相对量给出。此外，该量可以是总量、频率、比率、百分比等。如本文中所用的，可以使用术语“水平”代替“量”，但是意在指代相同类型的值。通常，除非另外提供，否则本文中提供的量表示样品中非对象核酸的比率或百分比。
在一些实施方案中，本文中提供的任何一种方法或系统可包含分析组件，其配置成将量与阈值或与一个或更多个先前量进行比较，以确定风险提高或降低的对象。例如，分析组件可以模拟供体基因型以使得能够在非对象基因型未知的情况下分析混合基因型样品。在另一个实例中，分析组件配置成将样品中获得的值(反映非对象(例如，供体)核酸(例如，cf-DNA)的量)与风险提高的目标阈值进行比较。在测量值或值低于阈值的情况下，可以将对象标记为低风险或者在一些情况下标记为风险未提高，并且在值超过阈值的情况下，可以将对象确定为风险提高。分析组件还可以将测量值或值与风险降低的阈值进行比较。如果对象低于阈值，则可以将该对象确定为低风险。如果不是这样，则该对象不能得到标记或者也可以针对高风险阈值对其进行评价。
如本文中所用的，“阈”或“阈值”是指指示某物的任何预定水平或水平范围。例如，在确定风险时，该阈值可以是病症的存在或不存在或者风险的存在或不存在。阈值可以采用多种形式。它可以是单个截断值，例如中值或均值。它可以基于比较组来确定，例如其中一个限定组中的风险是另一个限定组中风险的两倍。它可以是范围，例如其中受试群体被均等(或不均等)地分成组，例如低风险组、中风险组和高风险组，或者分成象限，最低象限是具有最低风险的对象并且最高象限是具有最高风险的对象。阈值可以取决于所选择的特定群体或者所测量并与阈值进行比较的值的目的。本领域普通技术人员仅通过常规实验就可以选择适当的阈的值、范围和类别。
由于即使在低水平下也能够确定非对象核酸的量，因此本文中提供的方法和系统可用于评估对象例如移植接受者或妊娠对象中的风险。如本文中所提供的，“风险”是指对象(例如移植接受者)中存在或不存在任何不期望的病症，或者这样的病症(例如，移植排斥)不存在或存在的可能性提高。如本文中所提供的，“风险提高”是指对象中存在任何不期望的病症或这样的病症存在的可能性提高。如本文中所提供的，“风险降低”是指对象中不存在任何不期望的病症或这样的病症存在的可能性降低(或不存在的可能性提高)。在本文中提供的任何一种方法的一些实施方案中，与阈值相比或与一个或更多个先前量相比具有提高的量的对象被确定为风险提高。在本文中提供的任何一种方法的一些实施方案中，与阈值相比或与一个或更多个先前量相比具有降低或相似的量的对象被确定为风险降低或未提高。
例如，在植入移植物(例如，心脏移植物)后及早检测排斥可以促进治疗并改善临床结果。移植排斥仍然是移植失败和晚期死亡的主要原因，并且通常需要终身监视监测。用免疫抑制治疗来治疗移植排斥已显示出改善治疗结果，特别是在早期检测排斥时。临床医生可以用供体cf-DNA的量对移植对象进行评估(例如，评估风险)，并且这样的步骤可以作为本文中提供的任何一种方法的一部分包括在内。
因此，在所提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，对象是移植的接受者，并且风险是与移植相关的风险。在所提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，与移植相关的风险是移植排斥的风险、移植的解剖学问题或移植物的损伤。在所提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，移植物的损伤是初始损伤或进行性损伤。在所提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，与移植相关的风险是急性病症或慢性病症。在所提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，急性病症是移植排斥，包括细胞排斥或抗体介导的排斥。在所提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，慢性病症是移植物血管病变。在所提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，与移植相关的风险指示了损伤的严重程度。在所提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，与移植相关的风险是感染的风险或状况。移植接受者的风险可作为本文中提供的任何一种方法的一部分来确定。
如本文中所用的，“移植”是指组织或器官或其部分从供体向接受者的移动，目的是替换接受者的受损或缺失的组织或器官或其部分。移植物可以是一个器官或多于一个器官。可以移植的器官的实例包括但不限于心脏、肾脏、肾、肝脏、肺、胰腺、肠等。可以将本文中提供的任何一种方法或系统用于本文中提供的样品，所述样品来自已经接受任何一种或更多种组织或器官或其部分的移植的对象。在一些实施方案中，移植物是心脏移植物。
在本文中提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，该方法或系统可包括使相对于对象或总核酸的非对象核酸的量的提高与病症(例如移植排斥)的风险提高相关联。在本文中提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，关联包括将非对象核酸的量(例如，浓度、比率或百分比)与阈值进行比较以确定病症的风险提高或降低的对象。在本文中提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，与阈值相比具有提高量的非对象核酸的对象被确定为病症的风险提高。在本文中提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，与阈值相比具有降低或相似量的非对象核酸的对象被确定为处于病症的风险降低。
也可以监测随时间的非对象核酸的量的变化，并且本文中提供的任何一种方法或系统可包括这样做的步骤。这可以允许测量临床状态的变化和/或允许计算正常值或基线水平。在器官移植中，这可以构成个体化非侵入性的排斥或与之相关的病症风险筛查测试的基础。通常，如本文中所提供的，非对象核酸的量，例如比率或百分比可以指示接受者中与病症相关的风险例如与移植相关的风险(例如排斥)的存在或不存在，或者可以指示需要进一步测试或监视。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，该方法或系统还可包括用于评估病症(例如移植排斥、移植损伤等)的另外的测试或者建议对对象进行这样的进一步测试(或提供有关这样的进一步测试的信息)的步骤。另外的测试可以是本文中提供的方法或系统中的任何一种。另外的测试可以是本文中提供的另一些方法或系统中的任何一种或者另外是本领域已知的(视情况而定)。
本文中提供的任何一种方法或系统都可包括“确定治疗方案”的步骤，这是指确定用于治疗对象的行动过程。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，确定治疗方案包括确定要提供给对象的适当的治疗或关于适当的治疗的信息。在本文中提供的任何一种方法或系统中，确定可包括向对象提供适当的治疗或关于适当的治疗的信息。在一些实施方案中，治疗是施用抗排斥治疗和/或抗感染治疗。如本文中所用的，关于治疗或疗法或监测的信息可以以书面形式或电子形式提供。在一些实施方案中，信息可作为计算机可读指令提供。在一些实施方案中，信息可口头提供。
“施用”或其变化形式等意指以药理学上直接或间接有用的方式向对象提供物质。因此，该术语包括指导(例如开处方)对象或另一方施用物质。治疗或疗法的施用可以通过本领域已知的任何方法来完成(参见，例如，Harrison’s Principle of InternalMedicine，McGraw Hill Inc.)。优选地，以治疗有效量进行治疗或疗法的施用。施用可以是局部或全身性的。施用可以是肠胃外(例如，静脉内、皮下或皮内)或经口的。用于不同施用途径的组合物是本领域已知的(参见，例如，E.W.Martin的Remington′s PharmaceuticalSciences)。
在一些实施方案中，施用的抗排斥治疗是免疫抑制剂。免疫抑制剂包括但不限于皮质类固醇(例如，泼尼松龙(prednisolone)或氢化可的松)、糖皮质激素、细胞抑制剂、烷化剂(例如，氮芥(环磷酰胺)、亚硝基脲、铂化合物、环磷酰胺(Cytoxan)、抗代谢物(例如，叶酸类似物例如甲氨蝶呤，嘌呤类似物例如硫唑嘌呤和巯嘌呤，嘧啶类似物以及蛋白质合成抑制剂)、细胞毒性抗生素(例如，放线菌素D、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素、光神霉素)、抗体(例如，抗CD20、抗IL-1、抗IL-2Rα、抗T细胞或者抗CD-3单抗和多抗，例如Atgam，和即复宁(Thymoglobuline))、作用于免疫亲和蛋白的药物、环孢素、他克莫司、西罗莫司、干扰素、阿片类药物、TNF结合蛋白、霉酚酸酯、芬戈莫德和多球壳菌素。在一些实施方案中，抗排斥治疗包含血液转移或骨髓移植。治疗还可包括用于治疗全身性病症例如脓毒症的治疗。脓毒症的治疗可包括静脉内液、抗生素、外科引流(surgical drainage)、早期目标导向治疗(early goal directed therapy，EGDT)、血管加压药(vasopressor)、类固醇、活化蛋白C、detrecoginα(活化的)、氧以及器官功能障碍的适当支持物。这可能包括肾衰竭中的血液透析、肺功能障碍中的机械通气、血液制品的输注以及循环衰竭的药物和流体治疗。确保充足的营养-优选地通过肠内喂养，但必要时通过肠胃外营养-也可包括在内，特别是在长期疾病期间。另一些相关治疗可包括胰岛素和用于预防深静脉血栓形成和胃溃疡的药物。
在其中指示有感染的一些实施方案中，用于治疗移植物接受者的治疗还可包括用于治疗细菌、真菌和/或病毒感染的治疗。这样的治疗包括抗生素。另一些实例包括但不限于杀阿米巴药、氨基糖苷类、驱肠虫剂、抗真菌药、唑类抗真菌药、棘白菌素类、多烯类、二芳基喹啉、酰肼衍生物、烟酸衍生物、利福霉素衍生物、链霉菌衍生物、抗病毒剂、趋化因子受体拮抗剂、整合酶链转移抑制剂、神经氨酸酶抑制剂、NNRTI、NSSA抑制剂、核苷反转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NRTI)、蛋白酶抑制剂、嘌呤核苷、碳青霉烯类、头孢菌素、甘氨酰环素、抗麻风药(leprostatic)、林可霉素衍生物、大环内酯衍生物、酮内酯类、大环内酯类、
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唑烷酮抗生素、青霉素、β-内酰胺酶抑制剂、喹诺酮类、磺胺类和四环素类。另一些这样的治疗是本领域普通技术人员已知的。本文中提供的任何一种方法可包括向对象施用或建议抗感染治疗(在一些实施方案中，包括向对象提供有关治疗的信息)。在一些实施方案中，抗感染治疗可以是施用于对象的免疫抑制治疗的量或频率的降低或者所述免疫抑制治疗的改变。另一些治疗是本领域普通技术人员已知的。
本文中提供的任何一种方法或系统可包括“确定监测方案”的步骤，其是指确定随时间监测对象中的病症的行动过程。在本文中提供的任何一种方法或系统的一个实施方案中，确定监测方案包括确定适当的行动过程以用于确定随时间或在随后的时间点对象中的非对象核酸的量，或者建议对对象进行这样的监测。这可以允许测量临床状态的变化和/或允许计算正常值或基线水平(以及与其比较)。在本文中提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，确定监测方案包括确定从对象获得样品的时机和/或频率。
如本文中所用的，来自对象的样品可以是生物学样品。此类生物学样品的实例包括全血、血浆、血清、尿等。在本文中提供的任何一种方法的一些实施方案中，可以向样品添加另外的核酸，例如标准品。
在本文中提供的任何一种方法或系统中，等位基因的量可以通过测序例如下一代或高通量测序和/或基因分型技术来确定。下一代和高通量测序和/或基因分型技术的实例包括但不限于大规模平行签名测序(massively parallel signature sequencing)、聚合酶克隆测序(polony sequencing)、454焦磷酸测序、Illumina(Solexa)测序、SOLiD测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、heliscope单分子测序、单分子实时(single moleculereal time，SMRT)测序、
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和选定区域的数字分析(DANSRTM)(参见，例如Stein RA(2008年9月1日).″Next-Generation Sequencing Update″.GeneticEngineering&Biotechnology News 28(15)；Quail，Michael；Smith，Miriam E；Coupland，Paul；Otto，Thomas D；Harris，Simon R；Connor，Thomas R；Bertoni，Anna；Swerdlow，Harold P；Gu，Yong(2012年1月1日).″A tale of three next generation sequencingplatforms：comparison of Ion torrent，pacific biosciences and illumina MiSeqsequencers″.BMC Genomics 13(1)：341；Liu，Lin；Li，Yinhu；Li，Siliang；Hu，Ni；He，Yimin；Pong，Ray；Lin，Danni；Lu，Lihua；Law，Maggie(2012年1月1日).″Comparison ofNext-Generation Sequencing Systems″.Journal of Biomedicine and Biotechnology2012：1-11；Qualitative and quantitative genotyping using single base primerextension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(
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).Methods Mol Biol.2009；578：307-43；Chu T，Bunce K，Hogge WA，Peters DG.A novel approach toward the challenge ofaccurately quantifying fetal DNA in maternal plasma.Prenat Diagn 2010；30：1226-9；以及Suzuki N，Kamataki A，Yamaki J，Homma Y.Characterization ofcirculating DNA in healthy human plasma.Clinica chimica acta；InternationalJournal of Clinical Chemistry 2008；387：55-8)。在一些实施方案中，这样的方法也可用于确定基因型。
在本文中提供的任何一种方法或系统中，等位基因的量可以通过扩增技术，如本文中或美国公布NO.WO 2016/176662中描述的这样的方法来确定。任何一种这样的技术中都并入本文。
在本文中提供的任何一种方法的一些实施方案中，扩增用PCR例如定量PCR(意味着可以确定核酸的量)进行。定量PCR包括实时PCR、数字PCR、TAQMANTM等。在本文中提供的任何一种方法或系统的一些实施方案中，PCR是“实时PCR”。这样的PCR是指其中在扩增过程仍在进行的同时可以在液相中监测反应动力学的PCR反应。与常规PCR相比，实时PCR提供了同时实时检测或定量扩增反应的能力。基于来自特定染料的荧光强度提高，甚至在扩增达到其平稳时期(plateau)之前都可以确定靶标的浓度。在所提供的任何一种方法的一些实施方案中，PCR是数字PCR。
系统实施
根据一个方面，提供了用于对取自对象例如移植接受者的样品计算质量度量的系统。任何一种系统的多个实施方案配置成响应于对从对象获得的基因组数据进行分析来确定具有较高或较低风险特性的样品。图3示出了用于确定这样的样品和风险谱的一个示例性系统300。根据任何一种系统的一个实施方案，该系统可以配置成直接分析样品或分析关于样品的数据以提供“定量基因分型”(qGT)。根据任何一种系统的一些实施方案，该系统执行定量基因分型，其使用杂合DNA源的标准曲线来量化每个靶标上的A和B等位基因。任何一种系统的另一些实施方案执行质量控制程序以根据可接受性标准评价每个标准曲线和样品扩增。根据任何一种系统的一些实施方案，该系统可以配置成将满足质量控制程序的数据分类为可量化靶标，并对质量控制数据执行解释算法。
根据任何一种系统的一些实施方案，质量控制基于特定的可接受性标准，其可包括对以下中的任何一项或更多项以及任意组合的分析：历史扩增形状、关于第二等位基因的等位基因特异性PCR测定的特异性、Cp或Ct值、PCR效率、信噪比、标准曲线集的斜率和r平方、对照的非扩增、或阴性对照的污染。
根据任何一种系统的一个实施方案，该系统包含质量控制组件302，其执行分析和/或公开算法以确定可量化靶标。
根据任何一种系统的一些实施方案，系统(例如，300)提供了基因型的主要分析。例如，系统可以首先评价接受者(或对象)和供体(或非对象)基因组的“基本基因分型(basic genotyping)”(bGT)。bGT过程为供体(或非对象)和/或接受者(或对象)产生每个靶标上的三种可能的基因型(例如，纯合AA、杂合AB和纯合BB)的标记。根据任何一种系统的多个实施方案，系统在解释每个靶标的qGT时使用该信息。根据任何一种系统的一个实施方案，系统300可包含基因分型组件304，其配置成分析在指定靶标处对样品贡献的供体(或非对象)和/或接受者(或对象)的基因型。根据任何一种系统的一个实施方案，在每个靶标上的基因型的确定允许系统基于基因型识别信息性靶标，例如完全和/或半信息性的。
例如，该系统可以配置成将信息性靶标定义为其中接受者(或对象)是已知纯合的且供体(或非对象)具有另一种基因型的那些。在一个实例中，系统确定信息性靶标，存储关于作为信息性的相应靶标的信息，并包含供体和/或接受者的标记以及两者的基因型分析结果。
根据任何一种系统的另一个实施方案，基因分型组件(例如，304)标记供体(或非对象)和/或接受者(或对象)靶标以分析信息性靶标。在另一个实例中，系统配置成确定信息性靶标，其中供体(或非对象)对于其他等位基因是纯合的(不同于纯合接受者(或对象))。在任何一种系统的另一些实施方案中，基因分型组件可以配置成响应于对观察到的等位基因比率的分析将相应靶标分类为完全信息性或半信息性的。
在这个实例中，靶标被称为完全信息性的，并且观察到的等位基因比率大约是总体供体cf-DNA(或非对象cf-DNA)水平。在另一些实例中，系统确定这样的实例，其中供体(或非对象)是杂合的并且接受者(或对象)是纯合的，并且靶标定义为半信息性的(因为对A等位基因和B等位基因二者都有贡献)。对于半信息性靶标，系统配置成调整测量的贡献。例如，响应于确定靶标是半信息性的，可将测量的贡献加倍。在另一些实施方案中，可以执行更精确的调整。例如，供体cf-DNA与接受者cf-DNA的比率可以表示为百分比。百分比值可用于相应地调整测量的贡献。在另一些实例中，对测量的贡献的调整可以基于统计变异以及其他选项。
根据任何一种系统的多个实施方案，系统配置成产生信息性和质量控制通过的等位基因比率的中值，并且将该中值作为供体无细胞DNA(或非对象cf-DNA)的百分比输出。系统可以配置成报告信息性和质量控制通过的等位基因比率的中值，并且将该中值作为供体无细胞DNA的百分比输出以提高计算结果的稳健性。在任何一种系统的一些实施中，系统包含基因分型组件(例如，304)，其配置成标记供体(或非对象)和/或接受者(或对象)靶标，并根据需要调整任何测量的贡献。
根据任何一种系统的一个实施方案，系统执行的qGT过程生成至少两个质量度量(例如，值的有用性评估)、稳健变异系数(rCV)和dQC。例如，系统可以配置成使用信息性和可量化靶标的分布来计算正则化(rCV)。
在一种方法中，将稳健标准差(rSD)计算为与中值次要物质比例的中值绝对差异，并通过归一化因子(例如，1.4826)进行缩放。在通过加上存根值(stub value)(例如，百分之一的四分之一)对rSD进行正则化之后，可以通过将rSD除以供体cf-DNA％(或非对象cf-DNA％)而将其转换为变异系数。存根值可以由系统引入以避免零除数附近的不稳定性，并且在多个实例中包括小的值以确保非零除数。在多个实施方案中，系统可以配置成利用rCV测量所测定靶标在其中值附近的散布。这允许系统将rCV确定为精度或样品质量的度量。系统可以配置成应用样品质量度量来确定健康样品。在一些实例中，有用的样品可具有低于50％的rCV。改善的质量度量的结果产生样品异常检测的提高以及与常规方法相比不良状况检测的改善。
根据任何一种系统的一个实施方案，系统300可包含分析组件306，其配置成对样品数据(包括例如基于基因型的经调整样品数据)计算多种质量度量。在一个实例中，分析组件配置成计算rSD、rCV和dQC以确保样品稳定性并确保没有发生样品污染。
根据任何一种系统的一些实施方案，系统确定dQC值以提供不一致质量检验：系统配置成对接受者纯合的和非信息性靶标的平均次要等位基因比例进行评价以防止样品混淆(mix-up)和污染。受非特异性等位基因噪声的影响，“dQC”值在理论上读取应接近零％。如果在收集或处理过程中发生了样品交换，则使用了错误的接受者基因型，并且系统执行的dQC测试立即在假定的非信息性靶标上标示高至50％或100％的读数。任何一种系统的另一些实施方案实施dQC分析以确定样品中的样品污染和基因组不稳定性。可以用默认值来设置系统以在计算出的dQC值降至例如0.5％以下时将数据标识为有用样品。可以实施另一些阈值(例如，＜1％、2％、0.3％、0.4％、0.6％等)。另一些示例性阈值包括1％、5％、10％或50％。在任何一种系统的多个实施方案中，与常规方法相比，dQC过滤的执行改善了污染的检测和/或基因组不稳定性的检测。
在另一方面(或在所提供的任何一种其他系统中的另一些实施方案中)，提供了这样的系统，其配置有模拟供体(或非对象)基因型，并且然后在一些实施方案中计算供体cf-DNA(或非对象cf-DNA)的方法(或可以这样配置)。例如，如果供体(或非对象)基因型不可用，则系统仍可以基于对供体(或非对象)基因型数据的模拟来计算供体cf-DNA(或非对象cf-DNA)。模拟供体(或非对象)基因型使得系统(例如，300)能够确定可能的供体(或非对象)基因型和可能的qGT结果的范围。根据任何一种系统的多个实施方案，系统配置成生成完全随机的基因型并执行统计计算以确定更可能的非自身基因型。系统可以通过对明显可见的等位基因施加偏倚(bias)来重复随机基因型的产生。
根据任何一种系统的多个实施方案，系统(例如，300)配置成当供体基因型不可用时执行模拟方法以计算供体cf-DNA(或非对象cf-DNA)。仅使用接受者的基因型和qGT结果，系统就可以使用蒙特卡罗模拟评价供体(或非对象)的选择。例如，模拟中的初步随机选择确定了给定qGT样品可以代表什么总体结果。系统对模拟结果的统计分析确定了可能的供体(或非对象)基因型。系统还可以配置成执行二次蒙特卡罗模拟以探究可能的供体(或非对象)基因型空间并产生一系列可能的qGT结果。根据一个实例，由系统执行的五万次模拟中的每一次都报告中值供体cf-DNA(或非对象cf-DNA)、rCV和dQC三元组(triplet)，从而创建了三维点云(three dimentional point cloud)。在系统的后续处理中，将点云切成dQC和rCV的下三分之一，而剩余的“象限”代表与真实且干净的样品相对应的模拟。在一些实施方案中，在没有供体(或非对象)基因型的情况下，中心95％的供体cf-DNA(或非对象cf-DNA)调用可产生qGT的“方法2”结果。在另一些实施中，可以执行较少的模拟(例如，一万、两万、三万等)或者可以执行更大量的模拟(例如，六万、七万等)以建立用于处理的值。根据任何一种系统的一些实施方案，可以应用另外的计算来完善基因型模拟和由此产生的供体基因型预测。
本文中所述的多个方面和功能(例如，基本基因分型算法、特定基因分型算法、qGT算法的执行，对样品记录数据的操作以将样品结果转换(例如，转换成基因型归一化外观值)，“没有供体(或非对象)”算法，(重新)模拟算法，蒙特卡罗模拟等)可以实施为在一个或更多个专门配置的计算机系统(例如，网络设备、个人计算机、工作站、主机、网络客户端、服务器、媒体服务器、应用服务器、数据库服务器、Web服务器、移动计算设备(例如，智能电话、平板电脑和个人数字助理)以及网路设备(例如，负载平衡器、路由器和交换机)中执行的专用硬件或软件组件。此外，多个方面可以位于单个计算机系统上，或者可以分布在连接至一个或更多个通信网络的多个计算机系统中。
例如，多个方面、功能、系统组件和过程(例如，质量控制组件、基因分型组件和分析组件)可以位于单个计算机系统上或者分布在一个或更多个计算机系统(包括云资源)中，所述一个或更多个计算机系统专门配置成向一个或更多个客户端计算机提供服务或者专门配置成作为分布式系统(例如图4中所示的分布式计算机系统400)的一部分执行总体任务。因此，实施方案不限于在任何特定系统或系统的组上执行。此外，方面、功能和过程可以以软件、硬件或固件、或其任意组合来实施。根据任何一种系统的一些实施方案，计算机系统400可以连接至用于处理组织和/或血液样品的其他系统以产生cf-DNA值或分析从中捕获的值以确定样品质量、污染、健康和/或生存力，以及其他选项。
参照图4，示出了专用分布式计算机系统400的框图，其中实践了本公开内容的多个方面和功能。如所示的，分布式计算机系统400包含交换信息的一个或更多个计算机系统。更具体地，分布式计算机系统400包含计算机系统402、404和406。如所示的，计算机系统402、404和406通过通信网络408互连并且可以通过通信网络408交换数据。网络408可包括计算机系统可以通过其交换数据的任何通信网络。为了使用网络408交换数据，计算机系统402、404和406以及网络408可以使用多种方法、协议和标准，尤其包括光纤通道、令牌环、以太网、无线以太网、蓝牙、IP、IPV6、TCP/IP、UDP、DTN、HTTP、FTP、SNMP、SMS、MMS、SS4、JSON、SOAP、CORBA、REST和Web服务。为了确保数据传输是安全的，计算机系统402、404和406可以使用多种安全措施包括例如SSL或VPN技术经由网络408传输数据。尽管分布式计算机系统400示出了三个联网的计算机系统，但是分布式计算机系统400不限于此并且可包含使用任何介质和通信协议联网的任何数目的计算机系统和计算设备。
如图4中所示，计算机系统402包含处理器410、存储器412、互连元件414、接口416和数据存储元件418。为了实施本文中公开的方面、功能和过程中的至少一些，处理器410执行得到操纵数据的一系列指令。处理器410可以是任何类型的处理器、多处理器或控制器。示例性处理器可包括市售处理器。处理器410通过互连元件414连接至其他系统组件，包括一个或更多个存储装置412。
存储器412在计算机系统402的操作期间存储程序(例如，编码为可由处理器410执行的指令序列)和数据。因此，存储器412可以是相对高性能的、易失性的、随机存取存储器，例如动态随机存取存储器(“DRAM”)或静态存储器(“SRAM”)。然而，存储器412可包括用于存储数据的任何设备，例如磁盘驱动器或其他非易失性存储装置。多个实例可以将存储器412组织成特殊化的并且在一些情况下独特的结构以执行本文中公开的功能。这些数据结构可以调整大小并组织成存储数据类型和特定数据的值。
计算机系统402的组件通过互连元件例如互连元件414耦合。互连元件414可包含系统组件(例如符合专门的或标准的计算总线技术的一个或更多个物理总线)之间的任何通信耦合。互连元件414使得通信(包括指令和数据)能够在计算机系统402的系统组件之间交换。
计算机系统402还包含一个或更多个接口装置416，例如输入装置、输出装置和组合输入/输出装置。接口装置可以接收输入或提供输出。更特别地，输出装置可以呈现信息以用于外部呈现。输入装置可以接受来自外部来源的信息。接口装置的实例包括键盘、鼠标装置、跟踪球、麦克风、触摸屏、打印装置、显示屏、扬声器、网络接口卡等。接口装置允许计算机系统402交换信息并与外部实体例如用户和其他系统进行通信。
数据存储元件418包含计算机可读和可写的非易失性或非暂时性数据存储介质，其中存储有定义由处理器410执行的程序或其他对象的指令。数据存储元件418还可包含记录在介质上或介质中并且在程序执行期间由处理器410处理的信息。指令可以被持久地存储为编码信号，并且指令可以使处理器410执行本文中所述的任何功能。介质可以例如是光盘、磁盘或闪存等。在操作中，处理器410或一些其他控制器使数据从非易失性记录介质读取到另一个存储器，例如存储器412中，与包含在数据存储元件418中的存储介质相比，该存储器允许处理器410更快地访问信息。存储器可以位于数据存储元件418中或存储器412中，然而，处理器410操纵存储器内的数据，并且然后在处理完成之后将数据复制到与数据存储元件418相关联的存储介质。多种组件可以管理存储介质和其他存储元件之间的数据移动，并且实例不限于特定的数据管理组件。此外，实例不限于特定的存储器系统或数据存储系统。
尽管通过实例的方式将计算机系统402示出为可以在其上实践多个方面和功能的一种类型的计算机系统，但是方面和功能不限于在如图4中所示的计算机系统402上实施。多个方面和功能可以在具有与图4中所示的架构或组件不同的架构或组件的一台或更多台计算机上实践。
计算机系统402可以是包含操作系统的计算机系统，该操作系统管理计算机系统402中包含的至少一部分硬件元件。处理器410和操作系统可以共同定义计算机平台，以高阶程式语言为其编写应用程序。另外，多个方面和功能可以在非编程环境中实施。例如，以HTML、XML或其他格式创建的文档在浏览器程序的窗口中查看时，可以呈现图形用户界面的多个方面或执行其他功能。此外，多个实例可以作为程序或非程序元素或者其任意组合来实施。
实施例
来自成人和儿科二者的87位独特的移植接受者对象的总共298个样品通过了质量控制(QC)标准并可供分析。一个个体参加了初始移植之后和再次移植之后二者的研究并且鉴于两个独特的供体/接受者错配DNA而被作为两个独特的对象进行分析。移植的平均患者年龄为7.9+/-7.5岁(范围为0.03至24.2岁)；血液样品的平均年龄为12.7+/-8.1岁(范围为0.08至30.2岁)；59.6％(51/87)的对象为男性并且65.5％(57/87)为白人。从移植到血液样品的平均时间为4.8+/-4.2年。
活检相关血液样品中供体分数(Donor Fraction)与细胞排斥等级之间的相关性
在EMB之前的24小时内采集了总共158个样品并计入用于分析。每个活检仅与一个样品相关。结果总结于表1中。134个活检为CR0级，21个活检为CR1级，并且3个活检为CR2级。
当已知供体基因型进行分析时，发现平均供体cf-DNA分数在与CR0级活检相关的样品中为0.11％(IQR 0.06％至0.21％)，在与CR1级活检相关的样品中为0.37％(IQR0.15％至0.72％)，并且在与CR2级活检相关的样品中为0.97％(IQR 0.88％至1.06％)(p＝0.027)。基于相关ROC曲线排除CR2级排斥的经验最佳割点为0.87％[95％CI 0.78％至0.97％(p＝0.009)]。PPV为13.4％(7.6，22.6)并且NPV为100％。数据的图形表示示于图1A中。
当供体基因型未知时，平均供体cf-DNA分数在与CR0级活检相关的样品中为0.25％(IQR 0.17％至0.39％)，在与CR1级活检相关的样品中为0.89％(IQR 0.44％至5.35％)，并且在与CR2级活检相关的样品中为1.22％(IQR 1.04％至5.18％)(p＜0.001)。基于相关ROC曲线排除CR2级排斥的经验最佳割点为0.89％[95％CI 0.46％至1.70％(p＝0.725)]。PPV为15％(3.21至37.9)并且NPV为100％(97.4，100)。数据的图形表示示于图1B中。
表1.供体分数和细胞排斥等级
Figure BDA0002416496240000231
*零假设：排斥等级类别之间(CR0相对于CR1相对于CR2)的中值相同与Quilty病变的相关性
139个样品与报告存在或不存在Quilty病变的活检相关(121否，18是)。供体cf-DNA分数之间的相关性总结于表2中。
当已知供体基因型进行分析时，平均供体cf-DNA分数在与对Quilty病变呈阴性的活检相关的样品中为0.12％(IQR 0.07％至0.32％)并且在与对Quilty病变呈阳性的活检相关的样品中为0.10％(IQR 0.06％至0.19％)(p＝0.738)。
当供体基因型未知时，平均供体cf-DNA分数在与对Quilty病变呈阴性的活检相关的样品中为0.28％(IQR 0.18％至0.53％)并且在与对Quilty病变呈阳性的活检相关的样品中为0.21％(IQR 0.15％至0.27％)(p＝0.03)。
表2.供体分数和Quilty病变的存在
Figure BDA0002416496240000232
*零假设：存在/不存在quilty病变之间(否相对于是)的中值相同与冠状动脉移植物血管病变(Coronary Artery Graft Vasculopathy，CAV)的相关性
在选择性冠状动脉血管造影术之前24小时内收集了116个血液样品。其中11个显现出如2010 ISHLT分级系统(Mehra等，J Heart Lung Transplant 29，717-727(2010))定义的移植物血管病变，并且99个未显示出移植物血管病变。血管造影术相关样品中供体cf-DNA分数的比较总结于表3中。
当已知供体基因型进行分析时，平均供体分数对于与CAV不相关的样品为0.09％(IQR 0.06％至0.20％)并且对于与CAV相关的样品为0.47％(IQR 0.27％至0.71％)(p＝0.05)。Mehra，M.R.，等，International Society for Heart and Lung Transplantationworking formulation of a standardized nomenclature for cardiac allograftvasculopathy-2010.J Heart Lung Transplant 29，717-727(2010)。排除CAV的经验最佳割点为0.19％[95％CI 0.09％至0.38％(p＜0.001)]。数据的图形表示示于图2A中。
当未知供体基因型进行分析时，与CAV不相关的样品的平均供体分数为0.27％(IQR 0.16％至0.52％)并且与CAV相关的样品的平均供体分数为0.55％(IQR 0.38％至1.22％)(p＝0.057)。排除CAV的经验最佳割点为0.37％[95％CI 0.24％至0.57％(p＜0.001)]。数据的图形表示示于图2B中。
表3.供体分数和冠状动脉移植物血管病变
Figure BDA0002416496240000241
*零假设：无CAD和GV之间(无CAD相对于GV)的中值相同与抗体介导的排斥(Antibody-mediated Rejection，AMR)的相关性
142个样品与分析抗体介导的排斥(AMR)的活检相关。将132个样品读取为pAMR0并且将3个样品读取为pAMR 1或2级。AMR样品中供体cf-DNA分数的比较总结于表4中。
当已知供体基因型进行分析时，与pAMR 0级相关的样品的平均供体分数为0.12％(IQR 0.07％至0.29％)并且与pAMR 1或2级相关的样品的平均供体分数为0.26％(IQR0.09％至0.33％)(p＝0.905)。
当未知供体基因型进行分析时，与pAMR 0级相关的样品的平均供体分数为0.29％(IQR 0.18％至0.61％)并且与pAMR 1或2级相关的样品的平均供体分数为0.39(IQR0.12％至0.44％)(p＝0.969)。基于相关ROC曲线排除pAMR 1或2的经验最佳割点为0.38％[95％CI 0.19％至0.74％(p＝0.005)]。
表4.供体分数和抗体介导的排斥
Figure BDA0002416496240000251
*零假设：感染治疗之间(0相对于1或2)的中值相同
讨论
已发现，用于量化供体cf-DNA的靶向、高通量测定具有出色的敏感性，例如用于心脏移植接受者的排斥监视，并且供体分数的明显升高与显著的同种异体移植物损伤相关，包括作为冠状动脉移植物血管病变形式的慢性排斥和急性阵发式排斥。具体地，0.87％(95％CI 0.78％至0.97％)的经验最佳割点可靠地将CR0和CR1与CR2级排斥区分开。然而，总cf-DNA的供体分数不能区分Quilty病变。
考虑到供体与接受者之间的遗传差异，供体cf-DNA特别适合作为移植领域中的生物标志物。自1998年首次报道在女性接受者的血清中检测到Y染色体的存在(Lo等，Lancet351：1329-1330(1998))以来，该领域已取得了显著进展。
供体cf-DNA的使用有望显著降低对监视活检的需求，并因此允许更频繁地监测排斥。该测定在检测早期排斥方面的明显敏感性以及与EMB或其他活检相比可以以更高频率使用的事实，都将使得临床医生能够频繁地进行非侵入性监测，这可实现降低对患者的创伤以及更早且更有效地检测排斥和/或其他有临床意义的事件二者。另外，供体cf-DNA可增加对心脏移植接受者的组织病理学模式的了解。具有或不具有Quilty病变的患者具有相似水平的供体cf-DNA的发现增加了这一病理学发现可能不反映对供体器官的损伤的证据，如其他人所建议的(Gopal等，Pathol Int 48：191-198(1998))。引人注目的是，当比较细胞等级CR0到CR1到CR2时，数据显示供体cf-DNA水平有逐步的统计学显著性差异。该结果是出乎意料的，并且表明供体cf DNA水平与供体器官进行性损伤之间存在可测量的线性关系。
材料和方法
测量和定义
记录每个对象在移植时的身高和体重以及住院时间。排斥的治疗定义为以治疗如病历中记录的同种异体移植物排斥为目的的免疫抑制药物的改变，并且排斥治疗的开始记录为该药物改变首次施用于对象的日期和时间。活检证实的细胞排斥定义为ISHLT 2级或更高的细胞排斥。活检证实的抗体介导的排斥定义为ISHLT 1级或更高AMR。机械循环支持定义为临时或持久性心室辅助装置、主动脉球囊泵、或体外循环支持。如果对象被诊断出患有癌症或移植后淋巴细胞增生性疾病，或已妊娠，则应记录诊断的最初日期，因为这些情况将另外的“非自身”无细胞DNA的混杂来源(confounding source)引入到接受者血清中。回顾了所有活检的病理报告，并记录了2004 ISHLT等级，以及是否判定了活检具有Quilty病变。如果在血液样品之前的24小时内进行冠状动脉血管造影术，则根据2010ISHLT分级系统记录其结果(Mehra等，J Heart Lung Transplant 29：717-727(1998))。
在以下临床情景下从心脏移植接受者获取血液样品：移植之后的第1、4、7和28天，任何EMB之前的24小时内，以及开始排斥治疗之后紧临第1、4、7和28天之前和之后。
平均总cf-DNA水平和四分位距(interquartile range，IQR)以ng/dL报告，并且将平均百分比供体cf-DNA水平和IQR报告为总数的分数。独立样品均值检验用于比较受试临床变量之间的供体分数(百分比供体cf-DNA)和总cf-DNA(ng/ml血浆)。
排除标准
在确定生物标志物对排斥的治疗之前检测的敏感性和特异性中，存在以下临床情景则将样品排除在分析之外：如果样品在心脏移植的8天内收集；如果样品在排斥治疗开始之后的28天内采集；如果样品在患者处于机械循环支持下时采集；如果在抽血时对象已诊断出患有癌症或移植后淋巴细胞增生性疾病；或者如果样品在活检过程中在心脏内接入之后采集，因为这些临床情景提供了总cf-DNA和供体分数改变的生物学原因，这混淆了测定结果的解释，因为它们与排斥的早期、治疗之前、检测相关。同种异体移植排斥的诊断的敏感性和特异性基于在这些排除标准之外的活检相关样品。鉴于多种供体/接受者(和胎儿)基因型混淆了分析，因此将接受骨髓或非心脏实体器官移植或者在心脏移植之前妊娠的对象也排除在本研究之外。
此外，如果样品不符合用于测定的以下质量控制(QC)标准，则对其进行技术排除：血容量、血浆容量、DNA数量、旋转时间和温度。
血液样品收集
收集三至十毫升(ml)的抗凝血以评估cf-DNA的循环水平。每个样品收集在10mlBCT管(Streck，Omaha，NE)中。样品被立即编码、去识别并送至实验室进行处理。
血浆处理和DNA提取
如前所述，通过离心从全血分离血浆。将血浆储存在-80℃直至DNA提取。所有cf-DNA提取均使用定制的ReliaPrepTM HT循环核酸试剂盒(Promega，Madison，WI)进行。还记录了来自每个血浆样品的总cf-DNA。通过使用ReliaPrepTM Large Volume gDNA分离系统(Promega，Madison，WI)或Gentra Puregene血液试剂盒(Qiagen，Germantown MD)提取接受者基因组DNA。用于基因分型的基因组供体DNA从威斯康星州东南部的血液中心(BloodCenter of Southeast Wisconsin)获得，该中心收集并储存来自所有供体的DNA，作为供体/接受者匹配过程的一部分。在一些情况下，基因组DNA从活检样品获得，并使用QIAampDNA微试剂盒(Qiagen，Germantown MD)提取。将所有经纯化基因组DNA重悬于0.1X TE缓冲液中。
总cf-DNA分析
使用TaqMan定量实时聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerasechain reaction，qRT-PCR)参考测定一式三份评价每个血浆样品中的总cf-DNA含量，该测定检测人14号染色体上的核糖核酸酶P RNA成分H1(H1RNA)基因(RPPH1)，cytoband14q11.2。该测定扩增了在NCBI build 37上的chr14：20811565(Thermo FisherScientific，Waltham，MA)处映射到单外显子RPPH1基因内的87bp产物。PCR分析在AppliedBiosystems QuantStudio 7 Flex实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)上进行。对于每个反应，使用从血浆提取的1μl cf-DNA。使用人基因组DNA的稀释系列创建量化的标准曲线。获得来自每个样品的总cf-DNA并表示为ng/ml血浆。
百分比供体cf-DNA分析
称为myTAI-Heart测定的专有、多重、等位基因特异性基于定量PCR的测定旨在直接量化作为总cf-DNA分数的供体无细胞DNA(Dcf-DNA)的百分比(TAI Diagnostics)。该测定用对每个等位基因具有特异性的实时PCR来量化双等位基因SNP。选择稳定基因组区域中的高频群体SNP，因为这提高了它们可靠量化的可能性以及接受者与供体基因组之间的区分能力。
将15ng cf-DNA添加至多重文库主混合物，将外源标准品(TAI5)加标到每个样品(4.5E+03拷贝)中并在25ul反应物中通过PCR扩增35个循环，所述反应物包含0.005U Q5(NEB)DNA聚合酶、0.2mM dNTP、96个靶标的3uM正向引物库和96个靶标的3uM反向引物库，最终浓度为2mM MgCl2。循环条件为98℃持续30秒，然后是35个循环：98℃持续10秒、55℃持续40秒和72℃持续30秒。然后在此之后是在72℃下孵育2分钟。然后将样品储存在4℃下。使用ExoSAP-IT(Thermo Fisher Scientific)通过在37℃下孵育15分钟和80℃下孵育15分钟来将10微升的最终反应物清理干净。
然后将样品用TAI保存缓冲液以1∶1稀释并在-80℃下储存直至准备进行定量基因分型。然后将样品以1∶100稀释用于定量基因分型，并与适当的对照和校准物一起建立3ul反应物用于使用Roche LightCycler 480系统(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)进行实时PCR运行。
分析
定量基因分型
“定量基因分型”(qGT)使用杂合DNA来源的标准曲线来量化每个靶标上的A和B等位基因。质量控制程序评价每个标准曲线和样品扩增以符合可接受性标准。然后解释可量化靶标。可接受性标准包括历史扩增形状、关于第二等位基因的等位基因特异性PCR测定的特异性、信噪比、标准曲线集的斜率和r平方、对照的非扩增、以及阴性对照的污染。
主要分析首先评价接受者和供体基因组的“基本基因分型”(bGT)。bGT过程在每个靶标上用三种可能的基因型(例如纯合AA、杂合AB和纯合BB)标记供体和/或接受者。需要此信息以准确解释每个靶标的qGT。信息性靶标定义为其中已知接受者是纯合的且供体具有另一种基因型的那些。当供体是纯合的并且不同于接受者时，靶标称为完全信息性的，因为观察到的B等位基因比率大约是总体供体cf-DNA水平。当供体是杂合的时，靶标称为半信息性的，因为对A等位基因和B等位基因二者都有贡献，这意味着测量的贡献必须加倍。为了稳健性，将信息性和质量控制通过的等位基因比率的中值报告为供体cf-DNA的百分比。
每个qGT过程都会产生两个主要的质量度量，即rCV和dQC。使用信息性和可量化靶标的分布来计算正则化的稳健变异系数(rCV)。首先，将稳健标准差(rSD)计算为与中值次要物质比例的中值绝对差异，通过1.4826的归一化因子进行缩放。在通过加上百分之一的四分之一对rSD进行正则化之后，通过将rSD除以供体cf-DNA％而将其转换为变异系数，以避免零除数附近的不稳定性。rCV测量所测定靶标在其中值附近的散布并用作精度或样品质量的度量。有用的样品将通常具有低于50％的rCV。
dQC是不一致质量检验：对接受者纯合的和非信息性靶标的平均次要等位基因比例进行评价以防止样品混淆和污染。受非特异性等位基因噪声的影响，这些在理论上读取应接近零％。如果在收集或处理过程中发生了样品交换，则使用了错误的接受者基因型，并且dQC立即在假定的非信息性靶标上标示高至50％或100％的读数。dQC还捕获样品污染和可能的基因组不稳定性。有用的样品将通常具有低于0.5％的dQC。
当供体基因型不可用时，可以使用二次方法(secondary method)计算供体cf-DNA。仅使用接受者的基因型和qGT结果，在蒙特卡罗模拟中评价供体的选择。初步随机选择举例说明了给定qGT样品可以代表什么总体结果。模拟结果的统计分析为可能的供体基因型提供了支持。二次蒙特卡罗模拟探究了可能或很可能的供体基因型空间并产生了一系列可能的qGT结果。50,000次模拟中的每一次都报告中值Dcf-DNA、rCV和dQC三元组，并构成一个三维点云。将点云切成dQC和rCV的下三分之一，而剩余的“象限”代表与真实且干净的样品相对应的模拟。中心95％的所得供体cf-DNA调用成为没有供体基因型的qGT的结果。
供体分数
计算供体分数(或百分比供体cf-DNA)并将其针对以下事件进行比较：例如细胞排斥、抗体介导的排斥、移植物血管病变、和临床上重大的死亡事件、心脏停搏、心脏再次移植、以及机械循环支持的开始。如果对象被诊断出患有癌症或移植后淋巴细胞增生性疾病，或已妊娠，则记录诊断的最初日期(如果适用的话)。
来自对象的样品的基因分型通过了纳入/排除标准并用于后续分析。每个供体接受者对的基因分型产生每个样品的信息性基因座。
统计
进行了独立中值的中值检验以测试排斥类型(CR0、CR1、CR2)是否按方法类型(有供体基因型或没有供体基因型的模拟)具有相等的中值。当将CR0和CR1组合并将这些方法的中值与CR2进行比较时，p值大于0.05。因此得出结论：排斥类型之间中值相等。然而，当比较三种排斥类型之间(CR0相对于CR1相对于CR2)的中值时，p值小于0.05，并且得出结论：对于排斥类型，当供体基因型已知时与供体基因型未知时所确定的中值不相等。
构建接受者操作特征(Receiver-operating characteristic，ROC)曲线以评估两种分析方法的敏感性和特异性，并比较它们诊断CR0相对于CR1相对于CR2的能力。最佳截止点或决策阈值是给出最大正确分类的点并且采用Liu等(Stat Med.31(23)：2676-86(2012))的方法。该方法使敏感性和特异性的乘积最大化。还计算了测试的阴性和阳性预测值。例如，在筛查测试呈阳性的人中，13.4％的阳性预测值(positive predictive value，PPV)表示疾病的可能性为13.4％。同样，在筛查测试呈阴性的人中，100％的阴性预测值(negative predictive value，NPP)表明无疾病的可能性为100％。
示例性系统实施
根据任何一种系统的一个实施方案，系统执行软件以在供体基因型未知的情况下确定供体分数(％)。在一个实例中，所述执行包括以下操作中的任何一个或更多个或任意组合：
1.对供体基因型执行蒙特卡罗模拟以确定可能的供体分数(在另一些实施方案中，可以使用其他模型或近似值)；
2.两阶段方法，其中将样品的(例如，阈值数目(例如，1000、2000、3000、4000、5000、5999，以及其他选项)的样品的)初始短模拟用于通知大量样品(例如，10000、15000、20000、25000、29999等)的二次模拟一在模拟中，可以计算出中值供体分数、rCV和dQC三元组；
3.在初始模拟中，可以通过对靶标选择单独对rCV和dQC的影响进行广义线性建模来确定明显的供体基因型。将高背景样品中靶标选择的熵和频率的进一步分析添加至供体基因型似然抵消项(likelihood offset term)；
4.在初始模拟中，可以均一地选择供体基因型(例如，设定为22.7％RR、45.5％RV、22.7％VV、10％NA)(例如，杂合(RV)、纯合变体(VV)和纯合参照(RR)；
5.二次模拟选择供体基因型为25％RR、50％RV和75％VV，具有由上述证据向量补偿均一的随机变量，减去两个无偏靶标；
6.创建了三维点云并审查了一部分。模拟具有如指数函数0.001/3+(exp(3*x)-1)/2750定义的中值供体分数和rCV的极值，对其进行标记用于审查。在一些实施方案中，如果要审查超过95％的模拟，则该算法可以配置成恢复高于其中值供体分数的中点的那些；
7.在剩余模拟中，较低的背景噪声模拟被确定为低于dQC的第一四分位数的那些。根据任何一种系统或方法的一些实施方案，将高于dQC的较低四分位数的模拟丢弃；
8.在剩余模拟中，内部一致的模拟被确定为低于rCV的前三分之一的那些。根据任何一种系统或方法的一些实施方案，可以丢弃高于rCV的下三分之一的模拟。在另一些实例中，可以对于rCV实施不同的截止值；
9.在任何一种系统或方法的一些实施方案中，可以在供体分析执行中包括校准，例如，可以通过线性公式(例如，y＜-(1.166002)x+0.0001230337)来缩放供体分数；以及
10.在任何一种系统或方法的一些实施方案中，算法配置成捕获中值供体分数的第48个百分位数，以返回该信息。
图5是根据一个实施方案的包括用于分析样品的系统元件和功能的平台500的框图。在多个实施方案中，平台500可以接收或生成待分析的数据。例如，系统可以从外部数据库(例如，550、552)捕获数据并分析所捕获的数据。在另一些实例中，用户(例如，554、556)可以管理或触发数据到平台500的通信。在另一些实例中，用户(658、560)可以操作测定装置和/或扩增装置(例如，582、584，并将结果直接提供给平台500。
根据任何一种系统或方法的多个实施方案，可以通过三个阶段来描述所执行的分析：bGT预处理、gGT预处理和定量基因型处理，并且将结果在592输出和/或存储(例如，在数据库590中)。
在一些实施方案中，通过图形用户界面的操作来捕获运行和样品信息(例如，基本基因分型运行信息502和/或定量基因分型运行信息504)。在一些实例中，基本基因分型预处理用可包含操作者姓名、样品标识符和样品位置的说明的信息进行操作；定量基因型预处理用可包含运行名称、操作者姓名、样品标识符和样品位置的信息进行操作；并且结果调用用可包含bGT预处理数据文件、文件命名(接受者或供体)、qGT预处理数据文件、运行名称和样品名称的信息进行操作。配置数据库594可包含指定数据格式的信息、控制信息和关于其他功能(包括管理功能)的数据。
如图5中所示，来自lightcycler 480(例如，582和584)的数据被处理，作为样品分析的一部分。在一个实例中，平台500经由XML文件或其他合适的数据格式从ROCHELighcycler 480捕获数据。该数据可以与用户管理(例如，由用户558或560触发)通信。
图5中在518处示出了三个工作流，其对获得的运行信息(例如，506和508)、液体处理信息(例如，510和512)以及RT-PCR数据(例如，514和516(其可包括例如实时PCR数据))进行操作。所述三个工作流程包括：bGT预处理522，其读取在基因组DNA样品上获得的数据(例如，结合板布局配置信息)以生成由基本基因分型结果和质量控制文件组成的数据文件(例如，二进制数据文件)-这些文件可以存档在单独的数据仓(data repository)或系统上；qGT预处理518，其读取无细胞DNA样品上的数据(例如，结合板布局配置)以生成由定量基因分型结果和质量控制文档组成的数据文件(例如，二进制数据文件)-这些文件可以存档在单独的数据仓或系统上；以及定量基因型处理520，其中对一对基本基因分型和定量基因分型数据文件(例如，来自518和520)进行分析以生成结果度量和总体质量控制文档-这些文件可以存档在单独的数据源或系统(包括例如数据库590)上。在多个实施方案中，结果592可以由平台显示或通信至其他系统进行显示。

Claims (65)

1.方法，其包括：
分析样品中多个相应靶标上的等位基因的量，并且在所述样品内确定可量化和/或信息性靶标；
用非对象的可能基因型执行模拟；以及
基于从所述模拟确定的可能的非对象基因型来确定归属于所述非对象和任选地所述对象的每个靶标的等位基因的量，并且任选地，确定所述样品中非对象相对于对象量的百分比或比率。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括确定所述对象基因型。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述方法还包括进行扩增以确定等位基因的量。
4.根据权利要求3所述的方法，其中对至少30、40、50、60、70、80、90或更多个靶标进行扩增。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括基于所述样品中确定的百分比或比率来计算质量度量。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括模拟可能的非对象基因型空间。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中执行模拟(例如，蒙特卡罗)以确定所述非对象的可能基因型的范围。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于相应的可能的基因型来调整对相应靶标的测量的贡献(例如，响应于确定所述非对象可能的基因型是杂合的，将测量的贡献值加倍)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括计算平均例如中值的百分比或比率。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括确定每个标准曲线和/或样品扩增值满足置信度阈值。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于对以下中的至少一项的分析来确定置信度值：历史扩增形状、等位基因特异性PCR测定(例如，关于第二等位基因)的特异性、样品的信噪比、标准曲线集的斜率和r平方值、在插入的对照上获得的非扩增值、或在来自阴性对照的样品上获得的污染值。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以历史扩增形状拟合从所述样品获得的数据。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括确定所述标准曲线集的斜率和r平方值不超过阈值。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述样品中确定为可量化和/或信息性的每个靶标上为所述非对象或对象建立标记。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括响应于根据基因型对相应靶标进行分类来确定所述样品内的信息性靶标。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括响应于确定所述对象和非对象具有不同的基因型(例如，所述对象对于一个等位基因是纯合的并且所述非对象对于另一个等位基因不是纯合的或是纯合的)，将相应靶标分类为信息性的。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括响应于确定所述非对象是杂合的来调整对相应靶标的测量的贡献(例如，响应于确定所述非对象是杂合的，将测量的贡献值加倍)。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括计算信息性(例如，由基因分型组件确定)和质量控制通过的(例如，由质量控制组件确定)等位基因比率的中值，并且将所述中值存储为比率或百分比。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于所述信息性和可量化靶标的分布以及相关百分比或比率来计算正则化的稳健变异系数(“rCV”)。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于与中值次要物质比例的中值绝对差异来计算稳健标准差(“rSD”)。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过除以例如所述非对象cf-DNA百分比将rSD转换为rCV。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括调整rSD以避免被零除(例如，通过将百分之一的四分之一加到除数上)。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于阈值rCV值确定适合用于量化的样品，所述阈值rCV值是基于所述信息性和可量化靶标的分布以及相关百分比或比率而确定的。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括针对污染阈值评价对象纯合的和非信息性靶标的平均次要等位基因比例。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于所述对象纯合的和非信息性靶标的平均次要等位基因比例来计算不一致质量检验(“dQC”)值，并且针对所述阈值评价所述dQC值。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括基于鉴定低于0.5％的dQC值来确定适合用于量化的样品。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述非对象是供体。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品来自移植对象。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述移植对象是心脏移植对象。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述样品来自儿科对象。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括选择所述可能的模拟的合计和/或95％置信区间。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括选择具有低于中值dQC和rCV的模拟和/或确定95％置信区间。
33.用于分析来自对象的样品的系统，所述系统包含：
有效连接至存储器的至少一个处理器；
由所述至少一个处理器执行的第一组件(例如，质量控制组件)，其配置成分析(例如，定量基因分型(“qGT”))样品中多个相应靶标的等位基因的量并且在所述样品内确定可量化和/或信息性靶标；
第二组件(例如，建模组件)，其配置成模拟非对象的可能的基因型信息；以及
由所述至少一个处理器执行的第三组件(例如，基因分型组件)，其配置成基于从所述模拟确定的可能的非对象基因型来确定归属于所述非对象和任选地所述对象的每个靶标的等位基因的量，并且任选地，确定所述样品中非对象相对于对象量的百分比或比率。
34.根据权利要求33所述的系统，其还包含由所述至少一个处理器执行的第四组件(例如，分析组件)，所述第四组件配置成基于所述样品中确定的百分比或比率来计算质量度量。
35.根据权利要求33或34中任一项所述的系统，其中所述第三组件配置成模拟可能的非对象基因型空间。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的系统，其中所述第三组件配置成执行模拟(例如，蒙特卡罗)以确定所述非对象的可能基因型的范围。
37.根据权利要求33至36中任一项所述的系统，其中所述第三组件配置成基于相应的可能的基因型来调整对相应靶标的测量的贡献(例如，响应于确定所述非对象可能的基因型是杂合的，将测量的贡献值加倍)。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的系统，其中所述至少一个处理器配置成计算平均例如中值的百分比或比率。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的系统，其中所述第一组件配置成确定每个标准曲线和/或样品扩增值满足置信度阈值。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的系统，其中所述第一组件配置成基于对以下中的至少一项的分析来确定置信度值：历史扩增形状、等位基因特异性PCR测定(例如，关于第二等位基因)的特异性、样品的信噪比、标准曲线集的斜率和r平方值、在插入的对照上获得的非扩增值、或在来自阴性对照的样品上获得的污染值。
41.根据权利要求40所述的系统，其中所述第一组件配置成以历史扩增形状拟合从所述样品获得的数据。
42.根据权利要求40所述的系统，其中所述第一组件配置成确定所述标准曲线集的斜率和r平方值不超过阈值。
43.根据权利要求33至42中任一项所述的系统，其中所述第一或第三组件配置成在所述样品中确定为可量化和/或信息性的每个靶标上为所述非对象或对象建立标记。
44.根据权利要求43所述的系统，其中所述第一或第三组件配置成响应于根据基因型对相应靶标进行分类来确定所述样品内的信息性靶标。
45.根据权利要求43或44所述的系统，其中所述第三组件配置成响应于确定所述对象和非对象具有不同的基因型(例如，所述对象对于一个等位基因是纯合的并且所述非对象对于另一个等位基因不是纯合的或是纯合的)，将相应靶标分类为信息性的。
46.根据权利要求33至45中任一项所述的系统，其中所述第三组件配置成响应于确定所述非对象是杂合的来调整对相应靶标的测量的贡献(例如，响应于确定所述非对象是杂合的，将测量的贡献值加倍)。
47.根据权利要求33至46中任一项所述的系统，其中所述第三组件计算信息性(例如，由基因分型组件确定)和质量控制通过的(例如，由质量控制组件确定)等位基因比率的中值并将所述中值存储为比率或百分比。
48.根据权利要求33至47中任一项所述的系统，其中任何一种所述组件(例如，所述分析组件)配置成基于所述信息性和可量化靶标的分布以及相关百分比或比率来计算正则化的稳健变异系数(“rCV”)。
49.根据权利要求33至48中任一项所述的系统，其中任何一种所述组件(例如，所述分析组件)配置成基于与中值次要物质比例的中值绝对差异来计算稳健标准差(“rSD”)。
50.根据权利要求49所述的系统，其中任何一种所述组件(例如，所述分析组件)配置成通过除以例如所述非对象cf-DNA百分比或比率将rSD转换为rCV。
51.根据权利要求49或50所述的系统，其中所述组件配置成调整rSD以避免被零除(例如，通过加上百分之一的四分之一)。
52.根据权利要求33至51中任一项所述的系统，其中所述系统配置成基于阈值rCV值来确定适合用于量化的样品，所述阈值rCV值是基于所述信息性和可量化靶标的分布以及相关百分比或比率而确定的。
53.根据权利要求33至52中任一项所述的系统，其中所述系统配置成针对污染阈值评价对象纯合的和非信息性靶标的平均次要等位基因比例。
54.根据权利要求53所述的系统，其中所述系统配置成基于所述对象纯合的和非信息性靶标的平均次要等位基因比例来计算不一致质量检验(“dQC”)值并针对所述阈值评价所述dQC值。
55.根据权利要求53或54所述的系统，其中所述系统配置成基于鉴定低于0.5％的dQC值来确定适合用于量化的样品。
56.根据权利要求33至55中任一项所述的系统，其中所述非对象是供体。
57.根据权利要求33至55中任一项所述的系统，其中所述样品来自移植对象。
58.根据权利要求57所述的系统，其中所述移植对象是心脏移植对象。
59.根据权利要求57或58所述的系统，其中所述样品来自儿科对象。
60.根据权利要求33至59中任一项所述的系统，其中所述系统还配置成选择所述可能的模拟的合计和/或95％置信区间。
61.根据权利要求33至60中任一项所述的系统，其中所述系统还配置成选择具有低于中值dQC和rCV的模拟和/或确定95％置信区间。
62.报告，其包含由任何一种前述方法或系统产生的任何一个或更多个值。
63.治疗对象的方法，其包括：
基于由任何一种前述方法或系统产生的任何一个或更多个值来评价对象，
以及对所述对象进行治疗、推荐对其进行治疗、改变对其进行的治疗、对其进行进一步监测或推荐对其进行进一步监测。
64.本文中提供的任何一种方法。
65.本文中提供的任何一种系统。
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